DE60202727T2

DE60202727T2 - Inhibition von Histondeacetylase zur Behandlung von Herzhypertrophie

Info

Publication number: DE60202727T2
Application number: DE60202727T
Authority: DE
Inventors: Michael R. Cherry Hills Village Bristow; Carlin Denver Long; Timothy A. Broomfield McKinsey; Eric N. Dallas Olson
Original assignee: University of Texas System; University of Colorado
Current assignee: University of Texas System; University of Colorado
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2022-09-28
Also published as: ES2236415T3; US20040186049A1; US20060025333A1; DK1297851T3; EP1297851A1; EP1297851B1; US20060069014A1; ATE287731T1; JP2003238445A; US20030144340A1; DE60202727D1; PT1297851E; US6946441B2; JP2010001311A; US6706686B2

Description

GRUNDLAGEN DER ERFINDUNG
Die Regierung ist im Besitz der Rechte der vorliegenden Erfindung gemäß der Bewilligungsnummer NHI RO1 HL61544 der National Institutes of Health. Die vorliegende Erfindung beansprucht Vorrecht der Priorität vor U.S. vorläufige Nr. 60/325.311, eingereicht am 27. September 2001, und 60/334.041, eingereicht am 31. Oktober 2001.
1. Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von HDAC-Inhibitoren zur Behandlung von Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz.
2. Beschreibung der verwandten Technik
Die Herzhypertrophie als Reaktion auf eine vom Herzen geforderte erhöhte Belastung ist ein grundlegender Anpassungsmechanismus. Es ist ein spezialisierter Prozess, der eine quantitative Zunahme von Zellgröße und -masse (eher als der Zellzahl) als Folge eines neuronalen, endokrinen oder mechanischen Stimulus oder einer Kombination davon widerspiegelt. Hypertension, ein weiterer in der Herzhypertrophie involvierter Faktor, geht häufig der kongestiven Herzinsuffizienz voraus. Bei einer Herzinsuffizienz ist der linke Ventrikel vergrößert und ausgeweitet und Kennziffern der systolischen Funktion, wie Ejektionsfraktion, sind vermindert. Eindeutig ist die hypertrophe Reaktion des Herzens ein komplexes Syndrom und die zur Aufklärung der Herzhypertrophie führenden Wege sind für die Behandlung von Herzkrankheiten, die sich aus den verschiedenen Stimuli ergeben, von großem Vorteil.
Eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die Myocyten-Enhancer-Faktor-2 Familie (MEF2), ist in der Herzhypertrophie involviert. Zum Beispiel kann können verschiedene Stimuli intrazelluläres Calcium erhöhen, was eine Kaskade intrazellulärer signalgebender Systeme oder Wege, einschließlich Calcineurin, CAM-Kinasen, PCK und MAP-Kinasen, auslöst. Alle diese Signale aktivieren MEF2 und führen zu einer Herzhypertrophie. Allerdings ist noch nicht ganz verstanden, wie die verschiedenen Signale ihre Wirkungen auf MEF2 ausüben und deren Hypertrophiesignale modulieren. Es ist bekannt, dass bestimmte Histondeacetylaseproteine, HDAC 4, HDAC 5, HDAC 7, HDAC 9 und HDAC 10, in der Modulierung der MEF2-Aktivität involviert sind.
Elf verschiedene HDACs sind von Vertebraten kloniert worden. Alle zeigen eine Homologie in der katalytischen Region. Histonacetylasen und -deacetylasen spielen eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Genexpression. Das Gleichgewicht zwischen Aktivitäten der Histonacetylasen, normalerweise als Acetyltransferasen (HATs) bezeichnet, und Histondeacetylasen (HDCACs) bestimmt das Ausmaß der Histonacetylierung. Folglich lösen acetylierte Histone die Relaxation von Chromatin und Aktivierung der Gentranskription aus, während deacetyliertes Chromatin im Allgemeinen transkriptionell inaktiv ist. In einem früheren Bericht wurde im Laboratorium der Erfinder gezeigt, dass HDAC 4 und 5 mit MEF2 dimerisieren und die Transkriptionsaktivität von MEF2 reprimieren und außerdem dass diese Wechselwirkung das Vorhandensein des N-Terminus der HDAC 4 und 5 Proteine erfordert. McKinsey et al. (2000a, b).
In einem anderen Zusammenhang ist in der jüngeren Forschung die bedeutende Rolle der HDACs in der Krebsbiologie in den Vordergrund gerückt worden. In der Tat sind verschiedene Inhibitoren der HDACs auf ihre Fähigkeit getestet worden, Zelldifferenzierung und/oder Apoptose in Krebszellen zu induzieren. Marks et al. (2000). Derartige Inhibitoren umfassen Suberoylanilidhydroxaminsäure (SAHA) (Butler et al., 2000; Marks et al., 2001); m-Carboxycinnaminsäurebis-hydroxamid (Coffey et al., 2001); und Pyroxamid (Butler et al., 2001). Diese Untersuchungen sind als Hinweis zusammengefasst worden, „dass die Hydroxaminsäure-basierten HPCs, insbesondere SAHA und Pyroxamid, potente Inhibitoren von HDAC in vitro und in vivo sind und Wachstumsstillstand, Differenzierung oder apoptotischen Zelltod von transformierter Zellen induzieren ... [und folglich] Führungsverbindungen in der Familie der Hydroxaminsäure-basierten HPCs sind und gegenwärtig in Phase I klinischen Versuchen sind." Marks et al. (2000). Bis heute sind keine Berichte über die Wirkungen von HDAC-Inhibitoren auf Muskelzellhypertrophie und Reaktion auf Stress veröffentlicht worden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Folglich ist entsprechend der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Histondeacetylaseinhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von pathologischer Hypertrophie des Herzens und Herzinsuffizienz bereitgestellt, umfassend (a) Identifizierung eines Patienten mit Herzhypertrophie; und (b) Verabreichung eines Histondeacetylaseinhibitors an den Patienten. Die Verabreichung kann eine intravenöse, orale, transdermale, langzeitwirkende, suppositorische oder sublinguale Verabreichung umfassen. Die Behandlung kann außerdem die Verabreichung eines zweiten therapeutischen Wirkstoffes umfassen, wie ein Betablocker, ein Inotrop, ein Diuretikum, ACE-I, AII-Antagonist oder Ca⁺⁺-Blocker. Der zweite therapeutische Wirkstoff kann zur selben Zeit wie der Histondeacetylaseinhibitor oder entweder vor oder nach dem Histondeacetylaseinhibitor verabreicht sein. Die Behandlung kann ein oder mehrere Symptome der Herzinsuffizienz verbessern, wie Bereitstellung einer erhöhte Übungskapazität, eines erhöhten Blutauswurfsvolumens, links-ventrikulären End-diastolischen Drucks, Lungenkapillar-Keildrucks, Herzauswurfsvolumens, Herzindex, Lungenarteriendrücke, links-ventrikuläre End-systolische und diastolische Ausdehnungen, links- und rechts-ventrikuläre Wandbeanspruchung, Wandspannung und Wanddicke, erkrankungsabhängige Morbidität und Mortalität.
In einer noch anderen Anwendungsform ist die Verwendung eines Histondeacetylaseinhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention pathologischer Hypertrophie des Herzens und Herzinsuffizienz bereitgestellt, umfassend (a) Identifizierung eines Patienten mit Risiko der Entwicklung einer Herzhypertrophie; und (b) Verabreichung eines Histondeacetylaseinhibitors an den Patienten. Die Verabreichung kann eine intravenöse, orale, transdermale, langzeitwirkende, suppositorische oder sublinguale Verabreichung umfassen. Der Patient mit diesem Risiko kann eines oder mehrere Anzeichen zeigen wie langjähriger nichtkontrollierter Bluthochdruck, nicht-korrigierte Herzklappenerkrankung, chronische Angina und/oder kürzlichen myokardialen Infarkt.
Entsprechend den vorhergehenden Anwendungsformen kann der Histondeacetylaseinhibitor ein beliebiges Molekül sein, das eine Aktivitätsminderung einer Histondeacetylase bewirkt. Dieses umfasst Proteine, Peptide, DNA-Moleküle (einschließlich antisense), RNA-Moleküle (einschließlich RNAi und antisense) und kleine Moleküle. Die kleinen Moleküle umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Trichostatin A (TSA), Trapoxin B, MS 275-27, m-Carboxycinnaminsäurebis-hydroxamid, Depudecin, Oxamflatin, Apicidin, Suberoylanilidhydroxyaminsäure, Scriptaid, Pyroxamid, 2-Amino-8-oxo-9,10-epoxydecansäure, 3-(4-Aroyl-H-pyrrol-2-yl)-N-hydroxy-2-propanamid und FR901228. Zusätzlich beschreiben die folgenden Referenzen Histondeacetylaseinhibitoren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ausgewählt sein können: AU 9.013.101; AU 9.013.201; AU 9.013.401; AU 6.794.700; EP 1.233.958 ; EP 1.208.086 ; EP 1.174.438 ; EP 1.173.562 ; EP 1.170.008 ; EP 1.123.111 ; JP 2001/348340; U.S. 2002/103192; U.S. 2002/65282; U.S. 2002/61860; WO 02/51842; WO 02/50285; WO 02/46144; WO 02/46129; WO 02/30879; WO 02/26703; WO 02/26696; WO 01/70675; WO 01/42437; WO 01/38322; WO 01/18045; WO 01/14581; Furumai et al. (2002); Hinnebusch et al. (2002); Mai et al. (2002), Vigushin et al. (2002); Gottlicher et al. (2001); Jung (2001); Komatsu et al. (2001); Su et al. (2000).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen sind Teil der vorliegenden Beschreibung und sind zur weiteren Demonstration bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Erfindung kann mit Bezug auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen zusammen mit der detaillierten Beschreibung der hier angeführten spezifischen Anwendungsformen besser verstanden werden.
1A–C. TSA verändert Agonist-induzierte Genrepression. Kultivierte Herzmyocyten wurden mit PE (20 μmol/l) oder IL-1 (1 ng/ml) 48 h behandelt. TSA (30 nmol) wurde 30 min vor Behandlung mit PE oder IL-1 zugegeben. Myocyten-spezifische mRNA-Expression (SERCA2a (1A), αMyHC (1B), βMyHC (1C) wurde in 5 μg Gesamt-RNA mittels RNase-Schutzassay getestet. Mittelwerte sind von 4 Kulturen und als % Kontrolle nach Normalisierung auf GAPDH-Signal dargestellt.
2A–D. Überexpression von HDACs reprimiert Muskel-spezifische Promotoren. Kultivierte Myocyten wurden 72 h mit Expressionsvektoren (2 μg pro ~3 × 10⁵ Zellen) für Flag-markierte HDAC 1, 4, 5 (oder deren Backbone-Vektor) und CAT-Reporter (5 μg) Konstrukten für SERCA (2A), αMyHC (2B), βMyHC (2C und 2D) Gene plus SV-40 gesteuerte sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP 1 μg, Clontech) transfiziert. TSA wurde mit 30 nmol/l verwendet und genau nach Transfektion zugegeben. PE 22 (20 μmol) wurde 24 h später zugegeben und CAT-Assays nach weiteren 48 h durchgeführt. Mittelwerte sind von n = 3 verschiedenen Kulturen und als % pCMV nach Normalisierung auf SEAP-Aktivität in den Medien dargestellt. Überexpression von HDAC wurde mittels Western Blot für Flag bestätigt.
3A–D. HDAC-Inhibitoren blockieren die Aktivierung von ANF-Reporter durch Phenylephrin ohne Cytotoxizität. Neonatale Rattenkardiomyocyten wurden mit insgesamt 1 μg Maus 3 kb ANF-Promotorfragment und CMV-Lac Z Plasmiden co-transfiziert. (3A) Der ANF-Promotor ist in nicht stimulierten Kardiomyocyten minimal aktiv. Die Zugabe von HDAC-Inhibitoren induziert keine ANF-Promotoraktivität. Zugabe von Phenylephrin aktivierte den ANF-Promotor, aber eine gleichzeitige Behandlung der Kardiomyocyten mit Phenylephrin und einem HDAC-Inhibitor (TSA (85 nM), NaBut (5 mM) oder HC-Toxin (5 ng/ml)) verhinderte die Aktivierung des ANF-Promotors durch Phenylephrin (100 μM). (3B) Lac Z Expression mit dem konstitutiven CMV-Promotor. Behandlung mit HDAC-Inhibitoren erhöhte die CMV-Aktivität mit und ohne Co-Behandlung mit Phenylephrin. (3C und 3D) Die Schaubilder zeigen Messungen der Adenylat-Kinase-Aktivität, die im Medium nach X Stunden Kulivierung der Kardiomyocyten bei Abwesenheit oder Anwesenheit von hypertrophen Stimulantien FBS, PE oder ET-1 konstant bleibt.
4A–C. HDAC-Inhibitoren verhindern normalerweise von hypertrophen Agonisten induzierte endogene ANF-Expression. (4A) Schaubild zeigt die Aufsummierung mehrerer Dot-Blot-Experimente (n = 4). Wie in den Transfektionsversuchen induziert Phenylephrin (100 μM) die ANF-Expression um das Dreifache. Behandlung mit HDAC-Inhibitoren (TSA 85 nM; Natriumbutyrat, 5 mM; HC-Toxin 5 ng/ml) blockiert die Akkumulation des ANF-Botenstoffes. (4B und 4C) Die Schaubilder zeigen eine Verminderung der Chemilumineszenz-Detektion von ANF im Kulturmedium mit ansteigenden Konzentrationen des HDAC-Inhibitors TSA (4B) und Natriumbutyrat (4C), wenn sie mit den hypertrophen Stimulantien FBS, PE oder ET-1 co-kultiviert sind.
5A–B. Behandlung von Kardiomyocyten mit HDAC-Inhibitoren blockiert das mit der Hypertrophie von Kardiomyocyten assoziierte fötale Genprogramm. (5A) Schaubild zeigt die x-fachen Änderungen der αSK-Actin-Expression durch Phenylephrin und die fehlende Genaktivierung in TSA-behandelten Proben. (5B) Schaubild zeigt die Änderungen von αMyHC und βMyHC RNA-Expression. Phenylephrin-Behandlung induziert die Aktivierung der βMyHC-Expression (fötales Gen) in Kardiomyocyten; während ausschließlich Phenylephrin nicht das αMyHC-Gen, die adulte Isoform, aktiviert. Behandlung mit TSA verhindert die Aktivierung von βMyHC, stimuliert aber die Expression von αMyHC. Die Schaubilder stellen drei oder mehr unabhängige Versuche dar.
6. Die Wirkungen der TSA-Behandlung auf die Reorganisation der Sarkomere und Proteinsynthese. Schaubilder der Messungen von S6 Ribosomenprotein in Kardiomyocyten zeigen, dass Phenylephrin und Serum die Proteinsynthese in Kardiomyocyten erhöht. Behandlung der Kardiomyocyten mit TSA ändert nicht diesen Anstieg nach 6 Stunden (linke Schaubilder). Die Schaubilder rechts zeigen den Gehalt von S6 Ribosomenprotein nach 24 Stunden gemeinsamer Behandlung mit PE und steigenden Konzentrationen von TSA oder mit Serum und steigenden Konzentrationen von TSA.
7A–B. TSA induziert die Aktivierung von Genen, die in der Kardiomyocyten-Differenzierung involviert sind. (7A) Drei Gene waren von Phenylephrin aufreguliert und von TSA abreguliert. (7B) Vier Gene waren von Phenylephrin inaktiviert und von TSA aktiviert (Ergebnisse von einem Phenylephrin-Chip, zwei Phenylephrin/TSA-Chips und einem TSA-Chip.)
BESCHREIBUNG VON VERANSCHAULICHENDEN ANWENDUNGSFORMEN
Herzinsuffizienz ist die häufigste Morbiditäts- und Mortalitätsursache in der Welt. Allein in den USA leben schätzungsweise 3 Millionen Menschen gegenwärtig mit Kardiomyopathie und bei weiteren 400.000 wird diese Diagnose jährlich gestellt. Dilatative Kardiomyopathie (DCM), auch als „kongestive Kardiomyopathie" bezeichnet, ist die am weitesten verbreitete Form der Kardiomyopathien und hat eine geschätzte Prävalenz von fast 40 auf 100.000 Individuen (Durand et al., 1995). Obwohl es weitere Ursachen für DCM gibt, ist angegeben worden, dass die familiäre dilatative Kardiomyopathie ungefähr 20% „idiopathischer" DCM darstellt. Ungefähr die Hälfte der DCM-Fälle sind idiopathisch, und der Rest ist mit bekannten Krankheitsprozessen verbunden. Zum Beispiel können ernste Myokardschäden von bestimmten Medikamenten hervorgerufen sein, die in der Krebs-Chemotherapie eingesetzt sind (z.B. Doxorubicin und Daunoribucin). Zusätzlich sind viele DCM-Patienten chronische Alkoholiker. Zum Glück kann für diese Patienten die Progression der Myokardfehlfunktion gestoppt oder umgekehrt werden, wenn der Alkoholkonsum in frühem Verlauf der Krankheit reduziert oder eingestellt wird. Peripartum Kardiomyopathie ist eine weitere idiopathische DCM-Form, da diese Krankheit mit infektiösen Folgeerscheinungen assoziiert ist. Summa sumarum stellen Kardiomyopathien, einschließlich DCM, signifikante Probleme der Volksgesundheit dar.
Da die Kardiomyopathie selbst typischerweise keine Symptome hervorruft, bis die Herzschädigung hinreichend schwer ist, um eine Herzinsuffizienz zu verursachen, sind die Symptome einer Kardiomyopathie die Symptome, die mit einer Herzinsuffizienz verbunden sind. Diese Symptome umfassen Kurzatmigkeit, Müdigkeit bei Anstrengungen, nicht flach liegen zu können, ohne kurzatmig zu werden (Orthopnoe), paroxysmale nächtliche Dyspnoe, vergrößertes Herz und/oder Anschwellen der unteren Extremitäten. Patienten zeigen oftmals einen erhöhten Blutdruck, zusätzliche Herzgeräusche, Herzrasseln, pulmonäre und systemische Emboli, Thoraxschmerzen, pulmonare Kongestion und Palpitationen. Zusätzlich verursacht DCM verminderte Ejektionsfraktionen (d.h. ein Maß sowohl für intrinsische systolische Funktion als auch Remodeling). Die Krankheit ist außerdem durch ventrikuläre Erweiterung und stark beeinträchtigte systolische Funktion aufgrund verminderter Kontraktionsfähigkeit des Myokards gekennzeichnet, was zu einer erweiterten Herzinsuffizienz bei vielen Patienten führt. Angegriffene Herzen durchlaufen ein Zell/Kammer-Remodeling als Folge der Myocyten/Myokardfehlfunktion, die zu einem „DCM-Phänotyp" beiträgt. Wenn diese Krankheit voranschreitet, schreiten die Symptome genauso voran. Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie haben ebenfalls eine stark erhöhte Inzidenz für lebensbedrohende Arrhythmien, einschließlich ventrikulärer Tachykardie und Kammerflimmern. In diesen Patienten wird eine Ohnmacht (Schwindel) als ein Vorbote eines plötzlichen Todes angesehen.
Die Diagnose der dilatativen Kardiomyopathie hängt typischerweise vom Nachweis vergrößerter Herzkammern, insbesondere vergrößerter Ventrikel, ab. Die Vergrößerung ist normalerweise beim Röntgen des Thorax zu erkennen, aber noch genauer unter Zuhilfenahme von Ultraschall-Echokardiographie einzuschätzen. DCM ist von einer akuten Myokarditis, Herzklappenerkrankung, Erkrankung der Koranararterien und hypertensiven Herzerkrankung häufig schwierig zu unterscheiden. Sobald die Diagnose einer dilatativen Kardiomyopathie gestellt ist, werden alle Anstrengungen darauf konzentriert, die potenziell reversiblen Ursachen zu identifizieren und zu behandeln, und eine weitere Herzschädigung zu verhindern. Zum Beispiel müssen Koronararterien- und Herzklappenerkrankung ausgeschlossen sein. Anämie, anormale Tachykardien, Mangelernährung, Alkoholismus, Schilddrüsenerkrankungen und/oder weitere Probleme müssen untersucht und kontrolliert werden.
Während der Versuche, die zugrundeliegende Ursache der Kardiomyopathie zu identifizieren und zu stabilisieren, wird die Behandlung im Allgemeinen begonnen, um die Symptome zu minimieren und die Leistung des insuffizienten Herzens zu optimieren. Medikamentation bleibt der wichtigste Pfeiler der Behandlung, obwohl es keine spezifische Behandlungen für dilatative Kardiomyopathie gibt, sondern nur Behandlungen, die allgemein bei der Herzinsuffizienz angewandt werden. Transplantation ist eine Option. In der Tat ist in den USA die dilatative Kardiomyopathie als der häufigste Grund für Herztransplantationen angegeben worden.
Nichtpharmakologische Behandlung dient hauptsächlich als ein Zusatz zur pharmakologischen Behandlung. Ein Mittel einer nichtpharmakologischen Behandlung schließt die Reduktion von Natrium in der Nahrung ein. Zusätzlich erfordert die nichtpharmakologische Behandlung den Ausschluss präzipitierender Wirkstoffe, einschließlich negativ inotroper Agentien (z.B. bestimmte Calciumkanal-Blocker und Antiarrhythmika wie Disopyramid), Kardiotoxine (z.B. Amphetamine) und Plasmavolumenexpandierer (z.B. nichtsteroide Entzündungshemmer und Glucocorticoide).
Behandlung mit pharmakologischen Mitteln stellt den Hauptmechanismus für eine Verminderung oder Beseitigung der Manifestationen der Herzinsuffizienz dar. Diuretika bilden die erste Behandlungslinie bei einer geringen bis mäßigen Herzinsuffizienz. Unglücklicherweise zeigen viele weit verbreitete Diuretika (z.B. Thiazide) zahlreiche Nebenwirkungen. Zum Beispiel können bestimmte Diuretika Serum-Cholesterol und Triglyceride erhöhen. Darüber hinaus sind Diuretika allgemein für Patienten unwirksam, die an einer schweren Herzinsuffizienz leiden.
Falls Diuretika unwirksam sind, können Vasodilatantien verwendet werden; die Angiotensin konvertierenden (ACE) Inhibitoren (z.B. Enalopril und Lisinopril) liefern nicht nur symptomatische Erleichterung, von ihnen ist ebenfalls berichtet worden, dass sie die Mortalität senken (Young et al., 1989). Wiederum sind allerdings die ACE-Inhibitoren mit nachteiligen Wirkungen verbunden, was dazu führt, dass sie bei Patienten mit bestimmten Krankheitsstadien (z.B. renale Arterienstenose) kontraindiziert sind.
Ähnlicherweise kann eine Therapie mit inotropen Agentien (d.h. ein Wirkstoff, der den Herzauswurf durch Erhöhung der Kraft der Herzmuskelkontraktion) ebenfalls angezeigt sein, falls Diuretika nicht zu einer adäquaten Erleichterung führen. Das von ambulanten Patienten am häufigsten genutzte inotrope Agens ist Digitalis. Allerdings ist es mit einem Spektrum an nachteiligen Reaktionen verbunden, einschließlich gastrointestinalen Problemen und Funktionsstörungen des Zentralnervensystems.
Folglich haben die gegenwärtig eingesetzten pharmakologischen Agentien schwere Mängel in bestimmten Patientenpopulationen. Die Verfügbarkeit neuer, sicherer und wirksamer Agentien wäre zweifellos von Vorteil für Patienten, die entweder zurzeit verfügbare pharmakologische Heilmittel nicht nutzen können oder die keine adäquate Erleichterung durch diese Heilmittel erfahren. Die Prognose für Patienten mit DCM ist variabel und hängt vom Ausmaß der ventrikulären Funktionsstörung ab, wobei die meisten Todesfälle innerhalb von fünf Jahren nach Diagnose vorkommen.
I. Die vorliegende Erfindung
Die Erfinder haben bereits gezeigt, dass MEF2 durch MAP-Kinase-Phosphorylierung von drei konservierten Stellen in ihrer Carboxy-terminalen Aktivierungsdomäne aktiviert wird (siehe Katoh et al., 1998). CaMK-Signalgebung aktiviert ebenfalls MEF2 durch Phosphorylierung der Klasse II HDACs, die auf hohen Niveaus im erwachsenen Herzen exprimiert sind, wo sie MEF2-Aktivität reprimieren können. Nach Phosphorylierung binden diese HDACs an 14-3-3 und dissoziieren von MEF2 ab, was zur Translokation zum Nukleus und Aktivierung der MEF2-abhängigen Transkription führt. Mutanten von Klasse II HDACs, die nicht phosphoryliert werden können, können sich nicht von MEF2 lösen und blockieren irreversibel die Expression von MEF2 Zielgenen.
WO 01/14581 legt offen, dass HDAC-Enzyme eine wichtige inhibitorische Rolle bei der Herzhypertrophie spielen. Ansteigende HDAC-Enzymaktivität ist als heilend für die Herzhypertrophie beschrieben.
Es ist ebenfalls gezeigt worden, dass ein Adenovirus, das eine nicht phosphorylierbare HDAC 5 Mutante codiert, in der Lage ist, Kardiomyocytenhypertrophie als Reaktion auf verschiedene signalgebende Wege in vitro zu verhindern (siehe Lu et al., 2000). Diese Feststellungen lassen vermuten, dass die Phosphorylierung dieser konservierten Stellen in Klasse II HDACs ein essenzieller Schritt für die Auslösung der Herzhypertrophie ist. Basierend auf dieser Feststellung könnte man erwarten, dass eine Hemmung der HDAC-Aktivität durch TSA zur Auslösung einer Herzhypertrophie wegen der Derepression von hypertrophen Antwortgenen führen würde. Ganz im Gegenteil stellten die Erfinder stattdessen fest, dass TSA tatsächlich die Herzhypertrophie verhindert. Diese unerwarteten Feststellungen lassen vermuten, dass wenigstens einige HDACs für eine Hypertrophie erforderlich sind und dass eine Hemmung der HDAC katalytischen Aktivität die Aktivierung hypertropher Gene verhindern kann.
Wie können diese offensichtlich widersprechenden Ergebnisse erklärt werden? Ein Modell postuliert, dass Klasse I und II HDACs verschiedene Gensätze in Kardiomyocyten steuern. Gemäß diesem Modell interagieren Klasse II HDACs mit der Aktivität von Transkriptionsfaktoren wie MEF2, die für die Hypertrophie erforderlich sind, und reprimieren diese Aktivität, was erklären würde, warum nicht phosphorylierbare Mutanten der Klasse II HDACs die Hypertrophie blockieren. Im Gegensatz dazu wird vorgeschlagen, dass Klasse I HDACs, HDAC 1 und HDAC 3 insbesondere die Expression von anti-hypertrophen Genen supprimieren. Folglich würde eine TSA-Exposition von Kardiomyocyten zu einer Derepression dieser anti-hypertrophen Gene und zu einer Blockierung der Hypertrophie führen. Dieses Modell sagt ebenfalls voraus, dass die Aktivität derartiger anti-hypertropher Gene über die Aktivität der Klasse II HDACs dominieren würde, da sie von TSA zu sehr reprimiert sind, was erwartet werden würde, um das hypertrophe Programm zu dereprimieren.
Auf jeden Fall und ungeachtet der genauen molekularen Grundlage zeigt die vorliegende Erfindung, dass überraschenderweise HDAC-Inhibitoren bei der Behandlung der Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz von Vorteil sind.
II. Histondeacetylase
Nukleosomen, das Primärgerüst der Chromatin-Faltung, sind dynamische makromolekulare Strukturen, die Chromatinlösungskonformationen beeinflussen (Workman und Kingston, 1998). Der Nukleosomen-Kern besteht aus Histon-Proteinen H2A, HB, H3 und H4. Histonacetylierung bewirkt, dass Nukleosomen und nukleosomale Anordnungen veränderte biophysikalische Eigenschaften annehmen. Das Gleichgewicht zwischen Aktivitäten von Histonacetyltransferasen (HAT) und -deacetylasen (HDAC) bestimmt das Ausmaß der Histonacetylierung. Acetylierte Histone verursachen eine Chromatin-Relaxation und Aktivierung der Gentranskription, wohingegen deacetyliertes Chromatin im Allgemeinen transkriptionell inaktiv ist.
Elf verschiedene HDACs sind von Vertebraten kloniert worden. Die ersten drei identifizierten humane HDACs waren HDAC 1, HDAC 2 und HDAC 3 (als Klasse I humane HDACs bezeichnet) und HDAC 8 (Van den Wyngaert et al., 2000) ist zu dieser Reihe hinzugefügt worden. Vor kurzem sind Klasse II humane HDACs, HDAC 4, HDAC 5, HDAC 6, HDAC 7, HDAC 9 und HDAC 10 (Kao et al., 2000) kloniert und identifiziert worden (Grozinger et al., 1999; Zhou et al., 2001; Tong et al., 2002). Zusätzlich ist HDAC 11 identifiziert, aber bis jetzt weder als Klasse I oder Klasse klassifiziert worden (Gao et al., 2002). Alle zeigen eine Homologie in der katalytischen Region. HDACs 4, 5, 7, 9 und 10 haben allerdings eine einzigartige Amino-terminale Erweiterung, die bei anderen HDACs nicht festzustellen ist. Diese Amino-terminale Region enthält die MEF2-bindende Domäne. Von den HDACs 4, 5 und 7 ist gezeigt worden, dass sie in der Regulation der kardialen Genexpression involviert sind und in besonderen Anwendungsformen die MEF2-Transkriptionsaktivität reprimieren. Der genaue Mechanismus, mit dem Klasse II HDACs die MEF2-Aktivität reprimieren, ist nicht vollständig verstanden. Eine Möglichkeit ist, dass eine HDAC-Bindung an MEF2 die MEF2-Transkriptionsaktivität hemmt, entweder kompetitiv oder durch Destabilisierung der nativen transkriptionell aktiven MEF2-Konformation. Es ist ebenfalls möglich, dass Klasse II HDACs eine Dimerisierung mit MEF2 erfordern, um HDAC in unmittelbarer Nähe zu Histonen für eine zu erfolgende Deacetylierung zu lokalisieren oder zu positionieren.
III. Deacetylaseinhibitoren
Es sind eine Reihe an Inhibitoren für die Histondeacetylase identifiziert worden. Die vorgeschlagenen Verwendungen sind vielfältig, konzentrieren sich aber primär auf die Krebstherapie. Saunders et al. (1999); Jung et al. (1997); Jung et al. (1999); Vigushin et al. (1999); Kim et al. (1999); Kitazomo et al. (2001); Vigushin et al. (2001); Hoffmann et al. (2001); Kramer et al. (2001); Massa et al. (2001); Komatsu et al. (2001); Han et al. (2001). Eine derartige Therapie ist Gegenstand eines NIH unterstützten Phase I klinischen Versuchs für feste Tumoren und Non-Hodgkin-Lymphom. HDACs steigern die Transkription von Transgenen und bilden folglich einen möglichen Zusatz zu einer Gentherapie. Yamano et al. (2000); Su et al. (2000).
HDACs können durch eine Reihe verschiedener Mechanismen – Proteine, Peptide und Nukleinsäure (einschließlich antisense und RNAi-Moleküle) inhibiert werden. Verfahren für die Klonierung, den Transfer und die Expression genetischer Konstrukte, die virale und nicht-virale Vektoren und Liposomen umfassen, sind dem Fachmann gut bekannt. Virale Vektoren umfassen Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Retrovirus, Vacciniavirus und Herpesvirus.
Auch kleine Molekül-Inhibitoren können in Betracht gezogen werden. Etwa der weit bekannte kleine Molekül-Inhibitor der HDAC-Funktion ist Trichostatin A, eine Hydroxaminsäure. Es ist gezeigt worden, dass es eine Hyperacetylierung induziert und eine Reversion von ras transformierten Zellen zu einer normalen Morphologie auslöst (Taunton et al., 1996) und in einem Maus-Modell eine Immunsuppression induziert (Takahashi et al., 1996). Es ist von BIOMOL Research Labs, Inc., Plymouth Meeting, PA, kommerziell erhältlich.
Die nachfolgenden Referenzen beschreiben alle HDAC-Inhibitoren, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können: AU 9.013.101; AU 9.013.201; AU 9.013.401; AU 6.794.700; EP 1.233.958 ; EP 1.208.086 ; EP 1.174.438 ; EP 1.173.562 ; EP 1.170.008 ; EP 1.123.111 ; JP 2001/348340; U.S. 2002/103192; U.S. 2002/65282; U.S. 2002/61860; WO 02/51842; WO 02/50285; WO 02/46144; WO 02/46129; WO 02/30879; WO 02/26703; WO 02/26696; WO 01/70675; WO 01/42437; WO 01/38322; WO 01/18045; WO 01/14581; Furumai et al. (2002); Hinnebusch et al. (2002); Mai et al. (2002), Vigushin et al. (2002); Gottlicher et al. (2001); Jung (2001); Komatsu et al. (2001); Su et al. (2000).
Beispiele einiger spezifischer HDAC-Inhibitoren sind in Tabelle 1 gezeigt.
IV. Verfahren zur Behandlung von Herzhypertrophie
A. Therapeutische Wirkstoffe
In einer Anwendungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von HDAC-Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung der Herzhypertrophie bereitgestellt. Für Zwecke der vorliegenden Anmeldung umfasst die Behandlung die Verminderung eines oder mehrerer Symptome der Herzhypertrophie wie verminderte Übungskapazität, vermindertes Blutauswurfsvolumen, erhöhten links-ventrikulären End-diastolischen Druck, erhöhten Lungenkapillar-Keildruck, vermindertes Herzauswurfsvolumen, Herzindex, erhöhte Lungenarteriendrücke, erhöhte links-ventrikuläre End-systolische und diastolische Ausdehnungen, erhöhte links-ventrikuläre Wandbeanspruchung, Wandspannung und Wanddicke wie auch für den rechten Ventrikel. Zusätzlich kann die Verwendung von HDAC-Inhibitoren Herzhypertrophie und die Ausbildung ihrer assoziierten Symptome verhindern.
Das Dosierungsschema der Behandlung variiert in Abhängigkeit der klinischen Situation. Allerdings würde eine lang andauernde Aufrechterhaltung unter den meisten Umständen geeignet erscheinen. Es kann ebenfalls die Behandlung der Hypertrophie mit HDAC-Inhibitoren mit Unterbrechungen erwünscht sein, wie innerhalb eines engen Fensters während der Progression der Krankheit. Gegenwärtig weisen Untersuchungen darauf hin, dass die optimale Dosierung für einen HDAC-Inhibitor die Maximaldosis ist, bevor eine signifikante Toxizität auftritt.
B. Kombinationstherapie
In einer anderen Anwendungsform ist daran gedacht, HDAC-Inhibitoren in Kombination mit anderen therapeutischen Heilmitteln zu verwenden. Zusätzlich zu oben beschriebenen Therapien kann man folglich den Patienten mit mehreren pharmazeutischen Herzstandardtherapien behandeln. Beispiele für Standardtherapien umfassen, ohne Einschränkung, sogenannte „beta-Blocker", Bluthochdruckmittel, Cardiotonika, Antithrombotika, Vasodilatanzien, Hormonantagonisten, Inotrope, Diuretika, Endothelinantagonisten, Calciumkanal-Blocker, Phosphodiesterase-Inhibitoren, ACE-Inhibitoren, Angiotensin Typ 2 Antagonisten und Zytokin-Blocker/Inhibitoren.
Kombinationen können durch Inkontaktbringen von Herzzellen mit einer einzigen Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierung, die beide Agentien enthält, oder durch Inkontaktbringen der Zelle mit zwei verschiedenen Zusammensetzungen oder Formulierungen zum selben Zeitpunkt erhalten sein, wobei eine Zusammensetzung das Expressionskonstrukt enthält und die andere das Agens enthält. Alternativ kann die HDAC-Inhibitor-Therapie vor oder nach der Verabreichung des anderen Agens in Zeitabständen erfolgen, die zwischen Minuten bis zu Wochen betragen. In Anwendungsformen, wo das andere Agens und das Expressionskonstrukt der Zelle getrennt appliziert sind, würde man sich im Allgemeinen vergewissern, dass kein signifikanter Zeitraum zwischen den Zeitpunkten der jeweiligen Applikation liegt, so dass das Agens und das Expressionskonstrukt noch in der Lage sind, eine vorteilhafte kombinierte Wirkung auf die Zelle auszuüben. In derartigen Fällen ist zu bedenken, dass man typischerweise die Zelle mit beiden Heilmitteln innerhalb jeweils etwa 12–24 Stunden und bevorzugter innerhalb jeweils etwa 6–12 Stunden in Kontakt bringt, wobei eine Verzögerungszeit von nur etwa 12 am bevorzugtesten ist. In manchen Situationen kann es erwünscht sein, die Behandlungsdauer signifikant zu verlängern, wo allerdings einige Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis zu einigen Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) zwischen den jeweiligen Verabreichungen verstreichen.
Es ist ebenfalls denkbar, dass mehr als eine Verabreichung entweder eines HDAC-Inhibitors oder des anderen Agens erwünscht ist. In dieser Hinsicht können verschiedene Kombinationen angewandt sein. Als Beispiel zur Erläuterung sind die folgenden Permutationen angegeben, die auf 3 und 4 Gesamtverabreichungen basieren, wobei der HDAC-Inhibitor „A" ist und das andere Mittel „B" ist:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
Weitere Kombinationen können ebenso in Betracht gezogen sein.
C. Wirkstoff-Formulierung und Verabreichungsrouten bei Patienten
Wo klinische Anwendungen erwogen sind, werden pharmazeutische Zusammensetzungen in einer geeigneten Form für die beabsichtigte Anwendung zubereitet. Im Allgemeinen erfordert dies eine Zubereitung von Zusammensetzungen, die im Wesentlichen frei von Pyrogenen wie auch anderen Verunreinigungen sind, die für Mensch oder Tier schädlich sein könnten.
Im Allgemeinen ist die Verwendung von geeigneten Salzen und Puffern erwünscht, um die Übertragungsvektoren stabil zu machen und deren Aufnahme von den Zielzellen zu erlauben. Puffer werden ebenfalls verwendet, wenn rekombinante Zellen in einen Patienten eingeführt werden. Wässrige Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine wirksame Menge des Vektors oder an Zellen, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder wässrigen Medium gelöst oder dispergiert. Der Ausdruck „pharmazeutisch oder pharmakologisch verträglich" bezieht sich auf molekulare Gebilde und Zusammensetzungen, die keine nachteiligen, allergischen oder andere ungünstige Reaktionen auslösen, wenn sie einem Menschen oder Tier verabreicht sind. Wie hier verwendet, umfasst „pharmazeutisch verträglicher Träger" Lösemittel, Puffer, Lösungen, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle oder fungizide Agentien, isotonische und die Absorption verzögernde Agentien und ähnliches, deren Verwendung für die Formulierung von Pharmazeutika verträglich ist, wie Pharmazeutika, die für eine Verabreichung an Menschen geeignet sind. Die Verwendung derartiger Medien und Agentien für pharmazeutisch aktive Stoffe ist in der Technik gut bekannt. Außer sofern beliebige herkömmliche Medien oder Agentien mit den Wirkstoffen der vorliegenden Verbindung nicht verträglich sind, wird ihre Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen erwogen. Ergänzende Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebaut sein, vorausgesetzt dass sie die Vektoren oder Zellen der Zusammensetzungen nicht inaktivieren.
Die aktiven Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können herkömmliche pharmazeutische Präparate umfassen. Verabreichung dieser Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung kann über eine beliebige gewöhnliche Route erfolgen, so lange das Zielgewebe über diese Route erreichbar ist. Diese umfasst oral, nasal und bukkal. Alternativ kann die Verabreichung durch intradermale, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion erfolgen. Derartige Zusammensetzungen würden normalerweise als pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen, wie oben beschrieben, verabreicht sein.
Die aktiven Verbindungen können ebenfalls parenteral oder intraperitoneal verabreicht sein. Beispielsweise können Lösungen der aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmazeutisch verträgliche Salze in Wasser, geeignet gemischt mit einer oberflächenaktiven Substanz wie Hydroxypropylcellulose, zubereitet sein. Dispersionen können ebenfalls in Glycerol, flüssigen Polyethylenglycolen und Mischungen davon und in Ölen zubereitet sein. Unter üblichen Aufbewahrungs- und Gebrauchsbedingungen enthalten diese Präparate im Allgemeinen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Formen, die für eine injizierbare Verwendung geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für eine unmittelbare Zubereitung injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. Im Allgemeinen sind diese Präparate steril und in dem Maße flüssig, dass sie leicht injizierbar sind. Präparate sollten unter Herstellungs- und Aufbewahrungsbedingungen stabil sein und sollten gegen eine verunreinigende Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze konserviert sein. Geeignete Lösemittel und Dispersionsmedien können zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol und flüssigen Polyethylenglycol und ähnliches), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle enthalten. Die passende Fluidität kann zum Beispiel durch Verwendung einer Beschichtung wie Lecithin, durch Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen aufrechterhalten sein. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann mit verschiedenen antibakteriellen und fungiziden Mitteln zum Beispiel Parabenen, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und ähnlichem erfolgen. In vielen Fällen ist es bevorzugt, dass isotonische Agentien zum Beispiel Zucker oder Natriumchlorid enthalten ist. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung in den Zusammensetzungen von die Absorption verzögernden Mitteln zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine erreicht sein.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Einbau der aktiven Verbindungen in einer geeigneten Menge in einem Lösemittel zusammen mit beliebig weiteren Bestandteilen (zum Beispiel wie oben aufgezählt) wie erwünscht und anschließende Sterilfiltration zubereitet sein. Im Allgemeinen sind Dispersionen durch Einbau der verschiedenen sterilisierten aktiven Verbindungen in einem sterilen Träger zubereitet, der das Dispersionsbasismedium und die erwünschten weiteren Bestandteile, z.B. wie oben aufgezählt, enthält. Im Falle steriler Pulver für die Zubereitung steriler, injizierbarer Lösungen umfassen die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungsverfahren, die ein Pulver aus aktiven Bestandteilen plus beliebigen zusätzlichen erwünschten Bestandteilen von einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon ergeben.
Für eine orale Verabreichung können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen in Arzneimittelträgern eingebaut sein und in Form nicht ingestibler Mundwasser und Zahnputzmittel verwendet sein. Ein Mundwasser kann durch Einbau des Wirkstoffes in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösemittel wie Natriumborat-Lösung (Dobells Lösung) zubereitet sein. Alternativ kann der Wirkstoff in einem antiseptischen Mittel, das Natriumborat, Glycerin und Kaliumbicarbonat enthält, eingebaut sein. Der Wirkstoff kann ebenfalls in Zahnputzmitteln einschließlich Gele, Pasten, Pulver und Aufschlämmungen dispergiert sein. Der Wirkstoff kann in einer therapeutisch wirksamen Menge zu einer Zahnpasta zugefügt sein, die Wasser, Bindemittel, Scheuermittel, Duftstoffe, Schaummittel und Feuchthaltemittel enthält.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können im Allgemeinen in neutraler Form oder Salzform formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen zum Beispiel saure Additionssalze (mit den freien Aminogruppen des Proteins gebildet), die von anorganischen Säuren (z.B. Salzsäure oder Phosphorsäure) oder von organischen Säuren (z.B. Essig-, Oxal., Wein-, Mandelsäure und ähnliche) abstammen. Salze, die mit freien Carboxylgruppen des Proteins gebildet sind, können ebenfalls von anorganischen Basen (z.B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden) oder von organischen Basen (z.B. Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und ähnliche) abstammen.
Nach Formulierung sind die Lösungen bevorzugt in einer mit der Dosierungsformulierung kompatiblen Weise und in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die Formulierungen können einfach in verschiedenen Dosierungsformen wie injizierbare Lösungen, Wirkstoff-freisetzende Kapseln und ähnliches verabreicht sein. Für parenterale Verabreichung in einer wässrigen Lösung ist die Lösung zum Beispiel im Allgemeinen geeignet gepuffert und das flüssige Verdünnungsmittel zuerst zum Beispiel mit Saline oder Glucose hinreichend isotonisch gemacht. Derartige wässrige Lösungen können zum Beispiel für intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Verabreichung verwendet sein. Vorzugsweise sind sterile wässrige Medien eingesetzt, wie es dem Fachmann bekannt ist, besonders im Lichte der vorliegenden Offenlegung. Zum Beispiel kann eine Einzeldosis in 1 ml isotonischer NaCl-Lösung gelöst sein und entweder zu 1000 ml Flüssigkeit für die subkutane Infusion gegeben oder in die vorgesehene Infusionsstelle injiziert werden (siehe zum Beispiel „Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. Auflage, Seiten 1035–1038 und 1570–1580). Einige Änderungen in der Dosierung können in Abhängigkeit des Zustandes der zu behandelnden Person erfolgen. Die für die Verabreichung verantwortliche Person wird in jedem Fall die geeignete Dosis für die Person individuell bestimmen. Darüber hinaus sollten die Präparate für die Verabreichung an Menschen Standards für Sterilität, Pyrogenität, allgemeine Sicherheit und Reinheit, wie von der FDA Behörde für Biologische Standards gefordert, erfüllen.
VI. Definitionen
Wie hier verwendet, ist der Ausdruck „Herzinsuffizienz" weit verbreitet und bedeutet einen beliebigen Zustand, der die Fähigkeit des Herzens reduziert, Blut zu pumpen. Als Folge entwickeln sich Kongestion und Ödeme in den Geweben. Am häufigsten ist die Herzinsuffizienz durch eine verminderte Kontraktionsfähigkeit des Myokards verursacht und führt zu einem reduzierten Koronarblutfluss; allerdings können viele andere Faktoren zu einer Herzinsuffizienz führen, einschließlich Schädigung der Herzklappen, Vitaminmangel und primäre Herzmuskelerkrankungen. Obwohl die genauen physiologischen Mechanismen der Herzinsuffizienz nicht vollständig verstanden sind, wird bei der Herzinsuffizienz vermutet, dass Störungen in mehreren autonomen Eigenschaften des Herzens involviert sind, einschließlich sympathischer, parasympathischer Reaktionen und Barorezeptorreaktionen. Der Ausdruck „Manifestationen von Herzinsuffizienz" ist weit verbreitet und umfasst alle Folgeerscheinungen, die mit der Herzinsuffzienz verbunden sind, wie Kurzatmigkeit, Dellen-Ödem, vergrößerte empfindliche Leber, gestaute Halsvenen, Rasselgeräusche der Lunge und ähnliches, einschließlich Laborbefunde, die mit Herzinsuffizienz verbunden sind.
Der Ausdruck „Behandlung" oder grammatische Entsprechungen umfasst die Verbesserung und/oder Verschwinden der Symptome der Herzinsuffizienz (d.h. die Fähigkeit des Herzens, Blut zu pumpen). „Verbesserung der physiologischen Funktion" des Herzens kann unter Verwendung beliebiger der hier beschriebenen Messungen (z.B. Messung der Ejektionsfraktion, fractional shortening, links-ventrikuläre interne Ausdehnung, Herzfrequenz etc.) wie auch eine beliebige Wirkung auf das Überleben eines Tieres bewertet werden. Bei Verwendung von Tiermodellen wird die Reaktion von behandelten transgenen Tieren und unbehandelten transgenen Tieren unter Zuhilfenahme der hier beschriebenen Tests verglichen (zusätzlich können behandelte und unbehandelte nicht transgene Tiere als Kontrollen einbezogen sein). Eine Verbindung, die eine Verbesserung bei einem beliebigen mit Herzinsuffienz verbundenen Parameter, der in den Durchmusterungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet war, verursacht, kann dadurch als therapeutische Verbindung identifiziert werden.
Der Ausdruck „dilatative Kardiomyopathie" bezieht sich auf eine Art von Herzinsuffizienz, die durch das Vorliegen eines symmetrisch gedehnten linken Ventrikels mit schlechter systolischer Kontraktionsfunktion gekennzeichnet ist und zusätzlich häufig den rechten Ventrikel mit einbezieht.
Der Ausdruck „Verbindung" bezieht sich auf ein beliebiges chemisches Gebilde, Pharmazeutikum, Wirkstoff und ähnliches, der/das zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung, Krankheit oder Störung von Körperfunktionen verwendet sein kann. Verbindungen umfassen sowohl bekannte als auch potenzielle therapeutische Verbindungen. Eine Verbindung kann als therapeutisch mit Hilfe von Durchmusterungsverfahren der vorliegenden Erfindung erkannt werden. Eine „bekannte therapeutische Verbindung" bezieht sich auf eine therapeutische Verbindung, von der gezeigt worden ist (z.B. durch Tierversuche oder frühere Erfahrungen mit Verabreichung an Menschen), dass sie in einer derartigen Behandlung wirksam ist. Mit anderen Worten: eine bekannte therapeutische Verbindung ist nicht auf eine Verbindung beschränkt, die bei der Behandlung von Herzinsuffizienz wirksam ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Agonist" auf Moleküle oder Verbindungen, die die Wirkung einer „nativen" oder „natürlichen" Verbindung nachahmen. Agonisten können zu diesen natürlichen Verbindungen hinsichtlich Konformation, Ladung oder anderer Merkmale homolog sein. Folglich können Agonisten von auf Zelloberflächen exprimierten Rezeptoren erkannt werden. Diese Erkennung kann zu physiologischen und biochemischen Änderungen innerhalb der Zelle führen, so dass die Zelle in Gegenwart eines Agonisten auf dieselbe Weise reagiert, wie wenn die natürliche Verbindung vorhanden wäre. Agonisten können Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate oder beliebig andere Moleküle umfassen, die mit einem Molekül, Rezeptor und/oder Stoffwechselweg von Interesse wechselwirken.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Herzhypertrophie" auf den Prozess, bei dem adulte kardiale Myocyten auf Stress mit hypertrophem Wachstum reagieren. Derartiges Wachstum ist durch eine Größenzunahme der Zelle ohne Zellteilung, Zusammenlagerung zusätzlicher Sarkomere innerhalb der Zelle, um die Kraftentwicklung zu maximieren, und einer Aktivierung eines fötalen Programms der kardialen Gene gekennzeichnet. Herzhypertrophie ist oftmals mit einem erhöhten Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko verbunden und folglich könnten Untersuchungen, die darauf abzielen, den molekularen Mechanismus der Herzhypertrophie zu verstehen, eine bedeutende Auswirkung auf die menschliche Gesundheit haben.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Ausdrücke „Antagonist" und „Inhibitor" auf Moleküle oder Verbindungen, die die Wirkung eines zellulären Faktors hemmen, der an der Herzhypertrophie beteiligt ist. Antagonisten können zu diesen natürlichen Verbindungen hinsichtlich Konformation, Ladung oder weiterer Merkmale homolog oder nicht homolog sein. Folglich können Antagonisten von den gleichen oder anderen Rezeptoren erkannt werden, die von einem Agonisten erkannt werden. Antagonisten können allosterische Effekte haben, die die Wirkung eines Agonisten verhindern. Alternativ können Antagonisten die Funktion des Agonisten verhindern. Im Gegensatz zu Agonisten führen antagonistische Verbindungen nicht zu pathologischen und/oder biochemischen Veränderungen in der Zelle, so dass die Zelle auf das Vorhandensein des Antagonisten auf die selbe Art und Weise reagiert, wie wenn der zelluläre Faktor vorhanden wäre. Antagonisten und Inhibitoren können Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate oder beliebig andere Moleküle umfassen, die mit einem Rezeptor, Molekül und/oder Stoffwechselweg von Interesse wechselwirken.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „modulieren" auf eine Änderung oder Veränderung der biologischen Aktivität. Modulation kann ein Ansteigen oder ein Abfallen der Proteinaktivität, eine Änderung von Bindungsmerkmalen oder irgendeine Änderung der biologischen, funktionellen oder immunologischen Eigenschaften sein, die mit der Aktivität eines Proteins oder einer anderen Struktur von Interesse verbunden sind. Der Ausdruck „Modulator" bezieht sich auf ein beliebiges Molekül oder Verbindung, die/das in der Lage ist, eine wie oben beschriebene biologische Eigenschaft zu ändern oder zu verändern.
Der Ausdruck „β-adrenerger Rezeptorantagonist" bezieht sich auf eine chemische Verbindung oder chemisches Gebilde, die/das in der Lage ist, entweder partiell oder komplett die beta (β) Typ Adrenorezeptoren (d.h. Rezeptoren des adrenergen Systems, die auf Katecholamine, insbesondere Norepinephrin, antworten) zu blockieren. Manche β-adrenerge Rezeptorantagonisten zeigen ein hohes Maß an Spezifität für einen Rezeptor-Subtyp (allgemein (β₁); derartige Antagonisten sind als „β₁-spezifische adrenerge Rezeptorantagonisten" und „β₂-spezifische adrenerge Rezeptorantagonisten" bezeichnet. Der Ausdruck „β-spezifischer adrenerger Rezeptorantagonist" bezieht sich auf chemische Verbindungen, die selektive und nicht selektive Antagonisten sind. Beispiele für „β-adrenerge Rezeptorantagonisten" umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Acebutolol, Atenolol, Butoxamin, Carteolol, Esmolol, Labetolol, Metoprolol, Nadolol, Penbutolol, Propanolol und Timolol. Die Verwendung von Derivaten bekannter β-adrenerger Rezeptorantagonisten ist von den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst. In der Tat ist jede Verbindung, die sich funktionell als ein β-adrenerger Rezeptorantagonist verhält, von den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Ausdrücke „Angiotensin-konvertierender Enzyminhibitor" oder „ACE-Inhibitor" beziehen sich auf eine chemische Verbindung oder chemisches Gebilde, die/das in der Lage ist, entweder partiell oder komplett das an der Konversion des relativ inaktiven Angiotensins I in das aktive Angiotensin II im Rennin-Angiotensin-System zu hemmen. Zusätzlich hemmen gleichzeitig die ACE-Inhibitoren den Abbau von Bradykinin, das die antihypertensive Wirkung der ACE-Inhibitoren signifikant verstärkt. Beispiele für ACE-Inhibitoren umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Benazepril, Captopril, Enalopril, Fosinopril, Lisinopril, Quiapril und Ramipril. Die Verwendung von Derivaten bekannter ACE-Inhibitoren ist von den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst. In der Tat ist jede Verbindung, die sich funktionell als ein ACE-Inhibitor verhält, von den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Genotypen" auf die tatsächliche genetische Ausstattung eines Organismus, während „Phänotyp" sich auf die physischen Eigenschaften bezieht, die von einem Individuum gezeigt sind. Zusätzlich ist der „Phänotyp" das Ergebnis einer selektiven Expression des Genoms (d.h. es ist eine Expression der Zellgeschichte und eine Reaktion auf die extrazelluläre Umgebung). In der Tat enthält das menschliche Genom schätzungsweise 30.000–35.000 Gene. In jedem Zelltyp ist nur ein kleiner Teil (d.h. 10–15%) dieser Gene exprimiert.
VII. Beispiele
Die folgenden Beispiele sind enthalten, um verschiedene Aspekte der Erfindung näher zu erläutern. Es sollte der Fachmann anerkennen, dass die in den Beispielen offen gelegten Techniken, die dargestellten Techniken und/oder vom Erfinder entdeckten Zusammensetzungen folgen, in der praktischen Umsetzung der Erfindung funktionieren und folglich als bevorzugte Anwendungsformen für die praktische Anwendung betrachtet werden können.
BEISPIEL 1
MATERIAL UND METHODEN
Zellkultur. Ventrikuläre Myocyten von ein Tag alten Ratten wurden mit geringer Dichte in MEM mit 5% Kälberserum ausplattiert und in Serum freiem MEM untersucht. Kulturen wurden mit PE (#P6126, Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO), IL-1 (#501-RL, R&D Systems, Minneapolis, MN), TSA (#GR-309, BIOMOL Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA) oder ihren Trägern (Ascorbinsäure für PE; bovines Serumalbumin für IL-1; Dimethylsulfoxid für TSA) behandelt.
Detektion acetylierter Lysin-Reste. Gesamtzellextrakt wurde einer Western-Blot Analyse unter Verwendung von Antikörpern von Cell Signaling Technology (Beverly, MA) (acetyliertes Lysin-Antikörper: #9441, acetyliertes Histon H3 Antikörper an Lysin 9: #9671, acetyliertes Histon H3 Antikörper an Lysin 23: #9674, Histon H3 Antikörper: #9712) unterzogen. Nukleäre Lokalisierung von acetyliertem Histon H3 wurde mittels Immunfärbung unter Verwendung der gleichen Antikörper geprüft.
Quantifizierung der Myocyten-Hypertrophie und Myocyten-spezifischen mRNA-Expression. Das Wachstum kultivierter Myocyten wurde mit Hilfe des Gehalts an radiomarkiertem Protein nach kontinuierlicher Inkubation mit ¹⁴C-Phenylalanin quantitativ bestimmt. Für eine Bewertung des Myocyten-Genprogramms wurde Gesamt-RNA aus den Zellen mit TRIZol (GIBCO, Carlsbad, California) extrahiert und in einem RNase Schutzassay mit Sonden auf SERCA, α-/β-MyHC, ANP, BNP und kardialem α-Actin eingesetzt. Alle Proben enthielten ebenfalls Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH) als interne Kontrolle für eine RNA-Ladung.
Transfektion. Myocyten wurden unter Verwendung von Calciumphosphat-Co-Präzipitation mit Cytomegalovirus-Promotor gesteuerten Flag-markierten Expressionsvektoren für HDACs 1, 4, 5 und Reporter-Plasmiden transfiziert, die die Ratten-Promotoren für SERCA (3500 bp), αMyHC (2900 bp) oder βMyHC (3300 bp) steuernde Expression 7 des Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) Gens tragen. Reporter-Expression wurde nach 48 Stunden bewertet, wie es bereits bei der Korrektur für die Transfektionseffizienz mit SEAP (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) beschrieben ist. Überexpression von HDACs wurde mittels Western-Blot Analysen unter Verwendung von anti-Flag M2 Antikörper (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO) bestätigt.
ERGEBNISSE
TSA führt zu vermehrter Proteinacetylierung in kardialen Myocyten. Erste Versuche konzentrierten sich darauf zu bestätigen, dass TSA in der Lage war, HDAC-Aktivität in Herzmyocyten zu hemmen, um daraus zu folgern, dass dieses zu einer Gesamtzunahme der Proteinacetylierung führen sollte. Das Ausmaß der Acetylierung wurde unter Verwendung von Antikörpern, die für acetylierte Lysin-Reste spezifisch sind, bestimmt. Die Erfinder zeigten sowohl mit Western-Blot als auch mit Zellimmunfluoreszenz-Analysen, dass eine 24 ständige TSA-Exposition zu einer Zunahme von acetylierten Lysin-Resten in zahlreichen Proteinen und besonders in Proteinen von Histon H3 effektiv führte.
TSA verstärkt Agonist-induziertes Wachstum, hebt aber die mit der Hypertrophie verbundene Genrepression auf. Obwohl TSA selbst keinen Effekt auf das Myocytenwachstum besitzt, stellten die Erfinder fest, dass es die einzelnen hypertrophen Reaktionen sowohl auf PE als auch IL-1 verstärkte. Beide hypertrophe Stimuli regelten die SERCA (1A) und αMyHC (1B) Expression herab und die kombinierte Exposition an beide Agonisten führte zu einer weiteren Repression. Im Gegensatz dazu verstärkte TSA die Grundexpression sowohl von SERCA2a als auch αMyHC mRNAs. TSA-Vorbehandlung führte ebenfalls zu einem beträchtlichen Rückgang der Repression der SERCA-Expression durch beide hypertrophe Stimuli. Bemerkenswert ist, dass, obwohl TSA fast zu einem vollständigen Rückgang des PE-Effektes auf die αMHC-Expression führte, dieser Effekt im Falle IL-1 behandelter (oder co-behandelter) Zellen weniger deutlich war. Die Erfinder zeigten früher, dass Co-Behandlung von Herzmyocyten sowohl mit PE als auch IL-1 die normale PE-Induktion der αMyHC-Expression zu fast 50% supprimierte. Es ist interessant, dass, obwohl TSA keine Effekte weder auf die Grundexpression noch auf die PE-Induktion dieses Gens hatte, es die αMyHC-Expression in Gegenwart von allein IL-1 erhöhte und den IL-1 Effekt in PE/IL-1 co-behandelten Zellen aufhob. Eine ähnliche Umkehrung war ebenfalls beim sACT-Gen zu beobachten (Wang und Long, nichtveröffentlicht). Bemerkenswert ist, dass TSA die Genexpression von kardialem α-Actin, ANP oder BNP unter beliebigen hypertrophen Behandlungsbedingungen nicht beeinflusste (Daten nicht gezeigt).
Überexpression von HDAC reprimierte Promotor-Aktivitäten von Myocyten-spezifischen Genen. Übereinstimmend mit Untersuchungen der mRNA-Expression für diese Zielgene erhöhte TSA ebenfalls die basalen Promotoraktivitäten sowohl von SERCA2 (2A) als auch αMyHC (2B) Genen, aber nicht die von βMyHC (2C). Außerdem verminderte eine Co-Transfektion dieser Konstrukte mit Expressionsvektoren für HDACs 1 oder 4 ebenfalls die Promotoraktivitäten sowohl für SERCA (2A) als auch αMyHC (2D) Gene. Im Gegensatz dazu hemmte HDAC 5 die Promotoraktivität keines der Gene, trotz ähnlicher Expressionslevels wie bei den anderen Isoformen (Daten nicht gezeigt). Bemerkenswert ist, dass alle drei HDAC-Konstrukte in der Lage waren, das PE-induzierte Ansteigen der αMyHC-Promotoraktivität abzuschwächen (2D).
BEISPIEL 2
MATERIAL UND METHODEN
Kardiomyocyten-Isolierung. Herzen wurden von 15 Tage zeitgleich trächtigen weiblichen Sprague-Dawley Ratten (Harlan, Houston, TX) geerntet. Nach der Zerkleinerung in Phosphatgepufferter Saline wurden die Kardiomoycyten durch aufeinanderfolgende Verdauungsfraktionen in 0,1% (w/v) Pancreatirilösung (Sigma, St. Louis, MO) isoliert. Die Fraktionen wurden gesammelt; in Ausplattierungsmedium resuspendiert, vereint; und dann für 2 Stunden ausplattiert, um die Fibroblasten von der Kardiomyocyten-Population zu trennen. Suspendierte Zellen wurden wieder gesammelt und in Platten mit 6 Vertiefungen mit 1 × 10⁶ Zellen/Vertiefung für die Transfektions- und Immunfluoreszensexperimente ausplattiert, und mit 2 × 10⁶ Zellen in 10 cm Petrischalen zur RNA Analyse ausplattiert.
Transkriptionsanalyse. Vierundzwanzig Stunden nach Ausplattierung wurden die Zellen mit insgesamt 1 μg/ml 5 h mit Hilfe von Lipofectamin Plus Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA) transfiziert. Transfizierte Zellen wurden 24 h inkubiert und dann für zusätzliche 24 h behandelt. Die Zellen wurden lysiert und die Lysate mit dem Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) auf Lumineszenz mit Hilfe eines Lucysoft 2 Luminometers (Rosys Anthos, New Castle, DE) untersucht.
Chemilumineszenz. Neonatale Kardiomyocyten wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät und 72 h behandelt. Die Zellen wurden zweimal in 1 × PBS gewaschen, in 4% Paraformaldehyd/1 × PBS fixiert und mit 0,1% Triton X-100 permeabilisiert. Nach der Blockierung wurden die Zellen 1 h mit 10 μg/ml monoklonalem anti-ANF Antikörper (Biodesign) inkubiert. Die Vertiefungen wurden zweimal mit 1% BSA/1 × PBS gewaschen und dann 1 h mit Ziege anti-Maus IgG-Fc-HRP (Jackson Labs, am Ort) 1:1000 verdünnt in 1 × PBS/1% BSA inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit 1% BSA/1 × PBS, zweimal mit 1 × PBS gewaschen und dann trocken getupft. Luminol (Pierce, Rockford, IL) wurde zugefügt und die Chemilumineszenz wurde mit einem Fusion Plate Reader (Perkin Elmer/Packard) detektiert.
Dot Blot Analyse. Gesamt-RNA wurde aus Kardiomyocyten isoliert, die entweder unbehandelt, mit Phenylephrin behandelt, mit TSA behandelt oder sowohl mit Phenylephrin als auch mit TSA behandelt waren. Ein Mikrogramm RNA wurde auf Nitrocellulose (Bio-Rad, Hercules, CA) geblottet und bei 50°C 14 h mit endmarkierten Oligonukleotiden hybridisiert. (ANF, 5'-aatgtgaccaagctgcgtgacacaccacaagggcttaggatcttttgcgatctgctcaag-3', SEQ ID NR 1; αSK Actin 5'-tggagcaaaacagaatggctggctttaatgcttcaagttttccatttccacaggg-3', SEQ ID NR 2; αMyHC 5'-cgaacgtttatgtttattgtggattggccacagcgagggtctgctggagagg-3', SEQ ID NR 3; βMyHC 5'-gctttattctgcttccacctaaagggctgttgcaa ggctccaggtctgagggcttc-3', SEQ ID NR 4: GAPDH 5'-ggaacatgtagaccatgtag ttgaggtcaatgaag-3' SEQ ID NR 5). Die Blots wurden zweimal in 2 × SSC/0,5% SDS Lösung gewaschen und einem Röntgen-Film (Kodak, Rochester, NY) oder Phosphoimager (Amersham Bioscience, Sunnyvale, CA) exponiert. Die Hybridisierungsintensität der Sonden wurde mit Hilfe eines ImageQuant^© (Amersham Bioscience, Sunnyvale, CA) gemessen.
Immunfärbung. Deckgläschen wurden mit Laminin (Invitrogen, Carlsbad, CA) durch Lösen von Laminin in 1 × PBS (40 μg/ml), Eintauchen der Deckgläschen in die Lösung und Trocknen an der Luft beschichtet. Zellen wurden 24 h behandelt, gewaschen, 10 min. mit 3,7% Formaldehyd fixiert, mit 1 × PBS gewaschen und mit 3% BSA und 0,1% NP-40 (Sigma, St. Louis, MO) haltiger 1 × PBS permeabilisiert. Primäre Antikörper waren 30 min. in 3% BSA und 0,1% NP-40 haltiger 1 × PBS und wurden dann dreimal in 1 × PBS gewaschen. Die zweiten FITC oder TRITC Antikörper (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) wurden (1:200) der gleichen Pufferlösung, wie die ersten Antikörper inkubiert, dann in 1 × PBS gewaschen, bedeckt und anschließend sichtbar gemacht. Die Bilder wurden unter Verwendung einer Digitalkamera (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan) aufgenommen.
Proteinsynthese. Kardiomyocyten wurden mit (0,1 μCi/ml; 172 Ci/mmol sp. Aktivität) ³H-Leucin (ICN Biochemicals, Inc., Irvine, CA) in behandelten RPMI-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) inkubiert. Nach 6 h Inkubation wurden die Zellen zweimal mit 1 × PBS gewaschen, dann in 10% TCA 30 min. auf Eis inkubiert. Hinterher wurden die Zellen zweimal mit 5% TCA, einmal mit Wasser gewaschen und dann in 0,25 NaOH lysiert. Die Lysate wurden in einem Sechstel Volumen Szintillationsflüssigkeit in einem Szintillationszähler (Beckman, Fullerton, CA) gemessen.
S6 Ribosomen-Protokoll. Nach Blockierung wurden die Zellen in 1% BSA/1 × PBS haltigem 50 μg/ml anti-S6 Protein (Cell Signalling, am Ort) 1 h inkubiert. Nach Waschen wurden die Zellen mit IgG-HRP (Jackson Labs, am Ort) in einer 1:400 Verdünnung inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal in 1% BSA/1 × PBS, in 1 × PBS gewaschen und trocken getupft. Luminol (Pierce, Rockford, IL) wurde zugefügt und die Chemilumineszenz wurde in einem Fusion Reader (Perkin-Elmer Packard) detektiert.
Gen-Chip und Analyse. RNA wurde unter Verwendung von Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) aus unbehandelten, Phenylephrin-behandelten, TSA-behandelten und Phenylephin/TSA co-behandelten neonatalen Ratten-Kardiomyocyten isoliert. Die RNAs wurde präpariert und an U32A Chips (Affymetrix, Inc. Santa Clara, CA) gemäß des Affymetrix Protokolls hybridisiert. Mit Hilfe von Micro Array Suite 5.0 (Affymetrix, Inc. Santa Clara, CA) wurde die Hybridisierungsintensität detektiert und die Veränderungen der Genexpression gemessen und analysiert.
ERGEBNISSE
Weil die Histondeacetylasen (HDACs) die Genexpression regulieren, untersuchten die Erfinder, ob HDAC-Inhibition die Expression der mit Herzhypertrophie assoziierten Gene verändern würde. Atrialer natriuretischer Faktor (ANF) ist ein derartiges Gen und seine Expression erhöht sich in Gegenwart von hypertrophen Agonisten. Um zu bestimmen, ob HDAC-Inhibition die ANF-Genaktivierung beeinflusst, wurden Transfektionsexperimente mit dem ANF-Promotor durchgeführt und transfizierte Kardiomyocyten wurden mit Phenylephrin und mehreren HDAC-Inhibitoren behandelt. Behandlung der Kardiomyocyten mit Trichostatin (TSA), Natriumbutyrat (NaBut) oder HC-Toxin (HC) aktivierte nicht den ANF-Promotor. Allerdings blockierten die HDAC-Inhibitoren vollständig die Aktivierung des Promotors durch eine Phenylephrin-Behandlung (3A). Dieser Effekt war spezifisch, weil Kardiomyocyten, die entweder jeweils mit ausschließlich HDAC-Inhibitor oder gemeinsam mit Phenylephrin behandelt waren, die transkriptionelle Aktivität des CMV-Lac Z Reporters erhöhten (3B), was darauf hinweist, dass die Wirkung dieser pharmakologischen Agentien für die Transkriptionskontrolle von ANF spezifisch war und keine allgemeine Transkriptionshemmung war.
Die Erfinder prüften dann, ob ansteigende TSA- und Natriumbutyrat-Dosen für kultivierte Kardiomyocyten cytotoxisch waren. Zur Bestimmung der Zellmortalität wurde die Freisetzung von Adenylat-Kinase aus Kardiomyocyten in das Kulturmedium untersucht. Dieser Test ist eine bekannte Messung für die Integrität der Zellmembran: Membranen werden in absterbenden Zellen durchlässig, was zur Freisetzung von Adenylat-Kinase führt. Ansteigende Dosen von TSA (bis zu 100 nM) und Natriumbutyrat (bis zu 25 nM) ergaben nur einen geringen Anstieg von Adenylat-Kinase im Kulturmedium, was auf ein Ausbleiben eines vermehrten Zelltodes durch TSA und Natriumbutyrat deutet (3C & 3D). In den einzelnen Zeitpunkt-Versuchen wurden 85 nM TSA oder 5 mM Natriumbutyrat eingesetzt, deshalb zeigen diese Ergebnisse, dass die Inaktivierung der ANF-Transkription ein direkter Effekt der HDAC-Inhibition ist und nicht eine indirekte Folge der Cytotoxizität von den HDAC-Inhibitoren ist.
Um zu bestimmen, ob die endogene Genexpression mit den Transfektionsergebnissen übereinstimmte, beobachteten die Erfinder endogene RNA-Levels von ANF aus Kardiomyocyten unter verschiedenen Behandlungsbedingungen. RNA Dot-Blot Analyse von Phenylephrin-behandelten Kardiomyocyten zeigten eine ungefähr dreifache Zunahme der ANF-Expression als Antwort auf Phenylephrin-Behandlung; allerdings verhinderte eine Co-Behandlung von Phenylephrin-behandelten Zellen mit den verschiedenen HDAC-Inhibitoren (TSA, NaBut oder HC-Toxin) die Phenylephrin-induzierte ANF-Antwort (4A) übereinstimmend mit den zuvor erwähnten Transfektionsergebnissen.
Ältere Daten haben gezeigt, dass eine geringe TSA-Dosis die ANF-Expression durch Acetylierung des ANF-Locus durch Inaktivierung des Transkriptionsrepressors NRSE induzieren kann. Um zu untersuchen, ob es einen Dosis-abhängigen Effekt von HDAC-Inhibitoren gibt, prüften die Erfinder die ANF-Expression nach Behandlung primärer Kardiomyocyten mit ansteigenden Konzentrationen von TSA (4B) und Natriumbutyrat (4C) in Abwesenheit oder Anwesenheit von den hypertrophen Stimulantien Serum (FBS), Phenylephrin (PE) oder Endothelin-1 (ET-1). Bei sehr geringen Dosen (0,2 nM) Natriumbutyrat (4C) beobachteten die Erfinder einen fast doppelten Anstieg der ANF-Expression. Einen nur geringfügigen Anstieg gab es mit TSA (4B). Allerdings induzierten die HDAC-Inhibitoren bei allen Konzentrationen keine ANF-Produktion und mit ansteigenden Konzentrationen wirkten sie der Induktion der ANF-Expression entgegen, die normalerweise nach Behandlung der kultivierten Kardiomyocyten mit Wachstumsstimulantien FBS, PE und ET-1 zu beobachten war (4B und 4C). Die Minimalkonzentrationen, die die hypertrophe Reaktion eines jeden Wachstumsstimulans hemmten, waren 40 nM TSA und 5 mM Natriumbutyrat, das die drei- bis vierfache Verringerung von ANF bei Transkription nachahmte, die in Transfektions- und Dot-Blot Experimenten beobachtet war. Diese Dosen lagen weit unterhalb der Toxizitätsschwelle.
Herzhypertrophie ist mit der Wiederprogrammierung fötaler Gene zusätzlich zu ANF verbunden. Die Erfinder wünschten zu bestimmen, ob die anderen Mitglieder der fötalen Genkaskade durch eine TSA-Behandlung zu beeinflussen wären. Quantitative Analyse der Änderung von α-sk-Expression und βMyHC zusätzlich zu ANF zeigte, dass HDAC-Inhibition zu der Suppression weiterer Gene führte, die von dem hypertrophen Stimulans Phenylephrin aktiviert werden (5A und B). Zusätzlich zur Herabregulation der fötalen Myosin-Kettenisoform (βMyHC) induzierte außerdem TSA-Behandlung von kardialen Myocyten die Expression von αMyHC, die adulte Myosin schwere Kettenisoform, die normalerweise in hypertrophen Kardiomyocyten vermindert ist (5B). Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass HDAC-Inhibition die transkriptionelle Wiederprogrammierung der mit der Kardiomyocytenhypertrophie verbundenen Genkaskade supprimiert.
Anfärbung auf ANF-Protein zeigte, dass mit Phenylephrin oder Serum behandelte Kardiomyocyten eine perinukleäre Akkumulation von ANF-Protein verglichen mit nicht stimulierten Zellen induzierten (Daten nicht gezeigt). Den mit TSA behandelten Kardiomyocyten fehlte die Akkumulation von ANF-Protein und die Zugabe von TSA zu Kardiomyocyten, die entweder mit Phenylephrin oder mit Serum behandelt waren, verringerte die ANF-Proteinakkumulation drastisch. Immuncytochemische Färbung auf α-Actin zeigte, dass HDAC-Inhibitoren der Reorganisation des Sarkomers entgegenwirkten, ein weiteres mit der Kardiomyocytenhypertrophie verbundenes Phänomen. Nicht stimulierte Kardiomyocyten behielten eine amorphe Form ohne offensichtliche strukturelle Organisation des Sarkomers (α-Actinin). Die hypertrophen Agonisten Phenylephrin, Serum und ET-1 stimulierten potenziell die Organisation des Sarkomers als Teil einer hoch geordneten Cytoskelettstruktur. Interessanterweise beeinflusste TSA die Morphologie der Kardiomyocyten. Obwohl TSA-behandelte Zellen ihre Größe nicht änderten, neigten sie dazu, ein „sternförmiges" Aussehen anzunehmen, indem schmale Erweiterungen von dem Zentralkörper der Zelle auswuchsen. Allerdings fehlten ihnen die Organisation von Sarkomeren. Der Effekt der TSA-Behandlung war in Gegenwart von Wachstumsstimulantien drastischer, da dies die von Phenylephrin, Serum oder ET-1 normalerweise induzierte hypertrophe Morphologie beeinflusste. Den TSA-behandelten Kardiomyocyten fehlten vollständig organisierte Sarkomere.
Die Erfinder bestimmten dann, ob TSA dem Anstieg der Proteinsynthese entgegenwirkte, die mit der hypertrophen Reaktion normalerweise verbunden ist, unter Zuhilfenahme von Assays auf Veränderungen der Proteinsynthese und Messung der Akkumulation des Proteingehalts der ribosomalen Untereinheit S6. Phenylephrin verstärkte die Proteinsynthese in den Kardiomyocyten um das doppelte nach 6 Stunden Stimulierung; allerdings hatte eine Co-Kultivierung in Phenylephrin mit den HDAC-Inhibitoren TSA und Natriumbutyrat einen geringen Effekt auf die Stimulierung der normalerweise mit Phenylephrin induzierten Proteinsynthese (6). Jedoch 24 Stunden nach Co-Behandlung wirkten HDAC-Inhibitoren der normalerweise von PE oder Serum induzierten Proteinsynthese in Dosis-abhängiger Weise entgegen (6). Dies lässt vermuten, dass die Verhinderung der Organisation des Sarkomers durch die HDAC-Inhibition ein für die Transkriptionsregulation spezifischer Effekt ist.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass TSA-Behandlung von Hefe zu einer Änderung der Genexpression in nur einer Teilmenge an Genen führt. Falls dies für Kardiomyocyten zutrifft, dann ist es möglich, dass eine begrenzte Anzahl an Genen für die Suppression des hypertrophen Phänotyps verantwortlich sind. Um diese Gene zu identifizieren, testeten die Erfinder die Expression von ungefähr achttausend Genen mittels Gen-Chip-Array. Anschließende graphische Analyse dieser Expressionstests zwischen den Genveränderungen in den Phenylephrin- und Phenylephrin/TSA-behandelten Zellen zeigte, dass der Großteil der Gene ein lineares Cluster bildete. Der Großteil der Transkripte blieb relativ unverändert (weniger als eine dreifache Veränderung der Genexpression) zwischen dem Chip, der mit RNA von Phenylephrin-behandelten Zellen hybridisierte, und dem Chip, der mit RNA von Phenylephrin/TSA-behandelten Zellen hybridisierte. Dies lässt vermuten, dass die relative Anzahl von Genen, die für die Suppression von Phenylephrin-induzierten Kardiomyocytenwachstum verantwortlich sind, gering ist.
Von den wenigen Genen, deren Expressionslevels durch Phenylephrin, TSA oder ihrer Kombination verändert wurden, identifizierten die Erfinder sieben Gene, die einen übereinstimmenden Unterschied vom Doppelten oder Mehrfachen zwischen Phenylephrin-Behandlung und der TSA-behandelten Gruppen, Phenylephrin/TSA und TSA, aufwiesen. Drei Gene waren durch Phenylephrin-Behandlung aufreguliert und von TSA herabreguliert: Cytochromoxidase Untereinheit VIII, Maus T-Komplex-Protein und Insulin-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein-3 (7A). Vier Gene, die durch Phenylephrin herabreguliert und durch TSA aufreguliert wurden, waren großes Tau-Mikrotubuli-assoziiertes Protein, Ubiquitin Carboxy-terminale Hydrolase, Thy-1 Zelloberflächen-Glycoprotein und MyHC Klasse I Antigen (7B). Nothern-Analyse bestätigte die Expressionsergebnisse des Gen-Chip-Array (Daten nicht gezeigt).
XI. Referenzen

Aus. Pat. No. 6,794,700.
Aus. Pat. No. 9,013,101.
Aus. Pat. No. 9,013,201.
Aus. Pat. No. 9,013,401.
Butler et al., Cancer Res., 60: 5165–5174, 2000.
Butler et al., Clin. Cancer Res., 7: 962–970, 2001.
Chien et al., Ann. Rev. Physiol., 55, 77–95, 1993.
Coffey et al., Cancer Res., 61: 3591–3594, 2001.
Durand et al., Ann. Med., 27: 311–317, 1995.
Eur. Pat. No. 1,123,111.
Eur. Pat. No, 1,170,008.
Eur. Pat. No. 1,173,562.
Eur. Pat. No. 1,174,438.
Eur. Pat. No. 1,208,086.
Eur. Pat. No. 1,233,958.
Furumai et al., Cancer Res., 62: 4916–21, 2002.
Gao et al., J. Biol. Chem., 277: 25748–55, 2002.
Gottlicher et al., EMBO J., 20: 6969-78, 2001.
Grozinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 4868–4873, 1999.
Han et al., Cancer Research, 60: 6068–6074, 2000.
Hinnebusch et al., J. Nutr., 132: 1012–7, 2002.
Hoffmann et al., Bioconjugate Chem., 12: 51–55, 2001.
Japanese Patent Application No. 2001/348340.
Jones et al., J. Clin. Invest., 98: 1906–1917, 1996.
Jung, Curr. Med. Chem., 8: 1505–11, 2001.
Jung et al., J. Med. Chem., 42: 4669–4679, 1999.
Jung et al., Med. Chem. Lett., 7: 1655–1658, 1997.
Kao et al., Genes Dev., 14: 55–66, 2000.
Katoh et al., J. Biol. Chem., 273: 1511–18, 1998.
Kim et al., Oncogene, 18: 2461–2470, 1999.
Kirazono et al., J. Clinical Endoc. Metabol., 86 (7): 3430–3435, 2001.
Komastsu et al., Cancer Res., 61: 4459–4466, 2001.
Kramer et al., Trends in Endoc. Metabolism, 12)7): 294–300, 2001.
Lu et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97: 4070–4075, 2000.
Mai et al., J. Med. Chem., 45: 1778–1784, 2002.
Marks et al., J. Natl. Cancer Inst., 92 (15): 1210–1216, 2000.
Marks et al., Clin. Cancer Res., 7: 759–760, 2001.
Massa et al., J. Med. Chem., 44: 2069–2072, 2001.
McKinsey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 14400–14405, 2000a.
McKinsey et al., Nature, 408: 106–111, 2000b.
Molkentin et al., Cell, 93: 215–228, 1998.
PCT Application No. WO 84/03564.
PCT Application No. WO 01/14581.
PCT Application No. WO 01/18045.
PCT Application No. WO 01/38322.
PCT Application No. WO 01/42437.
PCT Application No. WO 01/70675.
PCT Application No. WO 02/26696.
PCT Application No. WO 02/26703.
PCT Application No. WO 02/30879.
PCT Application No. WO 02/46129.
PCT Application No. WO 02/46144.
PCT Application No. WO 02/50285.
PCT Application No. WO 02/51842.
Remington's Pharmaceutical Sciences, 15^th ed., pages 1035–1038 and 1570–1580, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980.
Sadoshima and Izumo, Ann. Rev. Physiol., 59: 551–571, 1997.
Saunders et al., Cancer Res., 59: 399–409, 1999.
Su et al., Cancer Res., 60: 3137–3142, 2000.
Takahashi et al., Antibiotics, 49: 453, 1996.
Taunton et al., Science, 272: 371, 1996.
Tong et al., Nucleic Acids Res., 30: 1114–23, 2002.
United States App. 2002/61860.
United States App. 2002/65282.
United States App. 2002/103192.
Van den Wyngaert et al., FEBS Lett., 478: 77–83, 2000.
Vigushin et al., Anticancer Drugs, 13: 1–13, 2002.
Vigushin et al., Cancer Res., 5 (Suppl), 1999.
Vigushin et al., Clinical Cancer Res., 7: 971–976, 2001.
Workman and Kingston, Annu. Rev. Biochem., 67: 545–579, 1998.
Yamano et al., Amer. Soc. Gene Ther., 2000.
Young et al., Handbook of Applied Therapeutics, 7.1–7.12 and 9.1–9.10, 1989.
Zhou et al., Proc. Natl. Acad.. Sci., 98: 10572–10577, 2001.

Claims

Verwendung eines Histondeacetylaseinhibitors für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von pathologischer Hypertrophie des Herzens und Herzinsuffizienz.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Histondeacetylaseinhibitor Trichostatin A, Trapoxin B, MS 275-27, m-Carboxycinnamonsäurebis-hydroxamid, Depudecin, Oxamflatin, Apicidin, Suberoylanilidhydroxaminsäure, Scriptaid, Pyroxamid, 2-Amino-8-oxo-9,10-epoxydecansäure, 3-(4-Aroyl-1H-pyrrol-2-yl)-N-hydroxy-2-propenamid und FR901228 ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament für eine intravenöse Verabreichung formuliert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament für eine orale, transdermale, langzeitwirkende, suppositorische oder sublinguale Verabreichung formuliert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Medikament für die Verabreichung zusammen mit einem zweiten therapeutischen Wirkstoff formuliert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei der zweite therapeutische Wirkstoff ein beta-Blocker, ein Iontrop, ein Diuretikum, ein ACE-I- oder AII-Antagonist und ein Ca⁺⁺-Blocker ist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei der zweite therapeutische Wirkstoff für seine gleichzeitige Verabreichung mit dem Histondeacetylaseinhibitor-Medikament formuliert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei der zweite therapeutische Wirkstoff für seine Verabreichung entweder vor oder nach der Verabreichung des Histondeacetylaseinhibitor-Medikaments formuliert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Behandlung pathologischer Hypertrophie des Herzens die Verbesserung eines oder mehrerer Symptome der Hypertrophie des Herzens umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei ein Symptom oder mehrere Symptome der Hypertrophie des Herzens eine erhöhte Übungskapazität, ein erhöhtes Blutauswurfsvolumen, links-ventrikulärer End-diastolischer Druck, Lungenkapillar-Keildruck, das Herzauswurfsvolumen, der Herzindex, die Lungenarteriendrücke, die links-ventrikulären End-systolischen und diastolischen Ausdehnungen, die links- und rechts-ventrikuläre Wandbeanspruchung, oder die Wandspannung, die Erkrankungs-abhängige Morbidität und Mortalität ist/sind.
Verwendung eines Histondeacetylaseinhibitors für die Herstellung eines Medikaments für die Prävention pathologischer Hypertrophie des Herzens und Herzinsuffizienz.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei der Histondeacetylaseinhibitor Trichostatin A, Trapoxin B, MS 275-27, m-Carboxycinnamonsäurebis-hydroxamid, Depudecin, Oxamflatin, Apicidin, Suberoylanilidhydroxaminsäure, Scriptaid, Pyroxamid, 2-Amino-8-oxo-9,10-epoxydecansäure, 3-(4-Aroyl-1H-pyrrol-2-yl)-N-hydroxy-2-propenamid und FR901228 ist.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei das Medikament für eine intravenöse Verabreichung formuliert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei das Medikament für eine orale, transdermale, langzeitwirkende, suppositorische oder sublinguale Verabreichung formuliert ist.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei das Medikament für seine Verabreichung an einen Patienten formuliert ist, der eine oder mehrere der folgenden Erkrankungen aufweist: einen langjährigen nicht-kontrollierten Bluthochdruck, eine nicht-korrigierte Herzklappenerkrankung, eine chronische Angina und/oder einen kürzlich erfolgten myokardialen Infarkt.