JP2002541762A - Ｍｅｆ２転写因子の阻害による心肥大および心不全の予防方法 - Google Patents

Ｍｅｆ２転写因子の阻害による心肥大および心不全の予防方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、心肥大に関する。より詳細には、本発明は、心肥大に対するカルシウム刺激に関連する分子事象を定義する。より詳細には、本発明は、肥大応答Ｃａ++刺激がＭＥＦ２によって媒介されることを示す。したがって、本発明は、心肥大の治療方法ならびにトランスジェニック動物調整用のトランスジェニック構築物を提供する。心肥大に対して治療活性を有する化合物の検出用の、本発明のトランスジェニック動物の使用法またはそれから単離した細胞をさらに提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、１９９８年１１月１０日に提出された米国仮出願番号６０／１０７
，７７５および１９９８年１１月１２日に提出された米国仮出願番号６０／１０
８，０８３の内容に対して優先権を主張し、特に引用することにより本明細書の
一部をなす。上記の各開示の全文章が、放棄されることなく特に引用することに
より本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】 ［発明の分野］ 本発明は、一般に、分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、心
肥大の中枢メディエータの発見に関する。
【０００３】 ［関連技術の説明］ 心肥大は、実質的に全ての形態の心疾患に対する心臓の適応応答（高血圧、機
械的負荷、心筋梗塞、心不整脈、内分泌障害、および心収縮タンパク質遺伝子の
変異を引き起こす応答が含まれる）である。肥大応答は心拍出量を増大させる最
初の代償性の機構である一方で、持続的な肥大により、拡張型心筋症、心不全、
および突然死を引き起こし得る。アメリカ合衆国では、毎年約５０万人の個体が
心不全と診断され、死亡率は５０％に迫る。
【０００４】 心肥大を引き起こす種々な刺激があるにもかかわらず、細胞サイズおよびタン
パク質合成の増加、肉腫組織の増加、胎児心遺伝子のアップレギュレーション、
ならびにｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃなどの遺伝子の誘導に関する肥大シグナル
に対する心筋細胞のプロトタイプの分子応答が存在する（Ｃｈｉｅｎら、１９９
３、ＳａｄｏｓｈｉｍａおよびＩｚｕｍｏ、１９９７に概説されている）。心肥
大の原因と結果についての論文は多数存在するが、心筋遺伝子の発現を再プログ
ラミングするために細胞膜で開始される肥大シグナルに関連する根本的な分子機
構はあまり理解されていない。これらの機構の解明は、心血管生物学における中
心的な問題であり、心肥大および心不全の予防または治療用の新規のストラテジ
ー設計に重要である。
【０００５】 多数の研究において、心肥大のシグナルとして細胞内Ｃａ++が関連することが
示唆されている。作動している心臓のサンプルに対する筋細胞の拡張または負荷
の増加に応答して細胞内Ｃａ++濃度が増加する（Ｍａｒｂａｎら、１９８７、Ｂ
ｕｓｔａｍａｎｔｅら、１９９１、Ｈｏｎｇｏら、１９９５）。これは、心拍出
量の上昇に伴う生理学的応答を調節するＣａ++の役割と一致する。心筋細胞にお
ける肥大応答を誘導する種々の体液因子（アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）
、フェニレフリン（ＰＥ）、およびエンドセリン−１（ＥＴ−１）を含む）（Ｋ
ａｒｌｉｎｅｒら、１９９０、ＳａｄｏｓｈｉｍａおよびＩｚｕｍｏ、１９９３
ａ、１９９３ｂ、Ｌｅｉｔｅら、１９９４）はまた、細胞内Ｃａ++濃度の上昇能
力を分担する。
【０００６】 肥大刺激により、βミオシン重鎖（ＭＨＣ）などの胎児タンパク質イソ型およ
びα骨格筋アクチンをコードする遺伝子をアップレギュレーションする一方で対
応する成体イソ型であるα−ＭＨＣおよびα心筋アクチンをダウンレギュレーシ
ョンするように成体の心筋の遺伝子発現が再プログラミングされる。ナトリウム
排泄増加因子（ＡＮＦ）およびβ型ナトリウム排泄増加ペプチド（ＢＮＰ）は、
血管拡張およびナトリウム排泄増加による血圧を減少させるナトリウム排泄増加
ペプチドであり、肥大シグナルに応答して心臓が迅速にアップレギュレーション
される（ＫｏｍｕｒｏおよびＹａｚａｋｉ、１９９３に概説）。肥大の間のこれ
ら心臓遺伝子の調和的な制御に関連する機構は知られていないが、いくつかの転
写因子（血清応答因子（ＳＲＦ）、ＴＥＦ−１、ＡＰ−１、およびＳｐ１を含む
）に対する結合部位は肥大に応答する胎児心臓遺伝子を活性化するのにに重要で
ある（ＳａｄｏｓｈｉｍａおよびＩｚｕｍｏ、１９９３ａ、１９９３ｂ、Ｋａｒ
ｉｙａら、１９９４、Ｋａｒｎｓら、１９９５、Ｋｏｖａｃｉｃ−Ｍｉｌｉｖｏ
ｊｅｖｉｃら、１９９６）。最近、心臓限定ジンクフィンガー転写因子ＧＡＴＡ
４はまた、肥大中にＡｎｇＩＩ型１αレセプタおよびβ−ＭＨＣの遺伝子の転写
活性化に必要であることが示されている（Ｈｅｒｚｉｇら、１９９７、Ｈａｓｅ
ｇａｗａら、１９９７、ＭｏｌｋｅｎｔｉｎおよびＯｌｓｏｎ、１９９７に概説
）。
【０００７】 心臓の発育および肥大における転写因子の筋細胞エンハンサー因子２（ＭＥＦ
２）ファミリーの潜在的な役割もまた考慮する。脊椎動物において、ＭＥＦ２Ａ
、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＥＦ２Ｃ、およびＭＥＦ２Ｄと呼ばれるＭＥＦ２ファミリーの
４つのメンバーが存在する（Ｏｌｓｏｎら、１９９５に概説されている）。これ
らの転写因子は、Ｎ末端ＭＡＤＳボックスおよびＭＥＦ２ドメインとしてしられ
ている近接モチーフについて、相同性を有する。まとめると、これらの領域は、
ＤＮＡ結合、ホモ二量体化およびヘテロ二量体化、ならびに種々のコファクター
（骨格筋におけるｂＨＬＨタンパク質など）との相互作用を媒介する。ＭＥＦ２
結合部位ＣＴ（Ａ／Ｔ）4ＴＡＧ／Ａは、骨格筋、心筋、および平滑筋遺伝子の
大部分の調節領域に見出される。ＭＥＦ２因子のＣ末端は転写活性化ドメインと
して機能し、選択的スプライシングの複雑なパターンに供される。
【０００８】 マウスの胚形成中、ＭＥＦ２遺伝子は心筋、骨格筋、および平滑筋系の前駆体
において発現され、その発現は分化筋細胞中で維持される（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ
ｅら、１９９４）。ＭＥＦ２因子はまた、種々の非筋細胞型において低レベル
で発現される。ＭＥＦ２Ｃの標的化不活性化により、心不全によって約Ｅ９．５
で胚が死亡することが示されている（Ｌｉｎら、１９９７）。ＭＥＦ２Ｃ変異マ
ウスの心管では、いくつかの心臓の遺伝子（ａ−ＭＨＣ、ＡＮＦ、およびａ−心
筋アクチンを含む）が発現しないのに対し、いくつかの他の心筋収縮タンパク質
遺伝子は、それらがその調節領域中に必須ＭＥＦ２結合部位を含むにもかかわら
ず、正常に発現される。これらの結果は、心筋発達におけるＭＥＦ２Ｃが不可欠
な役割を果たすことを示し、ＭＥＦ２ファミリーの他のメンバーがＭＥＦ２Ｃの
非存在下での筋遺伝子のサブセットの発現を支持することができるという重複す
る機能を有することが示唆される。ショウジョウバエでは、Ｄ−ＭＥＦ２と呼ば
れる１つのＭＥＦ２遺伝子のみが存在する。Ｄ−ＭＥＦ２を欠く胚では、筋組織
の遺伝子はいかなる筋原系においても活性化されない。これは、ＭＥＦ２は全て
の筋細胞型の分化プログラムに不可欠な成分であることを示す（Ｌｉｌｌｙら、
１９９５、Ｂｏｕｒら、１９９５）。
【０００９】 ＭＥＦ２因子は筋組織遺伝子の活性化に必要であるにもかかわらず、この因子
はこれらの遺伝子を単独で活性化するのに十分ではない。それどころか、生化学
的および遺伝的研究により、ＭＥＦ２因子は遺伝子発現の特異的プログラムを活
性化するために、他の転写因子と組み合わせて作用することが示された。骨格筋
では、ＭＥＦ２は、筋遺伝子転写を活性化させるためにＭｙｏＤファミリーのメ
ンバーとの相互作用による組み合わせコードを確立する（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら
、１９９５、ＭｏｌｋｅｎｔｉｎおよびＯｌｓｏｎ、１９９６）。ＭＥＦ２タン
パク質が種々の遺伝子を制御することが示されている心筋および平滑筋細胞また
は非筋細胞におけるＭＥＦ２の特異的なパートナーを決定する余地がある。
【００１０】 以下に考察するように、心肥大の調節下におけるＭＥＦ２の重要な役割が示唆
される証拠となるの４つの系が存在する。１）ＭＥＦ２は、肥大中にアップレギ
ュレーションされる多数の胚心筋遺伝子を制御する。２）ＭＥＦ２転写活性は、
肥大を調節する同一のシグナル伝達によって誘導される。３）ＭＥＦ２Ｃは、ヒ
ト鬱血性心不全患者の心臓においてアップレギュレーションされる。４）ＭＥＦ
２は、ａ−ＭＨＣ遺伝子の転写を制御するために甲状腺ホルモンレセプタと相乗
作用する（Ｌｅｅら、１９９７）。甲状腺ホルモンは肥大の強力なインデューサ
ーである。
【００１１】 Ｔ細胞レセプタ活性に応答したＴ細胞におけるオーファンステロイドレセプタ
Ｎｕｒ７７遺伝子（ＮＧＦＩ−Ｂ）の転写活性化は、ＣｓＡ感受性のカルシウム
依存性シグナル経路によって媒介される（Ｗｏｒｏｎｉｃｚら、１９９５）。こ
のシグナル経路は、ＮＧＦＩ−Ｂプロモータにける２つのＭＥＦ２結合部位に向
けられる。この系において、カルシウムシグナルの存在下または非存在下でＭＥ
Ｆ２の結合活性が変化しないのに対して、ＭＥＦ２の転写活性は、カルシウムシ
グナルによって激増する。これは、カルシウムシグナルが転写活性を刺激するＭ
ＥＦ２のコファクターまたは翻訳後の修飾の誘導によってＭＥＦ２活性を上昇さ
せることを意図する。
【００１２】 さらに、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）の溶菌サイクルの誘導
に必要なカルシウム依存性溶菌サイクル変換遺伝子ＢＺＬＦ１の転写は、ＣｓＡ
およびＦＫ５０６によって阻害され、これは、カルシニューリン依存経路がこの
遺伝子の活性化を媒介することを示す（Ｌｉｕら、１９９７）。ＢＺＬＦ１転写
のＣｓＡ感受性を、ＢＺＬＦ１プロモータ中の３つのＭＥＦ２部位に置く。Ｃｓ
Ａ感受性誘導は、ＣＲＥＢ／ＡＰ−１部位に関連したＭＥＦ２部位の複数のコピ
ーを含む人工プロモータを用いて再構築されることが示された。ＮＦＡＴはＢＺ
ＬＦ１プロモータに結合しなかったが、このプロモータのＣｓＡ感受性誘導は、
カルシニューリンおよびＮＦＡＴ依存性であることが示された。ＣａＭＫＩＶは
また、ＭＥＦ２活性の強力なインデューサーであることが示された（Ｌｉｕら、
１９９７）。ＭＥＦ２がカルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル系に対する応答を
付与する機構を解明する余地がある。
【００１３】 ＭＡＰキナーゼシグナル経路はまた、種々の細胞型においてＭＥＦ２因子の転
写活性を上昇させることが示されている（Ｈａｎら、１９９７、Ｃｏｓｏら、１
９９７、Ｋａｔｏら、１９９７、Ｃｌａｒｋｅら、１９９８）。この上昇は、Ｍ
ＡＰキナーゼファミリーメンバーｐ３８によるＣ末端活性化ドメイン中の３つの
アミノ酸（Ｔｈｒ２９３、Ｔｈｒ３００、およびＳｅｒ３８７）のリン酸化によ
って媒介されるＭＥＦ２Ｃを示した。これらの同一の残基が心臓において、肥大
シグナルによってリン酸化されるかどうかを識別する余地がある。
【００１４】 心肥大応答がＣａ++依存経路によってある程度阻害されることは明白である。
しかし、肥大応答を媒介する遺伝子の正確な識別は、確認できないままである。
本発明は、心肥大に対する有利な効果を達成するために操作することができる肥
大経路における正確なポイントの解明に関する。ヒトの心肥大治療用の薬理学的
ストラテジーを開発するためには、疾患の病理学的プロフィールを正確に反映す
る動物モデルの確立が重要である。
【００１５】 ［発明の要旨］ したがって、本発明により、ＭＥＦ２の機能を阻害するステップを含む心筋細
胞の肥大の治療方法が得られる。ＭＥＦ２機能の阻害には、例えば、ＭＥＦ２と
ＭＥＦ２と結合して不活性化する物質との接触によるＭＥＦ２の発現の減少を含
み得る。本方法には、さらに、例えばアンチセンスによるＭＥＦ２によってアッ
プレギュレーションされる遺伝子のアップレギュレーションの阻害が含まれる。
ＭＥＦ２発現を減少させる物質はアンチセンス構築物であり、ＭＥＦ２に結合し
て不活性化する物質は抗体調製物（例えば、一本鎖抗体または小分子インヒビタ
ー）であり得る。
【００１６】 別の実施形態では、ＭＥＦ２によって活性化される転写制御因子の調節下にあ
る指標遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物細胞が得られる。哺乳動
物は、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ヒツジ、または他の適切な動物であ
り得る。指標遺伝子は、ｌａｃＺ、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、お
よびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択することができる。
【００１７】 さらに別の実施形態では、（ａ）ＭＥＦ２誘導制御配列の調節下にある指標遺
伝子を含む心筋細胞を得るステップと、（ｂ）前記細胞と候補活性調節因子とを
接触させるステップと、（ｃ）前記候補活性調節因子で処理していない細胞と比
較して、前記指標遺伝子発現について前記細胞をモニタリングするステップとを
含む心肥大の活性調節因子のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】 細胞は、心筋細胞株または初代心筋細胞由来であり得る。細胞はまた、トラン
スジェニック動物由来であり得る。接触は、インビトロまたはインビボで行うこ
とができる。候補活性調節因子は、小分子ライブラリーまたは抗体（例えば、一
本鎖抗体）由来のアンチセンス構築物であり得る。
【００１９】 本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明白となるで
あろう。しかし、詳細な説明および特定の実施例が本発明の好ましい実施形態を
示す一方で、例示のみを示し、本発明の精神および範囲内での種々の変更および
修正がこの詳細な説明から当業者に明らかとなることが理解されるべきである。
【００２０】 以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の一定の態様をさらに示すた
めに含まれる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な説明と
組み合わせて１つまたは複数のこれらの図面を参照することによってより理解さ
れ得る。
【００２１】 ［例示的実施形態の説明］ 心不全をひきおこす心肥大は、合衆国の罹患率の主な原因であるが、根本的な
分子機構はわかっていない。心筋症は、家族性および散発性の両方の形態でおこ
る。この型の心筋症は、左心室の肥大によって特徴づけられる。肥大性心筋症は
、心臓収縮機能の増大、遅延かつ異常に強力な等尺性収縮段階後の弛緩障害、お
よび心弛緩中の心房の硬直が特徴である。
【００２２】 心臓に課される負担の増加に応答する心肥大は、基本的な順応機構である。こ
れは、神経、エンドクリン、または機械的刺激のいずれかまたはこれらの組み合
わせの結果生ずる（細胞数よりもむしろ）細胞サイズおよび質量の量的増大を反
映した特殊化された過程である。高血圧（心肥大に関与する別の因子）は、鬱血
性心不全の頻繁な前駆症状である。心不全を発症すると、通常左心室が肥大して
拡張し、駆出率などの心筋収縮の指標は減少する。明確に、心肥大応答は、複雑
な症候群であり、心肥大を誘導する経路の解明が種々の刺激に起因する心疾患の
治療に有利である。
【００２３】 ［１．本発明］ 細胞内Ｃａ++の上昇は、機械的またはアゴニスト誘導心肥大の阻害に関連する
ことが十分に証明されている（Ｍａｒｂａｎら、１９８７、Ｂｕｓｔａｍａｎｔ
ｅら、１９９１、Ｈｏｎｇｏら、１９９５、Ｌｅ Ｇｕｅｎｎｅｃら、１９９１
、Ｐｅｒｒｅａｕｌｔら、１９９４、Ｓａｅｋｉら、１９９３）。さらに、心肥
大は、細胞数の増加がほとんどないか全くなく、心筋細胞のタンパク質含有量が
増加する一定の遺伝子のアップレギュレーションに起因することが知られている
。この肥大経路の活性により、分子および病態生理学が変化する。診断および治
療におけるこれらの相互作用の利用は、以下に記載の本発明の基本である。
【００２４】 本発明は、ｌａｃＺ導入遺伝子の活性化による心臓でＭＥＦ２作用を示すトラ
ンスジェニックマウスを提供する。より詳細には、デスミン遺伝子由来のＭＥＦ
２部位の３つのタンデムコピーを全ての細胞において基底レベルで発現する熱シ
ョックタンパク質（ｈｓｐ）６８プロモータの上流でクローン化した導入遺伝子
およびｌａｃＺレポータを用いて、これらのマウスを作製する。胚形成の間、Ｍ
ＥＦ２部位依存性導入遺伝子は、発生中の筋細胞系で発現し、これは、心筋、骨
格筋、および平滑筋遺伝子発現の活性化についてのＭＥＦ２因子の重要性と合致
する。しかし、出生後、導入遺伝子の発現は比色分析ｌａｃＺ染色によって検出
不可能なレベルにまでダウンレギュレーションされる。
【００２５】 心臓の肥大シグナルに対するＭＥＦ２−ｌａｃＺ導入遺伝子の応答を試験する
ために、導入遺伝子を、ＭＨＣカルシニューリンおよびＭＨＣ−ＣＡＭＫＩＶ導
入遺伝子を保有するマウス系への交配によって移入する。ｌａｃＺの発現は、カ
ルシニューリンおよびＣＡＭＫＩＶに応答して大幅にアップレギュレーションさ
れ、これは、肥大応答の活性化を示している。
【００２６】 ＰＫＣ活性は、ＭＥＦ−２のリン酸化状態がその活性と直接関連する可能性を
高めるＭＥＦ−２活性化と関連することが認められている。そのようなものとし
て、分子がリン酸化されても、分子が出現し、標的化されるように操作すること
によって恒常的に活性化されるＭＥＦ−２の変異形態を構築することが可能であ
る。次いで、このような変異体ＭＥＦ−２遺伝子を含むトランスジェニック細胞
およびトランスジェニック動物を、心肥大の細胞、組織、および器官の病態生理
学理解の観点および肥大遺伝子のＭＥＦ２関連活性化を制限し得る薬物の試験の
両方についての疾患モデルとして使用することができる。心肥大を担うＭＥＦ２
標的遺伝子の下流である遺伝子の識別も望まれる。
【００２７】 本発明は、ＭＥＦ２遺伝子のノックアウト方法を提供する。遺伝子の標的によ
り、ＥＳ細胞およびトランスジェニックマウスにおける４つのＭＥＦ２遺伝子を
不活性化した。特に、ＭＥＦ２Ｃを欠くマウスは、右心室が存在せずかつ血管系
を形成できない重傷の心血管欠損症由来のＥ９．５で死亡する（Ｌｉｎら、１９
９７）。さらに、ａ−ＭＨＣ、ａ−ｃａｒｄｉａｃ ａｃｔｉｎおよびＡＮＦを
含む心筋タンパク質遺伝子のサブセットは、これらの動物の発育中の心臓で発現
することができない。それに対して、いくつかの心筋遺伝子（ｍｙｏｓｉｎ ｌ
ｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ２Ａおよび２Ｖなど）は、ＭＥＦ２Ｃ変異体の胚の心
臓において正常レベルで発現し、これは、これらの遺伝子がＭＥＦ２Ｃ独立性で
あることを示している。
【００２８】 本発明は、さらに、ＭＥＦ２ポリペプチドを産生する活性化ＭＥＦ２遺伝子の
使用を意図する。構成遺伝子発現の可能な様式は、活性転写因子の転写活性ドメ
インに対するＭＥＦ２遺伝子の機能である。
【００２９】 ［２．心肥大の転写経路］ 上記のように、Ｃａ++活性化は心肥大に著しく関与することが知られているが
、カルシニューリンが心筋細胞における肥大シグナルの伝達に関与する可能性が
以前に調査されている。本発明は、心肥大についてのカルシニューリン依存性経
路を記載し、この経路を図１１に示す。心肥大に関連するこの経路の各成分を、
以下にさらに詳細に考察する。
【００３０】 ［ａ．カルシニューリン］ カルシニューリンは、５９ｋＤのカルモジュリン結合触媒性Ａサブユニットお
よび１９ｋＤのＣａ++結合制御Ｂサブユニットからなるヘテロダイマーとして存
在する遍在発現性セリン／トレオニンホスファターゼである（Ｓｔｅｍｍｅｒお
よびＫｌｅｅ、１９９４、Ｓｕら、１９９５）。カルシニューリンは、酵素が持
続的なＣａ++の停滞状態によって活性化され、心筋細胞収縮に応答して起こる一
時的なＣａ++流動に非感受性であるので、Ｃａ++シグナルに対する心筋細胞の肥
大応答の遅延を媒介するように固有に適合する（Ｄｏｌｍｅｔｓｃｈら、１９９
７）。
【００３１】 カルシニューリンの活性化は、Ｃａ++およびカルモジュリンのそれぞれ制御サ
ブユニットおよび触媒サブユニットへの結合によって媒介される。以前の研究に
より、心臓でのカルモジュリンの過剰発現により肥大もまた発症することが示さ
れたが、関連する機構は識別されていなかった（Ｇｒｕｖｅｒら、１９９３）。
本明細書中で所見が示されたとすれば、本発明でカルモジュリンは肥大応答を誘
導するカルシニューリン経路によって作用することが明らかである。
【００３２】 ［ｂ．ＭＥＦ２］ 転写因子のファミリーである単球エンハンサー因子２ファミリー（ＭＥＦ２）
は、骨格筋、心筋、および平滑筋細胞の形態形成および筋形成の重要な役割を果
たすことが知られている（Ｏｌｓｏｎら、１９９５）。ＭＲＦ２因子は、筋肉特
異的遺伝子の大部分の調節領域中の保存ＤＮＡ配列に結合する。全ての発生筋細
胞型において発現する。４つの哺乳動物のＭＥＦ２遺伝子のうち、有意に機能が
異なる３つ（ＭＥＦ２Ａ、ＭＥＦ２Ｂ、およびＭＥＦ２Ｃ）を選択的にスプライ
シングすることができる（Ｂｒａｎｄ、１９９７、Ｏｌｓｏｎら、１９９５）。
これらの転写因子は、Ｎ末端ＭＡＤＳボックスおよびＭＥＦ２ドメインとして知
られる隣接モチーフに相同性を有する。まとめると、これらのＭＥＦ２領域は、
ＤＮＡ結合、ホモおよびヘテロ二量体化、ならびに種々のコファクター（骨格筋
中の筋原性ｂＨＬＨタンパク質など）との相互作用を媒介する。さらに、脊椎生
物および無脊椎動物における生物学的および遺伝的研究により、ＭＥＦ２因子は
、他の転写因子との組み合わせ相互作用によって、筋形成を制御することが示さ
れている。
【００３３】 機能喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）研究は、ＭＥＦ２因子が胚形
成中の筋肉遺伝子発現の活性化に必須であることを示す。ＭＥＦ２タンパク質の
発現および機能は、ＭＥＦ２因子が関与する種々の転写回路を微調整する多数の
形態の正および負の制御に供される。本発明は、心肥大発症におけるＭＥＦ２の
役割の識別方法を記載する。
【００３４】 ［ｃ．カルシニューリンの阻害］ ＣｓＡおよびＦＫ−５０６はイムノフィリンであるサイクロフィリンおよびＦ
Ｋ−５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）とそれぞれ結合してカルシニューリ
ン触媒サブユニットと結合する複合体を形成し、カルシニューリンの活性を阻害
する。ＣｓＡおよびＦＫ−５０６は、培養した心筋細胞のＡｎｇＩＩおよびＰＥ
とに応答して肥大する能力を妨害する。この肥大アゴニストは、いずれも細胞内
Ｃａ++の上昇によって作用し、ＰＫＣおよびＭＡＰキナーゼシグナル経路が活性
化されることが示されている（ＳａｄｏｓｈｉｍａおよびＩｚｕｍｏ、１９９３
ａ、１９９３ｂ、Ｋｕｄｏｈら、１９９７、Ｙａｍａｚａｋｉら、１９９７、Ｚ
ｏｕら、１９９６）。ＣｓＡは細胞膜での初期シグナル（ＰＩ代謝回転、Ｃａ++ 動員、またはＰＫＣ活性化など）に干渉されない（Ｅｍｍｅｌら、１９８９）。
したがって、ＡｎｇＩＩおよびＰＥの肥大応答を抑制する機能により、カルシニ
ューリン活性化はＡｎｇＩＩおよびＰＥシグナル伝達経路における不可欠な段階
であることが示唆される。
【００３５】 ［ｄ．肥大遺伝子］ ホルモン刺激、遺伝的刺激、および機械的刺激に応答して、心筋は各筋細胞の
肥大によって仕事量を増加させて適応する（Ｍｏｒｇａｎら、１９８７）。成体
の心筋細胞が最終的に分化して増殖能を喪失しているので、肥大過程中の心臓の
成長は、主に心細胞数をほとんど変化しないか全く変化しない各心筋細胞あたり
のタンパク質含有量の増加に起因する。したがって、心筋肥大応答の主な特徴は
、収縮タンパク質含有量の増加、収縮タンパク質イソ型の誘導、および胚マーカ
ーの発現であり、これは、主にこれらのタンパク質をコードする対応心筋遺伝子
の転写活性化に非常に依存するようである。
【００３６】 心筋中で構成的に発現した収縮タンパク質遺伝子（ラット心筋ミオシン軽鎖２
（ＭＬＣ−２）遺伝子など）のアップレギュレーションにより、各心筋細胞中の
ＭＬＣ−２レベルが量的に増加し、対応するこの収縮タンパク質が蓄積される。
心筋細胞肥大はまた、胚成長において通常発現される収縮タンパク質遺伝子の誘
導（例えば、げっ歯類およびウサギの心肥大モデルにおける骨格筋α−アクチン
（Ｓｃｈｗａｒｔｚら１９８６）およびβ−ミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現の再活
性化）を含む収縮タンパク質成分の質的変化に関連する。特定の収縮タンパク質
成分の誘導に加えて、心室肥大はまた、非収縮タンパク質遺伝子発現の変化によ
って特徴づけられる。
【００３７】 心室肥大中にアップレギュレーションされる既知の非収縮タンパク質遺伝子の
うち、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）発現の再活性化を最も十分に特定す
ることができる。ＡＮＦは、心房の筋細胞によって分泌され、組織の拡大または
カテコールアミンまたはエンドセリン（ＥＴ）などのホルモンに応答してエキソ
サイトーシスを受ける分泌顆粒内に保存される血管制御ペプチドホルモンである
。血管拡張およびナトリウム利尿によって血圧が低下するβ型ナトリウム利尿ペ
プチド（ＢＮＰ）はまた、肥大シグナルに応答して心臓において迅速にアップレ
ギュレーションされる（ＫｏｍｕｒｏおよびＹａｚａｋｉ、１９９３に概説）。
【００３８】 ［３．トランスジェニックマウスの作製方法］ 上記のように、本発明の特定の実施形態により、ＭＥＦ２関連構築物を含むト
ランスジェニック動物が得られる。ＭＥＦ２制御導入遺伝子を発現するトランス
ジェニック動物、およびこのような動物およびトランスジェニック胚由来の組換
え細胞株は、ＭＥＦ２機能を抑制することにより心肥大を緩和する物質のスクリ
ーニングおよび識別方法に有用であり得る。転写活性ドメインに融合した構成発
現ＭＥＦ２遺伝子の使用は、さらに有用である。また、ＭＥＦ２発現を「ノック
アウト」されたトランスジェニック動物は、ＭＥＦ２機能の発生的態様の分析の
用途がある。さらに、「ノックアウト」マウスを、ディファレンシャルディスプ
レイを用いた下流ＭＥＦ２標的の識別に使用することができる。
【００３９】 一般的な態様では、トランスジェニック動物を、導入遺伝子が発現される様式
でのゲノムへの所与の導入遺伝子の組み込みによって作製する。トランスジェニ
ック動物の作製法は、一般に、ＷａｇｎｅｒおよびＨｏｐｐｅ（米国特許第４，
８７３，１９１号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする））、
Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９９５（その全体が引用することにより本明細書の一部
をなすものとする）、および「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ
Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、（Ｈｏ
ｇａｎ、Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｍｉ、Ｌｏｎｇ編、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９４
（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする））に記載さ
れている。
【００４０】 典型的には、ゲノム配列に隣接する遺伝子を、受精卵への微量注入によって導
入する。微量注入した卵を宿主雌に移植し、導入遺伝子の発現について子孫をス
クリーニングする。トランスジェニック動物を、多数の動物（爬虫類、両生類、
鳥類、哺乳動物、および魚類を含むが、これらに限定されない）由来の受精卵か
ら作製することができる。特に好ましい実施形態では、ＭＥＦ２によって制御さ
れる指標ポリペプチドを発現するトランスジェニックマウスを作製する。
【００４１】 微量注入用のＤＮＡクローンを、当該分野で既知の任意の手段によって調製す
ることができる。例えば、微量注入用のＤＮＡクローンを、標準的な技術を用い
て細菌プラスミド配列除去に適切な酵素で切断し、ＤＮＡフラグメントをＴＢＥ
緩衝液の１％のアガロースゲルで電気泳動することができる。ＤＮＡバンドを、
臭化エチジウムでの染色によって視覚化し、発現配列を含むバンドを切り出す。
次いで、切り出したバンドを、０．３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む
透析バッグに入れる。ＤＮＡを透析バッグに電気的に溶出し、１：１のフェノー
ル：クロロホルム溶液で抽出し、２体積のエタノールで沈殿させる。ＤＮＡを、
１ｍｌの低塩緩衝液（０．２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）
、および１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄ（商標）カラム
で精製する。カラムを、最初に３ｍｌの高塩緩衝液（１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭ
のＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）および１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、その後５ｍｌの
低塩緩衝液で洗浄する。ＤＮＡ溶液を、３回カラムに通過させ、カラムの基質に
ＤＮＡを結合させる。３ｍｌの低塩緩衝液で１回洗浄後、ＤＮＡを、０．４ｍｌ
の高塩緩衝液で溶出し、２体積のエタノールで沈殿させる。ＤＮＡ濃度を、ＵＶ
分光光度計で２６０ｎｍの吸収により測定する。微量注入用に、ＤＮＡ濃縮物を
、５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．１ｍＭのＥＤＴＡで３μｇ／ｍｌ
に調整する。
【００４２】 微量注入用の他のＤＮＡ精製法は、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ
ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８
６）、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３００、６１１、１９８２、Ｔｈｅ
Ｑｉａｇｅｎｏｌｏｇｉｓｔ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
、第３版、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、およびＳａ
ｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｌｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）に記載さ
れている。
【００４３】 微量注入手順の例として、６週齢の雌のマウスを、５ＩＵの（０．１ｃｃ、腹
腔内）の妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、Ｓｉｇｍａ）注射で過剰排卵を誘
導し、４８時間後、５ＩＵ（０．１ｃｃ、腹腔内）のヒト絨毛性ゴナドトロピン
（ｈＣＧ、Ｓｉｇｍａ）を注射した。雌を、ｈＣＧ注射直後に雄とともに置いた
。ｈＣＧ注射から２１時間後、交配させた雌をＣＯ2による窒息または頸部脱臼
によって屠殺し、胚を、切り出した卵管から回収し、０．５％のウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水に置く。
周囲の卵丘細胞をヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で取り除く。次いで、前核
胚を洗浄し、注射するまで、５％のＣＯ2、９５％の加湿した空気で３７℃のイ
ンキュベーターで、０．５％のＢＳＡを含むＥａｒｌｅ平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ
）中に置く。胚を、２細胞に移植することができる。
【００４４】 無作為に世代交代した成体雌マウスを、精管切除した雄と対にする。Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６またはＳｗｉｓｓマウスまたは他の類似の系統をこの目的に使用すること
ができる。同時に、レシピエント雌をドナー雌として交配する。胚導入時に、レ
シピエントの雌を、０．０１５ｍｌの２．５％のアバーティン／ｇ／体重の腹腔
内注射によって麻酔する。卵管を、単純な背部正中線切開によって暴露した。卵
管を越えて直接体壁を通して切開される。次いで、卵嚢を時計用ピンセットで引
き裂く。導入する胚をＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水）中および
導入ピペットチップに置く（約１０〜１２個の胚）。ピペットチップを卵管漏斗
に挿入し、胚を導入する。導入後、切開部を２回の縫合によって閉じる。
【００４５】 上記のように、このような動物由来のトランスジェニック動物および細胞株は
、一定の試験での用途があり得る。これに関して、ＭＥＦ２制御指標遺伝子を発
現するトランスジェニック動物および細胞株を、試験物質に暴露することができ
る。これらの試験物質を、ＭＥＦ２活性を減少させる能力についてスクリーニン
グすることができる。このような手順で識別された化合物は、心疾患の治療の用
途がある。
【００４６】 ［４．トランスジェニックマウスおよびその使用］ 本発明のトランスジェニック動物には、非トランスジェニック同腹子と比較し
て、心肥大の自発的発症の可能性を実質的に増大させるトランスジェニック動物
が含まれる。心肥大の自発的発症の可能性が「実質的に増加した」とは、トラン
スジェニック動物を非トランスジェニック動物と比較した場合、心肥大の測定可
能な症状に実質的に有意な増加が認められることを意味する。
【００４７】 １つの実施形態では、肥大シグナルに応答して心筋細胞において発現する少な
くとも１つの遺伝子の転写を調整する遺伝子産物をコードするコード領域を含む
導入遺伝を用いて、本発明のトランスジェニック動物を作製する。さらに、ＭＥ
Ｆ２によって活性化される転写制御因子の調節下にある指標遺伝子を含むトラン
スジェニック「識別子（identifier）動物」を使用して、ＭＥＦ２活性をスクリ
ーニングすることができる。
【００４８】 本明細書中で使用される、用語「肥大シグナル」は、心肥大の類似の症状が得
られる、機械的または化学的な任意の刺激を示す。肥大シグナルには、機械的拡
大、βアドレナリン作用性アゴニスト、α1アドレナリン作用性レセプタゴニス
ト、およびアンギオテンシンＩＩが含まれるが、これらに限定されない。心肥大
の症状を、種々のパラメータ（左心室質量／体重、心筋細胞のサイズおよび組織
化の変化、心筋遺伝子発現の変化、および心臓機能の変化が含まれるが、これら
に限定されない）によって測定することができる。
【００４９】 本発明のトランスジェニックマウスは、種々の異なる用途がある。第１に、Ｍ
ＥＦ２活性を測定することができる動物モデルの作製によって、本発明は、ＭＥ
Ｆ２機能がさらに分析することができる生きた「血管」が得られた。１つの特定
のシナリオでは、トランスジェニックマウスを使用してＭＥＦ２のさらなる核因
子との相互作用を解明することができる。したがって、本発明はまた、ＭＥＦ２
との相互作用を介して作用する核因子の識別を明確に含む。
【００５０】 本発明のトランスジェニックマウスの他の用途は、ＭＥＦ２活性、最終的には
心肥大の活性調節因子のインビボ識別である。ＭＥＦ２制御指標遺伝子の存在は
、ＭＥＦ２機能のベースラインを示す。推定ＭＥＦ２インヒビターでのトランス
ジェニックマウスの治療、およびこの治療マウスと未治療トランスジェニックマ
ウスとの応答の比較により、候補インヒビターの活性を評価する手段が得られる
。
【００５１】 ［５．心臓病の治療］ Ｃａ++媒介経路がある種の心臓病に関与していることが報告されているが、本
発明は、肥大性応答の中枢メディエータとしてのＭＥＦ２の最初の証拠を提供す
る。実質的には、Ｃａ++依存性タンパク質カルシニューリンおよびＣａＭＫＩＶ
はＭＥＦ２依存性遺伝子発現を活性化する。さらに、ＭＥＦ２Ｃの転写活性化ド
メインは肥大性シグナリング経路についての核標的であることが示された。
【００５２】 このように、本発明の特定の具体例において、心肥大の治療方法が提供される
。これらの方法は、ＭＥＦ２が肥大性応答に関与する遺伝子の発現をアップレギ
ュレートするように見えるという後記にて詳細に述べる本発明者らの観察を開発
する。その最も基本的なことにおいて、この具体例は、肥大性応答を受けてしま
った、肥大性応答を現在受けている、または心肥大性の危険性があることが疑わ
れる個体においてＭＥＦ２のインビボ活性を減少することによって機能するであ
ろう。これはいくつかのメカニズムの１つによって達成することができる。まず
、ＭＥＦ２タンパク質の発現をブロックすることができる。第２に、ＭＥＦ２タ
ンパク質に結合するかまたはそれを不活性化する薬剤を提供することによってＭ
ＥＦ２タンパク質の機能を直接ブロックすることができる。第３にＭＥＦ２の１
以上の標的と干渉することによってＭＥＦ２の効果を間接的にブロックすること
ができる。
【００５３】 本発明の治療組成物は、アスピリン、ニトレート、ベータブロッカーのごとき
心臓疾患のための現行の治療の投与と同様に投与することができる。このように
、治療組成物は（アスピリンに関するごとく）飲み下すためのまたは（ニトレー
トに関するごとく）舌の下で溶解させるための錠剤形態の経口投与用のものとす
ることができる。また、これらの医薬は皮膚に適用するためのパッチとして、ま
たは皮膚に適用するための局所クリームとして供することができる。
【００５４】 ［ａ．ＭＥＦ２のブロッキング発現］ ＭＥＦ２発現をブロックするための最も直接的な方法はアンチセンス技術を介
するものである。用語「アンチセンス」は、ＭＥＦ２ ＲＮＡの一部に相補的な
ポリヌクレオチド分子、またはそれに対応するＤＮＡをいうことを意図する。「
相補的」なポリヌクレオチドは、標準的なワトソンクリック相補性規則に従って
塩基対合できるものである。すなわち、より大きなプリンはより小さなピリミジ
ンと塩基対合してシトシンと対合したグアニン（Ｇ：Ｃ）およびＤＮＡの場合に
はチニンと対合したアデニン（Ａ：Ｔ）、ＲＮＡの場合にはウラシルと対合した
アデニン（Ａ：Ｕ）の組合せを形成するであろう。ハイブリダイズする配列にイ
ノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその
他のごときより通常ではない塩基を含めることは対合に干渉しない。
【００５５】 ポリヌクレオチドで二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを標的化することは三重らせん形成
に至り、ＲＮＡを標的化することは二重らせん形成に至るであろう。標的細胞に
導入されると、アンチセンスポリヌクレオチドはその標的ポリヌクレオチドに特
異的に結合し、転写、ＲＮＡプロセッシング、輸送、翻訳および／または安定性
に妨害する。アンチセンスＲＮＡ構築物、またはそのようなアンチセンスＲＮＡ
をコードするＤＮＡを使用して、ヒト対象を含めた宿主動物内のごとく、インビ
トロまたはインビボいずれかで宿主細胞内で遺伝子の転写または翻訳を阻害する
ことができる。
【００５６】 アンチセンス構築物は遺伝子のプロモータおよび他の制御領域、エクソン、イ
ントロンまたはエクソンイントロン境界に結合するように決定することができる
。本発明について最も効果的なアンチセンス構築物はｍＲＮＡ開始部位に相補的
な領域を含むであろうと考えられる。単に構築物をインビトロでテストして標的
タンパク質のレベルが影響されるか否かを判断することによってそのような構築
物を容易にテストすることができる。同様に、タンパク質合成の有害な非特異的
阻害は、標的細胞生存率をインビトロで決定することによって測定することもで
きる。
【００５７】 本明細書中で用いるごとく、用語「相補的」または「アンチセンス」は、その
全長にわたって実質的に相補的であり、非常に少数の塩基ミスマッチを有するポ
リヌクレオチドを意味する。例えば、長さが１５塩基の配列は、それらが１５の
うち１３または１４のヌクレオチドにおいて相補的なヌクレオチドを有する場合
に相補的であるということができる。当然、「完全に相補的」である配列は、そ
の全長にわたって完全に相補的であって、塩基ミスマッチを有しない配列であろ
う。
【００５８】 低い程度の相同性を持つ他の配列も考えられる。例えば、高相同性の限定され
た領域を有するが、非相同領域（例えば、リボザイム）を含有するアンチセンス
構築物を設計することもできる。これらの分子は、５０％未満の相同性を有する
ものの、適当な条件下で標的配列に結合するであろう。
【００５９】 本発明によるポリヌクレオチドはＭＥＦ２遺伝子またはタンパク質発現のアン
チセンス阻害を行うのに十分な遺伝子の一部をコードすることができる。ポリヌ
クレオチドはゲノミックＤＮＡに由来することができ、すなわち、特定の生物の
ゲノムから直接クローン化することができる。しかしながら、他の具体例におい
てポリヌクレオチドは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得る。ｃＤＮＡはメッセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を鋳型として調製されたＤＮＡである。このように
、ｃＤＮＡはいずれかの中断されたコーディング配列を含有せず、通常、対応す
るタンパク質についてほとんど絶対的にコーディング領域を含有する。他の具体
例において、アンチセンスポリヌクレオチドは合成により製造することができる
。
【００６０】 ゲノミックＤＮＡの一部のｃＤＮＡまたは合成配列と組合せて特異的構築物を
作り出すのが有利である。例えば、イントロンが最終構築物中で必要な場合、ゲ
ノミッククローンを使用する必要があろう。ｃＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチ
ドは構築物の残りの部分についてより便利な制限部位を提供することができ、従
って、配列の残りで用いることができよう。
【００６１】 本明細書中に開示したものとは異なる配列を有する天然変種が存在すると考え
られる。このように、本発明はＭＥＦ２にについての提案されたポリヌクレオチ
ド配列の使用に限定されず、むしろ、いずれの天然に生じる変種の使用も含む。
そのような変種の特定の配列に応じて、それらは標的選択性の点でさらなる利点
を供することができ、すなわち、関連する転写体の望まないアンチセンス阻害を
回避する。また、本発明はこれらの配列の化学的に合成された突然変異体を含む
。
【００６２】 前記したごとく、アンチセンス配列は全長ゲノミックまたはｃＤＮＡコピー、
またはその大きな断片であり得るが、それらはより小さな断片、またはここでは
５０以下の塩基を有するポリヌクレオチドを定義する「オリゴヌクレオチド」で
もあり得る。より短いオリゴマー（８〜２０）も作成し、インビボ接近性を増加
させるのがより容易であるが、多数の他の因子が塩基対合の特異性を決定するの
に関与する。例えば、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性
および配列特異性は共に長さが増大するにつれ増加する。８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、
４０、４５または５０塩基対が使用されるであろうと考えられる。遺伝子配列の
全てまたは一部をアンチセンス構築の意味で用いることができるが、統計的には
、１７塩基長のいずれかの配列がヒトゲノムで１回のみ生ずるはずであり、した
がって、固有の標的配列を特定するのに十分である。
【００６３】 ある具体例において、他のエレメント、例えばＣ−５プロピンピリミジンを含
むものを含むアンチセンス構築物を使用するのが望まれるであろう。ウリジンお
よびシチジンのＣ−５プロピンアナログを含有するオリゴヌクレオチドは高親和
性を持ってＲＮＡと結合し、遺伝子発現の優れたアンチセンス阻害剤であること
が示されている。
【００６４】 標的化アンチセンス送達の代替法として、標的化リボザイムを用いることがで
きる。用語「リボザイム」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡ双方において特定の塩基配
列を標的化しそれを切断できるＲＮＡベースの酵素をいう。リボザイムはリボザ
イム配列を取り込んだＲＮＡオリゴヌクレオチドの形態で直接細胞に標的化する
ことができるか、あるいは所望のリボザイムＲＮＡをコードする発現ベクターと
して細胞に導入することができる。リボザイムはアンチセンスポリヌクレオチド
について記載したのとほとんど同じ方法で使用し適用することができる。リボザ
イム配列は、アンチセンスポリヌクレオチドにつき記載したのとほどんど同一の
方法で修飾することができる。例えば、非−ワトソン−クリック塩基を取り込む
か、あるいは混合したＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを作成するか、あるい
はホスホジエステル骨格を修飾することができるか、あるいはＲＮＡのリボース
糖基中の２’−ヒドロキシを修飾することができる。
【００６５】 別の方法として、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびポリヌ
クレオチドは、オリゴポリヌクレオチドをコードする核酸を運ぶ発現構築物から
転写を介してＲＮＡとして提供することができる。この明細書を通じて、用語「
発現構築物」とは、核酸配列の一部または全てが転写できるアンチセンス産物を
コードする核酸を含有するいずれのタイプの遺伝子構築物をも含むことを意味す
る。典型的な発現ベクターは、ｐＵＣまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）プラ
スミドシリーズのいずれかまたは、後記でさらに議論するごとく、真核生物細胞
で使用するのに適合したウイルスベクターのごとき細菌プラスミドまたはファー
ジを含む。
【００６６】 好ましい具体例において、核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードし
、あるいはポリヌクレオチドを、シス作用性転写および翻訳シグナルでのアンチ
センス分子の発現を支持する複製可能なクローニング担体に入れる。発現構築物
は問題の遺伝子および本明細書中で後記する種々の制御因子を含むであろう。
【００６７】 ［ｂ．ＭＥＦ２のブロッキング機能］ もう１つの具体例においては、その発現を阻害するよりもむしろＭＥＦ２ポリ
ペプチドの機能をブロックするのが望ましいであろう。これは、ＭＥＦ２の機能
と干渉する有機化学組成物の使用によって、活性部位またはＭＥＦ２上の結合部
位をブロックする抗体の使用によって、またはＭＥＦ２標的を模倣する分子の使
用によって達成することができる。有機化学的な阻害剤に関しては、そのような
化合物は標準的なスクリーニングアッセイで識別することができる。いったん識
別されれば、そのような阻害剤は治療の意味でＭＥＦ２機能を阻害することがで
きる。
【００６８】 抗体が作成される方法は当業者に既知であり、明細書の他の箇所で詳細に記載
される。再度ＭＥＦ２に結合する抗体は他の機能的属性につきスクリーニングす
ることができる。
【００６９】 ＭＥＦ２の作用をブロックする特に有用な抗体は一本鎖抗体である。一本鎖抗
体の製造方法は当業者に周知である。そのような方法については（引用すること
により本明細書の一部をなすものとする）米国特許第５，３５９，０４６号を当
業者は参照することができる。本発明で好ましい一本鎖抗体は、短いペプチドリ
ンカーを用いて重鎖および軽鎖の可変ドメインを一緒に融合させ、それにより、
単一分子上に抗原結合部位を再構成することによって作成される。
【００７０】 １つの可変ドメインのＣ末端が１５〜２５のアミノ酸ペプチドまたはリンカー
を介して他のもののＮ末端に連結された一本鎖抗体可変断片（Ｆｖｓ）が、抗原
結合または結合の特異性を有意に破壊することなく開発されている（Ｂｅｄｚｙ
ｋら、１９９０；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０）。これらのＦｖｓは天然抗
体の重鎖および軽鎖に存在する定常領域（Ｆｃ）を欠く。
【００７１】 ＭＥＦ２標的を模倣する阻害剤に関しては、ミメティックスのような慣用的設
計の分子の１つの例を提供する。そのような分子は、ＭＥＦ２タンパク質活性を
阻害する小さな分子の阻害剤であり得る。そのような分子は、構造において標的
の構造および／または有機化学的方法の少なくとも鍵となる部分において、現実
の標的化合物と立体的に同様であり得る。別の方法としてこれらの阻害剤はペプ
チジル化合物であってもよく、これらは、ペプチドミメティックスと呼ばれる。
ペプチドミメティックスは、タンパク質の二次構造のエレメントを模倣するペプ
チド含有分子である。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）参照。ペプチドミ
メティックスの使用の背後にある基礎となる理念は、タンパク質のペプチド骨格
は、リガンドおよびレセプタのもののごとき分子の相互作用を促進するようにア
ミノ酸側鎖を配向させるために主として存在するということである。本発明の例
示的なペプチドミメティックスは、対象に投与されると、ＭＥＦ２に結合するで
あろう。
【００７２】 ペプチドミメティックス概念の成功した適用は、このように、高度に抗原性で
あることが知られているタンパク質内のβターンのミメティックスに大いに焦点
を当ててきた。同様に、本発明の抗原内のβターン構造は前記したごとくコンピ
ューターベースのアルゴリズムによって予測することができる。いったんターン
の構成アミノ酸が決定されれば、ミメティックスは、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９
３）に議論されているごとくアミノ酸側鎖の必須エレメントが同一の空間的配位
を達成するように構築することができる。
【００７３】 ［ｃ．ＭＥＦ２標的のブロッキング］ 前述したごとく、本発明の１つの利点はＭＥＦ２が作用する標的の識別である
。これらの標的は、α骨格アクチン、β−ＭＦＣ、ＡＮＦ、ＢＮＦのごとき、カ
ルシニューリンおよびＧＡＴＡ４、またはＧＡＴＡ４との活性化されたＭＥＦ２
相互作用によってアップレギュレートされる他の遺伝子のような結合パートナー
であり得る。ＭＥＦ２がこれらの標的と相互作用するのを妨げるために、種々の
異なるアプローチを採ることができる。例えば、標的に対して抗体を作成し、次
いで、問題の対象に関する抗体を供し、それにより、標識分子に対するＭＥＦ２
のアクセスをブロックすることができる。
【００７４】 さらにもう１つの具体例において、ＭＥＦ２結合パートナーはＤＮＡ分子であ
ると考えられるので、アンチセンス方法を使用してＭＥＦ２とその標的との相互
作用を阻害することができる。別の方法として、ＭＥＦ２と同一様式でＭＥＦ２
標的と相互作用できるが、標的に対していずれのＭＥＦ２様効果がないポリペプ
チドまたはペプチドミメティックも設計することができる。
【００７５】 好ましい具体例において、本発明はＧＡＴＡ４に競合的に結合する薬剤を提供
するであろう。より好ましい具体例において、剤はＭＥＦ２よりもＧＡＴＡ４に
対してより大きな親和性を有するであろう。ＧＡＴＡ４に対する親和性は、結合
速度について動的な実験を行うことによってインビトロで決定することができる
。
【００７６】 ＭＥＦ２分子および識別された標的分子双方の、コンピューターモデリングお
よび予測された高次構造に基づいて他の化合物を開発することができる。このア
プローチは多数のレセプタとリガンドとの相互作用につき阻害剤を開発すること
に成功したことを証明した。
【００７７】 ［６．遺伝子構築物および遺伝子導入］ 本発明の特別の態様において、種々の心臓遺伝子を発現構築物に入れ、それら
の発現をモニターするのが望ましいであろう。例えば、ＢＮＰ、ＭＨＣ等のごと
き心肥大遺伝子は、培養した心筋細胞を、肥大感受性遺伝子または遺伝子類に作
動可能に連結したプロモータを含む発現構築物を導入し、次いで肥大感受性遺伝
子または遺伝子類の発現をモニターすることによってテストすることができる。
発現構築物はトランスジェニック動物を作製するのに使用され、動物細胞中での
構築物の発現のためのプロモータおよび肥大シグナルに応答して心筋細胞で発現
される少なくとも１つの遺伝子の転写を変調する遺伝子産物をコードする領域を
含む。他の具体例において、発現構築物はアンチセンスオリゴまたはポリヌクレ
オチドをコードし、前記した治療目的で、アンチセンス分子の発現を支持する複
製可能なクローニング担体に入れられる。
【００７８】 ［ａ．遺伝子構築物］ 本出願を通じて、用語「発現構築物」は、核酸コーディング配列の１部または
全てを転写することができる遺伝子産物をコードする核酸を含有するいずれのタ
イプの遺伝子構築物も含むことを意味する。該転写体はタンパク質に翻訳するこ
とができるが、それは必ずしも必要ない。ある具体例において、発現は遺伝子の
転写およびｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳を共に含む。他の具体例において、発
現は注目する遺伝子をコードする核酸の転写を含むに過ぎない。
【００７９】 ［ｉ．心筋細胞特異的制御因子］ 本発明で使用するのに適した転写制御因子は、それらが心筋細胞において優先
的に作動可能に連結したコーディング領域の転写を指令するものを含む。「優先
的に」とは、心筋細胞におけるトランスジーンの発現が非心筋細胞におけるもの
よりも少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも１０倍〜約５０倍、より
好ましくは少なくとも約５０倍〜１００倍、より好ましくは１００倍を超えて大
きいことを意味する。好ましくは、トランスジーンの発現は、当業者に周知のレ
ポータ遺伝子アッセイに示されるごとく、心筋細胞以外の細胞での検出限界未満
である。
【００８０】 ［ｉｉ．一般的プロモータ］ 遺伝子産物をコードする核酸はプロモータの転写制御の下にある。「プロモー
タ」とは、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識され、遺伝子
の特異的転写を開始するのに必要なＤＮＡ配列をいう。用語「転写制御の下」と
はプロモータが核酸に関して正しい位置および向きにあって、当該遺伝子のＲＮ
Ａポリメラーゼ開始および発現を制御することを意味する。
【００８１】 用語「プロモータ」は、ここでは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための開始部位
の周りにクラスターを形成する転写制御モジュールの群をいうのに用いられる。
いくつかのウイルスプロモータの分析に由来して、どのようにしてプロモータが
組織されるかについて多くの考えがある。このようなウイルスプロモータには、
ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写ユニットについてのも
のを含む。最近の仕事によって増加したこれらの研究は、プロモータが区別され
る機能的モジュールよりなり、各々はほぼ７〜２０ｂｐＤＮＡよりなり、転写ア
クチベーターまたはリプレッサータンパク質についての１以上の認識部位を有す
ることを示した。
【００８２】 各プロモータにおける少なくとも１つのモジュールはＲＮＡ合成のための開始
部位を位置決定するように機能する。これの最良の知られた例はＴＡＴＡボック
スであるが、哺乳動物ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺
伝子についてのプロモータおよびｓｖ４０後期遺伝子（late gene）についての
プロモータのごときＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモータにおいては、
開始部位それ自体と重なる区別されるエレメントが開始の位置を固定するように
働く。
【００８３】 さらなるプロモータエレメントは、転写可能の頻度を調節する。典型的には、
これらは開始部位の３０−１１０ｂｐ上流領域に位置するが、多数のプロモータ
が最近同様に開始部位の下流の機能的エレメントを含有することが示されている
。プロモータエレメント間の間隔はしばしば柔軟性があり、従って、エレメント
が相互に対して逆となり、または移動した場合にプロモータの機能は維持される
。ｔｋプロモータにおいて、プロモータエレメントの間の間隔は、活性が低下し
始める前に５０ｂｐまで増加させることができる。プロモータに依存して、個々
のエレメントは協働してまたは独立して機能し、転写を活性化することができる
。
【００８４】 注目する核酸配列の発現を制御するのに使用される特定のプロモータは、それ
が標的細胞中の核酸の発現を指令することができる限り、重要であるとは考えら
れない。このように、ヒト細胞が標的化される場合、ヒト細胞で発現され得るプ
ロモータに隣接し、かつ該プロモータの制御下に核酸コーディング領域を位置さ
せるのが好ましい。一般的に言って、そのようなプロモータはヒトまたはウイル
スプロモータのいずれかを含むであろう。
【００８５】 種々の具体例において、ヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型遺伝子
プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスロングターミナル
リピート、βアクチン、ラット・インスリンプロモータおよびグリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いて注目するコーディング配列の高レベル
発現を得ることができる。注目するコーディング配列の発現を達成するための当
該分野で周知の他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージプロモータ
の使用の同様に考えられるが、発現のレベルは与えられた目的で十分なものとす
る。周知の特性を持つプロモータを使用することによって、トランスフェクショ
ンまたは形質転換に続く注目するタンパク質の発現のパターンを最適化すること
ができる。
【００８６】 特異的な生理学的または合成シグナルに応答して調節されるプロモータの選択
は、遺伝子産物の誘導可能な発現を可能とすることができる。例えば、トランス
ジーン、またはマルチシストロニックベクターが利用される場合はトランスジー
ン類の発現がベクターがその中で生産される細胞に対して毒性である場合、トラ
ンスジーンの１以上の発現を阻害または低下させるのが望ましいであろう。プロ
デューサー細胞系に対して毒性であり得るトランスジーンの例はプロアポトーシ
スおよびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘導性プロモータシステムは、
トランスジーン産物が毒性であり得るウイルスベクターの生産で利用できる。
【００８７】 エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は１
つのそのようなシステムである。このシステムは哺乳動物細胞における注目する
遺伝子の調節された発現を可能とするように設計される。それは、トランスジー
ンの実質的に基礎的なレベルの発現を可能としないが、２００倍を超える誘導性
を可能とする密接に調節された発現メカニズムよりなる。システムはショウジョ
ウバエのヘテロダイマーエクジソンレセプタに基づき、ムリステロンＡのごとき
エクジソンまたは類似体がレセプタに結合する場合、レセプタはプロモータを活
性化させて下流トランスジーンの発現にスイッチを入れ、高レベルのｍＲＮＡの
転写体が得られる。このシステムにおいて、ヘテロダイマーレセプタの両方のモ
ノマーは１つのベクターから構成的に発現され、他方、注目する遺伝子の発現を
駆動するエクジソン応答性プロモータはもう１つのプラスミド上にある。従って
、注目する遺伝子導入ベクターへのこのタイプのシステムの作成が有用であろう
。プロデューサー細胞系中の注目する遺伝子およびレセプタモノマーを含有する
プラスミドの共トランスフェクションは、従って、潜在的に毒性のトランスジー
ンの発現を伴うことなく遺伝子導入ベクターの生産を可能とするであろう。適切
な時点において、トランスジーンの発現はエクジソンまたはムリステロンＡで活
性化し得る。
【００８８】 有用であろうもう１つの誘導可能なシステムは、元来はＧｏｓｓｅｎおよびＢ
ｕｊａｒｄ（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、１
９９５）によって開発されたＴｅｔ−Ｏｆｆ（商標）またはＴｅｔ−Ｏｎ（商標
）システム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。このシ
ステムは、高レベルの遺伝子発現がデオキシサイクリンのごときテトラサイクリ
ンまたはテトラサイクリン誘導体に応答して調節されるのを可能とする。Ｔｅｔ
−Ｏｎ（商標）システムにおいて遺伝子発現はデオキシサイクリンの存在下でス
イッチが入れられ、他方、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）システムにおいて、遺伝子発
現はデオキシサイクリンの不存在下でスイッチが入れられる。これらのシステム
はＥ．ｃｏｌｉのテトラサイクリン経口性オペロンに由来する２つの制御因子に
基づく。これらは、テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリン
オペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質である。注
目する遺伝子は、その中に存在するテトラサイクリン応答性エレメントを有する
プロモータ背後でプラスミドにクローン化される。第２のプラスミドは、Ｔｅｔ
−Ｏｆｆ（商標）システムにおいて、単純疱疹ウイルスからのＶＰ１６ドメイン
および野生型テトラサイクリンリプレッサーよりなるテトラサイクリン制御トラ
ンスアクチベーターと呼ばれる制御因子を含有する。このように、デオキシサイ
クリンの不存在下では、転写は構成的にオンである。Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）シス
テムにおいてテトラサイクリンリプレッサーは野生型ではなく、デオキシサイク
リンの存在下で転写を活性化する。遺伝子導入ベクターの生産ではＴｅｔ−Ｏｆ
ｆ（商標）システムが好ましく、従って、プロデューサー細胞はテトラサイクリ
ンまたはデオキシサイクリンの存在下で増殖でき、潜在的に毒性なトランスジー
ンの発現を妨げるが、ベクターが患者に導入された場合、遺伝子発現は構成的に
オンであろう。
【００８９】 いくつかの状況において、遺伝子導入ベクター中のトランスジーンの発現を調
節するのが望ましい。例えば、強度が変化する活性を持つ、異なるウイルスプロ
モータが、所望の発現のレベルに依存して利用することができる。哺乳動物細胞
において、ＣＭＶ即時型プロモータが強力な転写活性化を供するのにしばしば使
用される。低下したレベルのトランスジーンの発現が望まれる場合、効力が少な
いＣＭＶプロモータの修飾バージョンも使用されてきた。造血細胞におけるトラ
ンスジーンの発現が望まれる場合、ＭＬＶまたはＭＭＴＶからのＬＴＲのごとき
レトロウイルスプロモータがしばしば使用される。所望の効果に依存して使用す
ることができる他のウイルスプロモータはＳＶ４０、ＲＳＶＬＴＲ、ＨＩＶ−１
およびＨＩＶ−２ ＬＴＲ、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域のごときアデノウ
イルスプロモータ、ＡＡＶ ＬＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＳＶ−
ＴＫおよび鳥類肉腫ウイルスを含む。
【００９０】 同様に、組織特異的プロモータを用いて特異的組織または細胞にて転写を行い
、非標的化組織に対する潜在的特性または望ましくない効果を低下することがで
きる。例えば、ＰＳＡのごときプロモータ、プロバシン、プロスタティン酸ホス
ファターゼまたは前立腺特異的腺カリフレイン（ｈＫ２）のごときプロモータを
用いて前立腺における遺伝子発現を標的化することができる。同様に、以下のプ
ロモータを用いて他の組織における遺伝子発現を標的化することができる。
【００９１】 前記プロモータいずれかを単独でまたはもう１つのプロモータと組み合わせて
用いることは、本発明による所望する活性に応じて有用であることが考えられる
。加えて、このプロモータのこのリストは限定的であると解釈されるべきではな
く、当業者であれば本明細書中に開示されたプロモータおよび方法と組み合わせ
て使用されることができる他のプロモータを知っているであろう。
【００９２】 ［ｉｉｉ．エンハンサー］ エンハンサーはＤＮＡの同一分子上の離れた位置にあるプロモータからの転写
を増加させる遺伝子エレメントである。エンハンサーはプロモータとよく似たよ
うに組織化される。すなわち、それらは多くの個々のエレメントからなり、その
各々は１以上の転写タンパク質に結合する。エンハンサーおよびプロモータの間
の基本的な区別は操作可能である。全体としてのエンハンサー領域はある距離に
おいて転写を刺激することができる。これはプロモータ領域またはそのコンピテ
ントエレメントでは必ずしも当てはまらない。他方、プロモータは特定の部位に
おいて、かつ特定の向きにおいてＲＮＡ合成の開始を指令する１以上のエレメン
トを有するが、他方、エンハンサーはこれらの特異性を欠く。プロモータおよび
エンハンサーはしばしば重複し、かつ隣接し、しばしば非常に似たモジュール組
織化を有するように見える。
【００９３】 本発明の好ましい具体例において、発現構築物はウイスルを含むか、またはウ
イスルゲノムに由来する作成された構築物を含む。ある種のウイスルがレセプタ
媒介エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムに取り込まれ、
ウイスル遺伝子を安定かつ十分に発現する能力は、それらを、外来性遺伝子の哺
乳動物細胞への導入のための魅力的な候補とした（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８
；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌお
よびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｔｅｍｉｎ，１９８６）。遺伝子ベクターとして
使用される最初のウイスルはパポバウイルス（シミアンウイスル４０、ウシ・パ
ピローマウイルスおよびポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃ
ｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６）およびアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗ
ａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６）を含めたＤ
ＮＡウイルスであった。これらは外来性ＤＮＡ配列に対して比較的低い能力を有
し、制限された宿主スペクトルを有する。さらに、許容される細胞におけるそれ
らの癌形成性の潜在的かつ細胞病理学的効果は安全性に問題がある。それらは８
ｋＢまでの外来性遺伝物質を収容できるに過ぎないが、種々の細胞系および実験
室動物に容易に導入することができる（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅ
ｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６）。
【００９４】 ［ｉｖ．ポリアデニル化シグナル］ ｃＤＮＡ挿入断片を使用する場合、典型的には、遺伝子転写体の適切なポリア
デニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含めるのが望まれるであろう。
ポリアデニル化シグナルの性質は本発明の成功した実施に非常に重要であると考
えられず、ヒトまたはウシ成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル
のごときいずれかのそのような配列を使用することができる。また、発現カセッ
トのエレメントとして考えられるのはターミネーターである。これらのエレメン
トはメッセージのレベルを増強し、他の配列へのカセットからのリードスルーを
最小化するように働くことができる。
【００９５】 ［ｂ．遺伝子導入］ 発現ベクターを細胞に導入する多数の方法がある。本発明のある具体例におい
て、発現構築物はウイルスまたはウイルスゲノムに由来する作成された構築物を
含む。他の具体例において、非ウイルス送達が考えられる。レセプタ媒介エンド
サイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムに取り込まれ、ウイルス遺
伝子を安定かつ効果的に発現するある種のウイルスの能力は、それらを、外来性
遺伝子の哺乳動物細胞への導入するための魅力的な候補とした（Ｒｉｄｇｅｗａ
ｙ，１９９８；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｂａｉ
ｃａｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｔｅｍｉｎ，１９８６）。送達メ
カニズムは後記にてさらに議論する。
【００９６】 ［ｉ．非ウイルス導入］ 本セクションは非ウイルス的な手段による遺伝子導入の方法および組成物につ
いて検討する。本発明のＤＮＡ構築物は一般に細胞へ送達され、ある状況では、
導入すべき核酸またはタンパク質は非ウイルス方法を用いて導入することができ
る。 培養された哺乳動物細胞への発現構築物の導入のための非ウイルス方法が本発
明で考えられる。これらはリン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ
Ｄｅｒ Ｅｂ，１９７３；Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅ
ら、１９９０）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ，１９８５）エレクトロポ
レーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、
直接マイクロインジェクション（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１
９８５）、ＤＮＡ負荷リポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，１９８２；
Ｆｒａｌｅｙら、１９７９）、細胞音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８
７）、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子衝撃（Ｙａｎｇら、１９９
０）、およびレセプタ媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ，１９８７；
ＷｕおよびＷｕ，１９８８）を含む。
【００９７】 いったん構築物が細胞に送達されれば、注目する特定の遺伝子をコードする核
酸は異なる部位に位置させ、発現させることができる。ある具体例において、遺
伝子をコードする核酸は細胞のゲノムに安定に組み込むことができる。この組込
は相同組換えを介する同族位置および向きであってよく（遺伝子置換）、あるい
はそれはランダムな非特異的位置に組み込むことができる（遺伝子増加）。なお
さらなる具体例において、核酸はＤＮＡの別々のエピソームセグメントとして細
胞中で安定に維持することができる。そのような核酸セグメントまたは「エピソ
ーム」は宿主細胞周期とは独立して、またはそれと同調して維持および複製を可
能とするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのようにして細胞に送達
されるか、および細胞において核酸がどこに留まるかは使用する発現構築物のタ
イプに依存する。
【００９８】 本発明の特定の具体例において、発現構築物はリポソームに捕獲することがで
きる。リポソームはリン脂質二層膜および内方水性媒体によって特徴付けられる
小胞構築物である。多層リポソームは水性媒体によって分離された複数の脂質層
を有する。それらは、リン脂質が過剰の水性溶液に懸濁された場合に自然に形成
される。脂質成分は、閉じた構造の形成の前に自己再配置を受け、水を捕獲し、
脂質二層の間に溶質を溶解させる（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ，１９
９１）。カチオン製リポソームへのＤＮＡの添加はリポソームから光学的複屈折
液晶凝縮小滴へのトポロジー的転移を引き起こす（Ｒａｄｌｅｒら、１９９７）
。これらのＤＮＡと脂質との複合体は遺伝子送達で使用される潜在的非ウイルス
ベクターである。
【００９９】 リポソーム媒介核酸送達およびインビトロでの外来性ＤＮＡの発現は非常に成
功した。βラクタマーゼ遺伝子を用い、Ｗｏｎｇら（１９８０）は培養したヒヨ
コ肺、ＨｅＬａおよび肝癌細胞における外来性ＤＮＡのリポソーム媒介送達およ
び発現の容易性を示した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は静脈内注射後におけ
るラットでの成功したリポソーム媒介遺伝子導入を達成した。また、「リポフェ
クション」技術を含む種々の商業的アプローチが含まれる。
【０１００】 本発明のある具体例において、リポソームは血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と
で複合体化できる。これは細胞膜との融合を容易とし、リポソームカプセル化Ｄ
ＮＡの細胞侵入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。
他の具体例においてリポソームは複合体化することができるか、あるいは核非ヒ
ストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と組み合わせて使用することができる（
Ｋａｔｏら、１９９１）。なおさらなる具体例において、リポソームは複合体化
することができるか、あるいはＨＶＪおよびＨＭＧ−１双方と組み合わせて使用
することができる。そのような発現構築物がインビトロおよびインビボにおいて
核酸の導入および発現で成功して使用されてきたことにおいて、それらは本発明
で適用可能である。
【０１０１】 特定の遺伝子をコードする核酸を細胞に送達するのに使用できる他のベクター
送達系はレセプタ媒介送達担体である。これらは、ほとんどすべての真核生物細
胞におけるレセプタ媒介エンドサイトーシスによるマクロ分子の選択的摂取を利
用する。種々のレセプタの細胞特異的な分布のため、このような送達は高度に特
異的であり得る（ＷｕおよびＷｕ，１９９３）。
【０１０２】 レセプタ媒介遺伝子標的化担体は一般に２つの構成要素、細胞レセプタに特異
的リガンドおよびＤＮＡ結合剤よりなる。いくつかのリガンドがレセプタ媒介遺
伝子導入で用いられてきた。最も広く認識されているリガンドは、アシアロオロ
ソムコイド（ＡＳＯＲ）（ＷｕおよびＷｕ，１９８７）およびトランスフェリン
（Ｗａｎｇｅｒら、１９９０）である。最近、ＡＳＯＲと同一のレセプタを認識
する合成ネオグリコプロテインは遺伝子送達担体として使用され（Ｆｅｒｋｏｌ
ら、１９９３；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４）、表皮成長因子（ＥＧＦ）もまた
遺伝子を偏平癌細胞に到達するのに使用されてきた（Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ０２７
３０８５）。
【０１０３】 他の具体例において、送達担体はリガンドおよびリポソームを含むことができ
る。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）はリポソームに取り込まれたラクト
シルセラミド、ガラクトース末端アシアルガングリオシドを使用し、肝細胞によ
るインスリンの摂取の増加を観察した。
【０１０４】 本発明のもう１つの具体例において、発現構築物は単に裸の組換えＤＮＡまた
はプラスミドよりなるものでよい。構築物の導入は、物理的または化学的に細胞
膜に浸透する前記方法のいずれかによって行うことができる。これはインビトロ
での導入に特に適用できるが、それは同様にインビボの使用にも適用できるＤｕ
ｂｅｎｓｋｙら（１９８４）はＣａＰＯ4沈殿の形態のポリオーマウイルスＤＮ
Ａを成体および新生マウスの肝臓および脾臓に成功して注入し、活性なウイルス
複製および急性感染を示した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（１９
８６）は、ＣａＰＯ4沈殿プラスミドの直接的腹腔内注射の結果、トランスフェ
クトされた遺伝子が発現されることを示した。ＣＡＭをコードするＤＮＡはイン
ビボで同様に導入し、ＣＡＭを発現できると考えられる。
【０１０５】 裸のＤＮＡ発現構築物を細胞に導入する本発明のもう１つの具体例は粒子衝撃
を含むことができる。この方法はＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルを高速に
加速し、それが細胞膜を貫き、細胞を殺す事なく細胞に侵入する能力に依存する
（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。小さな粒子を加速するためのいくつかのデバイス
が開発されている。１つのそのようなデバイスは、電流を発生するための高電圧
放電により、これが動力を供給する（Ｙａｎｇら、１９９０）。使用されたマイ
クロプロジェクタイルはタングステンまたは金ビーズのごとき生物学的に不活性
な物質よりなるものであった。
【０１０６】 ある具体例において、遺伝子導入はエクス・ビボ条件下でより容易に行うこと
ができる。エクス・ビボ遺伝子適用とは動物からの細胞の管理、インビトロでの
核酸の細胞への送達、および動物への修飾された細胞の復帰をいう。これは動物
または細胞および組織の一次培養からの組織／器官の外科的摘出を含むことがで
きる。
【０１０７】 ［ｉｉ．ウイルス導入］ ［アデノウイルス］ インビボ送達での好ましい方法の１つはアデノウイルス発現ベクターの使用を
含む。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）構築物のパッキングを支持
する、および（ｂ）それにクローン化されているアンチセンスポリヌクレオチド
、タンパク質、ポリヌクレオチド（例えば、リボザイム、またはｍＲＮＡ）を発
現するのに十分なアデノウイルス配列を含有する構築物を含める意味である。こ
の文脈において、発現は遺伝子産物が合成されることを要しない。
【０１０８】 発現ベクターはアデノウイルスの遺伝子工学的に作製された形態を含む。アデ
ノウイルス、３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡウイルスの遺伝的組織化の知識は、ア
デノウイルスＤＮＡの大きな断片の７ｋｂまでの外来性配列の置換を可能とする
（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。レトロウイルスとは対
照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体組込をもたらさない。なぜなら
ば、アデノウイルスＤＮＡは潜在的遺伝子特性なくしてエピソーム様式では複製
できるからである。本明細書中で用いるごとく、用語「遺伝子特性」とは永久的
遺伝可能な宿主細胞遺伝子改変をいう。また、アデノウイルスは構造的に安定で
あって、正常誘導体の広い増幅後にゲノム再配置は検出されていない。アデノウ
イルスはその細胞周期の段階には無関係に、実質的に全ての上皮細胞を感染する
ことができる。これまで、アデノウイルス感染は非免疫抑制ヒトにおける急性呼
吸器病のごとき温和な病気のみに関連しているようである。
【０１０９】 アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作の容易性、高力価、広
い標的細胞範囲および高感染性のため遺伝子導入ベクターとして用いるのに特に
適当である。ウイルスゲノムの両方の端部は１００〜２００塩基対のインバーテ
ッドリピート（ＩＴＲ）を含有し、これはウイルスＤＮＡ複製およびパッキング
に必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、
ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分けられる、異なる転写ユニットを含む。Ｅ
１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転
写制御を担うタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現
の結果、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパ
ク質はＤＮＡ複製、後記遺伝子発現および宿主細胞シャットオフに関与する（Ｒ
ｅｎａｎ，１９９０）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含めた後記遺
伝子の産物は、主要な後記プロモータ（ＭＬＰ）によって発行された単一の一次
転写体の有意なプロセッシング後にのみ発現される。（１６．８ｍ．ｕ．に位置
した）該ＭＬＰは感染の後期段階の間に特に効果的である、このプロモータから
発行された全てのｍＲＮＡは、それらを翻訳に好ましいｍＲＮＡとする５’三部
リーダー（5'-tripartile leader）（ＴＰＬ）配列を保有する。
【０１１０】 Ｅ３領域は、Ａｄ感染細胞の効果的な溶解ならびにＴＮＦ媒介細胞溶解および
感染細胞のＣＴＬ媒介溶解の予防で必要であるように見えるタンパク質をコード
する。一般に、Ｅ４領域は７つのタンパク質をコードすると考えられ、そのうち
いくつかはＥ２プロモータを活性化する。それは宿主ｍＲＭＡ輸送をブロックし
、ウイルスＲＮＡの細胞質への輸送を増強することが示されている。さらに、Ｅ
４産物は、部分的には、感染の後期に見られる初期遺伝子発現の減少を担う。Ｅ
４は溶解増殖の間にＥ１ＡおよびＥ４発現を阻害する（しかし、Ｅ１Ｂ発現は阻
害しない）。いくつかのＥ４タンパク質が効果的なＤＮＡ複製において必要であ
るが、この関与のメカニズムは知られていない。Ｅ４はウイルス後記遺伝子発現
における転写後事象、すなわち、溶解増殖における三部リーダーの代替スプライ
シングに関与する。それにもかかわらず、Ｅ４はＤＮＡ複製に絶対的には必要で
ないが、それらが欠如すれば、複製を遅延させるであろう。他の機能はウイルス
ＤＮＡ合成の負の調節、アデノウイルス感染の間に通常は見られる核下再組織化
の誘導、およびウイルス複製、後期ウイルスｍＲＭＡ蓄積、および宿主細胞転写
シャットオフに必要な他の機能を含む。
【０１１１】 現在のシステムにおいて、組換えアデノウイルスはシャトルベクターおよびプ
ロウイルスベクターの間の相同組換えから作成される。２９３細胞における、ま
たは挿入されたｐＢＲ３２２配列のｐＪＭ１７プラスミドの自然欠失の場合にお
けるプロウイルスベクターおよびＡｄ配列の間の可能な組換えは全長の野生型Ａ
ｄ５アデノウイルスを作製することができる。従って、個々のプラークからウイ
ルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を調べるのが非常に重要である。
【０１１２】 複製が不十分な現行のアデノウイルスベクターの作製および増殖は、Ａｄ５
ＤＮＡ断片によりヒト肺腎臓細胞から形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成的に
発現する２９３と命名されたユニークなヘルパー細胞系に依存する（Ｇｒａｈａ
ｍら、１９７７）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムになくてもよいので（Ｊｏ
ｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ，１９７８）、２９３細胞の助けを借りて現行のアデノ
ウイルスベクターはＥ１、Ｅ３または双方の領域いずれかに外来性ＤＮＡを運ぶ
（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１９９１）。性質上、アデノウイルスは野
生型ゲノムのほぼ１０５％をパッケージでき（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ
ら、１９８７）、約２ｋｂ過剰のＤＮＡに対する能力を供する。Ｅ１およびＥ３
領域で置き換えることができるほぼ５．５ｋｂのＤＮＡと組み合わせて、現行の
アデノウイルスベクターの最大能力は７．５ｋｂ、またはベクターの全長の約１
５％下にある。アデノウイルスのウイルスゲノムの８０％以上がベクター骨格に
残り、ベクターで生じた細胞毒性の源である。また、Ｅ１欠失ウイルスの複製血
管は不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現の漏れが、高多重度の感染（Ｍ
ＯＩ）にて現在利用可能なベクターで観察されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９
９３；Ｓｈｅｎｋ，１９７８）。
【０１１３】 ヘルパー細胞系はヒト肺腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞または他のヒト肺間質
または上皮細胞のごときヒト細胞に由来することができる。別の方法として、ヘ
ルパー細胞はヒトアデノウイルスに許容される他の哺乳動物種の細胞に由来する
ことができる。そのような細胞は、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル肺間質もしくは
上皮細胞を含む。前記で述べたごとく、好ましいヘルパー細胞系は２９３である
。
【０１１４】 Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は２９３細胞を培養し、アデノウイルスを増殖さ
せる改良された方法を開示する。１つの様式において、天然細胞凝集体は個々の
細胞を１００−２００ｍｌの培地を含有する１リットルのシリコン化スピナーフ
ラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に接種することによって増
殖させる。４０ｒｐｍでの撹拌に続き、細胞生存率をトリパンブルーで評価する
。もう１つの様式において、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌミクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ
Ｓｔｅｒｌｉｎ，Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を以下のごとく使用する。５
ｍｌの培地中に再懸濁させた細胞接種物を２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラス
コ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加し、場合によっては撹拌しつつ、１〜４時間
静置する。次いで、培地を５０ｍｌの新鮮な培地で置き換え、震盪を開始する。
ウイルス生産のために、細胞を約８０％密集まで増殖させ、その時点の後、培地
を（最終容量の２５％まで）置き換え、０．０５のＭＯＩにてアデノウイルスを
添加する。培養を一晩静置し、その後容量を１００％まで増加させ、さらに７２
時間震盪を開始する。
【０１１５】 アデノウイルスベクターが複製欠陥である、または少なくとも条件付で欠陥で
あるという要件以外に、アデノウイルスベクターの性質は本発明の実施を成功さ
せるのに非常に重要とは考えられない。アデノウイルスは４２の異なる既知の血
清型または亜群Ａ−Ｆのいずれかであり得る。亜群Ｃのアデノウイルスタイプ５
は、本発明で用いる条件付複製欠陥アデノウイルスベクターを得るための好まし
い出発材料である。これは、アデノウイルスタイプ５が、非常に大きな生化学、
医学および遺伝学情報が知られているヒトアデノウイルスであって、それはベク
ターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築で歴史的に使用されてきた
からである。
【０１１６】 前記したごとく、本発明による典型的なベクターは複製欠陥のものであり、ア
デノウイルスＥ１領域を有しない。このように、Ｅ１コーディング配列がそれか
ら取り出された位置に注目する遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入する
のが最も便利であろう。しかしながら、アデノウイルス配列内への構築物の挿入
の位置は本発明では非常に重要というわけではない。注目する遺伝子をコードす
るポリヌクレオチドは、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）によって記載されてい
るごとくＥ３置換ベクターにおける欠失Ｅ３領域の代わりに、あるいはヘルパー
細胞系またはヘルパーウイルスがＥ４欠陥を補うＥ４領域に挿入することもでき
る。
【０１１７】 アデノウイルスは増殖させ、操作するのが容易であって、インビトロおよびイ
ンビボで広い宿主範囲を呈する。ウイルスのこの群は高力価、例えば、１ｍｌ当
たり１０9〜１０11プラーク形成単位で得ることができ、それらはかなり感染性
である。アデノウイルスの細胞周期は宿主細胞ゲノムへの組込を要しない。アデ
ノウイルスベクターによって送達された外来性遺伝子はエピソームであり、従っ
て、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスでのワクチ
ン接種の研究において副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔ
ｏｐら、１９７１）、これは、インビボでの遺伝子導入ベクターとしてのそれら
の安全性および治療的能力を示す。
【０１１８】 アデノウイルスベクターは真核生物遺伝子発現調査（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９
９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａ
ｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｘ，１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１９
９２）で使用されてきた。最近、動物実験は組換えアデノウイルスが遺伝子導入
に使用されることを示唆した（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔお
よびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａ
ｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織への組換えアデノ
ウイルスの投与における研究は気管注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）末梢静
脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ，１９９３）、鼻孔内接種（Ｇｉｎｓｂ
ｅｒｇら、１９９１）、肺へのエアロゾル投与（Ｂｅｌｌｏｎ，１９９６）、腹
腔内投与（Ｓｏｎｇら、１９９７）、胸腔内注入（Ｅｌｓｈａｍｉら、１９９６
）、膀胱内投与を用いる膀胱への投与（Ｗｅｒｔｈｍａｎら、１９９６）、腹腔
内、胸腔内、筋肉内または皮下を含めた皮下注射（Ｏｇａｗａ、１９８９）、心
筋層への心室注射（心臓、Ｆｒｅｎｃｈら、１９９４）、肺灌流（肝臓動脈また
は門静脈、（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら、１９９７）および脳への定位接種（Ｌｅ
Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅｓら、１９９３）を含む。
【０１１９】 ［レトロウイルス］ レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞によってそれらのＲＮ
Ａを二本鎖ＤＮＡに変換する能力によって特徴付けられる一本鎖ＲＮＡウイルス
の群である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。次いで、得られたＤＮＡはプロウイル
スとして細胞染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指令する
。組み込みの結果、レセプタ細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列を
保持する。レトロウイルスゲノムは、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素
およびエンベロープ構成要素を各々コードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌお
よびｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子から上流で見い出された配列はビリオンへ
のゲノムのパッキングのためのシグナルを含有する。２つのロングターミナルリ
ピート（ＬＴＲ）配列はウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これ
らは強力なプロモータおよびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組込
に必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
【０１２０】 レトロウイルスベクターを構築するためには、注目する遺伝子をコードする核
酸を、ある種のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して複製欠陥であ
るウイルスを得る。ビリオンを生産するためには、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎ
ｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびパッキング構成要素を含まないパッキング
細胞を構築する（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッキ
ング配列と共に、ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドを（例えば、リン酸カル
シウム沈殿によって）この細胞系に導入すると、パッキング配列は組換えプラス
ミドのＲＮＡ転写体をウイルス粒子にパッケージさせ、次いで、これを培養培地
に分泌させる（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍ
ｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含
有する培地を収集し、所望により濃縮し、遺伝子導入のために使用する。レトロ
ウイルスベクターは広く種々の細胞タイプを感染させることができる。しかしな
がら、組込および安定な発現は宿主細胞の分裂を要する（Ｐａｓｋｉｎｄら、１
９７５）。
【０１２１】 レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能とするように設計された新規な
アプローチが、最近、ラクトース残基のウイルスエンベロープへの化学的添加に
よるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて開発された。この修飾はシアロ糖タ
ンパク質レセプタを介する肝臓細胞の特異的感染を可能とできる。
【０１２２】 組換えレトロウイルスの標的化に対する異なるアプローチが設計されており、
ここに、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するおよび特異的細胞レセ
プタに対するビオチン化抗体が用いられた。抗体はストレプトアビジンを用いる
ことによってビオチン構成要素を介してカップリングされた（Ｒｏｕｘら、１９
８９）。主要組織適合複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用い
、それらは、インビトロでエコトロピックウイルスとでそれらの表面抗原を運ぶ
種々のヒト細胞の感染を示した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０１２３】 本発明の全ての態様におけるレトロウイルスベクターの使用に対してある限定
がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノム中のランダム部
位に組み込まれる。これは、宿主遺伝子の中断を介して、またはフランキング遺
伝子の機能に干渉し得るウイルス調節配列の挿入を介して挿入突然変異誘発に至
り得る（Ｖａｒｍｕｓら、１９８１）。欠陥レトロウイルスベクターの使用に関
するもう１つの関心は、パッキング細胞における野生型の複製コンピテントウイ
ルスの潜在的出現である。これは、組換えウイルスからの無傷配列が宿主細胞ゲ
ノムに組み込まれたｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ配列から上流に挿入される組換え事
象に由来し得る。しかしながら、組換えの確立を大いに減少させる新しいパッキ
ング細胞系が今日利用できる（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８；Ｈｅｒｓｄｏ
ｒｆｆｅｒら、１９９０）。
【０１２４】 ヘルペスウイルス。単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）はニューロトロピックである
ので、それは中枢神経障害を治療するにおいてかなりの興味を生じた。さらに、
潜伏期間の間に活性であるプロモータの存在と共に、宿主細胞染色体に組み込ま
れるか、またはそうでなければ宿主細胞の代謝を変更することなく非分裂ニュー
ロン細胞において潜伏感染を確立するＨＳＶの能力はＨＳＶを魅力的なベクター
とする。多くの注意がＨＳＶのニューロトロピック適用に焦点を当ててきたが、
このベクターはその広い宿主範囲を仮定すれば他の組織のために開発することも
できる。
【０１２５】 ＨＳＶを魅力的なベクターとするもう１つの因子はゲノムのサイズおよび組織
化である。ＨＳＶは大きいので、複数遺伝子または発現カセットの組込は他のよ
り小さなウイルス系におけるよりも問題が少ない。加えて、変動する性能（一時
的、強度等）を持つ、異なるウイルス制御配列の利用可能性は、他の系における
よりも余計に発現を制御できるようにする。また、ウイルスが比較的少数のスプ
ライスされたメッセージを有し、さらに遺伝子操作を容易とするのは利点である
。
【０１２６】 ＨＳＶは操作するのは比較的容易であって、高力価まで増殖させることができ
る。このように、十分なＭＯＩを達成するのに必要な容量において、および反復
した投与の低下した必要性において、送達は問題が少ない。遺伝子導入ベクター
としてのＨＳＶのレビューについては、Ｇｌｏｒｉｏｓｏら（１９９５）参照。
【０１２７】 サブタイプ１および２と命名されたＨＳＶは、ヒトが遭遇する最も通常の感染
性物質のうち世界的に数百万人のヒト対象に感染しているエンベロープがあるウ
イルスである。大きくて複雑な二本鎖ＤＮＡゲノムは数ダースの異なる遺伝子産
物をコードし、そのうちのいくつかはスプライスされた転写体に由来する。ビリ
オンおよびエンベロープ構造成分に加えて、このウイルスはプロテアーゼ、リボ
ヌクレオチドレダクダーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ｓｓＤＮＡ結合タンパク質、
ヘリカーゼ／プリマーゼ、ＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ、ｄＵＴＰａｓｅその他を
含めた多数の他のタンパク質をコードする。
【０１２８】 ＨＳＶ遺伝子は、その発現が協同的に調節され、順次カスケード様に命令され
るいくつかの群を形成する（ＨｏｎｅｓｓおよびＲｏｉｚｍａｎ，１９７４；Ｈ
ｏｎｅｓｓおよびＲｏｉｚｍａｎ １９７５；ＲｏｉｚｍａｎおよびＳｅａｒｓ
，１９９５）。α遺伝子、感染後に発現される遺伝子の最初の組の発現はビリオ
ンタンパク質数１６またはα変換因子によって増強される（Ｐｏｓｔら、１９８
１；ＢａｔｔｅｒｓｏｎおよびＲｏｉｚｍａｎ，１９８３）。β遺伝子の発現は
、α４遺伝子によってコードされる機能的α遺伝子産物、最も注目すべきＩＣＰ
４を要する（ＤｅＬｕｃａら、１９８５）。γ遺伝子、ビリオン構造タンパク質
を大いにコードする遺伝子の不均一群は最適発現にウイルスＤＮＡ合成の開始を
必要とする（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９８０）。
【０１２９】 ゲノムの複雑性と一致して、ＨＳＶのライフサイクルはかなり不明確である。
ウイルス粒子の合成および結局は細胞の死滅をもたらす溶解サイクルに加えて、
ウイルスは潜伏状態に入る能力を有し、そこでは、まだ明らかとされていないシ
グナルのいくつかが溶解サイクルの再発をトリガーするまでゲノムは神経節に維
持される。ＨＳＶの無毒性変種が開発されており、遺伝子導入の意味で使用する
のに容易に入手できる（米国特許第５，６７２，３４４号）。
【０１３０】 ［アデノ関連ウイルス］ 最近、より通常に使用されるレトロウイルスおよびアデノウイルスベクターの
潜在的代替としてアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）が出現した。レトロウイルスお
よびアデノウイルス媒介遺伝子導入に関する研究は前者の潜在的癌形成特性、お
よび後者に関連する免疫原性の問題についての関心を生じさせたが、ＡＡＶはい
ずれかのそのような病理学的兆候とは関連付けられたことがなかった。
【０１３１】 加えて、ＡＡＶは、それを他のベクターよりも望ましいものとするいくつかの
ユニークな特徴を保有する。レトロウイルスとは異なり、ＡＡＶは非分裂細胞に
感染でき、野生型ＡＡＶは、ヒト細胞の染色体１９への部位特異的組込によって
特徴付けられており（ＫｏｔｉｎおよびＢｅｒｎｓ，１９８９；Ｋｏｔｉｎら、
１９９０；Ｋｏｔｉｎら、１９９１；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９９１）；および
ＡＡＶは抗ガン形成特性を保持する（Ｏｓｔｒｏｖｅら、１９８１；Ｂｅｒｎｓ
およびＧｉｒａｕｄ，１９９６）。組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ＩＴＲの間
に注目するＤＮＡ配列を分子的にクローニングし、野生型ＡＡＶゲノムの全コー
ディング配列を排除することによって構築される。そのように生産されたＡＡＶ
ベクターは野生型ＡＡＶのコーディング配列のいずれも欠くが、インビトロおよ
びインビボ双方での変換に際して組換え遺伝子の安定な染色体組込および発現の
特性を保有する（Ｂｅｒｎｓ，１９９０；ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｓｋｙ，
１９８７；Ｂｅｒｔｒａｎら、１９９６；Ｋｅａｍｓら、１９９６；Ｐｏｎｎａ
ｚｈａｇａｎら、１９９７ａ）。最近まで、ＡＡＶはほとんど全ての細胞型に感
染し、種の障害を交差さえすると考えられた。しかしながら、今日ではＡＡＶ感
染はレセプタ媒介されると判断されている（Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら、１９９
６；Ｍｉｚｕｋａｎｉら、１９９６）。
【０１３２】 ＡＡＶは約４７００塩基対の線状一本鎖ＤＮＡを利用する。インバーテッドタ
ーミナルリピートはゲノムに隣接してそれを挟む。２つの遺伝子はゲノム内に存
在し、多数の区別される遺伝子産物を生じる。第１のＣＡＰ遺伝子はＶＰ−１、
ＶＰ−２およびＶＰ−３と命名された３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）
を生じる。第２のｒｅｐ遺伝子は４つの非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする
。１以上のこれらのｒｅｐ遺伝子産物がＡＡＶ転写をトランス活性化するのを担
う。ＡＡＶの配列はＳｒｉｖａｓｔａｖａら、（１９８３）および米国特許第５
，２５２，４７９号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に
よって供される。
【０１３３】 ＡＡＶにおける３つのプロモータはゲノム中でマップ単位にてその位置によっ
て命名される。これらは左から右にｐ５、ｐ１９およびｐ４０である。転写は６
つの転写体を生じ、２つは３つのプロモータの各々において開始され、各対の１
つはスプライスされる。マップ単位４２〜４６に由来するスプライス部位は各転
写体につき同一である。４つの非構造タンパク質は、明らかに、転写体のより長
いもの、および３つのビリオンタンパク質は全て最も小さい転写体から生じる。
【０１３４】 ＡＡＶはヒトにおけるいずれの病理学的状態にも関係しない。興味深いことに
は、効果的な複製では、ＡＡＶは単純疱疹ウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロ
ウイルス、偽狂犬病ウイルスおよび、もちろん、アデノウイルスのごときウイル
スからの「助け」機能を必要とする。ヘルパー類のうち、最もよく認識されてい
るのはアデノウイルスであり、このウイルスについての多くの「初期」機能はＡ
ＡＶ複製を助けることが示されている。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の低レベルの
発現はＡＡＶ構造発現を抑制しておくと考えられ、ヘルパーウイルス感染はこの
ブロックを除去すると考えられる。
【０１３５】 ［ワクシニアウイルス］ ワクシニアウイルスベクターは、その構築の容易性、得られた発現の比較的高
レベル、広い宿主範囲およびＤＮＡを運ぶ大きな能力のため広く使用されてきた
。ワクシニアは顕著な「Ａ−Ｔ」優先性を呈する約１８６ｋｂの線状二本鎖ＤＮ
Ａゲノムを含有する。約１０．５ｋｂのインバーテッドターミナルリピートは近
接してゲノムを挟む。必須の遺伝子の大部分は、ポックスウイルスの間で最も高
度に保存された中枢領域内にマップされるようである。ワクシニアウイルスにお
ける見積もられるオープンリーディングフレームは１５０〜２００の数である。
両方のストランドともコードしているが、かなりのリーディングフレームの重複
は共通ではない。
【０１３６】 少なくとも２５ｋｂはワクシニアウイルスゲノムに挿入することができ（Ｓｍ
ｉｔｈおよびＭｏｓｓ，１９８３）。プロトタイプのワクシニアベクターは相同
組換えを介してウイルスチミジンキナーゼ遺伝子に挿入されたトランスジーンを
含有する。ベクターはｔｋ表現型に基づいて選択される。脳心筋炎ウイルスの非
翻訳リーダー配列を含めると、発現のレベルは通常のベクターのものよりも高く
、トランスジーンは２４時間以内に感染した細胞のタンパク質の１０％以上で蓄
積する（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら、１９８９）。
【０１３７】 ［ｃ．選択方法］ 一次哺乳動物細胞培養は種々の方法で調製することができる。細胞がインビト
ロで発現構築物と接触しつつ生存を維持するためには、細胞が正しい比率の酸素
および二酸化炭素ならびに栄養素との接触を維持するが、微生物汚染から保護さ
れていることを保証するのは重要である。細胞培養技術はよく記載されており、
文献によって開示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｒ，１９９２）。
【０１３８】 前記の１つの具体例はタンパク質の生産用の細胞を不死化させるための遺伝子
導入の使用を含む。注目するタンパク質についての遺伝子は前記したごとく適当
な宿主細胞に導入し、続いて適当な条件下で細胞を培養することができる。実質
的にいずれのポリペプチドについての遺伝子もこのように使用できる。組換え発
現ベクターの作製、およびそこに含まれるエレメントは後に議論する。別の方法
として、生産すべきタンパク質は問題の細胞によって通常は合成される内因性タ
ンパク質であり得る。
【０１３９】 有用な哺乳動物宿主細胞系の例はＶｅｒｏおよびＨｅＬａ細胞ならびにチャイ
ニーズハムスター卵巣、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、
ＮＩＨ３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞の細胞系である。加えて、挿入された
配列の発現を変調し、所望の様式で遺伝子産物を修飾し処理する宿主細胞株を選
択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化
）およびプロセッシング（例えば、切断）はタンパク質の機能で重要であり得る
。異なる宿主細胞はタンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾の特徴および
特異的メカニズムを有する。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現される
外来性タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを保証することができる。
【０１４０】 このように、細胞への発現構築物の導入に続き、レポータ遺伝子の発現は慣用
的手段によって測定することができる。レポータ遺伝子によってコードされるタ
ンパク質を直接検出することによって、またはレポータ遺伝子がコードする酵素
の酵素産物を検出することによってのいずれかでレポータ遺伝子の産物を検出す
るいずれのアッセイも本発明で用いるのに適する。アッセイは比色、蛍光または
ルミネセンスアッセイ、あるいはタンパク質標識の場合にはラジオイムノアッセ
イまたは他の免疫学的アッセイを含む。トランスフェクション効率は、レポータ
遺伝子に作動可能に連結された構成的に活性なプロモータを含む発現構築物を共
トランスフェクトすることによりモニターすることができる。
【０１４１】 限定されるものではないが、各々、ｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ細胞にお
けるＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含めた多
数の選択系を用いることができる。また、抗代謝産物抵抗性を、抵抗性を付与す
るｄｈｆｒ、マイコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ、アミノグリ
コシドＧ４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ、およびヒグロマイシンに対す
る抵抗性を付与するｈｙｇｒｏについての選択の基礎として用いることができる
。
【０１４２】 動物細胞はインビトロで２つの様式、つまり細胞のバルクを通じて懸濁液中で
増殖する足場非依存性細胞として、またはその増殖のための個体基材への付着を
必要とする足場依存性細胞（すなわち、単層タイプの細胞増殖）として増殖させ
ることができる。
【０１４３】 ［７．トランスジーン発現のモニタリング］ ＭＥＦ２指標構築物が首尾よくトランスジェニック動物のゲノムに組み込まれ
たか否かを判断するために、種々の異なるアッセイを行うことができる。トラン
スジェニック動物はそれらのＤＮＡを分析することによって識別することができ
る。この目的では、トランスジェニック動物が齧歯類である場合、尾の試料（１
〜２ｃｍ）を３週齢動物から摘出することができる。次いで、これらまたは他の
試料からのＤＮＡを調製し、サザンブロット、ＰＣＲ、またはスロットブロット
によって分析して、トランスジェニック創始者（Ｆ0）動物およびそれらの子孫
（Ｆ1およびＦ2）を検出することができる。
【０１４４】 ［ａ．病理学的研究］ トランスジーンを運ぶ種々のＦ０、Ｆ１およびＦ２動物を、免疫組織学、電子
顕微鏡、心電図記録法および全および領域的心臓の重量の測定、心筋細胞の断面
積の測定および心筋細胞の数の測定を含めた種々の技術のいずれかによって分析
することができる。適当な特異性の抗体を用いることによるトランスジーンの発
現のための免疫組織学的分析は既知の方法を用いて行うことができる。領域的重
量、心筋細胞の断面積および心筋細胞の核の数を測定する形態学的分析は既知の
方法を用いて行うことができる。心臓は胎児心臓遺伝子の機能、組織学および発
現につき分析することができる。
【０１４５】 免疫ベースの分析において、指標結合抗体に頼る必要があるであろう。抗体生
産技術の一般的なレビューが提供されている。当該分野で周知のように、与えら
れた組成物はその免疫原性において変化し得る。従って、ペプチドまたはポリペ
プチド免疫原を担体にカップリングすることによって達成できるごとく、宿主免
疫系にブースト注射することがしばしば必要である。例示的および好ましい担体
はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブ
ミンのごとき他のアルブミンを担体として使用することもできる。担体タンパク
質にポリペプチドを接合するための手段は当該分野で周知であり、グルタルアル
デヒドｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カ
ルボジイミドおよびビスビアゾ化ベンジジン（bis-biazotized benzidine）を含
む。
【０１４６】 特定の免疫原組成物の免疫原性はアジュバントとして知られる、免疫応答の非
特異的刺激物質の使用によって増強させることができる。例示的および好ましい
アジュバントはフロイントの完全アジュバント（殺されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する免疫応答の非特異的刺激物質）、
フロイントの不完全アジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントを含む
。
【０１４７】 ポリクローナル抗体の生産で用いられる免疫原組成物の量は免疫原の性質なら
びに免疫化で使用される動物に応じて変化する。種々の経路を用いて免疫原を投
与することができる（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内）。ポリクロー
ナル抗体の生産は、免疫化に続く種々の時点で免疫化された動物の血液をサンプ
リングすることによってモニターすることができる。第２のブースター注射を与
えることもできる。ブースティングおよびティターリングのプロセスは適当な力
価が達成されるまで反復する。所望のレベルの免疫原性が得られれば、免疫化動
物から血液を採取し、血清を単離し保存し、および／または該動物を用いてｍＡ
ｂｓを生じさせることができる。
【０１４８】 ポリクローナル抗体は、ＭＥＦ２ポリペプチドまたはその断片を含む免疫原で
動物を免疫化し、その免疫化動物から抗血清を収集することによって調製される
。広い範囲の動物種を抗血清の生産で用いることができる。典型的には抗抗血清
の生産で用いられる動物はウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモッ
トである。ウサギの比較的大きな血液容量のため、ポリクローナル抗体の生産で
はウサギが好ましい選択で有り得る。
【０１４９】 モノクローナル抗体を得るには、やはり実験動物を抗原性組成物で免疫化する
。次いで、抗体を生じるのに十分な時間の後、当該動物から脾臓またはリンパ節
細胞の集団を得る。次いで、脾臓またはリンパ節をヒトもしくはマウス骨髄腫株
のような細胞系と融合させて抗体分泌ハイブリドーマを生産することができる。
これらのハイブリドーマを単離して個々のクローンを得ることができ、次いで、
これを所望の標的ペプチドに対する抗体の生産につきスクリーニングすることが
できる。
【０１５０】 本発明のモノクローナル抗体はＥＬＡＳＡおよびウエスタンブロット方法など
の標準的な免疫化学手法、ならびにＭＥＦ２エピトープに特異的な抗体を利用す
ることができる他の手法において有用な適用を見い出すと考えられる。加えて、
ＭＥＦ２に特異的なモノクローナル抗体は他の有用な適用で利用することができ
ると考えられる。例えば、抗ＭＥＦ２抗体に対する抗イディオタイプ抗体はＭＥ
Ｆ２結合部位をよく模倣することができ、このように、ＭＥＦ２標的の識別のた
めのツールを提供する。
【０１５１】 ［ｂ．ｍＲＮＡレベルによるトランスジーン発現の分析］ メッセンジャーＲＮＡは、これに限定されるものではないが、酸性チオシアン
酸グアニジニウムフェノール、クロロホルム抽出方法を含めた当該分野で知られ
たいずれかの方法によってトランスジェニック動物の細胞系および組織から単離
して（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ １９８７）、ノーザンブロ
ット、ＲＮＡｓｅおよびヌクレアーゼ保護アッセイにより発現レベルを測定する
ことができる。
【０１５２】 ［ｃ．タンパク質レベルを測定することによるトランスジーン発現の分析］ タンパク質レベルは、トランスジーンによってコードされたタンパク質につき
特異的な１以上の抗体を用い、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡおよびラジ
オイムノアッセイを含めた当該分野で知られたいずれかの手段によって測定する
ことができるが、これらに限定されるものではない。
【０１５３】 ウエスタンブロット分析では、タンパク質画分を組織ホモジネートおよび細胞
溶解物から単離し、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
ＮＹ；１９８８）；Ｂｒｏｗｎら（１９８３）；およびＴａｔｅ−Ｏｓｔｒｏｆ
ｆら（１９８９）によって記載されているごとくウエスタンブロット分析に付す
ことができる。
【０１５４】 例えば、タンパク質画分はＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で変性し、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル上の電気泳動に付すことができる。次いで、タンパク質を電
気ブロッティングによってニトロセルロースフィルターに移す。該フィルターを
ブロックし、一次抗体と共にインキュベートし、最後に酵素結合二次抗体と反応
させることができる。適当な色原体基質での引き続いてのインキュベーションは
トランスジーンがコードするタンパク質の位置を明らかにする。
【０１５５】 ＥＬＩＳＡは好ましくは本発明と組み合わせて用いられる。例えば、ＥＬＩＳ
Ａアッセイを行うことができ、ここに、試料からの標的タンパク質を選択された
表面、好ましくはポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのごときタン
パク質親和性を呈する表面に固定化する。該プレートを洗浄して不完全に吸着し
た物質を除去し、プレートを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは
粉末化ミルクの溶液のごとき、テスト抗体に関して抗原的に中性であることが知
られている非特異的タンパク質でコートする。これは、固定化表面上の非特異的
吸着部位のブロッキングを可能とし、このように、表面への抗血清の非特異的結
合によって引き起こされたバックグラウンドを低下させる。
【０１５６】 次に、抗体を、免疫複合体（抗原／抗体）形成に対して導電的にプレートに付
加する。そのような条件は、好ましくは、ＢＳＡ、ウシ・ガンマグロブリン（Ｂ
ＧＧ）およびリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／ＴｗｅｅｎRのごとき希釈剤
で抗血清／抗体を希釈することを含む。また、これらの添加された物質は非特異
的バックグラウンドの低下を助ける傾向にある。次いで、プレートを好ましくは
約２５℃〜約２７℃のオーダーの温度にて約２〜４時間インキュベートする。イ
ンキュベーションに続き、プレートを洗浄して免疫複合化していない物質を除去
する。好ましい洗浄方法は、ＰＢＳ／ＴｗｅｅｎRまたはホウ酸緩衝液などの溶
液での洗浄を含む。
【０１５７】 試料と抗体との特異的免疫複合体の形成、および引き続いての洗浄の後、プレ
ートを第２の抗体プローブに付すことによって免疫複合体形成の発生および量を
測定することができる第２の抗体は第１のものに対して特異性を有する（通常、
第１のもののＦｃ部分は標的である）。検出手段を供するために、第２の抗体は
、好ましくは、適当な色原体基質とのインキュベーションに際して発色を生じる
であろう関連酵素を有する。このように、例えば、免疫複合体形成の発生を好都
合とする時間および条件下で、抗体結合表面をウレアーゼまたはペルオキシダー
ゼ接合抗ヒトＩｇＧと接触させインキュベートするのが望まれるであろう（例え
ば、ＰＢＳ／ＴｗｅｅｎRのごとき溶液を含有するＰＢＳ中での室温にての２時
間のインキュベーション）。
【０１５８】 第２の酵素標識された抗体とのインキュベーション、および引き続いて行う未
結合物質を除去するための洗浄の後、尿素およびブロモクレゾールパープルまた
は２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸
（ＡＢＴＳ）のごとき色原体および酵素標識としてのペルオキシダーゼの場合の
Ｈ2Ｏ2とのインキュベーションによって標識の量が定量される。次いで、例えば
、可視スペクトル領域の分光光度計を用いて色の発生の程度を測定することによ
って定量が達成される。このアッセイならびに完全に異なるアッセイ（ラジオイ
ムノ沈殿、イムノアフィニティークロマトグラフ、ウエスタンブロット）での変
動もまた本発明の一部として考えられる。
【０１５９】 ＥＬＩＳＡの変形は酵素結合凝集アッセイ、またはＥＬＣＡ（米国特許第４，
６６８，６２１号）であり、これは普遍的な検出として標識酵素ＲＶＶ−ＸＡと
組み合わせた凝集カスケードを用いる。本発明のためのこのシステムの利点は、
凝集反応が広く種々の緩衝液の存在下で生理学的ｐＨで実行できることである。
従って、複合体分析の一体性を保持することができる。
【０１６０】 本発明に含まれる他のイムノアッセイは、限定されるものではないが、米国特
許第４，３６７，１１０号（二重モノクローナル抗体サンドイッチアッセイ）お
よび米国特許第４，４５２，９０１号（ウエスタンブロット）に記載されている
ものを含む。他のアッセイは標識されたリガンドの免疫沈降および免疫細胞化学
（インビトロおよびインビボ双方）を含む。
【０１６１】 ［８．心肥大の活性調節因子についてのスクリーニング］ また、本発明では、心肥大を阻害する化合物の能力について、化合物をスクリ
ーニングすることが考えられる。この病気を模倣する細胞、器官および生物シス
テムを作り出す本発明者らの能力は、治療活性について種々の化合物をテストす
る理想的な設定を提供する。特に好ましい化合物は心肥大を阻害し、および心臓
病を予防または逆行させるのに有用なものである。本発明のスクリーニングアッ
セイにおいて、候補基質をまず基本的な生化学活性、例えば、標識分子への結合
につきスクリーニングし、次いで、細胞、組織または全動物レベルで肥大表現型
を阻害するその能力につきテストすることができる。
【０１６２】 ［ａ．阻害剤およびアッセイの様式］ ［ｉ．アッセイの形成］ 本発明は、心肥大の阻害剤につきスクリーニングする方法を提供する。このス
クリーニング技術は、心肥大をブロックし、および／またはいったん発生すれば
心肥大を低下させる化合物の識別に有用であろうことが判明する。これらの具体
例において、本発明は、（ａ）肥大表現型を呈するＭＥＦ２誘導性調節配列の制
御下にある指標遺伝子を含有する心臓細胞を供するステップと、（ｂ）該細胞を
候補阻害剤と接触させるステップと、（ｃ）該候補阻害剤で処理していない同様
の細胞と比較して、指標遺伝子発現に対する効果につき該細胞をモニターするス
テップとを一般的に含む、肥大を阻害する候補物質の能力を測定する方法につい
てのものである。
【０１６３】 １つの態様において、細胞は、ＢＺＬＦ１およびデスミン遺伝子からの転写制
御因子（ＴＲＥ）を含めた種々の制御因子の制御下にある指標遺伝子を発現する
。これらのエレメントはＭＥＦ２によって調節され、制御された指標遺伝子の発
現を通じて、ＭＥＦ２転写アクチベーター活性の尺度を提供する。ＭＥＦ２制御
に従ういずれの制御因子を利用することもでき、後記の実施例によって示される
ごとく、ＭＥＦ２によって影響されるＴＲＥの１以上の反復を供するのは有用で
あろう。指標遺伝子はｌａｃＺ、ＧＦＰルシフェラーゼおよび他の同様のマーカ
ーを含む。
【０１６４】 好ましい態様において、細胞は、ＭＥＦ２結合部位の３つのタンデムコピーの
制御下でｌａｃＺを発現する。ある具体例において、ＭＥＦ２経路に関与する他
の遺伝子を改変して同一効果を達成することができる。
【０１６５】 ［ｉｉ．ＭＥＦ２の阻害剤およびアクチベーター］ 本発明による阻害剤は、ＭＥＦ２の上流または下流でその阻害効果を発揮する
か、または直接ＭＥＦ２に対して阻害効果を発揮するものであり得る。本発明の
スクリーニング方法によって識別される阻害剤のタイプに関わらず、そのような
化合物による阻害の効果の結果、添加された候補物質の不存在下で、心肥大、ま
たはそのいくつかの関連する生化学または生理学的態様、例えば、増殖、Ｃａ++ 依存性遺伝子発現等がもたらされる。
【０１６６】 ［ｉｉｉ．候補物質］ 本明細書中で用いるように、用語「候補物質」とは、心肥大を潜在的に阻害で
きるいずれの分子をもいう。候補物質はタンパク質もしくはその断片、小分子阻
害剤、または核酸分子でさえあり得る。最も有用な薬理学的化合物は、サイクロ
スポリンＡおよびＦＫ５０６のごとき、肥大の他の既知の活性調節因子に構造的
に関連する化合物であろうことが当てはまると判明するであろう。そのような努
力は、しばしば、「合理的なドラッグデザイン」として知られており、既知の阻
害剤との比較のみならず標的分子の構造に関連する予測も含む。
【０１６７】 合理的なドラッグデザインの目標は、生物学的に活性なポリペプチドまたは標
的化合物の構造的類似体を作り出すことである。そのようなアナログを作り出す
ことによって、改変に対して異なる感受性を有する、または種々の他の分子の機
能に影響し得る天然分子よりも活性または安定である薬物を作り出すことが可能
である。１つのアプローチにおいて、ＭＥＦ２のような分子についての三次元構
造、またはその断片が作り出され、それにより、ＭＥＦ２の競合阻害剤が作り出
されるであろう。これは、Ｘ線結晶学、コンピューターモデリング、または双方
のアプローチの組合せによって達成することができる。
【０１６８】 また、抗体を用いて標的化合物または阻害剤の構造を確認することもできる。
原理的には、このアプローチは、引き続いてのドラッグデザインがそれに基づく
ファルマコア（pharmacore）を生じる。機能的薬理学的に活性な抗体に対する抗
イディオタイプ抗体を生じさせることによって、タンパク質結晶学を用いること
を回避することができる。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は元
の抗原のアナログであると予測されるであろう。次いで、抗イディオタイプを用
いて、化学的にまたは生物学的に生産されたペプチドのバンクからペプチドを識
別し単離することができる。次いで、選択されたペプチドはファルマコアとして
働くであろう。抗イディオタイプは、抗原として抗体を用い、抗体を生産するた
めの本明細書中に記載された方法を用いて作製することができる。
【０１６９】 他方、有用な化合物の識別を「強く推し進める」努力において、有用な薬物に
対する基本的な基準を満たすと考えられる小分子ライブラリーを種々の商業的源
から単に獲得することができる。コンビナトリアル作製ライブラリー（例えば、
ペプチドライブラリー）を含めたこのようなライブラリーのスクリーニングは、
活性につき非常に多数の関連（および未関連）化合物をスクリーニングする迅速
かつ効果的な方法である。コンビナトリアルアプローチは、活性ではあるが望ま
しくない化合物から作った第２、第３および第４世代の化合物の作製による潜在
的薬物の迅速な進化に導く。
【０１７０】 候補化合物は天然に生じる化合物の断片または一部を含むことができるか、あ
るいは不活性な既知化合物の活性組み合せとして見い出すことができる。動物、
細菌、菌類、葉および皮を含めた植物源、および海洋試料のごとき天然源から単
離された化合物は、潜在的に有用な医薬剤の存在につき候補としてアッセイする
ことができると考えられる。スクリーニングすべき医薬剤は化学組成物または腎
臓化合物に由来することができるかまたはそれから合成することができると理解
される。このように、本発明によって識別される候補物質はポリペプチド、ポリ
ヌクレオチド、小分子阻害剤、あるいは肥大応答の既知の阻害剤から出発して合
理的ドラッグデザインを介して設計することができるいずれの他の化合物であっ
てもよいことが理解される。
【０１７１】 他の適当な阻害剤はアンチセンス分子、リボザイム、および（一本鎖抗体を含
む）抗体を含み、その各々はＭＥＦ２経路内に位置する標的に特異的であろう。
そのような化合物は本明細書中の他の箇所でもっと詳細に記載される。例えば、
ＭＥＦ２の翻訳または転写開始部位に結合したアンチセンス分子、またはＭＥＦ
２に結合した抗体は理想的な候補阻害剤であろう。
【０１７２】 ある状況において「有効量」は、その正常レベルと比較して細胞からの肥大を
再現性よく減少させるのに効果的な量である。活性のかなり適当な変化を達成す
る化合物が用いられるであろう。
【０１７３】 例えば、心筋細胞増殖、Ｃａ++応答、心臓遺伝子発現等を用いて測定して、心
肥大の有意な変化は、少なくとも約３０％〜４０％の活性の減少、最も好ましく
は少なくとも約５０％の変化によって表され、より高い値はもちろん可能である
。また、本発明の活性化合物は、次いで、さらにそのような阻害剤を検出し定量
するための分析および調製技術で用いることができる抗体の作製で使用すること
もできる。
【０１７４】 もちろん、本発明の全てのスクリーニング方法は、効果的な候補を見い出すこ
とはできないという事実にかかわらずそれ自体有用であるということが理解され
るであろう。本発明は、そのような候補を見い出す方法のみならずそのような候
補をスクリーニングする方法を提供する。
【０１７５】 ［ｂ．インビトロアッセイ］ 迅速な安価かつ容易な実行すべきアッセイは結合アッセイである。標的への分
子の結合は、立体的、アロステリックまたは電荷と電荷との相互作用のため、内
在的にかつそれ自体が阻害的であり得る。これは溶液中でまたは固相で実行する
ことができ、より精巧なスクリーニングアッセイに移す前にある化合物を迅速に
排除するための第１ラウンドのスクリーニングとして利用することができる。こ
の種の１つの具体例において、ＭＥＦ２分子またはその断片に結合する化合物の
スクリーニングが提供される。
【０１７６】 標的は溶液中で遊離しているか、支持体に固定されているか、細胞中または細
胞の表面で発現されるか、のいずれかであり得る。標的または化合物いずれかを
標識することができ、それにより、結合の測定が可能である。もう１つの具体例
において、アッセイは標的の天然もしくは人工基材または（ＭＥＦ２のごとき）
結合パートナーへの結合の阻害を測定することができる。競合結合アッセイを行
うことができ、ここに、物質の１つ（例えば、ＭＥＦ２）を標識する。通常、標
的は標識された種であり、結合する部位の機能と干渉するであろう機会を低下さ
せる。結合または結合の阻害を測定するための遊離標識対結合標識の量を測定す
ることができる。
【０１７７】 化合物の高スループットスクリーニングのための技術はＷＯ８４／０３５６４
に記載されている。非常に多数の小ペプチドテスト化合物はプラスティックピン
またはいくつかの他の表面のごとき個体基材上で合成される。ペプチドテスト化
合物は、例えば、ＭＥＦ２と反応し、洗浄される。結合したポリペプチドは種々
の方法によって検出される。
【０１７８】 ＭＥＦ２のごとき精製された標的は、前記薬物スクリーニング技術で用いられ
るプレート上に直接コートすることができる。しかしながら、ポリペプチドに対
する非中和抗体を用いてポリペプチドを固相に固定化することができる。また、
反応領域（好ましくは、末端領域）を含有する融合タンパク質を用いて活性領域
（例えば、ＭＥＦ２のＣ末端）を固相にリンクさせることができる。
【０１７９】 ［ｃ．イン・サイトアッセイ］ 心肥大特徴を呈する種々の細胞系を候補物質のスクリーニングへ利用すること
ができる。例えば、前述した作成された指標を含有する細胞を用いて、候補化合
物の種々の機能的属性を研究することができる。そのようなアッセイにおいて、
その生物学的性質を仮定すれば、化合物は適切に処方され、標的細胞と接触する
であろう。
【０１８０】 アッセイに依存して、培養が必要であり得る。前記したごとく、次いで、多数
の異なる生理学的アッセイによって細胞を調べることができる（増殖、サイズ、
Ｃａ++効果）。別の方法として、分子分析を行うことができ、ＭＥＦ２の機能お
よび関連経路を開発することができる。これは、タンパク質発現、酵素機能、基
質利用、ｍＲＮＡ発現（全細胞またはポリＡ ＲＮＡの異なる表示）その他につ
いてのもののごときアッセイを含む。
【０１８１】 ［ｄ．インビボアッセイ］ 本発明では、特に、種々の動物モデルの使用が考えられる。ここに、ＭＥＦ２
活性が容易にモニターされるようにする構築物でトランスジェニックマウスが作
製された。これらの動物の作製は本明細書の他の箇所に記載した。
【０１８２】 これらの動物のテスト化合物での処理は、適当な形態の化合物の動物への投与
を含むであろう。投与はいずれかの経路によるものであり、限定されるものでは
ないが、経口、鼻孔、口腔または局所を含めた臨床的または非臨床的目的で利用
できるであろう。別の方法として、投与は、気管吸入、気管支吸入、皮内、皮下
、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によるものであってよい。特に考えられるの
は、全身静脈内注射、血液またはリンパ供給を介する局所的投与である。
【０１８３】 インビボで化合物の効率を測定するのは、指標遺伝子の発現を調べることを含
む。
【０１８４】 ［９．医薬組成物］ 有効成分（薬物、ポリペプチド、抗体、あるいはアンチセンスオリゴもしくは
ポリヌクレオチドを含むリポソームまたは発現ベクター）の臨床的適用が行われ
る場合、意図した適当に適した医薬組成物を調製するのが必要であろう。一般に
、これは、実質的に発熱物質、ならびにヒトまたは動物に有害であり得るいずれ
かの他の不純物がない医薬組成物を調製することを含むであろう。また、一般に
、複合体を安定にし、標的細胞による摂取を可能とするのに適当な緩衝液を使用
するのが望まれるであろう。
【０１８５】 本発明の水性組成物は、さらに、医薬上許容される担体または水性媒体に分散
された、有効量の前記有効成分を含む。また、そのような組成物を摂取物という
。フレーズ「医薬上許容されるまたは薬理学上許容される」とは、適当には動物
またはヒトに投与した場合に有害、アレルギー性または他の望まない反応を生じ
ない組成物をいう。
【０１８６】 本明細書中で用いるごとく、「医薬上許容される担体」はいずれかのおよび全
ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗菌類剤、等張剤および吸収
遅延剤等を含む。医薬上活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は
当該分野で周知である。いずれかの慣用的媒体または剤が有効成分と不適合であ
る限りを除き、治療組成物におけるその使用が考えられる。また、補充的な有効
成分を組成物に配合することもできる。
【０１８７】 治療組成物の領域は、ヒドロキシプロピルセルロースのごとき界面活性剤と適
当に混合した水中で調製することができる。また、分散液はグリセロール、液体
ポリエチレングリコール、その混合物中で、および油中で調製することもできる
。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を妨げるため
の防腐剤を含有する。
【０１８８】 本発明の治療組成物は、有意には、液体溶液または懸濁液いずれかとしての注
射組成物の形態で投与され、注射に先立って液体中の溶液、液体中の懸濁液に適
当な固体形態を調製することができる。これらの製剤は乳化することもできる。
そのような目的の典型的な組成物は医薬上許容される担体を含む。例えば、該組
成物はリン酸緩衝化生理食塩水１ミリリットル当たり１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０
ｍｇまたは約１００ｍｇまでのヒト血清アルブミンを含有することができる。他
の医薬上許容される担体は、水性溶液、非毒性賦形剤を含み、塩、防腐剤、緩衝
液等を含む。
【０１８９】 非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油お
よびオレイン酸エチルのごとき注射用有機エステルである。水性担体は水、アル
コール性／水性溶液、生理食塩水溶液、塩化ナトリウムのごとき非経口ビヒクル
、リンガーデキストロース等を含む。静脈内ビヒクルは流体および栄養補充物を
含む。防腐剤は抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスを含む。
医薬組成物中の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度が周知のパラメータに従って
調製される。
【０１９０】 さらなる処方が経口投与に適する。経口処方は、例えば、医薬グレードのマン
ニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウ
ム、セルロース、炭酸マグネシウム等のごとき典型的な賦形剤を含む。組成物は
溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方または粉末の形態を採る
。経路が局所である場合、該形態はクリーム、オイントメント、制御放出パッチ
、軟膏またはスプレーであり得る。
【０１９１】 本発明の治療組成物は古典的医薬製剤を含む。本発明による治療組成物の投与
は、標的組織がその経路を介して利用可能である限りいずれの通常の経路を介す
ものでもよいであろう。これは経口、鼻孔、口腔、直腸、膣または局所を含む。
別の方法として、投与はオルソトピック、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静
脈内注射によるであろう。そのような組成物は、通常、医薬上許容される担体、
緩衝液または他の賦形剤を含む医薬上許容される組成物として投与されるであろ
う。散在性病気状態の治療のための好ましい具体例の送達経路は、全身であるが
、領域的送達も考えられる。
【０１９２】 治療組成物の有効量は意図した目標に基づいて決定される。用語「単位用量」
または「投与量」とは対象で使用するのに適した物理的に区別される単位をいい
、各単位はその投与との関係で、すなわち、適当な経路および治療方法との関係
で、前記した所望の応答を生じるように計算された所定量の治療組成物を含有す
る。治療および単位用量の数に従い、投与される量は所望の保護に依存する。
【０１９３】 また、治療組成物の正確な量は実行者の判断に依存し、各個体に特殊である。
用量に影響する因子は患者の物理的および臨床的状態、投与の経路、治療および
効力の意図した目標、特定の治療物質の安定性および毒性を含む。
【０１９４】 ［１０．下流遺伝子の探索］ ＭＥＦ２ノックアウトマウスの下流の遺伝子の識別は本発明でも考えられる。
これらの遺伝子は、ＭＥＦ２ノックアウトマウスの特異的に発現された遺伝子を
正常マウスのそれと比較することによって識別することができる。好ましい具体
例において、これは後述する「差分表示」によって達成されるであろう。
【０１９５】 ＲＮＡフィンガープリンティングは、多くの異なる組織、細胞型または治療群
から単離されたＲＮＡを同時にサンプリングして、その相対的豊富さが変化する
ＲＮＡを識別することができる手段である。この技術の２つの形態が同時に開発
され、ＲＮＡフィンガープリンティングおよび差分表示として１９９２年に報告
された（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ，１９９２；Ｗｅｌｓｈら、１９９２）
。（また、引用することによりその全体を本明細書の一部とみなすＬｉａｎｇお
よびＰａｒｄｅの米国特許第５，２６２，３１１号、および米国特許第５，６６
５，５４７号参照）。両技術は後記する実験で利用した。本明細書中に記載する
実験のいくつかはＤｏｎａｈｕｅら、１９９４と同様に行った。
【０１９６】 ＰＣＲによるＲＮＡフィンガープリンティングの全ての形態は理論的には同様
であるが、それらのプライマーの設計および適用は異なる。差分表示およびＲＮ
Ａフィンガープリンティングと他の方法との最も顕著な差異は、差分表示がｍＲ
ＮＡのポリＡテイルにハイブリダイズする固定プライマー（anchoring primer）
を利用することである。その結果、差分表示で増幅されたＰＣＲ産物はｍＲＮＡ
の３’非翻訳領域に向かって偏っている。
【０１９７】 差分表示の基本的な技術は詳細に記載されている（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄ
ｅｅ，１９９２）。全細胞ＲＮＡは、オリゴｄＴよりなる固定されたプライマー
での第一のストランドの逆転写のための起点となる。該オリゴｄＴプライマーは
逆転写酵素、例えば、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を
用いて伸長される。第２ストランドの合成は、低下したストリンジェンシー条件
を用い、任意に選択されたオリゴヌクレオチドを起点とする。いったん二本鎖ｃ
ＤＮＡが合成されれば、同一のプライマーを利用し、標準的なＰＣＲ技術によっ
て増幅が進行する。得られたＤＮＡフィンガープリントは、臭化エチジウム染色
またはオートラジオグラフィーでのゲル電気泳動によって分析される。同一オリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて異なる細胞由来のＲＮＡからのフィンガープ
リントの１対１の比較は、特異的に発現されるｍＲＮＡを識別する。
【０１９８】 差分表示技術は、癌で特異的に発現される遺伝子を識別するのに効果的である
と示されている（Ｌｉａｎｇ＆Ｐａｒｄｅｅ，１９９２；Ｗｏｎｇら、１９９３
；Ｓａｇｅｒら、１９９３；Ｍｏｋら、１９９４；Ｗａｔｓｏｎら；Ｃｈｅｎら
、１９９５；Ａｎら、１９９５）。本発明はＲＮＡフィンガープリンティング技
術を利用して、前立腺癌で特異的に発現される遺伝子を識別する。これらの研究
は、異なる転移可能性を持つ腫瘍細胞として挙動する腫瘍組織および腫瘍由来細
胞系から単離されたＲＮＡを利用した。
【０１９９】 これらの研究の基礎となる概念は、異なる転移可能性を持つ細胞で特異的に発
現される遺伝子は転移可能性の指標として使用することができることであった。
転移は生命を脅かす病理学に対する前立腺癌進行についての要件であるので、転
移可能性の指標は病理学的可能性の指標のようである。
【０２００】 細胞は、しばしば、増殖の後期対数期に収穫される。ＲＮＡはチオシアン酸グ
アニジウム方法によって単離できる（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ，
１９８７）。ＲＮＡ単離の後に、核酸をエタノールで沈殿させる。沈殿物を遠心
分離によってペレット化し、水に再溶解させる。次いで、再溶解した核酸を、製
造業者の支持に従ってＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．）で消化し、続いて、フェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコール（２５：２４：１）で有機抽出し、エタノールで再沈殿さ
せる。
【０２０１】 次いで、ＤＮａｓｅＩ処理したＲＮＡを遠心分離によってペレット化し、水に
再溶解させる。溶液中のＲＮＡの純度および濃度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎ
ｍの波長で光学密度を測定することによって見積もられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、１９８９）。ＲＮＡの小アリコートを、ＭＯＰＳ緩衝液を含む３％のホルムア
ルデヒドゲル中の電気泳動によって分離して（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）
、濃度の見積もりを確認し、リボソームＲＮＡが無傷であるかを判断する。この
ＲＮＡを全細胞ＲＮＡという。
【０２０２】 全細胞ＲＮＡで実行された２種類のＲＮＡフィンガープリンティング実験があ
った。これらの種類の実験の最初のものは、それが異方性ＰＣＲ産物検出のため
に５’ビオチニル化プライマーを用いて修飾される以外は、ＬｉａｎｇおよびＰ
ａｒｄｅｅ，（１９９２）の差分表示プロトコルに従う。
【０２０３】 これらの実験において、全細胞ＲＮＡの０．２μｇを本発明による固定プライ
マーでの逆転写の起点とし、次いで、これらの位置における各ヌクレオチドの可
能な組合せの全てを含めたヌクレオチドを２つ任意に選択する。５０ｍＭトリス
ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤ
ＴＴ、５００μＭのｄＮＴＰ、１μＭの固定されたプライマーおよび１Ｕ／μｌ
のＲＮａｓｅ阻害剤の存在下、２００ユニットのＭＭＬＶ（モロニーネズミ白血
病ウイルス）逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）にて逆転写を行う。反応混合物
を室温にて１０分間、次いで３７℃で５０分間インキュベートする。逆転写の後
、６５℃まで１０分間で加熱することによって酵素を不活性化する。
【０２０４】 次いで、逆転写ステップで使用したのと同一の固定プライマーおよび任意に選
択された配列の第２のオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって、得られた逆
転写反応物の１／１０を増幅する。ＰＣＲ反応は、４０μｌ容量中に１０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２０μのｄＮＴＰ、１．５μＭ
のＭｇＣｌ2、２００ｎＭの任意デカマー、１μＭの固定されたプライマーおよ
び１ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）を含有する。増幅は、３０秒間の９４℃での変性、２分間の４０℃に
おけるアニーリング、および３０秒間の７２℃での伸長での３０サイクルのサー
マルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で行い、35Ｓ−ｄＡＴＰをＰＣＲ反
応に添加する。
【０２０５】 次いで、ＰＣＲ産物を６％のＴＢＥ尿素配列決定ゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
１９８９）で分離し、オートラジオグラフィーによって検出する。特異的に出現
するＰＣＲ産物をゲルから切り出し、元の増幅で使用したのと同一のプライマー
を用いて再度増幅し、ＴＡクローニング戦略を用いてクローン化する（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．およびＰｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）。
【０２０６】 ＲＮＡフィンガープリンティング実験の第２のタイプはＷｅｌｓｈら（１９９
２）のプロトコルとかなり密接に似ている。このアプローチは、アガロースゲル
および臭化エチジウム染色によるバンドの非アイソトピック検出の使用によって
修飾された前記の変形を使用する（Ａｎら、１９９５）。全ＲＮＡを記載されて
いるごとく凍結された前立腺組織または培養細胞から単離する（Ｃｈｏｍｃｚｙ
ｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ，１９８７）。１０マイクログラムの全細胞ＲＮＡを２
０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ2
中の５ユニットのＲＮＡｓｅフリーＤＮＡｓｅＩ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、およ
び２０ユニットのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）で処理する。フェノール／クロロホルムでの抽出およびエタノール沈殿の後、
ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水に再溶解させる。
【０２０７】 ２μｇの各全細胞ＲＮＡ試料を、ランダムに選択されたヘキサマープライマー
およびＭＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いｃＤＮＡに逆転写する
。ＰＣＲは１つまたは２つの任意に選択されたオリゴヌクレオチドプライマー（
１０〜２０量体）を用いて行った。ＰＣＲ条件は、２０μｌの最終容量中の１０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2
、５０μＭのｄＮＴＰ、０．２μＭのプライマー、１ユニットのＴａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）である。増幅パラメータは９４℃での３０
秒間の変性、４０℃での９０秒間のアニーリング、および７２℃での６０秒間の
伸長での３５サイクルの反応を含む。７２℃での最後の伸張は１５分で行われる
。得られたＰＣＲ産物を、ＴＢＥ緩衝液中の２％のアガロースゲルを通じる電気
泳動によるサイズ分離によってフィンガープリントに解像する（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、１９８９）。フィンガープリントは、臭化エチジウムでの染色によって可
視化する。再増幅は行わない。
【０２０８】 特異的に発現された遺伝子を表すであろう特異的に出現するＰＣＲ産物をカミ
ソリ刃でゲルから切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキット（Ｂｉｏ１０１、Ｉｎｃ
．）を用いてアガロースから精製し、水中で溶出させ、ＴＡクローニング戦略（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．およびＰｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）を用いプラ
スミドベクターに直接クローン化する。これらの産物は最初のＰＣＲフィンガー
プリンティングプロトコル後には再増幅しない。
【０２０９】 ［１１．実施例］ 以下の実施例は本発明の好ましい具体例を示すために含めるものである。以下
の実施例に開示された技術は本発明の実施でよく機能する本発明者らによって発
見された技術を表し、このように、その実施のための好ましい様式を構成すると
考えられることができるのは当業者に認識されるべきである。しかしながら、当
業者であれば、本開示に照らして、開示された特別の具体例において多くの変形
をなすことができ、本発明の精神および範囲を逸脱することなく依然として同様
または類似の結果を得ることができることを認識するであろう。
【０２１０】 ［実施例１］ ［材料および方法］ ［一次ラット心筋細胞の調製］ 一日齢の新生ラット心臓の解離によって心筋細胞培養を差分的に平板培養して
繊維芽細胞を除去した。肥大応答を誘導するために、ＡｎｇＩＩおよびＰＥを、
各々、無血清Ｍ１９９倍地中、１０ｎＭおよび１０μＭにて心筋細胞培養に添加
する。いずれかのアゴニストを含有する培養培地を１２時間ごとに７２時間交換
する。
【０２１１】 ［免疫細胞化学］ 一次心筋細胞における筋節組織化を可視化するために、抗ａアクチンマウスモ
ノクローナル抗体を用いる（Ｓｉｇｍａ）。細胞を１×ＰＢＳ中で洗浄し、３．
７％のパラホルムアルデヒド中で５分間固定し、１×ＰＢＳで３回洗浄し、次い
で、２％のウマ血清、２％のＢＳＡおよび０．１％のＮＰ４０を含有する１×Ｐ
ＢＳ中で３０分間予備ブロックする。抗ａ−アクチニン抗体を新鮮な予備ブロッ
ク溶液中で１：８００の希釈にて添加し、さらに３０分間インキュベートする。
引き続いて細胞を０．１％のＮＰ４０を含む１×ＰＢＳ中で３回洗浄する。次い
で、抗マウスＴＲＩＴＣ結合二次抗体を予備ブロック溶液中で１：４００の希釈
にて３０分間で添加し、０．１％のＮＰ４０を含有する１×ＰＢＳ中で細胞を再
度３回洗浄する。ＤＮＡについての核染色をＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌのビス
ベンズイミドで行い、続いてＰＢＳで３回すすぐ。
【０２１２】 ［ＲＮＡ分析］ 全ＲＮＡを収集し、推奨されているごとくトリアゾール試薬（Ｇｉｂｏ ＢＲ
Ｌ）で精製する。野生型およびトランスジェニック心臓からの、ならびに培養し
た心筋細胞からのＲＮＡを、従前に記載されているごとく（Ｊｏｎｅｓら、１９
９６）オリゴヌクレオチドプローブのパネルに対するドットブロットハイブリダ
イゼーションに付した。
【０２１３】 ［組織学的分析］ 野生型およびトランスジェニックマウスからの心臓を組織学的分析に付した。
簡単に述べれば、心臓を収集し、ＰＢＳで緩衝化した１０％のホルマリン中で一
晩固定し、エタノール中で脱水し、キシレン、次いでパラピンに移した。パラピ
ン包埋心臓を４μＭの薄片とし、引き続いて、ルーチン的な組織学調査のために
ヘマトキシリンおよびエオシンで、またはコラーゲンのためにＭａｓｓｏｎトリ
クロームで染色した（ＷｏｏｄｓおよびＥｌｌｉｓ，１９９４）。
【０２１４】 ［実施例２］ ［心臓遺伝子発現におけるＭＥＦ２の役割］ ［構造機能実験］ その産物を図１に模式的に示す４つの脊椎動物ＭＥＦ２遺伝子がある。広い突
然変異分析を通じて、ＭＥＦ２タンパク質の機能的ドメインが特徴付けられてい
る（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９５；Ｍａｒｔｉｎら、１９９３；Ｍｏｌｋｅ
ｎｔｉｎら、１９９６ａ；１９９６ｂ）。これらの実験は、Ｎ末端ＭＡＤＳボッ
クスがＤＮＡの結合および二量体化を媒介することを示す。隣接ＭＥＦ２ドメイ
ンはＤＮＡ結合親和性および筋原性ｂＨＬＡタンパク質との相互作用に影響し、
ＭＥＦ２因子のＣ末端領域は複数の独立した転写活性化ドメインを含有する。
【０２１５】 ＭＥＦ２および筋原性ｂＨＬＨ因子による筋肉転写の協働活性化。骨格筋系に
おいて、ＭＥＦ２はｂＨＬＨ転写因子のＭｙｏＤファミリーのメンバーと組み合
わされて作用する。ＭＥＦ２タンパク質のＭＡＤＳボックスは筋原性因子のｂＨ
ＬＨ領域と直接相互作用することが示されている（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９
９５）。ＭＥＦ２因子による筋肉遺伝子発現のコンビナトリアル制御についての
生化学的モデルは、ショウジョウバエでの遺伝子研究によって支持されている。
これは、ＭＥＦ２が筋芽細胞、骨格、心臓および内蔵のすべてのタイプの分化に
対する不可欠なコファクターであることを示した（Ｌｉｌｌｙら、１９９５；Ｂ
ｏｕｒら、１９９５）。
【０２１６】 ［ＭＥＦ２リン酸化］ リンペプチドマッピング実験は，ＭＥＦ２因子が複数のリン酸化部位を含有す
ることを示す。ＭＡＤＳボックス中のカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）部位が
ＤＮＡに対するＭＥＦ２Ｃの親和性を増強することが示されている（Ｍｏｌｋｅ
ｎｔｉｎら．１９９６ｃ）。この部位はショウジョウバエおよびＣ．ｅｌｅｇａ
ｎｓからヒトまでの範囲の生物で全ての既知のＭＥＦ２タンパク質で保存され、
ＭＥＦ２機能に対するその重要性と合致する。この部位が調節されたリン酸化に
従うか否かはまだ決定されていない。現在までにはっきりとされているＭＥＦ２
Ｃの模式的ダイアグラムおよびリン酸化部位を図３に示す。
【０２１７】 また、ＭＥＦ２Ｃの転写活性が活性化されたＰＫＣの存在下で劇的に増強され
ることも示されている。ＭＥＦ２ＣおよびＰＫＣの活性化された形態に対する発
現ベクターと共にＭＥＦ２依存性レポータ遺伝子での繊維芽細胞のトランスフェ
クションの結果、転写活性が１０倍を超えて増加し、ＤＮＡ結合は見かけ上増加
しない。これらの結果は、ＭＥＦ２ＣがＰＫＣのある種の転写効果を媒介するこ
とを示唆する。
【０２１８】 ［ＭＥＦ２遺伝子のノックアウト］ 遺伝子標的化によって、ＥＳ細胞およびトランスジェニックマウスにおけるＭ
ＥＦ２遺伝子は不活性化される。ＭＥＦ２Ｃを欠くマウスは、右心室の不存在お
よび血管系が形成されないことを含むひどい心血管欠陥で、Ｅ９．５で死亡する
（Ｌｉｎら、１９９７）。加えて、ａ−ＭＨＣ、ａ心臓アクチン、およびＡＮＦ
を含めた心臓収縮タンパク質遺伝子のサブセットは発生する心臓で発現されない
。対照的に、ミオシン軽鎖２Ａおよび２Ｖのごときいくつかの他の心臓遺伝子は
ＭＥＦ２Ｃ突然変異体肺の心臓において正常レベルで発現され、これはそれらが
ＭＥＦ２Ｃ独立性であることを示す。これらの遺伝子はそれらのプロモータ中に
必須のＭＥＦ２結合部位を含有するので、ＭＥＦ２ファミリーのもう１つのメン
バーがＭＥＦ２Ｃの不存在下でそれらの発現を支持できるようである。ＭＥＦ２
Ｂは初期心臓においてＭＥＦ２Ｃとに共発現され、ＭＥＦ２Ｃ突然変異体肺でア
ップレギュレートされ、これはそれをＭＥＦ２Ｃとで部分的に重複した役割を演
じる候補とするのである。心臓遺伝子のサブセットがＭＥＦ２Ｃに依存している
という発見は、筋肉遺伝子がＭＥＦ２ファミリーの異なるメンバーの間で区別で
きることを示す。
【０２１９】 ［実施例３］ ［肥大シグナリングによるインビトロでのＭＥＦ２活性の誘導］ Ｔ細胞におけるカルシウム依存性シグナル変換経路に応答するＭＥＦ２の能力
に徴して、本発明者らは同一経路が心筋細胞中でＭＥＦ２を活性するか否かを調
べた。図４に示されるごとく、活性化されたカルシニューリンまたはＣａＭＫＩ
Ｖはトランスフェクトされた心筋細胞においてＭＥＦ２依存性ルシフェラーゼレ
ポータ遺伝子をアップレギュレートでき、一緒に、これらのカルシウム感受性シ
グナリング酵素はＭＥＦ２遺伝子発現を相乗的に活性化する。ＤＮＡ結合アッセ
イにおいて、活性化されたカルシニューリンおよびＣａＭＫＩＶに応答してのＭ
ＥＦ２ ＤＮＡ結合活性の増加は観察されず、これは、ＭＥＦ２転写活性の増加
が翻訳後メカニズムを反映することを示唆する。転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）
を含有するが、ＤＮＡ結合および二量体化に必要なＭＡＤＳおよびＭＥＦ２ドメ
インを欠くＭＥＦ２ＣのＣ末端が酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと
融合する場合、得られたＧＡＬ４−ＭＥＦ２Ｃ融合タンパク質はカルシニューリ
ンおよびＣａＭＫＩＶに対する感受性を保持する（図５）。このＧＡＬ４−ＭＥ
Ｆ２Ｃ融合タンパク質は、心筋細胞の肥大アゴニストフェニレフリン（ＰＥ）で
の刺激によっても活性化される（図６）。まとめると、これらの結果は、ＭＥＦ
２Ｃの転写活性ドメインが肥大シグナリング経路に対する核標的であることを示
す。
【０２２０】 ［実施例４］ ［ＭＥＦ２指標マウスの作製］ インビトロアッセイは、ＭＥＦ２が心筋細胞中の肥大シグナリング経路での重
要な下流標的であるという結論を支持する。肥大刺激の時間が遅延され、無傷心
臓の生理学が培養された心筋細胞とは区別されるインビボ設定までこれらの観察
を拡大するために、ｌａｃＺトランスジーンの活性化によるＭＥＦ２活性化を信
頼性よく明らかとするマウスの感受性かつ特異性株が開発されている。これらの
マウスは、デスミン遺伝子からのＭＥＦ２部位の３つのタンデムコピーが、全て
の細胞中において、基礎レベルで発現するヒートショックタンパク質（ｈｓｐ）
６８プロモータ、およびｌａｃＺレポータの上流にクローン化されたトランスジ
ーンを用いて作製された（図７）。この構築物を作製するのに用いたＭＥＦ２部
位の配列は以下のとおりである。 ＧＧＣＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＡＴＡＡＡＴＡＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＴ
ＡＴＴＴＣＡ
【０２２１】 ＭＥＦ２部位は前記配列中で下線を施す。本発明者らは誕生前および誕生後の
生命体を通じたこのトランスジーンの発現パターンを特定した。肺形成の間、Ｍ
ＥＦ２部位依存性トランスジーンは発生する筋肉細胞系で発現され（図８）、こ
れは、心臓、骨格および平滑筋遺伝子発現の活性化のためのＭＥＦ２因子の重要
性を合致する。しかしながら、誕生後、トランスジーンの発現は、組織の比色ｌ
ａｃＺ染色によっては検出できないレベルまでダウンレギュレートされる。
【０２２２】 ＭＥＦ２−ｌａｃＺトランスジーンが心臓中で肥大シグナルに応答するか否か
をテストするために、本発明者らは、ＭＨＣカルシニューリンおよびＭＨＣ−Ｃ
ＡＭＫＩＶトランスジーンを担うマウスの株に育種によってトランスジーンを導
入した。図９および図１０に示されるごとくｌａｃＺ発現はカルシニューリンお
よびＣＡＭＫＩＶに応答して劇的にアップレギュレートされ、このように、肥大
応答の活性化を反映する。
【０２２３】 ［実施例５］ ［複数シグナリング経路に応答して肥大をブロックする転写因子の標的化］ 単一シグナル変換経路を阻害することによって肥大および心疾患を治療するに
おける困難の１つは、複数のシグナリングシステムが種々の形態の肥大に応答し
て活性化されることが示されていることである。このように、１つの経路の阻害
は、同一終点に至る他の重複した経路のため、肥大応答に対して完全な影響を有
することができない。この冗長性を迂回する可能な手段は、多くの生化学シグナ
リング経路が集中する経路の終点を標的化することである。肥大に導く全てでは
ないにせよほとんどのシグナリング系のメディエータとしてのＭＥＦ２の重要性
を仮定すれば、ＭＥＦ２活性を阻害する薬物は肥大応答の効果をなくするための
大きな利点によるであろう。さらに、本結果は、ＭＥＦ２が成人の心臓で基礎レ
ベルでのみ発現されることを示唆し、これは、ＭＥＦ２活性の阻害剤が正常な心
臓機能に対して有害な効果を有しないであろうことを示唆する。
【０２２４】 ［実施例６］ ［心肥大におけるＣａＭキナーゼシグナリングによるＭＥＦ２／ヒストンデアセ
チラーゼ複合体の破壊］ 誕生後心筋細胞において、ＭＡＰＫ、ＣａＭＫおよびカルシニューリンを活性
化する成長因子および他のシグナルは、細胞の増大、即時型および胎児心臓筋肉
遺伝子の活性化、および筋節組立てによって特徴付けられる肥大応答を誘導する
（ＭｃＫｉｎｓｅｙおよびＯｌｓｏｎ，１９９９）。ＭＥＦ２が心筋細胞におけ
る肥大シグナリングに対する標的であるか否かを判断するために、本発明者らは
、フェニレフリン（ＰＥ）および胎児ウシ血清（ＦＢＳ）に応答した肥大が３つ
のＭＥＦ２結合部位を含有するＭＥＦ２依存性レポータ（３×ＭＥＦ２ルシフェ
ラーゼ）を活性化するか否かをテストした。ＰＥおよびＦＢＳは共にＭＥＦ２レ
ポータを刺激したが（図１２Ａ）突然変異体ＭＥＦ２部位を含有するレポータを
刺激しなかった。これらの条件下でのＭＥＦ２ ＤＮＡ結合活性の量は変化せず
、これは、予め存在するＭＥＦ２の活性化を示唆する。
【０２２５】 ＰＥ（図１２Ｂ）およびＦＢＳはＭＥＦ２Ｃの完全なオープンリーディングフ
レームを含有するＧＡＬ４−ＭＥＦ２Ｃ融合タンパク質の活性化も刺激した。Ｃ
ａＭＫおよびｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＫＮ６２およびＳＢ２０２１９０は、各々
、ＰＥによるＧＡＬ−ＭＥＦ２Ｃの活性化を部分的にブロックし、他方、両阻害
剤はほとんど全ての活性化をブロックした（図１２Ｂ）。これはＣａＭＫおよび
ＭＡＰＫ経路が協働して肥大心筋細胞においてＭＥＦ２を活性化することを示唆
した。
【０２２６】 ＣａＭＫおよびＭＡＰＫに応答性を付与したＭＥＦ２Ｃの領域をマップするた
めに、本発明者らは、ＧＡＬ−ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＡＤを含有するがＭＡＤＳ
およびＭＥＦ２ドメインを欠く欠失突然変異体（ＧＡＬ−ＭＥＦ２Ｃ−ΔＮ）に
対するこれらのキナーゼの効果を比較した。ＣａＭＫＩおよびＣａＭＫＩＶはＧ
ＡＬ−ＭＥＦ２Ｃの活性化を刺激したが、それらはＧＡＬ−ＭＥＦ２Ｃ−ΔＮに
対してほとんど影響を有しなかった（図１２Ｃ）。対照的に活性化ｐ３８によっ
てＭＥＦ２を刺激するＭＡＰＫキナーゼＭＫＫ６は優先的にＧＡＬ−ＭＥＦ２Ｃ
−ΔＬを活性化した（図１２Ｃ）。これらの結果は、ＣａＭＫおよびＭＡＰＫ経
路がＭＥＦ２Ｃの、各々、Ｎ末端およびＣ末端領域を標的化し、およびＭＡＤＳ
／ＭＥＦ２領域がＭＫＫ６によるＴＡＤの活性化に干渉したことを示した。
【０２２７】 心肥大シグナルがインビボでＭＥＦ２活性も刺激したか否かを判断するために
、いくつかの系列のトランスジェニックマウスを作製した。１つの系列はα−Ｍ
ＨＣプロモータの制御下でＣａＭＫＩＶを活性化し、これは心臓においてトラン
スジーン発現を特異的に指令し、その結果心肥大が起こる。ＭＥＦ２−指標マウ
スといわれる第２のトランスジェニック系は３つのＭＥＦ２結合部位に連結した
ｌａｃＺトランスジーンを保有した。このレポータ遺伝子は肺心臓全体で発現さ
れ、これは、筋肉発生におけるＭＥＦ２の役割に合致する。
【０２２８】 ＭＥＦ２は心臓において高レベルで発現されるが、ＭＥＦ２−ｌａｃＺトラン
スジーンは誕生後に心臓においてバックグラウンドレベルを超えて発現されなか
った（図１３Ａ）。しかしながら、それが、α−ＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶトランス
ジーンを担うトランスジェニック系に育種によって導入された場合には、トラン
スジーンは心臓全体で非常に高レベルの発現までアップレギュレートされた（図
１３Ａ）。心臓抽出物のアッセイは、ＣａＭＫＩＶに応答した心臓でのｌａｃＺ
発現の１４５倍の増加を示した。対照的に、ＭＥＦ２ ＴＡＤをリン酸化する活
性化されたＭＡＰＫ ＭＥＫ５をコードするトランスジーンの心臓発現はＭＥＦ
２−ｌａｃＺレポータをアップレギュレートせず、これは、心筋細胞においてＭ
ＡＰＫシグナリングは単独ではＭＥＦ２活性化で不十分であることを示すインビ
トロデータで合致する。
【０２２９】 ゲルシフトアッセイによって測定されたＭＥＦ２ ＤＮＡ結合活性は野生型お
よびＣａＭＫＩＶトランスジェニックスからの心臓抽出物において匹敵した（図
１３Ｂ）。抗ＭＥＦ２Ａ抗体はＤＮＡとタンパク質との複合体をなくし、これは
、それがＭＥＦ２Ａホモもしくはヘテロダイマーいずれかよりなることを示す（
図１３Ｂ）。
【０２３０】 ＣａＭＫによるＭＥＦ２の活性化はＤＮＡ結合に影響しなかったので、本発明
者らは、ＣａＭＫ感受性をＭＥＦ２に付与するであろう潜在的コファクターに対
する筋肉細胞ｃＤＮＡライブラリーの酵母２−ハイブリッドスクリーニングを行
った。わなとしてのＧＡＬ４に融合したＭＥＦ２ＣのＮＡＤＳ−ＭＥＦ２ドメイ
ン（アミノ酸１〜８６）を用いて識別された１１の強力に陽性のクローンのうち
、９つがヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）−４に応答し、２つがＨＤＡＣ５
に応答した。ＭＥＦ２およびこれらのＨＤＡＣは重複する発現パターンを呈し、
心臓、脳および骨格筋で最大に発現された。ＨＤＡＣ４および５はアミノ末端延
長の存在によって他のＨＤＡＣから区別される（図１４Ａ）。２−ハイブリッド
スクリーニングから救済されたＨＤＡＣ４および５の一部は、それらのアミノ末
端近くのほとんど同一の１８アミノ酸セグメントにおいて重複した。
【０２３１】 ＨＤＡＣ上のＦｌａｇエピトープ標識に対する抗体での免疫沈降、続いての抗
ＭＥＦ２抗体でのウエスタンブロットは一過的にトランスフェクトされた２９３
Ｔ細胞においてＭＥＦ２Ａ、ＣおよびＤとの複合体を形成したことを示した（図
１４Ｂ）。対照的に、ＨＤＡＣ１または３およびＭＥＦ２の間には相互作用がな
かった。１８アミノ酸最小ＭＥＦ２インターアクチン領域を含めた、アミノ酸２
２−４８８（ＨＤＡＣ５−ΔＮ）を欠くＨＤＡＣ５欠失突然変異体はＭＥＦ２因
子と共免疫沈降しなかった。
【０２３２】 ＨＤＡＣは、ＤＮＡに補充するとヒストンを脱アセチル化し、その結果、転写
が抑制される。このように、ＴＡＤを抑制するＭＥＦ２の領域とＨＤＡＣ４およ
び５との相互作用は、この相互作用がＭＥＦ２機能の調節で重要な役割を演じる
ことを示唆した。ＨＤＡＣ４および５の存在下で、ＭＥＦ２Ａ、ＣおよびＤは１
０Ｔ１／２繊維芽細胞で３×ＭＥＦ２ルシフェラーゼをトランス活性化できず、
他方、ＨＤＡＳ１または３の存在下では、これらのＭＥＦ２因子は十分に活性で
あった。ＧＡＬ−ＭＥＦ２Ｃの転写活性はＨＤＡＣ４および５によって完全に阻
害されたがＨＤＡＣ１または３あるいはＨＤＡＣ５ΔＮによっては完全には阻害
されなかった（図１４Ｃ）。対照的に、ＨＤＡＣ結合領域を欠くＧＡＬ−ＭＥＦ
２Ｃ−ΔＮはＨＤＡＣ４および５に対して感受性ではなかった（図１４Ｃ）。
【０２３３】 ＭＥＦ２がＤＮＡに結合し、同時にＨＤＡＣ４と相互作用できるか否かを判断
するために、本発明者らは、インビトロで翻訳されたＧＳＴ−ＨＤＡＣ４および
ＭＥＦ２Ｃならびに標識されたＭＥＦ２結合部位での相互作用アッセイを行った
。ＧＳＴ−ＨＤＡＣ４はその32Ｐ−標識部位に結合した35Ｓ−標識ＭＥＦ２Ｃと
相互作用した（図１４Ｄ）。対照的に、ＭＥＦ２Ｃまたは標識されたＤＮＡプロ
ーブのＧＳＴ単独への有意な結合はなかった。ＭＥＦ２Ｃ突然変異体ＲＫＫ３−
５ＴＮＱはインビボでＨＤＡＣ４に結合したが、ＤＮＡ結合は欠けている。この
突然変異体はＧＳＴ−ＨＤＡＣ４と相互作用したが、32Ｐ−標識ＤＮＡ結合部位
を複合体に入れなかった（図１４Ｄ）。また、ＤＮＡ結合部位は、ＧＳＴ−ＨＤ
ＡＣ４と相互作用できないＭＥＦ２Ｃ突然変異体ＬＩ４５，４６ＲＮの存在下で
ＧＳＴ−ＨＤＡＣ４によって捕獲されなかった（図１４Ｄ）。同様に、ＭＥＦ２
のＭＡＤＳボックスと相同性を有する標識ＳＲＦはＧＳＴ−ＨＤＡＣ４と有意に
会合しなかった（図１４Ｄ）。３×ＭＥＦ２ルシフェラーゼレポータでの修飾さ
れた哺乳動物１−ハイブリッドアッセイを用い、ＭＥＦ２ＣのＤＮＡの結合ドメ
イン（アミノ酸１−１１７）が、カルボキシル末端触媒ドメインがＶＰ１６で置
き換えられたＨＤＡＣ４および５突然変異体を補充できたことを観察され、これ
は、ＭＥＦ２とＨＤＡＣ４および５との相互作用がＭＥＦ２のＤＮＡへの結合に
干渉しないという結論を支持する。ＤＮＡ結合ＭＥＦ２はＨＤＡＣをプロモータ
に補充して、転写を抑制するターナリ複合体を形成するようである。
【０２３４】 ＨＤＡＣ４および５がＣａＭＫ活性化およびＭＫＫ６活性化の抑制に必要なＭ
ＥＦ２の同一領域と相互作用したという発見は、ＭＥＦ２のシグナル依存性活性
化がＨＤＡＣによる脱抑制に関与するのではないかということを示唆した。活性
化されたＣａＭＫＩ（図１５Ａ）およびＣａＭＫＩＶは、ＨＤＡＣ５の存在下で
転写活性をＧＡＬ−ＭＡＦ２Ｃに回復させた（図１５Ａ）。対照的にＭＫＫ６は
ＨＤＡＣによる阻害を克服できなかった。ＭＫＫ６およびＣａＭＫＩはＭＥＦ２
依存性転写を相乗的に活性化した。
【０２３５】 本発明者らは、活性化されたＣａＭＫＩまたはＩＶを発現する細胞においてＨ
ＤＡＣ活性の低下を観察せず、これは、酵素活性の阻害がＭＥＦ２のＣａＭＫ依
存性活性化に対するメカニズムではないことを示唆した。従ってＣａＭＫシグナ
リングがＨＤＣＡをＭＥＦ２から脱着できるか否かをテストした。図１５Ｂに示
されるごとく、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞での共免疫沈降アッセイによ
って測定した結果、活性化されたＣａＭＫＩはＨＤＡＣ５およびＭＥＦ２Ｃまた
はＭＥＦ２Ａの会合を妨げた（図１５Ｂ）。ＣａＭＫＩの不存在下では、ＨＤＡ
Ｃ５およびＭＥＦ２は共に核に存在することが突き止められた（図１５Ｃ、パネ
ルａおよび図１５Ｃ、パネルｂ）。しかしながら、ＣａＭＫＩの存在下で、ＨＤ
ＡＣ５は細胞質に突き止められ、他方、ＭＥＦ２Ｃは核に留まった（図１５Ｃ、
パネルｃおよび図１５Ｃ、パネルｄ）。従って、ＣａＭＫシグナリングはＭＥＦ
２／ＨＤＡＣ複合体を破壊し、その結果、ＨＤＡＣが細胞質に蓄積される。
【０２３６】 これらの結果は、ＭＥＦ２が、肥大心筋細胞においてＰＥによって活性化され
るＣａＭＫおよびＭＡＰＫシグナリング経路（図１５Ｄ）に対する二部標的とし
て作用することを示す。ＣａＭＫシグナリングは、核輸入を妨げるか、ＨＤＡＣ
５（ＭＥＦ２活性のリプレッサー）の核輸出を誘導することによって、ＭＥＦ２
の転写可能性を解除できる。対照的に、ＭＡＰＫによるＭＥＦ２の活性化はＴＡ
Ｄのリン酸化によって媒介され、ＨＤＡＣとＤＮＡ結合ドメインとの会合によっ
て妨げることができる。ＣａＭＫによるＭＥＦ２の抑制に続き、ＭＥＦ２と相互
作用し、ＣａＭＫＩＶによって活性化されることが以前に示されたＣＢＴ／ｐ３
００のごとき、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を持つコアクチベータ
ーはＭＥＦ２依存性プロモータに補充できず、その結果転写が活性化される。
【０２３７】 心肥大はカルシニューリンを含むシグナリング経路および転写因子ＮＦＡＴ３
によって制御されることが示されているが、別の経路に対する証拠がある。ＨＤ
ＡＣのＣａＭＫ媒介解離によるＭＥＦ２の肥大活性化は、心臓増殖に対するその
ような別の経路を構成し得る。筋肉および神経の発生におけるＭＥＦ２の非常に
重要な役割を仮定すれば、ＨＤＡＣおよびＣａＭＫシグナリングもまたこれらの
プロセスで役割を演じることができる。
【０２３８】 本明細書中で開示し特許請求した組成物および／または方法の全ては、本開示
に照らせば過度の実験なくしてなすことができ、かつ実施できる。本発明の組成
物および方法を好ましい具体例により記載してきたが、本発明の概念、精神およ
び範囲を逸脱することなく、本明細書中に記載した方法のステップにおいてまた
はステップの配列において組成物および／または方法に変形を適用できるのは当
業者に明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的に関連するある
種の剤が、同一または類似の結果を達成しつつ、本明細書中に記載した剤に代え
て置き換えることができるのは明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのよ
うな同様の置換および修飾は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精
神、範囲および概念の内にある。
【０２３９】 ［参考文献］ 以下の文献は、それが例示的手法または本明細書中に記載したものを補足する
他の詳細を提供する程度で、具体的に引用することにより本明細書の一部をなす
ものとする。
【表１】
【表１（つづき）】
【表１（つづき）】
【表１（つづき）】
【表１（つづき）】
【表１（つづき）】
【表１（つづき）】
【表１（つづき）】
【表１（つづき）】
【表１（つづき）】
【表１（つづき）】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＭＥＦ２イソ型の略図である。
【図２】 ＭＥＦ２活性を制御するカルシウム依存性シグナル経路を示す図である。種々
の細胞外刺激により、カルシニューリン、ＣＡＭキナーゼ、ＰＫＣ、およびＭＡ
Ｐキナーゼを含む複数の細胞内シグナル系を活性化する細胞内カルシウムが上昇
する。これらのシグナル全ては、ＭＥＦ２を活性化し、心肥大を生じさせる。
【図３】 ＭＥＦ２Ｃ中の既知のリン酸化部位の位置を示す図である。
【図４】 ＣａＭＫＩＶおよびカルシニューリンは、ＭＥＦ２依存性レポータ遺伝子を活
性化するように相乗作用する。
【図５】 ＧＡＬ４−ＭＥＦ２Ｃ融合タンパク質の存在下で、ＣａＭＫＩＶおよびカルシ
ニューリンは、ＧＡＬ４依存性レポータ遺伝子を活性化するように相乗作用する
。心筋細胞を、ＧＡＬ４−ＭＥＦ２Ｃ融合遺伝子および、表示のように、ＧＡＬ
４依存性レポータ遺伝子で一時的にトランスフェクトした。ＭＥＦ２Ｃの転写活
性は、ＣａＭＫＩＶおよびカルシニューリンによって劇的に向上した。
【図６】 フェニレフリンは、ＣａＭＫ依存性経路によってＭＥＦ２Ｃ転写活性を誘導す
る。心筋細胞を、ＰＥおよびＣａＭＫインヒビターＫＮ−９３の存在下および非
存在下でのＧＡＬ４−ＭＥＦ２ＣおよびＧＡＬ４依存性レポータ遺伝子をコード
する発現ベクターで一時的にトランスフェクトした。
【図７】 ＭＥＦ２依存性ｌａｃＺレポータ遺伝子を示す略図である。デスミン遺伝子由
来のＭＥＦ２結合部位の３つのタンデムコピーを、ｈｓｐ６８プロモータの調節
下でｌａｃＺレポータの上流にクローン化した。このレポータを使用して、トラ
ンスジェニックマウスを作製した。レポータを作製するために使用したＭＥＦ２
オリゴヌクレオチド配列を示し、ＭＥＦ２部位に下線を引いた。
【図８】 ＭＥＦ２部位依存性ｌａｃＺ導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウス
胚のｌａｃＺ染色を示す図である。ＭＥＦ２−ｌａｃＺ導入遺伝子を使用して、
トランスジェニックマウス株を作製した。ｌａｃＺ発現について染色されたＥ１
０．５でトランスジェニックマウス胚を示す。ｌａｃＺは、全ての発生した筋細
胞型（心筋、骨格筋、および平滑筋）において高レベルで発現された。
【図９】 カルシニューリントランスジェニックマウスの心臓におけるＭＥＦ２−ｌａｃ
Ｚ発現の活性化を示す図である。ＭＥＦ２−ｌａｃＺ導入遺伝子を、ＭＨＣカル
シニューリン導入遺伝子を保有するマウスに移入した。マウスを、４週齢で屠殺
し、心臓をビブラトームで切断し、ｌａｃＺ発現について染色した。ｌａｃＺは
、ＭＥＦ２−ｌａｃＺ導入遺伝子を保有する同腹子において検出可能なレベルで
発現されず、カルシニューリン導入遺伝子（コントロール）では検出されなかっ
た。しかし、ｌａｃＺ発現は、肥大性のＭＨＣカルシニューリントランスジェニ
ック心臓全体で容易に検出可能である。
【図１０】 カルシニューリントランスジェニックマウスの心臓におけるＭＥＦ２−ｌａｃ
Ｚ導入遺伝子由来のｌａｃＺ活性のアップレギュレーションを示す図である。Ｍ
ＥＦ２−ｌａｃＺ導入遺伝子を、ＭＨＣカルシニューリン導入遺伝子を保有する
マウス株に移入した。マウスを４週齢で屠殺し、ｌａｃＺ酵素活性を心臓抽出物
で測定した。ＭＥＦ２−ｌａｃＺ導入遺伝子を保有する同腹子の心臓で基底レベ
ルのｌａｃＺが発現されルが、ＭＨＣカルシニューリン導入遺伝子（コントロー
ル）では発現されなかった。しかし、ＭＨＣカルシニューリン導入遺伝子心臓に
おいて１５倍を超えるｌａｃＺ発現がアップレギュレーションされる。
【図１１】 カルシニューリンおよびＮＦＡＴ３による肥大シグナル経路を示す図である。
細胞膜で作用するＡｎｇＩＩおよびＰＥならびに可能な他の肥大刺激により、細
胞質中でのカルシニューリンが活性化される。カルシニューリンがＮＦＡＴ３を
脱リン酸化することにより、核への転座、ＧＡＴＡ４との相互作用、および胎児
心筋遺伝子の活性化が起こる。原則として、カルシニューリンまたはＮＦＡＴ３
は、ＧＡＴＡ４依存性機構により作用することができる。
【図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１２Ｃ】 ＣａＭキナーゼおよびＭＡＰキナーゼは、ＭＥＦ２の異なるドメインを標的す
る。無血清培地中の初代新生児ラット心筋細胞を、表示の発現プラスミドでトラ
ンスフェクトし、細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を測定した。図１２Ａでは
、表示のように、細胞をＰＥ（１０μＭ）または１０％のＦＢＳで刺激し、ＭＥ
Ｆ２依存性レポータである３ｘＭＥＦ２ルシフェラーゼの発現をアッセイした。
図１２Ｂでは、ｐＧ５Ｅ１ｂルシフェラーゼ（Ｇａｌ−ｌｕｃ）およびＧＡＬ−
ＭＥＦ２Ｃで一時的にトランスフェクトした細胞を、表示のようにＫＮ６２また
はＳＢ２０２１９０の存在下で、を図１２ＡのようにＰＥで刺激した。図１２Ｃ
では、細胞を、表示のように活性化ＣａＭＫＩＶおよびＭＫＫ６と共にｐＧ５Ｅ
１ｂルシフェラーゼおよびＧＡＬ−ＭＥＦ２Ｃ（左のパネル）またはＧＡＬ−Ｍ
ＥＦ２Ｃ−ΔＮ（右のパネル）で一時的にトランスフェクトした。
【図１３および図１３Ｂ】 インビボでのＣａＭＫＩＶシグナルによるＭＥＦ２活性の活性化を示す図であ
る。図１３Ａでは、インタクトな心臓におけるＣａＭＫＩＶによるＭＥＦ２活性
の誘導を示す図である。本明細書に記載のように、ＭＥＦ２指標マウスを、α−
ＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶまたはα−ＭＨＣ−ＭＥＫ５導入遺伝子を保有するマウス
と交配した。ｌａｃＺ導入因子に陽性で、何も含まない（左）か、ＣａＭＫＩＶ
（中央）またはＭＥＫ（右）導入遺伝子を含む同腹子を８週齢で屠殺し、心臓を
ｌａｃＺ発現について染色した。ｌａｃＺ発現は、ＣａＭＫＩＶトランスジェニ
ック心臓全体で検出されるが、コントロール同腹子またはα−ＭＨＣ−ＭＥＫ５
トランスジェニックでは検出されず、これは、ＭＥＦ２活性化はインビボでＣａ
ＭＫＩＶシグナル経路における下流段階であることを示す。図１３Ｂでは、核抽
出物を、非トランスジェニックでα−ＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶトランスジェニック
同腹子の心臓から調製し、32Ｐ標識ＭＥＦ２部位をプローブとして用いたゲル移
動度シフトアッセイに使用した。表示のように、抗ＭＥＦ２Ａ抗体をアッセイに
添加した。両抽出物で類似の量のＭＥＦ２ ＤＮＡ結合活性が検出され、抗ＭＥ
Ｆ２Ａ抗体を用いた全ての活性は、大きくシフトした。非免疫血清は、ＭＥＦ２
−ＤＮＡタンパク質複合体に対して効果がなかった。プローブがシフトしたゲル
の領域のみを示す。
【図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、および図１４Ｄ】 酵母および哺乳動物細胞におけるＭＥＦ２とＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５との
相互作用ならびにＭＥＦ２活性のＨＤＡＣ媒介抑制を示す図である。図１４Ａで
は、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５の模式図ならびにｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリ
ーニングにおける「餌食」として取り上げられたｃＤＮＡによってコードされる
タンパク質の異なる領域を示す。取り上げられたＨＤＡＣ ｃＤＮＡは、下に示
す１８アミノ酸セグメントで重複する。図１４Ｂ１〜図１４Ｂ２では、トランス
フェクト細胞由来のＭＥＦ２ＣとＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５との同時免疫沈降
を示す図である。カルボキシ末端にＦｌａｇエピトープを有するＨＤＡＣおよび
ＭＥＦ２Ｃを、一時的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞中で発現させた。ト
ランスフェクションから４８時間後、細胞抽出物を調製し、抗Ｆｌａｇ抗体を用
いて免疫沈降させた。次いで、免疫沈降物を、ＳＤＳＰＡＧＥで分離し、抗ＭＥ
Ｆ２抗体または抗Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットした。上のパネルは、抗ＭＥＦ２
ウェスタンの結果を示し、これは、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５のＭＥＦ２Ｃと
の特異的相互作用を示す。下のパネルは抗Ｆｌａｇ（ＨＤＡＣ）ウェスタンブロ
ットの結果を示し、これは、トランスフェクト細胞において類似の量の各ＨＤＡ
Ｃが発現したことを示す。図１４Ｃでは、１０Ｔ１／２細胞を、ｐＧ５Ｅ１ｂル
シフェラーゼレポータならびにＧＡＬ４−ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＬ４−ＭＥＦ２Ｃ−
ΔＮ、および表示のＨＤＡＣの発現ベクターで一時的にトランスフェクトし、ル
シフェラーゼ活性を識別した。図１４Ｄでは、ＭＥＦ２−ＤＮＡ複合体のＧＳＴ
−ＨＤＡＣ４への結合を示す図である。ＧＳＴ−ＨＤＡＣ４を、32Ｐ標識ＭＥＦ
２部位と予め混合した35Ｓ標識インビトロ翻訳産物とインキュベートした。次い
で、ビーズを洗浄し、会合した放射能を識別した。
【図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄ】 ＣａＭキナーゼシグナルは、ＭＥＦ２活性のＨＤＡＣ媒介抑制を克服する。１
０Ｔ１／２細胞を、ｐＧ５Ｅ１ｂルシフェラーゼおよび表示の発現ベクターでト
ランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を識別した。図１５Ｂでは、表示のよう
にＭＥＦ２Ｃ、ＨＤＡＣ４およびＣａＭＫＩ発現ベクターでトランスフェクトし
た細胞抽出物の免疫沈降を図３Ｂに記載のように行った。活性化ＣａＭＫＩの存
在下では、ＭＥＦ２ＣとＨＤＡＣ５との間の相互作用は、有意に減少した。図１
５Ｃでは、ＣａＭＫＩ発現プラスミドの非存在下（ａおよびｂ）または非存在下
（ｃおよびｄ）でのＦｌａｇ標識化ＨＤＡＣ５およびＭｙｃ標識化ＭＥＦ２Ｃを
コードする発現ベクターで同時トランスフェクトしたＣｏｓ細胞を固定し、ロー
ダミン結合抗Ｆｌａｇ抗体およびフルオレセイン結合抗Ｍｙｃ抗体を用いた間接
的免疫蛍光検査法によって試験した。画像は、異なる波長で視覚化した２回染色
培地由来である。図１５Ｄでは、ＣａＭＫおよびＭＡＰＫシグナルによるＭＥＦ
２活性の制御モデルを示す図である。
【図１６Ａおよび図１６Ｂ】 トランスフェクト細胞由来のＭＥＦ２因子とＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５との
同時免疫沈降を示す図である。図１６Ａは、ＭＥＦ２因子ならびにＨＤＡＣ４お
よびＨＤＡＣ５を、記載のようにトランスフェクト細胞から同時免疫沈降した。
カルボキシ末端にＦｌａｇエピトープを有するＨＤＡＣおよびＭＥＦ２Ｃを、一
時的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において発現させた。トランスフェク
ションから４８時間後、細胞抽出物を調製し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降
した。次いで、免疫沈降物を、ＳＤＳＰＡＧＥで分離し、抗ＭＥＦ２抗体または
抗Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットした。上のパネルは、抗ＭＥＦ２ウェスタンの結
果を示し、これは、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５のＭＥＦ２ＡおよびＭＥＦ２Ｄ
との特異的相互作用を示す。下のパネルは抗Ｆｌａｇ（ＨＤＡＣ）ウェスタンブ
ロットの結果を示し、これは、トランスフェクト細胞において類似の量の各ＨＤ
ＡＣが発現したことを示す。実験の略図を傍らに示す。図１６Ｂでは、細胞抽出
物を、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降した後、抗ＭＥＦ２（上のパネル）でウェスタ
ンブロットするか事前に免疫沈降せずに抗ＭＥＦ２ウェスタンによって探索した
（下のパネル）。ＨＤＡＣ５アミノ末端の欠失により、ＭＥＦ２ＡおよびＭＥＦ
２Ｃとの相互作用が阻止される。
【図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７Ｃ】 ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５によるＭＥＦ２活性の阻害に関する。１０Ｔ１／
２細胞を、表示のＨＤＡＣおよびＭＥＦ２因子の発現ベクターと共にＭＥＦ２依
存性レポータ、３ｘＭＥＦ２ルシフェラーゼで一時的にトランスフェクトした。
４８時間後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を識別した。
【図１８】 改変ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄアッセイにおけるＭＥＦ２ＣとＨＤＡＣ４およびＨ
ＤＡＣ５との相互作用を示す図である。１０Ｔ１／２細胞を、表示のように３ｘ
ＭＥＦ２ルシフェラーゼレポータならびにＭＥＦ２Ｃ１−１１７およびＨＤＡＣ
４−ＶＰ１６およびＨＤＡＣ５−ＶＰ１６の発現プラスミドで一時的にトランス
フェクトした。ＨＤＡＣ４−ＶＰ１６およびＨＤＡＣ５−ＶＰ１６を、それぞれ
クローンＣ１およびＲ４とベクターｐＶＰ１６（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）との融合に
よって作製した。ＭＥＦ１−１１７は、ＴＡＤを欠くので３ｘＭＥＦ２ルシフェ
ラーゼを活性化することができなかった。しかし、ＨＤＡＣ４−ＶＰ１６および
ＨＤＡＣ５−ＶＰ１６の存在下では、ＭＥＦ２結合部位へのこれらのＨＤＡＣの
漸増を反映して、ＭＥＦ２ １−１１７はレポータを活性化する。ＭＥＦ２ １
−１１７の非存在下では、ＨＤＡＣ４−ＶＰ１６およびＨＤＡＣ５−ＶＰ１６は
、レポータを弱く活性化し、これは、内因性ＭＥＦ２Ｄまたはプロモータに結合
する他の因子との相互作用に寄与し得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 45/06 ４Ｃ０８５ 45/06 48/00 ４Ｃ０８６ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 9/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/52 19/00 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 CB01 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FA11 FB01 FB02 FB03 FB12 GC15 4B024 AA01 AA11 BA21 CA04 CA07 DA02 GA11 HA12 HA17 4B063 QA19 QQ08 QQ43 QQ48 QR08 QR32 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B065 AA91X AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 AA17 AA20 ZA36 ZB21 4C085 AA13 AA14 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZB21 4H045 AA10 AA30 CA40 DA01 EA20 EA50 FA74

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＭＥＦ２の機能を阻害するステップを含む心筋細胞肥大の治
    療方法。
  2. 【請求項２】 前記ＭＥＦ２の機能の阻害が、ＭＥＦ２の発現を減少させる
    ステップを含む請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ＭＥＦ２機能の阻害が、ＭＥＦ２とＭＥＦ２に結合して
    不活性化させる物質とを接触させるステップを含む請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記方法が、ＭＥＦ２によってアップレギュレーションされ
    る遺伝子のアップレギュレーションの阻害をさらに含む請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ＭＥＦ２の発現を減少させる物質が、アンチセンス構築
    物である請求項３に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記ＭＥＦ２に結合して不活性化させる物質が、抗体調製物
    または小分子インヒビターである、請求項３に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記抗体調製物が一本鎖抗体を含む請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記抗体調製物が実質的にモノクローナル抗体からなる請求
    項６に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記遺伝子機能を阻害する物質がアンチセンス構築物である
    請求項４に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、その細胞が
    転写制御因子の調節下にある指標遺伝子を含み、該転写制御因子がＭＥＦ２によ
    って活性化されることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  11. 【請求項１１】 前記哺乳動物がマウスである請求項１０に記載のトランス
    ジェニック哺乳動物。
  12. 【請求項１２】 前記指標遺伝子が、ｌａｃＺ、緑色蛍光タンパク質をコー
    ドする遺伝子、およびルシフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択さ
    れる、請求項１０に記載のトランスジェニック哺乳動物。
  13. 【請求項１３】 前記転写制御因子が、ＭＥＦ２の３つのタンデムリピート
    である請求項１０に記載のトランスジェニック哺乳動物。
  14. 【請求項１４】 （ａ）ＭＥＦ２誘導制御配列の調節下にある指標遺伝子を
    含む心筋細胞を得るステップと、 （ｂ）前記細胞と候補活性調節因子とを接触させるステップと、 （ｃ）前記候補活性調節因子で処理していない細胞と比較して、前記指標遺伝子
    発現について前記細胞をモニタリングするステップと を含む心肥大の活性調節因子のスクリーニング方法。
  15. 【請求項１５】 前記細胞が心筋細胞株由来である請求項１４に記載の方法
    。
  16. 【請求項１６】 前記細胞が初代心筋細胞由来である請求項１４に記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】 前記接触がインビトロで行われる請求項１４に記載の方法
    。
  18. 【請求項１８】 前記接触がインビボで行われる請求項１４に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記細胞がトランスジェニック非ヒト哺乳動物由来である
    請求項１４に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記候補活性調節因子が、アンチセンス構築物である請求
    項１４に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記候補活性調節因子が、小分子ライブラリー由来である
    請求項１４に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記候補活性調節因子が、抗体である請求項１４に記載の
    方法。
  23. 【請求項２３】 前記抗体が一本鎖抗体である請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 心肥大の発症に関する遺伝子の識別方法であって、 （ａ）ＭＥＦ２ノックアウト細胞を得るステップと、 （ｂ）前記細胞を、同型の非ノックアウト細胞において心肥大を引き起こす条
    件に供するステップと、 （ｃ）前記ＭＥＦ２ノックアウト細胞中の遺伝子発現と非ノックアウト細胞に
    おける遺伝子発現とを比較するステップと、 （ｄ）特異的に発現した遺伝子を識別するステップと を含み、 前記特異的に発現した遺伝子が、心肥大を促進するのに関与するものとして識
    別されることを特徴とする識別方法。
  25. 【請求項２５】 ステップ（ｄ）の前記特異的に発現した遺伝子と前記心肥
    大を引き起こす条件の非存在下における非ノックアウト細胞によって発現された
    遺伝子とを比較するステップをさらに含む請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記比較が、サブトラクションハイブリッド形成を含む請
    求項２４に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記比較が、ＰＣＲ媒介ディファレンシャルディスプレイ
    を含む請求項２４に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 活性転写因子の転写活性化ドメインに融合させたＭＥＦ２
    を含む転写活性ＭＥＦ２ポリペプチド。
  29. 【請求項２９】 前記活性転写因子がＶＰ１６である請求項２８に記載のポ
    リペプチド。
  30. 【請求項３０】 （ａ）ＭＥＦ２と（ｂ）活性転写因子の転写活性ドメイン
    との融合体を含む、転写活性ＭＥＦ２分子をコードするポリヌクレオチド。
  31. 【請求項３１】 前記活性転写因子がＶＰ１６である請求項３０に記載のポ
    リヌクレオチド。
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