JP2003507076A - 心臓の遺伝子発現の調節におけるｈｄａｃ４およびｈｄａｃ５ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、心肥大に関する。より詳細には、本発明は、心肥大へのカルシウム刺激を連結する分子事象を規定する。より詳細には、本発明は、肥大応答のＣａ ²⁺刺激が、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５とＭＥＦ２との相互作用を介して媒介されること、およびＨＤＡＣのリン酸化が、ＭＥＦ２肥大作用のＨＤＡＣ媒介抑制の損失を引き起こすことを示す。従って、本発明は、心肥大の処置方法および心肥大の処置組成物、ならびに、心肥大の危険性がある被験体を同定するための方法および心肥大の危険性がある被験体を同定するための組成物を提供する。さらに、心肥大に対して治療活性を有する化合物を検出するための方法が、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 本出願は、１９９９年８月２０日に出願された、米国仮出願６０／１５０，０
４８に対して優先権を主張する。

【０００２】 （１．発明の分野） 本発明は、一般的に、分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、
心肥大の中心的メディエイターの発見に関する。

【０００３】 （２．関連技術の説明） 心肥大は、心臓疾患（高血圧、機械的負荷、心筋梗塞、不整脈、内分泌障害お
よび心筋収縮タンパク質遺伝子における遺伝的変異から生じる疾患を含む）の実
質的に全ての形態に対する、心臓の適応性応答である。肥大応答は、最初、心拍
出量を増加させる補償機構であったが、持続的な肥大は、拡大した心筋症、心不
全、および突然死を引き起こし得る。米国において、約５０万人の個体が、毎年
心不全であると診断され、そして死亡率は、５０％に近づきつつある。

【０００４】 心肥大を引き起こす多種多様な刺激に関わらず、心筋細胞の肥大シグナルへの
原形分子応答が存在し、このシグナルは、細胞のサイズおよびタンパク質合成、
増強された筋節組織化、胎児心臓遺伝子の上方制御、ならびにｃ−ｆｏｓおよび
ｃ−ｍｙｃのような遺伝子の誘導における増加に関連する（Ｃｈｉｅｎｒら、１
９９３；ＳａｄｏｓｈｉｍａおよびＩｚｕｍｏ，１９９７に総説される）。心肥
大の原因および影響は、広範に報告されているが、心筋細胞遺伝子発現を再プロ
グラムするように、細胞膜で開始される、肥大シグナルとカップルする根底に有
る分子機構は、あまり理解されていないままである。これらの機構の解明は、心
臓血管生物学における中心的な問題であり、そして心肥大および心不全の予防ま
たは処置のための新しいストラテジーの設計において重要である。

【０００５】 多くの研究が、細胞内Ｃａ²⁺を心肥大のついてのシグナルとして関連付けてい
る。作動する心臓標本に対する筋細胞伸長または増加した負荷に対する応答にお
いて、細胞内Ｃａ²⁺濃度は増加する（Ｍａｒｂａｎら，１９８７；Ｂｕｓｔａｍ
ａｎｔｅら、１９９１；Ｈｏｎｇｏら、１９９５）。このことは、増加した心拍
出量を伴う、生理学的応答を協調させる際のＣａ²⁺の役割と一貫する。種々の体
液性因子（例えば、アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）、フェニレフリン（Ｐ
Ｅ）およびエンドセリン−１（ＥＴ−１）を含み、これらは、心筋細胞における
肥大応答を誘導する（Ｋａｒｌｉｎｅｒら，１９９０；Ｓａｄｏｓｈｉｍａおよ
びＩｚｕｍｏ，１９９３ａ，１９９３ｂ；Ｌｅｉｔｅら，１９９４））はまた、
細胞内Ｃａ²⁺濃度を上昇させる能力を共有する。

【０００６】 肥大刺激は、成体の心筋層における遺伝子発現の再プログラミングを生じ、そ
の結果、β−ミオシン重鎖（ＭＨＣ）およびα−骨格アクチンのような胎児タン
パク質アイソフォームをコードする遺伝子が上方制御されるが、対応する成体ア
イソフォームα−ＭＨＣおよびα−心臓アクチンは下方制御される。ナトリウム
排泄増加性ペプチド（心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）およびβ型ナトリウ
ム排泄増加性ペプチド（ＢＮＰ）（これらは、血管拡張およびナトリウム排泄増
加によって血圧を減少される））もまた、肥大シグナルに対する応答において、
心臓内で急速に下方制御される（ＫｏｍｕｒｏおよびＹａｚａｋｉ，１９９３に
総説される）。肥大の間にこれらの心臓遺伝子を協調的に制御することに関連す
る機構は公知であるが、いくつかの転写因子（血清応答因子（ＳＲＦ）、ＴＥＦ
−１、ＡＰ−１およびＳｐ１）についての結合部位は、肥大に対する応答におい
て胎児心臓遺伝子の活性化のために重要である（ＳａｄｏｓｈｉｍａおよびＩｚ
ｕｍｏ，１９９３ａ；１９９３ｂ；Ｋａｒｉｙａら，１９９４；Ｋａｒｎら，１
９９５；Ｋｏｖａｃｉｃ−Ｍｉｌｉｖｏｊｅｖｉｃら、１９９６）。最近、心臓
制限亜鉛フィンガー転写因子ＧＡＴＡ４もまた、肥大の間にＡｎｇＩＩ型１αレ
セプターおよびβ−ＭＨＣについての遺伝子の転写活性化のために必要とされる
ことが示されている（Ｈｅｒｚｉｇら，１９９７；Ｈａｓｅｇａｗａら，１９９
７；ＭｏｌｋｅｎｔｉｎおよびＯｌｓｏｎ，１９９７に総説されている）。

【０００７】 心臓発達および肥大における転写因子の筋細胞エンハンサー因子−２（ＭＥＦ
２）ファミリーの潜在的な役割もまた考慮される。ＭＥＦ２ファミリーの４つの
メンバーが存在し、これらは、脊椎動物において、ＭＥＦ２Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−
Ｄと呼ばれる（Ｏｌｓｏｎら、１９９５に総説される）。これらの転写因子は、
Ｎ末端のＭＡＤＳ−ｂｏｘおよび隣接するモチーフ（ＭＥＦ２ドメインとして公
知）において相同性を共有する。従って、これらの領域は、ＤＮＡ結合、ホモダ
イマー化およびヘテロダイマー化、ならびに種々の共因子（例えば、骨格筋にお
ける筋原性ｂＨＬＨタンパク質）との相互作用を媒介する。ＭＥＦ結合部位ＣＴ
（Ａ／Ｔ）₄ＴＡＧ／Ａは、骨格筋、心筋および平滑筋遺伝子の大部分の制御領
域に見出される。ＭＥＦ２因子のＣ末端は、転写活性化ドメインとして機能し、
そして代替のスプライシングの複雑なパターンに供される。

【０００８】 マウス胚形成の間、ＭＥＦ２遺伝子は、心筋、骨格筋および平滑筋直系の前駆
体において発現され、そしてそれらの発現は、分化した筋肉細胞において維持さ
れる（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎら、１９９４）。ＭＥＦ２因子は、また種々の非筋肉
細胞型においてより低いレベルで発現される。ＭＥＦ２Ｃの標的化された不活性
化は、心不全に起因して約Ｅ９．５で胚死を生じることが示されている（Ｌｉｎ
ら，１９９７）。ＭＥＦ２Ｃ変異体マウスの心臓管において、いくつかの心臓遺
伝子（α−ＭＨＣ、ＡＮＦおよびα−心臓アクチンを含む）は、発現し損ねるが
、それらが、それらの制御領域に本質的なＭＥＦ２結合部位を含むという事実と
は関わりなく、いくつかの他の心臓収縮タンパク質遺伝子は、普通に発現される
。これらの結果は、心臓発達についてＭＥＦ２Ｃの本質的な役割を例証し、そし
てＭＥＦ２ファミリーの他のメンバーが、ＭＥＦ２Ｃの非存在下で、筋肉遺伝子
のサブセットの発現を支持し得る重複した機能を有し得ることを示唆する。Ｄｒ
ｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、単一のＭＥＦ２遺伝子（Ｄ−ＭＥＦ２と呼ばれる）
が存在する。Ｄ−ＭＥＦ２を欠く胚において、筋肉構造遺伝子は、任意の筋原性
直系において活性化されず、ＭＥＦ２が、すベての筋肉細胞型の分化プログラム
の本質的な成分であることを立証する（Ｌｉｌｌｙら、１９９５；Ｂｏｕｒら、
１９９５）。

【０００９】 ＭＥＦ２因子は、筋肉構造遺伝子の活性化のために必要とされるが、それらは
、これらの遺伝子のみを活性化するのに十分ではない。その代わり、生化学的お
よび遺伝的研究は、ＭＥＦ２因子が、遺伝子発現の特定のプログラムを活性化す
るために、他の転写因子と組み合わせて作用することを示す。骨格筋において、
ＭＥＦ２は、筋肉遺伝子転写を活性化するために、ＭｙｏＤファミリーのメンバ
ーとの相互作用を通して、組み合わせコードを確立する（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら
、１９９５；ＭｏｌｋｅｎｔｉｎおよびＯｌｓｏｎ、１９９６）。心筋細胞およ
び平滑筋細胞における、または非筋肉細胞（ここで、ＭＥＦ２タンパク質は、種
々の遺伝子を調節することが示されている）におけるＭＥＦ２についての特定の
パターンが、規定されていない。

【００１０】 以下に議論されるように、心肥大の制御におけるＭＥＦ２に対する重要な役割
を示唆する証拠の４つの系列が存在する。１）ＭＥＦ２は、肥大の間に上方制御
される胎児心臓遺伝子の多くを調節する。２）ＭＥＦ２転写活性が、肥大を制御
する同じシグナル伝達経路によって誘導される。３）ＭＥＦ２Ｃは、先天性心不
全を有するヒト患者の心臓において、上方制御される。４）ＭＥＦ２は、α−Ｍ
ＨＣ遺伝子の転写を調節するために、甲状腺ホルモンレセプターと協調し（Ｌｅ
ｅら、１９９７）、そして甲状腺ホルモンは、肥大の強力なインデューサーであ
る。

【００１１】 Ｔ細胞レセプター活性化に対する応答において、Ｔ細胞における見なし（ｏｒ
ｐｈａｎ）ステロイドレセプターＮｕｒ７７遺伝子（ＮＧＦＩ−Ｂ）の転写活性
化は、ＣｓＡ−感受性、カルシウム依存性シグナル伝達経路によって媒介される
（Ｗｏｒｏｎｉｃｚら、１９９５）。このシグナル伝達経路は、ＮＧＦＩ−Ｂプ
ロモーターにおける２つのＭＥＦ２結合部位に指向される。その系において、カ
ルシウムシグナルの存在または非存在下で、ＭＥＦ２のＤＮＡ結合活性における
変化はないが、ＭＥＦ２の転写活性は、カルシウムシグナル伝達によって、劇的
に増加する。このことは、カルシウムシグナルが、転写活性を刺激するＭＥＦ２
の共因子または翻訳後改変を誘導することによって、ＭＥＦ２活性を増強しなけ
ればならないことを意味する。

【００１２】 さらに、カルシウム依存性溶解サイクルスイッチ遺伝子ＢＺＬＦ１（Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）の溶解サイクルの誘導に必要とされる）の
転写は、ＣｓＡおよびＦＫ５０６によって阻害され、カルシニュリン依存性経路
が、この遺伝子の活性化を媒介することを示す（Ｌｉｕら、１９９７）。ＢＺＬ
Ｆ１転写のＣｓＡ感受性は、ＢＺＬＦ１プロモーターにおける３つのＭＥＦ２部
位にマッピングする。ＣｓＡ感受性誘導性は、ＣＲＥＢ／ＡＰ−１部位と共に、
ＭＥＦ２部位の複数のコピーを含む人工プロモーターを使用して再構成されるこ
とが示された。ＮＦＡＴは、ＢＺＬＦ１プロモーターに結合しなかったが、この
プロモーターのＣｓＡ感受性誘導は、カルシニュリン依存性およびＮＦＡＴ依存
性であることが示された。ＣａＭＫＩＶはまた、ＭＲＦ２活性の強力なインデュ
ーサーであることが示された（Ｌｉｕら、１９９７）。ＭＥＦ２が、カルシニュ
リン／ＮＦＡＴシグナル伝達系に対する応答性を与える機構は、しかしながら、
解明されていない。

【００１３】 ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路はまた、種々の細胞型においてＭＲＦ２因子
の転写活性の増強に導くことが示されている（Ｈａｎら、１９９７；Ｃｏｓｏら
、１９９７；Ｋａｔｏら、１９９７；Ｃｌａｒｋｅら、１９９７）。この増強は
、ＭＥＦ２Ｃについて、ＭＡＰキナーゼファミリーメンバーｐ３８によるＣ末端
活性化ドメイン内のＴｈｒ２９３、Ｔｈｒ３００、およびＳｅｒ３８７の３つの
アミノ酸のリン酸化によって媒介されることが示されている。これらの同じ残基
が、心臓における肥大シグナル伝達によってリン酸化されるか否かが、決定され
ていない。

【００１４】 心肥大応答は、Ｃａ²⁺依存性経路を通して、何とかして開始されることが、明
かである。しかし、肥大応答を媒介する遺伝子の正確な同定は、残されたままで
ある。本発明は、肥大経路（これは、心肥大に対する有利な効果を達成するよう
に操作され得る）における正確な点の解明に関する。ヒトにおける心肥大の処置
のための薬理学的ストラテジーを開発するために、疾患の病理学的プロフィール
を正確に反映する実験モデルを確立すること、および肥大成長を調節または阻害
する組成物を同定することが重要である。

【００１５】 （発明の要旨） 心肥大は、心臓疾患の実質的に全ての形態に対する心臓の適応性応答である。
肥大応答は、最初、心拍出量を増加させる補償機構であったが、持続的な肥大は
、拡大した心筋症、心不全、および突然死を引き起こし得る。米国において、約
５０万人の個体が、毎年心不全であると診断され、そして死亡率は、５０％に近
づいている。従って、心肥大の影響を防ぐかまたは無効にさえする方法および組
成物に対する必要性が存在する。

【００１６】 本発明は、心肥大に対する有利な効果を達成するために操作され得る肥大経路
における正確な点の解明に関する。従って、特定の実施形態において、本発明は
、心肥大のインヒビターを同定するための方法を提供し、この方法は、ＨＤＡＣ
４またはＨＣＡＤ５酵素の供給源を提供する工程、この酵素と候補物質とを接触
させる工程、この候補物質の存在下で酵素機能を決定する工程、およびこの候補
物質の非存在下で酵素機能を比較する工程を包含し、ここで、候補物質の非存在
下での酵素機能と比較して、候補物質の存在下での酵素機能の増加は、心肥大の
インヒビターとして候補物質を同定する。特定の実施形態において、この酵素は
、精製されたＨＤＡＣ４、精製されたＨＤＡＣ５またはＨＤＡＣ４またはＨＤＡ
Ｃ５の混合物である。他の実施形態において、ＨＤＡＣ酵素は、ＨＤＡＣ４およ
びＨＤＡＣ５の混合物であり、ここで、この混合物は、心臓細胞内に有る。なお
他の実施形態において、心臓細胞中のＤＨＡＣ４およびＨＤＡＣ５酵素混合物は
、実験動物内にある。

【００１７】 特定の実施形態において、精製されたＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５の酵素機能
は、インビトロ脱アセチル反応によって決定される。他の実施形態において、Ｈ
ＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５混合物の酵素機能は、心臓細胞または実験動物におけ
る心臓細胞のヒストンアセチル化の状態によって決定される。このようなインヒ
ビターを生成する方法、およびこのような方法に従って生成されたインヒビター
もまた、提供される。

【００１８】 本発明の別の実施形態では、心臓細胞における遺伝子発現のモジュレーターを
同定するための方法が意図される。本方法は、ＭＥＦ２ ＨＤＡＣ結合領域を提
供する工程、ＭＥＦ２ ＨＤＡＣ結合領域を、ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５
のＭＥＦ２結合領域および候補物質と接触させる工程、ならびに候補物質の存在
下または非存在下でのＭＥＦ２ ＨＤＡＣ結合領域の結合を決定する工程を包含
し、ここで、候補物質の存在下での結合と非存在下での結合との間の相違は、候
補物質を心臓遺伝子発現のモジュレーターとして同定する。特定の実施形態では
、ＭＥＦ２ ＨＤＡＣ結合領域は、残基１〜８６を含む。他の実施形態では、Ｍ
ＥＦ２ ＨＤＡＣ結合領域は、残基１〜１１７を含む。別の実施形態では、ＭＥ
Ｆ２ ＨＤＡＣ結合領域は、全長ＭＥＦ２を含む。他の実施形態では、ＨＤＡＣ
４またはＨＤＡＣ ５のＭＥＦ２結合領域は、ＨＤＡＣ ４の残基１６３〜１
８０またはＨＤＡＣ ５の残基１７５〜１９２を含む。なお他の実施形態では、
ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５のＭＥＦ２結合領域は、全長ＨＤＡＣを含む。

【００１９】 特定の実施形態では、ＭＥＦ２ ＨＤＡＣ結合領域およびＨＤＡＣ ４または
ＨＤＡＣ ５のＭＥＦ２結合領域は個々に、クエンチ可能なマーカーおよびクエ
ンチング剤を含む。他の実施形態では、ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５のＭＥ
Ｆ２結合領域は転写因子に融合され、そして結合は、レセプター発現カセットの
転写活性化によって測定される。なお他の実施形態では、レポーターカセットは
、β−ガラクトシダーゼ、ｌａｃＺおよびＧＦＰルシフェラーゼからなる群より
選択される検出可能なマーカーをコードする。

【００２０】 本発明はさらに、ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５の少なくとも１つを動物中
の心臓組織に提供する工程を包含する、動物において心肥大を処置するための方
法を提供する。この動物は、ヒトであり得る。他の実施形態では、ＨＤＡＣ ４
およびＨＤＡＣ ５は両方とも、動物中の心臓組織に提供される。特定の実施形
態では、ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５の少なくとも１つは、心臓組織におい
て活性なプロモーターの制御下でＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５をコードする
発現カセットを心臓組織に移入することによって提供される。別の実施形態では
、発現カセットは、ウイルス発現ベクターであり、そして移入する工程は、ウイ
ルス発現ベクターを含むウイルス粒子による心臓組織の感染によって達成される
。特定の実施形態では、ウイルス発現ベクターは、アデノウイルス、レトロウイ
ルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスから誘
導される。本発明の他の実施形態では、心肥大を処置するための方法はさらに、
伝統的な冠状心臓疾患薬物処方物（例えば、「βブロッカー」、抗高血圧剤、強
心剤、抗血栓剤、血管拡張剤、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴ
ニスト、サイトカインインヒビター／ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカ
ー、ホスホジエステラーゼインヒビターおよびアンギオテンシン２型アンタゴニ
スト）を動物に投与する工程を包含する。

【００２１】 特定の実施形態では、動物における心肥大を処置するための方法は、ＨＤＡＣ
４アゴニストまたはＨＤＡＣ ５アゴニストをこの動物に提供する工程を包含
する。特定の実施形態では、このアゴニストは、ＨＤＡＣ ４もしくはＨＤＡＣ
５の合成を増大させるか、またはこのアゴニストは、ＨＤＡＣ ４もしくはＨ
ＤＡＣ ５の安定性を増大させるか、またはこのアゴニストは、ＨＤＡＣ ４も
しくはＨＤＡＣ ５の活性を増大させるか、またはこれらの任意の組み合わせで
ある。別の実施形態では、動物における心肥大を処置するための方法はさらに、
伝統的な冠状心臓疾患薬物処方物を動物に投与する工程を包含する。

【００２２】 本発明は、特定の実施形態において、心肥大を発達させる危険性のある被験体
を同定するための方法を提供し、この方法は、この被験体から生物学的サンプル
を得る工程、およびこのサンプルの細胞中のＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５の
遺伝子型を評価する工程を包含する。特定の実施形態では、評価する工程は、Ｈ
ＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５のポリヌクレオチド配列を決定する工程を包含し
、ここで、このポリヌクレオチド配列はコード配列である。別の実施形態では、
評価する工程は、ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５のＲＦＬＰパターンを決定す
る工程を包含する。なお別の実施形態では、評価する工程は、ＨＤＡＣ ４また
はＨＤＡＣ ５の転写産物または遺伝子の大きさを決定する工程を包含し、ここ
で評価する工程はさらに、ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５の転写産物または遺
伝子を増幅する工程を包含し得る。好ましい実施形態では、生物学的サンプルは
、心臓組織である。

【００２３】 本発明の他の実施形態では、心肥大のインヒビターは、ＨＤＡＣ ４酵素また
はＨＤＡＣ ５酵素の供給源を提供する工程、この酵素を候補物質と接触させる
工程、酵素の機能を候補物質の存在下で決定する工程、候補物質の非存在下での
酵素機能を比較する工程であって、ここで、候補物質の非存在下での酵素機能と
比較して、候補物質の存在下で低下した酵素機能は、候補物質を心肥大のインヒ
ビターとして同定する、工程、およびこのようにして同定されたインヒビターを
産生する工程を包含する方法に従って同定される。

【００２４】 本発明は、別の実施形態で、心臓細胞における遺伝子発現のモジュレーターを
同定するための方法を提供し、この方法は、ＭＥＦ２ ＨＤＡＣ結合領域を提供
する工程、ＭＥＦ２ ＨＤＡＣ結合領域をＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５のＭ
ＥＦ２結合領域および候補物質と接触させる工程、ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ
５のＭＥＦ２結合領域および候補物質の工程において結合を決定する工程、候
補物質の非存在下での結合を比較する工程であって、ここで、候補物質の存在下
での結合と非存在下での結合との間の相違は、この候補物質を心臓遺伝子発現の
モジュレーターとして同定する、工程、ならびにこのようにして同定されたモジ
ュレーターを産生する工程を包含する。

【００２５】 他の実施形態では、ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５の１以上の機能的対立遺
伝子を欠く非ヒトトランスジェニック動物が提供される。特定の実施形態では、
非ヒトトランスジェニック動物は、ＨＤＡＣ ４およびＨＤＡＣ ５の全ての機
能的対立遺伝子を欠く。なお他の実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物
は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギおよびウシからなる群より選択され
、そしてさらにＭＥＦ２調節性プロモーターの制御下で検出可能なマーカー遺伝
子を含み得る。特定の実施形態では、ＭＥＦ２調節性プロモーターは、ＮＧＦＩ
−Ｂプロモーターであり、そして検出可能なマーカー遺伝子は、β−ガラクトシ
ダーゼ、ＧＦＰまたはルシフェラーゼである。

【００２６】 なおさらなる実施形態では、ＨＤＡＣリン酸化のモジュレーターを同定する方
法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）このＨＤＡＣのリン
酸化を支持する条件下で、このＨＤＡＣの供給源を提供する工程；（ｂ）このＨ
ＤＡＣを候補物質と接触させる工程；（ｃ）このＨＤＡＣにおける１以上のセリ
ン残基のリン酸化状態を決定する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）のＨＤＡＣの
リン酸化状態を、候補物質の存在下でのＨＤＡＣと比較する工程であって、この
候補物質の非存在下での酵素機能と比較したときの、この候補物質の存在下での
このＨＤＡＣのリン酸化状態の変化は、この候補物質をＨＤＡＣリン酸化のモジ
ュレーターとして同定する、工程。

【００２７】 ＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５であり得る。ＨＤＡＣ ５の場
合、セリン残基は、２５９、４９８および６６１からなる群より選択され得る。
リン酸化状態は、例えば、１４−３−３に対するこのＨＤＡＣ結合によって決定
され得、ここで、１４−３−３に対するＨＤＡＣ結合は、ＨＤＡＣのＧＡＬ４融
合物および１４−３−３のＧＡＬ４融合物が、マーカー遺伝子の転写を開始する
能力によって決定される。マーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、グリーン
蛍光タンパク質またはルシフェラーゼであり得る。ＨＤＡＣは、宿主細胞（例え
ば、酵母細胞）中に位置し得る。あるいは、リン酸化状態は、ＨＤＡＣの細胞内
局在を決定することによって決定され得る。このようなモジュレーターを調製す
る方法およびこのような方法によって調製されたモジュレーターもまた提供され
る。

【００２８】 動物における心肥大を処置するための方法もまた提供され、この方法は、ＨＤ
ＡＣリン酸化のインヒビターを動物に提供する工程を包含する。これは、ヒトの
ものであり得る。インヒビターは、Ｃａｍキナーゼのインヒビター（例えば、Ｋ
Ｎ６２）であり得る。この方法はさらに、第２の薬学的組成物（例えば、「βブ
ロッカー」、抗高血圧剤、強心剤、抗血栓剤、血管拡張剤、ホルモンアンタゴニ
スト、エンドセリンアンタゴニスト、サイトカインインヒビター／ブロッカー、
カルシウムチャネルブロッカー、ホスホジエステラーゼインヒビターおよびアン
ギオテンシン２型アンタゴニスト）をこの動物に提供する工程を包含し得る。Ｈ
ＤＡＣは、ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５であり得る。

【００２９】 別の実施形態では、ＨＤＡＣキナーゼを同定する方法が提供され、この方法は
、以下の工程を包含する：（ａ）ＨＤＡＣ−ＧＡＬ４融合物および１４−３−３
−ＧＡＬ４融合物を、ＨＤＡＣのセリン残基をリン酸化しない宿主細胞中に提供
する工程であって、ここで、この宿主細胞はさらに、ＧＡＬ４によって誘導され
るプロモーターの制御下にマーカー遺伝子を含む、工程；（ｂ）工程（ａ）の宿
主細胞を、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換する工程；および（ｃ）このマーカ
ー遺伝子発現を決定する工程であって、ここで、細胞によるこのマーカー遺伝子
の発現が、ＨＤＡＣキナーゼをコードするｃＤＮＡを含むと細胞を同定する、工
程。ＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５であり得る。

【００３０】 （例示的実施形態の説明） 心不全をもたらす、心肥大は、米国における罹病率の主な原因であるが、その
基礎となる分子機構は理解されていない。肥大型心筋症は、家族性および散発性
の両方の形態で生じる。この型の心筋症は、左心室の肥大によって特徴付けられ
る。肥大型心筋症は、増強された収縮期機能、長期でかつ異常に強力な等容性収
縮期、その後の拡張期の間の損なわれた弛緩および増大した室剛直性によって特
徴付けられる。

【００３１】 心臓に付与された増大した作業負荷に応答した心肥大は、基本的適応機構であ
る。これは、神経刺激、内分泌刺激または機械的刺激のいずれかまたはそれらの
組み合わせの結果として、細胞の大きさおよび重さ（むしろ、細胞数）における
量的増大を反映する、特化されたプロセスである。心肥大に関与する別の因子で
ある高血圧は、うっ血性心不全の頻繁な前兆である。心不全が生じた場合、左心
室は通常、肥大および拡張しており、そして収縮期機能指数（例えば、駆出率）
が減少する。明らかに、心肥大応答は複雑な症候群であり、そして心肥大をもた
らす経路の解明は、種々の刺激から生じる心臓疾患の処置において有益である。

【００３２】 転写因子のファミリーである、単球エンハンサー因子−２ファミリー（ＭＥＦ
２）は、心肥大に関与する。例えば、種々の刺激が、細胞内カルシウムを上昇さ
せて、細胞内シグナル伝達系または細胞内シグナル伝達経路（カルシニューリン
、ＣＡＭキナーゼ、ＰＫＣおよびＭＡＰキナーゼを含む）のカスケードを生じさ
せ得る。これらのシグナルの全てが、ＭＥＦ２を活性化させ、そして心肥大を生
じる。しかし、種々のシグナル系がいかにしてＭＥＦ２にそれらの効果を及ぼす
か、およびいかにしてその肥大シグナル伝達を調節するかは、依然として完全に
は理解されていない。本発明は、ＭＥＦ２活性の調節に関与する２つのヒストン
デアセチラーゼタンパク質（ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５）を同定した。

【００３３】 ６つの異なるＨＤＡＣが、哺乳動物からクローニングされた。全てが、その触
媒領域において、相同性を共有する。しかし、ＨＤＡＣ４および５は、他のＨＤ
ＡＣにおいては見出されない独自のアミノ末端伸長を有する。このアミノ末端領
域は、ＭＥＦ２結合ドメインを含む。ヒストンアセチラーゼおよびデアセチラー
ゼは、遺伝子発現の制御において、主要な役割を果たす。ヒストンアセチラーゼ
（ＨＡ）とヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）との活性の間のバランスが、ヒ
ストンのアセチル化のレベルを決定する。その結果、アセチル化されたヒストン
は、クロマチンの緩和および遺伝子転写の活性化を引き起こし、一方で脱アセチ
ル化されたクロマチンは、一般に、転写的に不活性である。本発明者らは、本発
明において、ＨＤＡＣ４および５が、ＭＥＦ２と二量化し、そしてＭＥＦ２の転
写活性を抑制することを実証した。さらに、この相互作用は、ＨＤＡＣ４タンパ
ク質およびＨＤＡＣ５タンパク質のＮ末端の存在を必要とする。

【００３４】 従って、特定の実施形態において、本発明は、ＨＤＡＣ４タンパク質およびＨ
ＤＡＣ５タンパク質を使用して、心肥大のインヒビターを同定するための方法お
よび組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、心臓細胞遺伝子発
現の調節因子を同定するための方法および組成物を提供する。他の実施形態にお
いて、本発明は、心肥大を発生させる危険性のある被験体を同定する方法を提供
し、そしてＨＤＡＣ４または５の１つ以上の機能性対立遺伝子を欠く非ヒトトラ
ンスジェニック動物を提供する。

【００３５】 （Ａ．心肥大のための転写経路） 細胞内Ｃａ²⁺の上昇が、機械的な心肥大またはアゴニスト誘導心肥大の開始に
関連することは、十分に立証されている（Ｍａｒｂａｎら、１９８７；Ｂｕｓｔ
ａｍａｎｔｅら、１９９１；Ｈｏｎｇｏら、１９９５；Ｌｅ Ｇｕｅｎｎｅｃら
、１９９１；Ｐｅｒｒｅａｕｌｔら、１９９４；Ｓａｅｋｉら、１９９３）。さ
らに、心肥大は、特定の遺伝子のアップレギュレーション（これは、細胞の数を
ほとんどまたは全く増加させることなく、心筋細胞のタンパク質含有量の増加を
導く）から生じることが、公知である。この肥大経路の活性化は、分子の変化お
よび病態生理学的変化を生じる。

【００３６】 上記のように、Ｃａ²⁺の活性化が心肥大に関与することは、公知である。本発
明は、ヒストンデアセチラーゼタンパク質ＨＤＡＣ４および５によってＭＥＦ２
転写活性が調節される、心肥大のための経路を記載する。この経路の個々の構成
要素を、心肥大に関連するとして、本明細書中以下にさらに詳細に議論する。

【００３７】 （１．カルシニューリン） カルシニューリンとは、ユビキチンにより（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ）発現
されるヘテロダイマーとして存在する、５９ｋＤのカルモジュリン結合触媒Ａサ
ブユニットおよび１９ｋＤのＣａ²⁺結合調節Ｂユニットからなる、セリン／スレ
オニンホスファターゼである（ＳｔｅｍｍｅｒおよびＫｌｅｅ、１９９４；Ｓｕ
ら、１９９５）。カルシニューリンは、Ｃａ²⁺シグナル伝達に対する心筋細胞の
延長した肥大性応答を調節するために、独自に適している。なぜなら、この酵素
は、持続したＣａ²⁺プラトーによって活性化され、そして心筋細胞収縮に応答し
て起こるような一時的なＣａ²⁺流出に対して非感受性であるからである（Ｄｏｌ
ｍｅｔｓｃｈら、１９９７）。

【００３８】 カルシニューリンの活性化は、Ｃａ²⁺およびカルモジュリンの、それぞれ調節
サブユニットおよび触媒サブユニットへの結合によって、媒介される。以前の研
究は、心臓におけるカルモジュリンの過剰発現もまた、肥大を生じさせることを
示したが、関与する機構は、決定されなかった（Ｇｒｕｖｅｒら、１９９３）。
本明細書中に提示される観察を考慮して、カルモジュリンが、カルシニューリン
経路を介して、肥大性応答を誘導するよう作用することが、ここで明らかである
。

【００３９】 （２．ＣＡＭＫ） 細胞内Ｃａ²⁺結合タンパク質であるカルモジュリンが心肥大の主要なレギュレ
ーターであり得ることを示唆する、実質的な証拠が存在する。例えば、トランス
ジェニックマウスの心臓におけるカルモジュリンの過剰発現は、肥大を誘導し（
Ｇｒｕｖｅｒら、１９９３）、そして培養された心筋細胞の、カルモジュリンア
ンタゴニストＷ−７による処理は、α−アドレナリン作用性刺激およびＣａ²⁺チ
ャンネルアゴニストに応答して、肥大を防止する（Ｓｅｉら、１９９１）。カル
シニューリンおよび多機能性Ｃａ²⁺／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ
（ＣａＭＫ）は、十分に特徴付けられたカルモジュリン調節の下流標的である。
実際に、活性化されたＣａＭＫＩＩは、インビトロで初代心筋細胞において肥大
応答性遺伝子心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）を誘導することが示されてお
り、そしてＣａＭＫインヒビターＫＮ−９３は、インビトロでエンドセリン−１
に対する肥大性応答をブロックし得る（Ｒａｍｉｒｅｚら、１９９７；Ｓｅｉら
、１９９１；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈおよびＧｌｅｍｂｏｔｓｋｉ、１９９２）。し
かし、ＣａＭＫＩＩのｄＢアイソフォーム（これは、心臓において発現されるＣ
ａＭＫＩＩの優勢なアイソフォームである）は、インビトロで完全な肥大性応答
を活性化させず、そしてビボでの肥大性増殖へのこのシグナル伝達経路の潜在的
な関与は、調査されなかった。近年、ＣａＭキナーゼ活性もまた、ヒトの不全心
臓において上昇することが報告された（Ｈｏｃｈら、１９９９）。

【００４０】 心肥大におけるＣａ²⁺／カルモジュリンの示唆された重要性、および肥大に対
するカルシニューリン非依存性機構に関する証拠に起因して、心筋細胞における
カルシニューリンとＣａＭキナーゼシグナル伝達との関係を調査した。本発明者
らは、活性化されたＣａＭＫＩおよびＣａＭＫＩＶが、初代新生児心筋細胞にお
ける肥大性応答を誘導し得、一方でＣａＭＫＩＩはこの応答を阻害することを示
した。ＣａＭＫＩおよびＩＶはまた、インビボおよびインビトロでカルシニュー
リン−ＮＦＡＴと共同して、肥大を刺激する。これらの結果は、心臓でのＣａＭ
キナーゼシグナル伝達における特異性を明らかにし、そしてＣａＭＫＩＶおよび
カルシニューリンにより制御されるＣａ²⁺／カルモジュリン依存性シグナル伝達
経路が共同的に作用し、そして異なるセットの下流転写因子に集合して肥大性応
答を引き起こすようであることを示唆する。

【００４１】 ６つの型のＣａＭキナーゼが存在する（ＣａＭキナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、お
よびＩＶ、ミオシン軽鎖キナーゼ、およびホスホリラーゼキナーゼ）。これらの
ＣａＭキナーゼは、共通の構造的組織を共有し、アミノ末端触媒ドメインおよび
中央のカルモジュリン結合調節ドメインを有する（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ，１９９
９に概説される）。ＣａＭＫＩおよびＣＡＭＫＩＶは、類似の触媒特性および構
造特性を共有する。両方のアイソフォームが、核に局在化し、そしてモノマーと
して存在し、そして両方が、初代新生児心筋解剖において、肥大応答を活性化す
る。ＣａＭＫＩは、心臓を含む広範な組織において発現され、一方でＣａＭＫＩ
Ｖは、優先的に、脳、精巣、脾臓、および胸腺において発現される。本発明の結
果は、ＣａＭＫＩＶもまた、他の組織においてより低いレベルでではあるが、心
臓において発現されることを示す。

【００４２】 （３．ＭＥＦ２） 転写因子のファミリーである、単球エンハンサー因子−２ファミリー（ＭＥＦ
２）は、骨格、心臓、および平滑筋の細胞における形態発生および筋発生におい
て、重要な役割を果たすことが公知である（Ｏｌｓｏｎら、１９９５）。ＭＥＦ
２因子は、全ての発生中の筋細胞型において発現され、大部分の筋特異的遺伝子
の制御領域において、保存されたＤＮＡ配列を結合する。４つの哺乳動物ＭＥＦ
２遺伝子のうちの３つ（ＭＥＦ２Ａ、ＭＥＦ２ＢおよびＭＥＦ２Ｃ）が、選択的
にスプライシングされ得、これらは、有意な機能的差異を有する（Ｂｒａｎｄ，
１９９７；Ｏｌｓｏｎら、１９９５）。これらの転写因子は、Ｎ末端ＭＡＤＳボ
ックスおよびＭＥＦ２ドメインとして公知の隣接するモチーフにおいて、相同性
を共有する。ともに、ＭＥＦ２のこれらの領域は、ＤＮＡ結合、ホモ二量化およ
びヘテロ二量化、ならびに種々の補因子（例えば、骨格筋における筋性ｂＨＬＨ
タンパク質）との相互作用を媒介する。さらに、脊椎動物および無脊椎動物にお
ける、生化学的および遺伝的研究は、ＭＥＦ２因子が、他の転写因子とのコンビ
ナトリアル相互作用を介して、筋発生を調節することを実証した。

【００４３】 機能損失の研究は、ＭＥＦ２因子が胚形成の間の筋肉遺伝子発現を活性化する
ために必須であることを示す。ＭＥＦ２タンパク質の発現および機能は、複数の
形態の陽性および陰性の調節に供されて、ＭＥＦ２因子が関与する様々な転写回
路を微調整するよう働く。本発明は、心肥大の発生におけるＭＥＦ２の役割を決
定するための方法を記載する。

【００４４】 （４．ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５） ヌクレオソーム（クロマチンの折り畳みの主要な骨格）は、動的な高分子構造
であり、クロマチン溶液コンホメーションに影響を及ぼす（Ｗｏｒｋｍａｎおよ
びＫｉｎｇｓｔｏｎ、１９９８）。ヌクレオソームコアは、ヒストンタンパク質
Ｈ２Ａ、ＨＢ、Ｈ３およびＨ４から作製される。ヒストンのアセチル化は、ヌク
レオソームおよびヌクレオソーム配置の、生物物理学的特性が変化した挙動を引
き起こす。ヒストンアセチラーゼ（ＨＡ）とヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ
）との間の活性のバランスが、ヒストンアセチル化のレベルを決定する。アセチ
ル化されたヒストンは、クロマチンの緩和および遺伝子転写の活性化を引き起こ
し、一方で脱アセチル化されたクロマチンは、一般に、転写的に不活性である。

【００４５】 ６つの異なるＨＤＡＣが、脊椎動物からクローニングされた。最初に同定され
た３つのヒトＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２およびＨＤＡＣ３（クラスＩ
ヒトＨＤＡＣと称する）であった。近年、クラスＩＩヒトＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ４
、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６およびＨＤＡＣ７）（Ｋａｏら、２０００）がクロー
ニングされ、そして同定された（Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒら、１９９９、本明細書中
に参考として援用される）。全てが、触媒領域において、相同性を共有する。し
かし、ＨＤＡＣ４および５は、他のＨＤＡＣにおいては見出されない独自のアミ
ノ末端伸長を有する。このアミノ末端領域は、ＭＥＦ２結合ドメインを含む。本
発明は、ＨＤＡＣ４および５が、心臓遺伝子発現の調節に関与すること、そして
特定の実施形態においては、ＭＥＦ２転写活性を抑制することを、確認した。Ｈ
ＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５がＭＥＦ２活性を抑制する正確な機構は、完全には理
解されていない。１つの可能性は、ＭＥＦ２に結合するＨＤＡＣ４または５が、
直接的にか、またはネイティブの転写的に活性なＭＥＦ２コンホメーションを不
安定化することによってかのいずれかで、ＭＥＦ２転写活性を阻害することであ
る。脱アセチル化を進行させるために、ＨＤＡＣ４または５が、ＭＥＦ２と二量
化して、ＨＤＡＣをヒストンの近位に局在化または配置させることを必要とする
こともまた、可能である。

【００４６】 （５．肥大性遺伝子） ホルモン性刺激、遺伝的刺激、および機械的刺激に応答して、心筋層は、個々
の筋細胞の肥大を介して、増加したワークロードに適応する（Ｍｏｒｇａｎら、
１９８７）。成体の心筋細胞は、末端が分化し、そして増殖する能力を失ってい
るので、肥大プロセスの間の心臓の増殖は、主として、筋細胞の数の変化をほと
んどまたは全く伴わずに、個々の心筋細胞あたりのタンパク質含有量の増加から
生じる。従って、心筋層の肥大性応答の中心的な特徴は、収縮性タンパク質含有
量の増加、収縮性タンパク質アイソフォームの誘導、および胚マーカーの発現で
あり、これらは、これらのタンパク質をコードする対応する心臓遺伝子の転写の
活性化に、大きく依存するようである。

【００４７】 心筋層において構成的に発現される収縮性タンパク質遺伝子（例えば、ラット
心臓ミオシン軽鎖−２（ＭＬＣ−２）遺伝子）のアップレギュレーションは、個
々の心筋細胞における、ＭＬＣ−２レベルの定量的な増加およびこの収縮性タン
パク質の対応する蓄積を生じる。心筋細胞の肥大はまた、収縮性タンパク質の組
成の定性的な変化（通常は胚の発生（例えば、骨格α−アクチンの再活性化（Ｓ
ｃｈｗａｒｔｚら、１９８６）ならびに心肥大のげっ歯類モデルおよびウサギモ
デルにおけるβ−ミオシン重鎖（ＭＨＣ）発現）において発現される収縮性タン
パク質遺伝子の誘導を含む）に関連する。特定の収縮性タンパク質成分の誘導に
加えて、心室の肥大もまた、非収縮性タンパク質遺伝子の発現の変化によって、
特徴付けられる。

【００４８】 心室の肥大の間にアップレギュレーションされる公知の非収縮性タンパク質遺
伝子のうちで、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）発現の再活性化が、最もよ
く特徴付けられ得る。ＡＮＦとは、心房の筋細胞によって分泌される脈管調節ペ
プチドホルモンであり、組織の伸長またはカテコールアミンもしくはエンドセリ
ン（ＥＴ）のようなホルモンに応答してエキソサイトーシスを起こす分泌顆粒内
に貯蔵される。β型ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＢＮＰ）（これは、血管拡
張およびナトリウム排泄増加によって血圧を低下させる）もまた、肥大性シグナ
ルに応答して、心臓において迅速にアップレギュレーションされる（Ｋｏｍｕｒ
ｏおよびＹａｚａｋｉ、１９９３に概説される）。

【００４９】 （Ｂ．心臓病の処置） Ｃａ²⁺媒介経路が特定の心臓病に関与するという報告が存在するが、本発明は
、ＭＥＦ２が肥大性応答の中心的な媒介物であるという証拠を提示する。本質的
に、Ｃａ²⁺依存性タンパク質であるカルシニューリンおよびＣａＭＫＩＶは、Ｍ
ＥＦ２依存性遺伝子発現を活性化させ得る。さらに、本発明者らによって、ヒス
トンデアセチラーゼＨＤＡＣ４および５が、心肥大の調節に関与することが実証
される。本発明において、ＨＤＡＣ４および５が、同定されたＨＤＡＣ４および
５のＭＥＦ２結合ドメインとの会合によって、ＭＥＦ２転写活性を調節すること
が、考慮される。

【００５０】 （１．ＨＤＡＣ４および５の活性化） 本発明の特定の実施形態において、心肥大の処置のための方法が提供される。
これらの方法は、ＨＤＡＣ４および５がＭＥＦ２と相互作用し、そして肥大性応
答に関与する遺伝子の発現をダウンレギュレーションするという、本発明者らの
観察を利用する。従って、ＨＤＡＣ４タンパク質およびＨＤＡＣ５タンパク質の
濃度の増加、あるいはＨＤＡＣ４または５の活性、発現もしくは安定性を増強す
る不可知論は、肥大性細胞増殖を抑制するとが、考慮される。

【００５１】 その最も基本的なこととして、この実施形態は、肥大性応答を起こしたと疑わ
れるか、現在肥大性応答を起こしているか、または心肥大の危険性がある個体に
おいて、肥大性シグナル伝達に関与する遺伝子の発現を減少させることによって
、インビボで機能する。このことは、いくつかの異なる機構のうちの１つによっ
て、達成され得る。第一に、ＨＤＡＣ４または５のタンパク質調製物、またはＨ
ＤＡＣ４または５をコードする発現カセットを提供し得る。ここで、ＨＤＡＣ４
または５は、肥大性遺伝子の発現をダウンレギュレーションする。第二に、ＨＤ
ＡＣ４タンパク質またはＨＤＡＣ５タンパク質に結合する因子またはアゴニスト
を提供することによって、ＨＤＡＣ４タンパク質またはＨＤＡＣ５タンパク質の
機能を直接的に刺激または安定化し得る。心肥大の調節因子について、そしてよ
り特定すると、ＨＤＡＣ４および５の活性の調節因子についてのスクリーニング
を、Ｃ節に記載する。

【００５２】 本発明の治療組成物は、心臓の状態のための現在の処置（例えば、アスピリン
、硝酸塩およびβ遮断薬）の投与と類似の様式で（そしてそれと組み合わせて）
投与され得る。従って、治療処方物は、飲み込まれるため（例えば、アスピリン
を用いる）、または舌下で溶解されるため（例えば、硝酸塩を用いる）の、錠剤
の形態で経口投与され得る。これらの医薬はまた、皮膚に装着するためのパッチ
として、または皮膚に適用されるための局所クリームとして、提供され得る。他
の例においては、本発明の治療組成物は、発現カセットとして提供されて、遺伝
子移入の方法を介して投与され得る。

【００５３】 （２．ＭＥＦ２の機能のブロッキング） 別の実施形態において、単独でかまたはＨＤＡＣ４および５と組み合わせて、
ＭＥＦ２ポリペプチドの機能をブロックすることが、望ましくあり得る。このこ
とは、ＭＥＦ２の機能を妨害するオルガノケミカル組成物の使用によって、また
は上記のようにＨＤＡＣを活性化することによって、達成され得る。ＨＤＡＣ４
および５のオルガノケミカルインヒビターＭＥＦ２またはアクチベーターに関し
て、このような化合物は、以下の節に記載するように、標準的なスクリーニング
アッセイにおいて、同定され得る。一旦同定されると、このような化合物は、治
療の観点において、ＭＥＦ２の機能を阻害するため、またはＨＤＡＣ４および５
の機能を活性化するために使用され得る。

【００５４】 （３．ＨＤＡＣリン酸化のブロッキング） 以下で議論するように、本発明者らは、リン酸化されるＨＤＡＣにおける特定
の残基を同定した。リン酸化状態に依存して、ＨＤＡＣは、核に局在化し、ＭＥ
Ｆ２を結合し、そして心肥大シグナルを阻害するか（リン酸化されていないもの
）、その代わりにシャペロンタンパク質１４−３−３に結合し、そして細胞質に
輸送される（リン酸化されたもの）。従って、ＨＤＡＣのリン酸化を阻害する能
力は、ＭＥＦ２依存性肥大性シグナルをブロックする際に、従って、心肥大の発
生を妨害する際に、重要な工程であることが、明らかである。

【００５５】 従って、本発明の１つの局面において、動物において心肥大を処置または予防
する方法が提供される。本発明は、この動物に、ＨＤＡＣリン酸化のインヒビタ
ーを提供する工程を包含する。ＫＮ６２は、Ｃａｍキナーゼを阻害する公知の薬
物である。他の組成物が、この努力において有用であり得、そしてＨＤＡＣに作
用するキナーゼの作用と反作用するホスホリラーゼ、ＨＤＡＣのリン酸化部位を
模倣するＨＤＡＣの小部分、ＨＤＡＣを模倣する単鎖抗体、または他の「模倣物
」が挙げられるが、これらに限定されない。

【００５６】 （４．組み合わせ治療） 多くの臨床的状況において、異なる治療の組み合わせを使用することが、望ま
しい。従って、上に記載される治療剤に加えて、より「標準の」薬学的心臓治療
剤を患者に提供することが望まれる。標準的治療剤の例として、いわゆる「βブ
ロッカー」、抗高血圧剤、強心剤、抗血栓剤、血管拡張剤、ホルモンアンタゴニ
スト、エンドセリンアンタゴニスト、サイトカインブロッカー／インヒビター、
カルシウムチャネルブロッカー、ホスホジエステラーゼインヒビター、およびア
ンギオテンシン２型アンタゴニストが挙げられる。また、本明細書中に記載され
るスクリーニング方法に従って同定された薬剤との組み合わせも意図される。

【００５７】 組み合わせは、心臓細胞を単一組成物または両方の薬剤を含む薬理学的処方物
と接触させることによって、またはこの細胞を同時に２つの異なる組成物もしく
は処方物と接触させることによって（ここで一方の組成物は、発現構築物を含み
、そして他方の組成物は薬剤を含む）、達成され得る。あるいは、遺伝子治療は
、数分〜数週の範囲の間隔により、他の薬剤処理に先行してもよいしまたはその
後に続いてもよい。他の薬剤および発現構築物が別個に細胞に適用される実施形
態において、一般に、かなりの期間が各送達の時間の間に終了しなかったことを
保証し、その結果、薬剤および発現構築物は、なお、細胞に対して有利に合わせ
られた効果を及ぼし得る。このような場合、互いの約１２〜２４時間内に、より
好ましくは互いの約６〜１２時間内に、細胞を両方の様式と接触させることが考
慮され、遅延時間が約１２時間だけであることが最も好ましい。しかし、幾つか
の状況において、処置のための期間を有意に延長することが所望され得、各投与
の間に数（２、３、４、５、６または７）日〜数（１、２、３、４、５、６、７
または８）週間経過する。

【００５８】 （ａ）ＨＤＡＣアゴニスト、ＭＥＦ２アンタゴニスト、もしくはＨＤＡＣリン
酸化のインヒビター、または（ｂ）他方の薬剤のいずれかを１回より多く投与す
ることが所望されることもまた、考えられる。下記に例示されるような、「Ａ」
がＨＤＡＣアゴニスト、ＭＥＦ２アンタゴニスト、もしくはＨＤＡＣリン酸化の
インヒビターであり、そして他方の薬剤が「Ｂ」である、種々の組み合わせが使
用され得る：

【００５９】

【化１】 他の組み合わせが、同様に考慮される。

【００６０】 （Ｃ．心肥大のモジュレーターについてのスクリーニング） 本発明はまた、心肥大を阻害する能力についての化合物のスクリーニングもま
た意図する。本発明者らがこの疾患を模倣する細胞系、器官系および生物系を作
製する能力は、治療的活性について種々の化合物を試験するための理想的状況を
提供する。特に好ましい化合物は、心肥大を阻害しそして心疾患を予防または逆
転する際に有用な化合物である。本発明のスクリーニングアッセイにおいて、候
補物質は、最初に、基本的な生化学活性（例えば、標的分子への結合）について
スクリーニングされ得、次いで、細胞レベル、組織レベル、または動物全体のレ
ベルにおける肥大表現型を阻害する能力について試験される。

【００６１】 （１．心肥大のインヒビターのスクリーニング） 本発明は、心肥大のインヒビターについてスクリーニングする方法を提供する
。このスクリーニング技術は、心肥大をブロックする化合物および／または一旦
発症した心肥大を減少する化合物の同定において有用であることを示すことが、
意図される。特定の実施形態において、スクリーニングアッセイは、インビトロ
、インサイト（ｉｎ ｃｙｔｏ）またはインビボで実施され得る。適切な宿主細
胞としては、酵母、線維芽細胞および心臓細胞が挙げられる。

【００６２】 １つの実施形態において、本発明は、候補物質が肥大を阻害する能力を決定す
るための方法に関し、この方法は、一般的に以下の工程： （ａ）ＨＤＡＣ４酵素またはＨＤＡＣ５酵素の供給源を提供する工程； （ｂ）その酵素と候補物質を接触させる方法； （ｃ）工程（ｂ）におけるその酵素の機能を決定する工程；および （ｄ）工程（ｃ）におけるその酵素機能を、その候補物質の非存在下でのその
酵素の酵素機能と比較する工程、 を包含し、ここで、その候補物質の非存在下での酵素機能と比較した、その候補
物質の存在下での酵素機能の増加が、その候補物質を心肥大のインヒビターとし
て同定する。

【００６３】 別の実施形態において、心臓細胞における遺伝子発現のモジュレーターを同定
するための方法が提供され、この方法は、一般的に、以下の工程： （ａ）ＭＥＦ２ ＨＤＡＣ結合領域を提供する工程； （ｂ）このＭＥＦ２ ＨＤＡＣ結合領域を、ＨＤＡＣ４ ＭＥＦ２結合領域も
しくはＨＤＡＣ５ ＭＥＦ２結合領域、および候補物質と接触させる工程； （ｃ）工程（ｂ）における結合を決定する工程；ならびに （ｄ）工程（ｃ）における結合を、その候補物質の非存在下でのＨＤＡＣ４
ＭＥＦ２結合領域もしくはＨＤＡＣ５ ＭＥＦ２結合領域とのＭＥＦ２ ＨＤＡ
Ｃ結合領域の結合と比較する工程、 を包含し、ここで、その候補物質の存在下における結合と非存在下での結合との
間の差異が、その候補物質を心臓遺伝子発現のモジュレーターとして同定する。

【００６４】 心肥大のインヒビターとして、または心臓遺伝子発現のモジュレーターとして
の、有効な候補物質の同定の際、その候補物質を生成する工程のようなさらなる
工程が、実行され得る。本発明におけるＨＤＡＣ４酵素またはＨＤＡＣ５酵素は
、別々にか、またはその２つの混合物として、提供され得る。さらに、候補物質
の特定のスクリーニング系は、インビトロ系またはインビボ系（例えば、候補細
胞、候補組織または実験動物中）であり得る。

【００６５】 より特定の実施形態において、本発明は、ＨＤＡＣのリン酸化を阻害する薬剤
を同定しようと努力する。目的の残基は、ＨＤＡＣ５配列の２５９、４９８およ
び６６１のセリン（または他のＨＤＡＣ中の匹敵する残基）を含む。従って、こ
れらの残基のリン酸化状態を評価するために候補物質の能力を試験する任意の方
法を使用し得る。特に有用な実施形態において、ツーハイブリッドシステムを利
用する方法が、提供される。ＨＤＡＣ５および１４−３−３各々が、ＧＡＬ４転
写活性化ドメインに融合される。残基２５９、４９８および／または６６１をリ
ン酸化する活性なキナーゼの存在下で、そのツーハイブリッドの会合およびマー
カー（例えば、ＬａｃＺ）遺伝子の転写活性化が存在する。リン酸化のインヒビ
ターの存在下で、転写活性化は失われる。酵母において、６６１の構成的リン酸
化が存在する。

【００６６】 上記のアッセイは、遺伝子発見様式においても使用され得る。酵母細胞は、残
基２５９および４９８をリン酸化し得るキナーゼを生成しない。従って、ｃＤＮ
Ａライブラリーを使用して、どれがこれらの残基をリン酸化し得るキナーゼをコ
ードするかを決定するために、異なるｃＤＮＡを細胞中に移入し得る。リン酸化
の非存在下で、インジケーターの転写は観察されない。しかし、これらの残基に
対して作用するキナーゼをコードするｃＤＮＡは、ＨＤＡＣ４と１４−３−３融
合物との結合、およびレポーター遺伝子の転写の活性化を生じる。この点に関し
て、このＨＤＡＣがＳｅｒ６６１のような構成的にリン酸化されている残基をす
べて欠くことが好ましい。

【００６７】 本発明における別のスクリーニング方法が、心肥大を発症する危険がある被験
体を同定するために使用され得、この方法は、一般的に、以下の工程を包含する
：その被験体由来の生物学的サンプルを得る工程；およびそのサンプルの細胞中
のＨＤＡＣ４遺伝子型またはＨＤＡＣ５遺伝子型を評価する工程。

【００６８】 （２．アッセイ方法） （ａ．インビトロアッセイ） 実行するのが迅速、安価かつ容易なアッセイは、結合アッセイである。標的へ
の分子の結合は、立体的相互作用、アロステリック相互作用または電荷間相互作
用に起因して、それ自体そして自然に、阻害的である。これは、溶液中または固
相上で行われ得、そしてより洗練されたスクリーニングアッセイへの進む前に、
特定の化合物を迅速に排除するための第１回のスクリーニングとして利用され得
る。この種の１つの実施形態において、ＨＤＡＣ４分子もしくはＨＤＡＣ５分子
またはそのフラグメントに結合する化合物のスクリーニングが提供される。別の
実施形態において、ＭＥＦ２ ＨＤＡＣ結合領域が提供され、このＭＥＦ２ Ｈ
ＤＡＣ結合領域が、候補物質の存在下または非存在下で、ＨＤＡＣ４結合領域ま
たはＨＤＡＣ５結合領域と接触させられる。

【００６９】 ＨＤＡＣ標的タンパク質またはＭＥＦ２ ＨＤＡＣ標的結合領域は、溶液中で
遊離しているか、支持体に固定されているか、細胞中にて発現されているか、ま
たは細胞表面上に発現されているかのいずれかであり得る。標的または化合物の
いずれかが標識され得、それにより結合の決定が可能になり得る。別の実施形態
において、このアッセイは、天然の物質もしくは人工的物質または結合パートナ
ー（例えば、ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５）への標的の結合の阻害を測定し得る
。その薬剤の１つが標識されている、競合的結合アッセイが、行われ得る。通常
、この標的は、標識された種であり、それにより、標識が結合部分の機能を妨げ
る機会を減少させる。結合または結合の阻害を決定するために、結合標識に対す
る遊離標識の量を測定し得る。

【００７０】 化合物の高スループットスクリーニングのための技術は、ＷＯ ８４／０３５
６４に記載される。多数の小さいペプチド試験化合物が、固体基材（例えば、プ
ラスチックピンまたは他のいくつかの表面）上で合成される。このペプチド試験
化合物は、例えば、ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５と反応させられ、そして洗浄さ
れる。結合したポリペプチドは、種々の方法により検出される。

【００７１】 精製された標的（例えば、ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５）が、上述の薬物スク
リーニング技術における使用のために、プレート上に直接コーティングされ得る
。しかし、そのポリペプチドに対する非中和抗体が、固相にそのポリペプチドを
固定するために使用され得る。また、反応性領域（好ましくは、末端領域）を含
む融合タンパク質が、固相に活性領域（例えば、ＭＥＦ２のＣ末端）を連結する
ために使用され得る。

【００７２】 他の実施形態において、ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５の酵素的活性を決定する
ために、ヒストンタンパク質のアセチル化状態または脱アセチル化状態を決定す
ることが必要である。これは、心肥大を阻害する候補物質についてスクリーニン
グする場合に、特に関連する。

【００７３】 以下の技術が、アセチル化または脱アセチル化を検出もしくはアッセイするた
めに使用され得る。このような方法は、適用可能である場合に、インビトロアッ
セイまたはインサイトアッセイのために使用され得る。例えば、特定の細胞株が
、種々の濃度の候補物質で処理され得る。ヒストンの過剰アセチル化を測定する
ための方法が、詳細に記載されており（ＶｅｒｄｅｌおよびＫｈｏｃｈｂｉｎ、
１９９９；Ｆｉｓｃｈｌｅら、１９９９；Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒら、１９９９）、
そして当該分野で公知である。例えば、過剰アセチル化されたＨ４ヒストンの出
現が、過剰アセチル化されたＨ４に対して惹起された抗体を使用してモニターさ
れ得、そして免疫蛍光の細胞蛍光測定により検出され得る（Ｖａｎ Ｌｉｎｔら
、１９９６を参照のこと）。別の技術において、細胞が溶解され、ヒストンが精
製され、そしてＴｒｉｔｏｎ／酸／尿素ゲル上で分析される。分析的超遠心分離
が、ヒストンアセチル化を検出するためにもまた、しばしば使用される。

【００７４】 ［³Ｈ］標識アセチル化ヒストンの脱アセチル化の割合を測定することもまた
、本発明において有用なアッセイである。例えば、候補物質は、［³Ｈ］標識ア
セチル化ヒストンを使用してＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５の活性に対するアゴニ
スト効果についてスクリーニングされ得る。放出された［³Ｈ］アセテートが、
アセテート励起の方法または免疫沈降されたヒストンの方法によって検出され得
、そして残存する［³Ｈ］標識アセチル化ヒストンレベルが測定され得る。

【００７５】 （ｂ．インサイトアッセイ） 心肥大の特徴を示す種々の細胞株が、候補物質のスクリーニングのために利用
され得る。例えば、上記のような、操作されたインジケーターを含む細胞が、候
補化合物の種々の機能的属性を研究するために使用され得る。このようなアッセ
イにおいて、その化合物は、その生物化学的性質を考慮されて、適切に処方され
、そして標的細胞と接触させられる。

【００７６】 そのアッセイに依存して、培養が必要であり得る。上記のように、その後その
細胞は、多数の異なる生理学的アッセイ（増殖、サイズ、Ｃａ²⁺効果）により試
験され得る。あるいは、ＭＥＦ２の機能、ＨＤＡＣ４経路、ＨＤＡＣ５経路、お
よび関連経路が利用され得る、分子分析が行われ得る。これは、タンパク質発現
、酵素機能、基質利用、ｍＲＮＡ発現（全細胞またはポリＡ ＲＮＡのディファ
レンシャルアッセイを含む）についてのアッセイなどのようなアッセイを包含す
る。

【００７７】 １つの局面において、その細胞は、種々の調節エレメントの制御下でインジケ
ーター遺伝子を発現する。これらのエレメントは、ＭＥＦ２により調節され、そ
して制御されたインジケーター遺伝子の発現を介して、ＭＥＦ２転写アクチベー
ター活性の指標を提供する。ＭＥＦ２制御下にある任意の調節エレメントが利用
され得る。インジケーター遺伝子としては、ｌａｃＺ、ＧＦＰルシフェラーゼ、
β−ガラクトシダーゼおよび他の類似のマーカーが挙げられる。

【００７８】 心肥大について被験体をアッセイする場合または心肥大を発症する危険がある
被験体をアッセイする場合、その被験体由来の生物学的サンプルが得られ、そし
てそのサンプルの細胞中のＨＤＡＣ４遺伝子型またはＨＤＡＣ５遺伝子型が評価
される。遺伝的分析は、ＨＤＡＣ４ポリヌクレオチド配列またはＨＤＡＣ５ポリ
ヌクレオチド配列の全体、あるいはＨＤＡＣ４ポリヌクレオチドコード配列また
はＨＤＡＣ５ポリヌクレオチドコード配列を配列決定する方法を包含し得る。Ｈ
ＤＡＣ遺伝子配列を検出するために使用され得る他のアッセイ方法は、ＲＥＬＰ
パターン、ＨＤＡＣ ｍＲＮＡの決定またはＨＤＡＣ遺伝子のサイズの決定であ
る。

【００７９】 （ｃ．インビボアッセイ） 本発明は、種々の動物モデルの使用を特に意図する。ここで、１つ以上の機能
的なＨＤＡＣ対立遺伝子またはＨＤＡＣ５対立遺伝子を欠くトランスジェニック
動物が作製されている。別の実施形態において、その動物は、ＭＥＦ２に調節さ
れたプロモーターの制御下にある検出可能なマーカー遺伝子をさらに含む。

【００８０】 試験化合物によるこれらの動物の処理は、適切な形態で、その化合物をその動
物に投与することを包含する。投与は、臨床目的または非臨床目的のために利用
され得る任意の経路により、この経路としては、経口経路、経鼻経路、経頬（ｂ
ｕｃｃａｌ）経路、または局所経路さえ挙げられるが、これらに限定されない。
あるいは、投与は、気管内点滴、気管支点滴、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射
、腹腔内注射、または静脈内注射により得る。特に意図されるのは、全身的静脈
内注射、血液供給またはリンパ供給を介する領域的投与である。

【００８１】 インビボでの化合物の有効性を決定することは、そのインジケーター遺伝子の
発現を試験することを包含する。

【００８２】 （２．ＭＥＦ２のインヒビター、ＨＤＡＣ４のアクチベーターおよびＨＤＡＣ
５のアクチベーター、ＨＤＡＣリン酸化のインヒビター） 本発明によるＭＥＦ２インヒビターは、ＭＥＦ２の上流もしくは下流にその阻
害効果を発揮するか、またはＭＥＦ２に対して直接その阻害効果を発揮する、イ
ンヒビターであり得る。本発明のスクリーニング方法により同定されるインヒビ
ターの型に関わらず、このような化合物による阻害の効果は、添加された候補物
質の非存在下で、心肥大の阻害、またはいくつかの関連するその生化学的局面も
しくは生理学的局面（例えば、増殖、Ｃａ²⁺依存性遺伝子発現など）の阻害を生
じる。同様に、本発明によるＨＤＡＣ４アクチベーターまたはＨＤＡＣ５アクチ
ベーターは、ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５に対してその効果を発揮するアゴニス
トであり、ここで活性化の結果は、心肥大の阻害として観察される。ＨＤＡＣ リン酸化のインヒビターは、特異的であってもまたは非特異的であってもよい。
このインヒビターは、ＨＤＡＣのリン酸化を担う酵素に直接影響し得るし、また
はＨＤＡＣ上の種々の（例えば、セリン）残基からリン酸を除去するホスホリラ
ーゼを誘導し得る。

【００８３】 （３．候補物質） 本明細書中で使用される場合、用語「候補物質」は、心肥大を潜在的に阻害し
得る任意の分子をいう。この候補物質は、タンパク質もしくはそのフラグメント
、低分子インヒビター、または核酸分子でさえであり得る。最も有用な薬学的組
成物は、他の既知の肥大のモジュレーター（例えば、シクロスポリンＡおよびＦ
Ｋ５０６）に構造的に関連した化合物であり得る場合と証明されている。このよ
うな努力は、しばしば、「合理的な薬物設計」として公知であり、そして、既知
のインヒビターとの比較だけでなく、標的分子の構造に関する推定をも含む。

【００８４】 合理的な薬物設計の目的は、生物学的に活性なポリペプチドまたは標的化合物
の構造アナログを産生することである。このようなアナログを産生することによ
って、天然分子（これは、変化に対して異なった感受性を有するかまたは種々の
他の分子の機能に影響し得る）よりも、より活性かまたはより安定である薬物を
作成することが可能である。１つのアプローチでは、当業者は、ＨＤＡＣ４もし
くは５のような分子またはそのフラグメントについての３次元構造を作成し、こ
れによって、ＨＤＡＣ４もしくは５のアンタゴニストまたはＨＤＡＣ４もしくは
５のリン酸化のアンタゴニスト（すなわち、１つ以上のリン酸化部位を含むＨＤ
ＡＣ４もしくは５のフラグメント）を作成する。あるいは、当業者は、ＭＥＦ２
のような分子もしくはそのフラグメントについての３次元構造を作成し得、これ
によって、ＭＥＦ２のインヒビターを作成する。これは、Ｘ線結晶学、コンピュ
ーターモデリングまたは両方のアプローチの組み合わせによって達成され得る。

【００８５】 標的化合物またはインヒビターの構造を確かめるために、抗体を使用すること
がまた可能である。原則的には、このアプローチは、後に続く薬物設計が基づき
得る薬物コア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生じる。機能的な薬理学的に活性な抗
体に対する抗イディオタイプ抗体をまとめて産生することによって、タンパク質
結晶学を回避することが可能である。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結
合部位は、元の抗原のアナログであることが予測される。次いで、抗イディオタ
イプは、化学的または生物学的に産生されたペプチドのバンクからペプチドを同
定および単離するために使用され得る。次いで、選択されたペプチドは、薬物コ
アとして機能する。抗イディオタイプは、抗体を抗原として用いて、本明細書中
に記載の抗体を産生するための方法を使用して、産生され得る。

【００８６】 他方、当業者は、種々の商業的供給源から、有用な化合物の同定を「力づくで
行なおう（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ）」と努力して、有用な薬物についての基本
的な基準を満たすと信じられている低分子ライブラリーを簡単に獲得し得る。こ
のようなライブラリーのスクリーニング（組み合わせて産生されたライブラリー
（例えば、ペプチドライブラリー）を含む）は、活性について関連した（および
関連していない）大多数の化合物をスクリーニングするための迅速なおよび効率
的な方法である。組み合わせアプローチはまた、活性であるが他方所望でない化
合物をモデルにした第２、第３、および第４世代の化合物の作製によって、潜在
的な薬物の迅速な進化にそれ自身が助けとなる。

【００８７】 候補化合物は、天然に存在する化合物のフラグメントもしくは一部を含み得る
かまたは別の不活性な既知の化合物の活性な組み合わせとして見出され得る。天
然の供給源（例えば、動物供給源、細菌供給源、真菌供給源、植物供給源（葉お
よび樹皮を含む））および海洋サンプルから単離された化合物は、潜在的に有用
な薬学的因子の存在についての候補としてアッセイされ得ることが提案される。
スクリーニングされる薬学的因子はまた、化学的組成物または人工化合物由来で
あるかまたはこれらから合成され得ることが理解される。従って、本発明によっ
て同定された候補物質は、肥大反応の既知のインヒビターから始まる合理的な薬
物設計を介して設計され得る、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子インヒ
ビターまたは任意の他の化合物であり得ることが理解される。

【００８８】 特定の場合における「有効量」は、細胞の正常なレベルと比較して、細胞から
肥大を再現可能に減少するのに有効な量である。活性において有意な適切な変化
を達成する化合物が使用される。

【００８９】 本発明の全てのスクリーニング方法は、有効な候補が見出され得ないという事
実に抵抗せず、それら自身が有用であることがもちろん理解される。本発明は、
このような候補についてのスクリーニングのための方法を提供するが、それらを
見出するのみの方法ではない。

【００９０】 （４．モジュレーター／インヒビターの産生） 以前に記載されたスクリーニングアッセイのいずれかの拡大の際、本発明はま
た、モジュレーターまたはインヒビターを産生する方法を提供する。前述のスク
リーニング工程のいずれかを包含する方法は、スクリーニングされた活性の「モ
ジュレーターとして同定された候補物質を産生する」さらなる工程が後に続く。

【００９１】 （Ｄ．薬学的組成物） 特定の実施形態では、活性成分（オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチ
ドまたは発現ベクターを含む薬物、ポリペプチド、抗体またはリポソーム）の臨
床学的適用が行なわれる場合、意図される適用のために適切な薬学的組成物を調
製することが必要である。一般的には、これは、基本的に発熱物質を含まない薬
学的組成物およびヒトまたは動物に対して有害であり得る任意の他の不純物を調
製することを伴う。当業者はまた、一般的に、複合体を安定化し、そして、標的
細胞による取り込みを可能にする適切な緩衝液を使用することを所望する。

【００９２】 本発明の水性組成物は、上記に考察されるように、有効量の活性成分を含み、
薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体においてさらに分散され得る。この
ような組成物はまた、接種材料ともいう。成句「薬学的に受容可能なまたは薬理
学的に受容可能な」は、適切に動物、すなわちヒトに投与される場合、有害な、
アレルギー性の、または、他の厄介な反応を生じない組成物をいう。

【００９３】 本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」としては、任
意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張
剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこれらの媒
体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が
、活性成分と不適合である場合を除いて、治療学的組成物におけるその使用が意
図される。補充性の活性成分もまた、この組成物に組み入れられ得る。

【００９４】 治療学的組成物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロー
ス）と水中で適切に混合して調製され得る。分散もまた、グリセロール、液体ポ
リエチレングリコール、その化合物中、および油中で、調製され得る。貯蔵およ
び使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を妨げるための防腐
剤を含む。

【００９５】 本発明の治療学的組成物は、液体溶液または懸濁液のどちらかとして注射可能
な組成物の形態で、有利に投与される；注射の前の液体中の溶液（または懸濁液
）に適した固体の形態がまた、調製され得る。これらの調製物はまた乳化され得
る。これらの目的のための代表的な組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含
む。例えば、この組成物は、リン酸緩衝化生理食塩水のミリリットル当り、１０
ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇまたは約１００ｍｇまでのヒト血清アルブミンを含み
得る。他の薬学的に受容可能なキャリアとしては、水溶液、非毒性賦形剤（生理
食塩水を含む）、防腐剤、緩衝液などが挙げられる。

【００９６】 非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油
およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性キャリアと
しては、水、アルコール溶液／水溶液、食塩水、塩化ナトリウムなどの非経口ビ
ヒクル、リンガーデキストロースなどが挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、
流体および栄養補充剤が挙げられる。防腐剤としては、抗微生物剤、抗酸化剤、
キレート剤および不活性気体が挙げられる。薬学的組成物の種々の成分のｐＨお
よび正確な濃度は、周知のパラメーターに従って調製される。

【００９７】 さらなる処方物が、経口投与に適している。経口処方物としては、例えば、薬
学的グレードのマニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム
、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのこのような代表
的な賦形剤が挙げられる。組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、除
放性処方物または粉末の形態をとる。経路が局所的の場合、形態は、クリーム、
軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、制御放出パッチ、軟膏（ｓａｌｖｅ）またはスプレ
ーであり得る。

【００９８】 本発明の治療学的組成物は、伝統的な薬学的調製物を含み得る。本発明に従う
治療学的組成物の投与は、標的組織がその経路を通って利用可能である限り、任
意の一般的な経路を通り得る。この投与としては、経口、経鼻、頬、直腸、膣ま
たは局所投与が挙げられる。あるいは、投与は、正所性、皮内、皮下、筋内、腹
腔内または静脈内注射であり得る。このような組成物は、通常、生理学的に受容
可能なキャリア、緩衝液または他の賦形剤を含む薬学的に受容可能な組成物とし
て投与される。汎発する疾患状態の処置についての好ましい実施形態の送達経路
は、全身的送達であるが、局地的送達もまた意図される。

【００９９】 治療学的組成物の有効量は、意図される目的に基づいて決定される。用語「単
回用量」または「投薬量」は、被験体における使用に適したユニットを物理的に
分散することをいい、それぞれのユニットは、その投与（すなわち、適切な経路
および処置レジメン）に関連して、所望の応答（上記に考察された）を産生する
ように計算された治療学的組成物の予定量を含む。投与される量は、処置の数お
よび単回用量の両方に従って、所望の保護に依存する。

【０１００】 治療学的組成物の正確な量もまた、開業医の判断に基づき、そして、それぞれ
の個体に特有である。用量に影響する因子は、患者の肉体的および臨床学的状態
、投与の経路、意図される処置の目的および特定の治療学的物質の効力、安定性
および毒性を含む。

【０１０１】 （Ｅ．トランスジェニック動物および細胞の作製の方法） 本発明の特定の実施形態は、１以上の機能的なＨＤＡＣ４対立遺伝子またはＨ
ＤＡＣ５対立遺伝子を欠くトランスジェニック動物および細胞を提供する。発明
者は、ＭＥＦ２部位に依存したｌａｃＺ導入遺伝子を作製し、そして、トランス
ジェニックマウス系統を作製した。例えば、ＭＥＦ２−ｌａｃＺ導入遺伝子が、
心臓の肥大シグナルに応答性か否かを試験するために、発明者らは、ＭＨＣ−カ
ルシニュリンおよびＭＨＣ−ＣＡＭＫＩＶ導入遺伝子を保有するマウスの系統に
交配することによって、導入遺伝子を導入した。これらの研究において、ｌａｃ
Ｚ発現は、カルシニュリンおよびＣＡＭＫＩＶに応答して、劇的に上方制御され
ることが観察された。このようにして肥大性応答の活性化をモニターする。ＨＤ
ＡＣ４および５マウスに関する類似した研究が、本発明において意図される。Ｈ
ＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５を発現するトランスジェニック動物、遺伝的ノックア
ウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）マウス、組換え細胞株およびこのような動物由来かま
たはこのような動物を作製するために使用されるトランスジェニック胚は、ＭＥ
Ｆ２の機能を抑制するかまたは増強し、これによって肥大増殖を軽減する薬剤を
スクリーニングし、そして、同定するための方法において有用である。

【０１０２】 一般的な局面では、トランスジェニック動物は、ゲノムへの所定の構築物の組
み込みによって作製される。トランスジェニックを作製するための方法は、一般
的にＷａｇｎｅｒおよびＨｏｐｐｅ（米国特許第４，８７３，１９１号；これは
本明細書中に参考として援用される、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８５；これは、
その全体が、本明細書中に参考として援用される）ならびに「Ｍａｎｉｐｕｌａ
ｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ」第２版（Ｈｏｇａｎ，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｍ
ｉおよびＬｏｎｇ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４；これは、その全体が、本明細書中に参考として
援用される）。

【０１０３】 代表的には、ゲノム配列によって隣接される遺伝子は、受精卵に微小注入する
ことによって移入される。この微小注入された卵は、雌宿主にインプラントされ
、そして、その子孫は、導入遺伝子の発現についてスクリーニングされる。トラ
ンスジェニック動物としては、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳動物、および魚類を
含むがこれらに限定されない多数の動物由来の受精卵から作製され得る。特定の
実施形態内では、短縮されたＨＤＡＣ４または５ポリペプチドの変異体形態を発
現するトランスジェニックマウスが、作製される。他の実施形態は、「ノックア
ウト」ＨＤＡＣ４または５を含み；ＨＤＡＣ４または５配列の全部または一部を
置換する選択マーカーを必要に応じて使用する。

【０１０４】 微小注入のためのＤＮＡクローンは、当該分野で公知の任意の方法によって調
製され得る。例えば、微小注入のためのＤＮＡクローンは、細菌のプラスミド配
列を除去するために適切な酵素で切断され得、そして、ＤＮＡフラグメントを、
標準技術を使用して、ＴＢＥ緩衝液中で１％アガロースゲル上で電気泳動した。
ＤＮＡバンドを、エチジウムブロマイドを使用して染色することによって可視化
し、そして、発現配列を含むバンドを切除した。次いで、この切除バンドを、０
．３％酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含む透析バッグ中に配置した。ＤＮＡを透
析バッグ中に電気溶出し（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）、１：１のフェノール
：クロロホルム溶液を使用して抽出し、そして、２倍容量のエタノールによって
沈殿させた。このＤＮＡを１ｍｌの低塩濃度緩衝液（０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で再溶解し、そして
、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄ^TMカラムで精製した。このカラムをまず３ｍｌの高塩濃度緩
衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．４、および１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）を使用してプライミングし、続いて、５ｍｌの低塩濃度緩衝液を使用して洗
浄した。ＤＮＡ溶液を３回カラムを通過させ、カラムマトリックスにＤＮＡを結
合させた。３ｍｌの低塩濃度緩衝液を使用して１回洗浄した後、ＤＮＡを、０．
４ｍｌの高塩濃度緩衝液を使用して溶出し、そして、２倍容量のエタノールによ
って沈殿させた。ＤＮＡ濃度をＵＶ分光光度計で２６０ｎｍでの吸収によって測
定した。微小注入については、ＤＮＡ濃度を、５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４お
よび０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中で３μｇ／ｍｌに調節した。

【０１０５】 微小注入のためのＤＮＡ精製の他の方法は、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａ
ｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ
Ｙ，１９８６）、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３００：６１１（１９８
２）；Ｔｈｅ Ｑａｇｅｎｏｌｏｇｉｓｔ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ、第３版、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｗｏｒｔｈ，ＣＡより
出版；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９
８９）において記載される。

【０１０６】 例示的な微小注入手順では、６週齢の雌マウスを、妊娠雌ウマ血清絨毛性性腺
刺激ホルモン（ＰＭＳＧ；Ｓｉｇｍａ）の５ＩＵ注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）を使
用して過排卵を誘導し、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ）の
５ＩＵ注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）が４８時間後に続いた。ｈＣＧ注射後すぐに、
雌を雄と交換した。ｈＣＧ注射の２１時間後、交配した雌をＣＯ₂窒息および子
宮頚部の脱臼によって屠殺し、そして、切除された卵管から胚を回収し、そして
、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）を使用して、ダルベッコ
リン酸緩衝化生理食塩水中に配置した。卵丘の周囲の細胞を、ヒアルロニダーゼ
（１ｍｇ／ｍｌ）を使用して取り出した。次いで、前核胚を洗浄し、そして、注
射の時間まで、５％ＣＯ₂、９５％空気の加湿した大気を用いる３７．５℃のイ
ンキュベーターで、０．５％ＢＳＡ（ＥＢＳＳ）を含むイール（Ｅａｒｌｅ）の
平衡化食塩水中に配置した。胚は、２細胞段階で、インプラントされ得る。

【０１０７】 無作為に動き回る成体雌マウスを、精管切除した雄とつがいとした。Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６マウスまたはスイスマウスまたは他の比較可能な系統を、この目的のため
に使用し得る。レシピエント雌を、ドナー雌と同じ時間に交配させた。胚移入の
際、レシピエント雌を、体重のグラム当り２．５％アバーチン（ａｖｅｒｔｉｎ
）を０．０１５ｍｌの個体内注射を使用して麻酔した。卵管を、単一の正中線の
背面切除によって、曝露した。次いで、体壁を介して卵管上に直接切除を行なっ
た。次いで、卵巣嚢を、時計製造の鉗子を使用して引き裂いた。移入される胚を
、ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水）中および移入ピペットの先
端部に配置した（約１０〜１２胚）。このピペット先端部を、卵管漏斗に挿入し
、そして、胚を移入した。移入後、２回の縫合によって、切開を閉じた。

【０１０８】 上記のように、このような動物に由来するトランスジェニック動物および細胞
株は、特定の試験実験において用途を見出し得る。これに関して、ＨＤＡＣ４ま
たは５変異体を発現し得るトランスジェニック動物および細胞株は、試験物質に
曝され得る。これらの試験物質は、ＨＤＡＣ４もしくは５の発現および／または
機能を減少する能力についてスクリーニングされ得る。このような手順によって
同定された化合物は、ナルコレプシーのような神経性障害の処置において有用で
ある。さらに、試験物質は、ＨＤＡＣ４もしくは５の発現および／または機能を
増加する能力についてスクリーニングされ得る。このような手順によって同定さ
れた化合物は、睡眠不足（例えば、不眠症）に関連する障害の処置において有用
である。

【０１０９】 特定の実施形態において、ヘテロ接合マウスは使用され得る。しかし、ホモ接
合性マウスが、本発明の方法において、より有用であり得る。最初のトランスジ
ェニックマウスは、特定の導入遺伝子についてヘテロ接合性であり得る。しかし
、当業者に公知の標準交配技術が、ホモ接合性マウスを作製するために使用され
得る。本明細書中に記載される方法を使用する遺伝形質決定を使用して、特定の
動物が、１つ以上の導入遺伝子に、ヘテロ接合性であるかまたはホモ接合性であ
るかを決定され得る。

【０１１０】 （１．トランスジェニックマウスおよびそれらの使用） 本発明のトランスジェニック動物は、１つ以上のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５
対立遺伝子を欠きそして非トランスジェニック同腹子と比べた場合、心肥大を発
症する可能性が実質的に増加している動物を含む。心肥大を発症する可能性が「
実質的に増加する」とは、心肥大の測定可能な症状の実質的に有意な増加が、ト
ランスジェニック動物と正常な非トランスジェニック同腹子と比較した場合に観
測されることを意味する。

【０１１１】 トランスジェニックマウスを構築する際に使用するためのコード領域は、ＨＤ
ＡＣ４またはＨＤＡＣ５のコードセグメントを含む。コード領域は、ペプチドま
たはポリペプチドの所望の機能が保持される（すなわち、このポリペプチドがＭ
ＥＦ２活性の抑制の調節に寄与し得る）限り、完全なペプチドまたはポリペプチ
ドあるいはそのフラグメントをコードし得る。本発明のトランスジーンを構築す
る際における使用のためのコード領域は、さらに、欠失、置換、短縮、より活性
なタンパク質を生じる変異、構成的に活性なタンパク質を生じる変異、および減
少した活性を伴うタンパク質を生じる変異を含む変異を含むコード領域を含む。
ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５が本明細書中に同定される動物における肥大を媒介
するので、以下の議論は、ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣノックアウトトランスジェ
ニックマウスに基づく。しかし、本明細書中に提供される教示は、ＨＤＡＣ４ま
たはＨＤＡＣ５の効果の上流または下流の心肥大にも影響し得る他のトランスジ
ーンに等しく適用可能であることが理解される。

【０１１２】 本明細書中に記載されるＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５トランスジェニックマウ
スの別の使用は、心肥大についての新規な疾患モデルを提供する。ＨＤＡＣ４ま
たはＨＤＡＣ５トランスジェニックマウスは、心肥大の研究について新規なモデ
ルを提供する。このモデルは、臨床医が疾患状態をより十分に理解するのに役立
ち得る。

【０１１３】 （２．病理学研究） トランスジーンを保有する種々のＦ０、Ｆ１およびＦ２動物は、免疫組織学、
電子顕微鏡、心電計を含み、そして全体的および局所的な心臓の重さの決定、心
筋細胞断面積の測定、および心筋細胞の数の測定を行う、任意の種々の技術によ
って分析され得る。適切な特異性の抗体を使用することによるトランスジーンの
発現についての免疫組織学的分析は、公知の方法を使用して実行され得る。局所
的な重さ、心筋細胞断面積および心筋細胞核の数を測定するための形態測定分析
は、公知の方法を使用して実行され得る。心臓は、機能、組織学および胎児心臓
遺伝子の発現について分析され得る。

【０１１４】 免疫ベースの分析において、インジケーター結合抗体に頼ることが必要であり
得る。抗体産生技術の一般的な総説が提供される。当該分野において周知なよう
に、所与の組成物は、その免疫原性において変化し得る。従って、宿主免疫系を
ブーストすることが必要であり、これは、ペプチドまたはポリペプチド免疫原を
キャリアに結合させることによって達成され得る。例示的かつ好ましいキャリア
は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アル
ブミンのような他のアルブミンはまた、キャリアとして使用され得る。ポリペプ
チドをキャリアタンパク質に結合体化するための手段は、当該分野において周知
であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｃｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、カルボジイミドおよびビス−ビア
ゾタイズドベンジジン（ｂｉｓ−ｂｉａｚｏｔｉｚｅｄ ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）
を含む。

【０１１５】 特定の免疫原性組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫応答性
の非特異的刺激物質の使用によって、向上され得る。例示的かつ好ましいアジュ
バントとして、フロイント完全アジュバント（殺傷されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む免疫応答性の非特異的刺激物質）、フ
ロイント不完全アジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられ
る。

【０１１６】 ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原組成物の量は、免疫原の性質お
よび免疫化に使用される動物に依存して変化する。種々の経路を使用して、免疫
原を投与し得る（皮下、筋内、皮内、静脈内および腹腔内）。ポリクローナル抗
体の産生は、免疫化後に種々の点で免疫化された動物の血液をサンプリングする
ことによってモニターされ得る。第２のブースター注射もまた、与えられ得る。
適切な力価が得られるまで、ブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）および力価測
定（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）のプロセスが、繰り返される。所望のレベルの免疫原性
が得られる場合、この免疫化した動物は出血され得、血清が単離され得、そして
保存され得、および／またはこの動物は使用されて、ｍＡｂを生成し得る。

【０１１７】 ポリクローナル抗体は、ＭＥＦ２またはＨＤＡＣ４もしくはＨＤＡＣ５ポリペ
プチドあるいはそれらのフラグメントを含む免疫原を用いて動物に免疫し、そし
てその免疫された動物から抗血清を回収することによって調製される。幅広い範
囲の動物種が、抗血清の産生のために使用され得る。代表的には、抗−抗血清の
産生に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモッ
トである。ウサギが比較的大量の血液量であるため、ウサギがポリクローナル抗
体の産生に好ましい選択であり得る。

【０１１８】 モノクローナル抗体を得るために、当業者はまた、実験動物を抗原性組成物で
免疫化する。次いで、当業者は、抗体生成を可能にするのに十分な時間の後、動
物から脾臓細胞またはリンパ細胞の集団を得る。次いで、脾臓細胞またはリンパ
細胞を、抗体スクリーニングハイブリドーマを作製するために、ヒトまたはマウ
スの骨髄腫の系統のような細胞株と融合し得る。これらのハイブリドーマは、個
々のクローンを得るために単離され得、個々のクローンは、次いで、所望の標的
ペプチドに対する抗体の産生についてスクリーニングされ得る。

【０１１９】 本発明のモノクローナル抗体がまた、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法
のような標準的な免疫化学手順ならびにＭＥＦ２またはＨＤＡＣエピトープに特
異的な抗体を利用し得る他の手順における有用な適用を見つけ出す。さらに、Ｍ
ＥＦ２ ＨＤＡＣに特異的なモノクローナル抗体が他の有用な適用に利用され得
ることが提案される。例えば、抗―ＨＤＡＣ４抗体または抗―ＨＤＡＣ５抗体に
対する抗イディオタイプ抗体は、十分にＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５結合部位に
似ており、従って、ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５標的の同定のツールを提供し得
る。

【０１２０】 （３．ｍＲＮＡレベルを測定することによるトランスジーン発現の分析） メッセンジャーＲＮＡは、当該分野で公知の任意の方法によって単離され得、
この方法には、ノーザンブロット、ＲＮＡｓｅおよびヌクレアーゼ保護アッセイ
によって発現レベルを決定するために、トランスジェニック動物の細胞株および
組織から、酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール：クロロホルム抽出法
（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ １９８７）が挙げられるが、こ
れに限定されない。

【０１２１】 （４．タンパク質レベルを測定することによるトランスジーン発現の分析） タンパク質レベルは、当該分野で公知の任意の手段によって測定され得、この
方法には、トランスジーンによってコードされるタンパク質に特異的な１つ以上
の抗体を使用する、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡおよびラジオイムノア
ッセイが挙げられるが、これらに限定されない。

【０１２２】 ウェスタンブロット分析について、タンパク質画分は、組織ホモジネートおよ
び細胞溶解物から単離され得、例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）；Ｂｒｏｗｎら，（１９８３）；およびＴａｔｅ−
Ｏｓｔｒｏｆｆら（１９８９）によって記載されるウェスタンブロット分析に供
される。

【０１２３】 例えば、タンパク質画分は、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で変性され得、
そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動され得る。次いで、タンパク
質は、エレクトロブロッティングによってニトロセルロースフィルターに移され
る。フィルターは、ブロックされ、一次抗体でインキュベートされ、そして最終
的に酵素結合二次抗体と反応させられる。適切な色素原性基質を用いた引き続く
インキュベーションは、トランスジーンコードタンパク質の位置を明らかにする
。

【０１２４】 ＥＬＩＳＡは、好ましくは、本発明と組み合わせて使用される。例えば、ＥＬ
ＩＳＡアッセイは、サンプルからの標的タンパク質が選択された表面（好ましく
は、ポリスチレンマイクロタイタープレートの壁のようなタンパク質親和性を示
す表面）に固定される。プレートは、不完全に吸着される材料を除くために洗浄
され、そしてこのプレートは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、また
は粉ミルクの溶液のような試験抗体に関して抗原的に中性であることが公知の非
特異的タンパク質でコーティングされる。これは、固定表面の非特異的吸着部位
の遮断を可能にし、従って、表面への抗血清の非特異的結合によって引き起こさ
れるバックグラウンドを減少する。

【０１２５】 次に、抗体は、免疫複合体（抗原／抗体）形成の助けとなる方法で、プレート
に加えられる。このような条件は、好ましくは、抗血清／抗体を希釈剤（例えば
、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）ならびにリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ（登録商標））で希釈することを含む。これらの加えられる
薬剤はまた、非特異的バックグラウンドの減少を助ける傾向がある。次いで、プ
レートを、約２〜約４時間、好ましくは約２５℃〜約２７℃のオーダーの温度で
インキュベートし得る。インキュベーションに続いて、プレートを、非免疫複合
材料を除去するために洗浄する。好ましい洗浄手順には、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（
登録商標）またはホウ酸塩緩衝液のような溶液で洗浄することを含む。

【０１２６】 サンプルと抗体との間の特異的免疫複合体の形成および引き続く洗浄に続いて
、免疫複合体形成の発生および量は、プレートを二次抗体プローブに供すること
によって決定され得、この二次抗体は、第１（通常、第１のＦｃ部分が標的であ
る）に対して特異性を有する。検出手段を提供するために、二次抗体は、好まし
くは、適切な色素原性基質を用いるインキュベーションの際に色の発色を生成す
る関連酵素を有する。従って、例えば、当業者は、免疫複合体形成の発生を支持
する時間の間および条件下（例えば、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）のような
ＰＢＳ含有溶液中、室温での２時間のインキュベーション）でのウレアーゼまた
はペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧとの接触および抗体結合表面のインキュベ
ーションを望む。

【０１２７】 二次酵素タグ化抗体を用いるインキュベーションの後、そして未結合材料を除
去するための洗浄に続いて、標識の量は、酵素標識のようなペルオキシダーゼの
場合において、尿素およびブロモクレゾールパープルまたは２，２’−アジノ（
ａｚｉｎｏ）−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢ
ＴＳ）およびＨ₂Ｏ₂のような色素原性基質でのインキュベーションによって定量
化される。次いで、定量化は、色生成の程度を測定すること（例えば、可視スペ
クトル分光光度計を使用すること）によって達成される。このアッセイの改変、
ならびに完全に異なるアッセイ（放射免疫沈降、イムノアフィニティークロマト
グラフ、ウェスタンブロット）もまた、本発明の一部として意図される。

【０１２８】 ＥＬＩＳＡの改変は、酵素連結凝集アッセイ、つまりＥＬＣＡ（米国特許４，
６６８，６２１号）があり、これは、一般的な検出系として標識酵素ＲＶＶ−Ｘ
Ａと組み合わされた凝集カスケードを使用する。本発明のこの系の利点は、凝集
反応が幅広い種々の緩衝液の存在下での生理学的ｐＨで行われ得ることである。
従って、複合体分析の一体性を保持することを可能にする。

【０１２９】 本発明によって含まれる他の免疫アッセイには、米国特許第４，３６７，１１
０号（二重モノクローナル抗体サンドイッチアッセイ）および米国特許第４，４
５２，９０１号（ウェスタンブロット）に記載されるアッセイが挙げられるが、
これらに限定されない。他のアッセイには、インビトロとインビボの両方におい
て標識リガンドの免疫沈降および免疫細胞化学が挙げられる。

【０１３０】 （Ｆ．遺伝子構築物および遺伝子移入） 本発明の特定の局面において、ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５をコードするＨＤ
ＡＣ４またはＨＤＡＣ５発現カセットを、生物、組織または細胞に移入すること
が望ましい。発現構築物はまた、トランスジェニック動物を生成する際に使用さ
れる。

【０１３１】 （１．遺伝子構築物） この出願を通じて、用語「発現カセット」は、核酸コード配列の一部または全
てが転写され得る遺伝子産物をコードする核酸を含む、任意のタイプの遺伝子構
築物を含むことを意味する。転写物は、タンパク質に翻訳され得るが、これは、
必要はない。特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡの遺伝
子産物への翻訳との両方を含む。他の実施形態において、発現のみは、目的の遺
伝子をコードする核酸の転写を含む。

【０１３２】 （ａ．一般的プロモーター） 遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモ
ーター」は、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮ
Ａ配列を示し、遺伝子の特異的転写を開始するのに必要とされる。句「転写制御
下」とは、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御
するために核酸に関して、正確な位置および方向にあることを意味する。

【０１３３】 特定の実施形態において、肥大経路に含まれる遺伝子の発現を制御する場合に
、筋特異的プロモーター（例えば、ヒトデスミン（ｄｅｓｍｉｎ）遺伝子プロモ
ーター、アルドースＡ遺伝子の筋特異的プロモーター（ｐＭ）、平滑筋α−アク
チン（ＳＭａｌｐｈａＡ）プロモーター、ホスホグリセレートムターゼ遺伝子（
Ｍ−ＰＧＡＭ）、α−ミオシン重鎖プロモーター）を使用するのが有用であるこ
とが証明され得る。心臓特異的プロモーターには、ミオシン軽鎖−２プロモータ
ー（Ｆｒａｎｚら、１９９４；Ｋｅｌｌｙら、１９９５）、α−アクチンプロモ
ーター（Ｍｏｓｓら、１９９６）、トロポニン１プロモーター（Ｂｈａｖｓａｒ
ら、１９９６）；Ｎａ⁺／Ｃａ²⁺交換プロモーター（ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ｐｒ
ｏｍｏｔｅｒ）（Ｂａｒｎｅｓら、１９９７）、ジストロフィンプロモーター（
Ｋｉｍｕｒａら、１９９７）、クレアチンキナーゼプロモーター（Ｒｉｔｃｈｉ
ｅ，Ｍ．Ｅ．、１９９６）、α７インテグリンプロモーター（Ｚｉｏｂｅｒおよ
びＫｒａｍｅｒ、１９９６）、脳ナトリウム排泄増加ペプチドプロモーター（Ｌ
ａＰｏｉｎｔｅら、１９９６）、α Ｂ−クリスタリン／小熱ショックタンパク
質プロモーター（Ｇｏｐａｌ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｒ．、１９９５）および
αミオシン重鎖プロモーター（Ｙａｍａｕｃｈｉ−Ｔａｋｉｈａｒａら、１９８
９）およびＡＮＦプロモーター（（ＬａＰｏｉｎｔｅら、１９８８）が挙げられ
る。

【０１３４】 用語プロモーターは、本明細書中で、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周
りにクラスター化される転写制御モジュールのグループを示すために使用される
。プロモーターがどのように組織化されるかについて考えることは、ＨＳＶチミ
ジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写ユニットに対するウイルスプロモ
ーターを含む、いくつかのウイルスプロモーターの分析から誘導される。これら
の研究は、ごく最近の研究によって増強され、プロモーターが別個の機能的モジ
ュールから構成され、それぞれがＤＮＡのおよそ７−２０ｂｐからなり、そして
転写アクチベーターまたはリプレッサタンパク質に対する１つ以上の認識部位を
含むことが示された。

【０１３５】 それぞれのプロモーターにおける少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成
の開始部位を位置付けるために機能する。これの最も知られた例は、タタボック
スであるが、タタボックスを欠くいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物末
端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子に対するプロモーターおよ
びＳＶ４０後期遺伝子に対するプロモーター）において、開始部位自身に重なる
別のエレメントは、開始の位置を固定するのに役立つ。

【０１３６】 さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を制御する。代表的には
、これらは、開始部位の上流の領域３０〜１１０ｂｐに位置するが、多くのプロ
モーターが現在、開始部位の下流の機能的エレメントも含むことが示されている
。プロモーターエレメント間の間隔は、しばしばフレキシブルであり、その結果
、エレメントが互いに対して反転または移動される場合、プロモーター機能が保
存される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活
性が低下し始める前に５０ｂｐ離れて増加し得る。プロモーターに依存して、個
々のエレメントが、転写を活性化するのに同時作動的にまたは独立してのいずれ
かで機能し得るようである。

【０１３７】 目的の核酸配列の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、核
酸の発現を標的細胞に方向付け得る限り、重要であると考えられない。従って、
ヒト細胞が標的化される場合、ヒト細胞において発現され得るプロモーターに隣
接してそのプロモーターの制御下で核酸コード領域を位置付けることが好ましい
。一般的に、このようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロ
モーターのいずれかを含み得る。

【０１３８】 種々の実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子
プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、β
−アクチン、ラットインシュリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−
ホスフェートデヒドロゲナーゼは、目的のコード配列の高レベル発現を得るため
に使用され得る。目的のコード配列の発現を達成するために当該分野で周知であ
る他のウイルスまたは哺乳動物細胞のプロモーターあるいはバクテリオファージ
プロモーターの使用は、発現のレベルが所与の目的に十分である限り、同様に意
図される。周知の性質を有するプロモーターを使用することによって、トランス
フェクションまたは形質転換に続く目的のタンパク質の発現のレベルおよびパタ
ーンが最適化され得る。

【０１３９】 特異的な生理学的シグナルまたは合成シグナルに応答して調節されるプロモー
ターの選択によって、遺伝子産物の誘導性発現が可能になる。例えば、導入遺伝
子の発現の場合、または複数シストロン性（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベ
クターが利用される場合の導入遺伝子は、このベクターが産生される細胞に対し
て毒性であり、１つ以上の導入遺伝子の発現を禁止するかまたは減少させること
が所望され得る。プロデューサー細胞株に対して毒性であり得る導入遺伝子の例
は、アポトーシス促進性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）遺伝子、およびサイト
カイン遺伝子である。いくつかの誘導性プロモーターシステムは、導入遺伝子産
物が毒性であり得るウイルスベクターの産生に利用可能である。

【０１４０】 エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）がこ
のようなシステムの１つである。このシステムは、哺乳動物細胞における目的の
遺伝子の調節された発現を可能にするために設計されている。このシステムは、
きっちり調節された発現機構から構成されており、この機構は、実質的に、導入
遺伝子の基底レベルでの発現はないが、２００倍をこえる誘導性を可能にする。
このシステムは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのヘテロ二量体エクジソンレセプターに
基き、そしてエクジソンまたはムリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎ）Ａのよう
なアナログがこのレセプターに結合する場合、このレセプターはプロモーターを
活性化し、下流の導入遺伝子の発現をオンに切り換えて、高レベルのｍＲＮＡ転
写物が得られる。このシステムでは、ヘテロダイマーレセプターの両方のモノマ
ーが１つのベクターから構成的に発現されるが、一方、目的の遺伝子の発現を駆
動するエクジソン反応性プロモーターは、別のプラスミド上である。従って、目
的の遺伝子移入ベクター中へのこのタイプのシステムの遺伝子操作は有用である
。次いで、プロデューサー細胞株への目的の遺伝子を含むプラスミドおよびレセ
プターモノマーの同時トランスフェクションにより、潜在的に毒性の導入遺伝子
の発現なしに、遺伝子移入ベクターの産生が可能になる。適切な時点で、導入遺
伝子の発現は、エクジソンまたはムリステロンＡで活性化され得る。

【０１４１】 有用な別の誘導性システムは、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｇｏｓｓｅ
ｎおよびＢｕｊａｒｄ，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５）によってもとも
と開発された、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ^TMシステム、またはＴｅｔ−Ｏｎ^TMシステム（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。このシステムはまた、テ
トラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えば、ドキシサイクリン）に
応答して調節される高レベルの遺伝子発現を可能にする。Ｔｅｔ−Ｏｎ^TMシステ
ムにおいて、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの存在下でオンに切り換えられる
が、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ^TMシステムでは、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの非存在
下でオンに切り換えられる。これらのシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉのテトラサイク
リン耐性オペロンに由来する２調節性エレメントに基く。このテトラサイクリン
オペレーター配列には、テトラサイクリンリプレッサーおよびテトラサイクリン
レプレッサータンパク質が結合する。目的の遺伝子を、プロモーターの後ろのプ
ラスミド（テトラサイクリン反応性エレメントがその中に存在する）中にクロー
ニングする。第２のプラスミドは、テトラサイクリン制御トランス活性化因子と
呼ばれる、調節エレメントを含む、このエレメントは、単純ヘルペスウイルス由
来のＶＰ１６ドメインおよび野生型テトラサイクリンリプレッサーから（Ｔｅｔ
−Ｏｆｆ^TMシステム中に）構成される。従って、ドキシサイクリンの非存在下で
、転写は構成的にオンである。Ｔｅｔ−Ｏｎ^TMシステムにおいて、テトラサイク
リンリプレッサーは、野生型でなく、そしてドキシサイクリンの存在下で転写を
活性化する。遺伝子移入ベクター産生のためには、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ^TMシステムが
好ましい。それによって、このプロデューサー細胞は、テトラサイクリンまたは
ドキシサイクリンの存在下で増殖し得、そして潜在的に毒性の導入遺伝子の発現
を妨げるが、このベクターが患者に導入される場合、この遺伝子発現は、構成的
にオンである。

【０１４２】 いくつかの状況では、遺伝子移入ベクター中で導入遺伝子の発現を調節するこ
とが所望され得る。例えば、異なる強度の活性を有する異なるウイルスプロモー
ターが、所望の発現レベルに依存して利用され得る。哺乳動物細胞においては、
しばしばＣＭＶ最初期プロモーターを用いて、強力な転写活性を提供する。強度
の弱いＣＭＶプロモーターの改変バージョンをまた、導入遺伝子の発現レベルの
低下が所望される場合に用いた。造血細胞における導入遺伝子の発現が所望され
る場合、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲのようなレトロウイルスプロモータ
ーがしばしば用いられる。所望の効果に依存して用いられ得る他のウイルスプロ
モーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２
ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領
域由来）、ＡＡＶ ＬＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＳＶ−ＴＫおよ
びトリ肉腫ウイルスが挙げられる。

【０１４３】 類似の組織特異的プロモーターが、特定の組織または細胞において転写をもた
らして、非標的組織に対する潜在的毒性または所望されない効果を減じるために
用いられ得る。例えば、ＰＳＡ、プロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）、前立腺酸性
フォスファターゼまたは前立腺特異的腺性カリクレイン（ｈＫ２）のようなプロ
モーターを用いて、前立腺における遺伝子発現を標的し得る。同様に、以下のプ
ロモーターを用いて、他の組織における遺伝子発現を標的し得る。

【０１４４】 上記のいずれかのプロモーター単独か、または別のプロモーターとの組合せは
、望ましい作用に依存して、本発明に従って有用であり得ることが想定される。
さらに、プロモーターのこの列挙は、排他的にも限定的にも解釈されるべきでは
なく、当業者は、本明細書において開示されるプロモーターおよび方法と組合せ
て用いられ得る他のプロモーターを認識している。

【０１４５】 （ｂ．エンハンサー） エンハンサーは、ＤＮＡの同じ分子上の離れた位置に位置するプロモーターか
らの転写を増加する遺伝的エレメントである。エンハンサーは、プロモーターと
同様に組織化される。すなわち、それらは、それぞれが１以上の転写タンパク質
に結合する多くの個別のエレメントから構成される。エンハンサーとプロモータ
ーとの間の基本的な違いは、操作性である。全体としてエンハンサー領域は、距
離をおいて転写を刺激し得なければならない；これは、本物のプロモーター領域
またはその成分エレメントである必要はない。一方、プロモーターは、特定の部
位および特定の配向でＲＮＡ合成の開始を方向付ける１以上のエレメントを有さ
なければならないが、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターお
よびエンハンサーは、しばしばオーバーラップし、そして連続し、しばしば非常
に類似の分子機構を有するようである。

【０１４６】 本発明の好ましい実施形態では、発現構築物は、ウイルスまたはウイルスゲノ
ム由来の操作された構築物を含む。特定のウイルスが、レセプター媒介エンドサ
イトーシスを介して細胞に侵入する能力、および宿主細胞ゲノムに組み込み、そ
してウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力は、これらウイルスを、外
来遺伝子の哺乳動物細胞への移入のための魅力的な候補とした（Ｒｉｄｇｅｗａ
ｙ、１９８８；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｂａｉ
ｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。遺伝子ベ
クターとして使用される第一のウイルスは、ＤＮＡウイルスであった。これは、
パポバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシパピローマウイルス、およびポリ
オーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ
、１９８６）およびアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｂａｉｃｈ
ｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）を含む。これらは、外来ＤＮＡ配列にと
って比較的低い能力を有し、そして制限された宿主範囲を有する。さらに、許容
性細胞におけるそれらの腫瘍形成能および細胞変性影響は、安全性の問題を生じ
させる。それらは、８ｋＢまでの外来遺伝子材料にのみ適合し得るが、種々の細
胞株および実験動物に容易に導入され得る（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓ
ｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。

【０１４７】 （ｃ．ポリアデニル化シグナル） ｃＤＮＡ挿入片が使用される場合、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を達
成するために、代表的には、ポリアデニル化シグナルを含むことが所望される。
ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に必須ではないと考えら
れ、ヒトまたはウシ成長ホルモンならびにＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのよ
うな任意のこのような配列が用いられ得る。また、発現カセットのエレメントと
して、ターミネーターもまた意図される。これらのエレメントは、メッセージレ
ベルを増強し、そしてカセットから他の配列への読み通しを最小のものとするよ
うに働き得る。

【０１４８】 （２．遺伝子移入） 治療の状況下、ならびにトランスジェニック細胞およびトランスジェニック動
物の作成の両方において、遺伝子移入は重要である。発現ベクターを細胞に導入
し得る多数の方法が存在する。本発明の特定の実施形態において、発現構築物は
、ウイルス、またはウイルスゲノム由来の操作された構築物を含む。他の実施形
態において、非ウイルス性送達が意図される。特定のウイルスが、レセプター媒
介エンドサイトーシスを会して細胞に進入する能力、宿主細胞ゲノムに組み込ん
でウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力によって、それらのウイルス
は、外来遺伝子を哺乳動物細胞に移入するための魅力的な候補となった（Ｒｉｄ
ｇｅｗａｙ、１９８８；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８
；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。
本明細書中以下において、送達機構をさらに詳細に考察する。

【０１４９】 （ａ．非ウイルス移入） 本発明は、非ウイルス遺伝子移入の方法および組成物の考察を行う。本発明の
ＤＮＡ構築物は、一般に、特定の状況において、細胞に送達され、移入される核
酸またはタンパク質は、非ウイルス的方法を使用して移入され得る。

【０１５０】 培養した哺乳動物細胞に発現構築物を移入するためのいくつかの非ウイルス的
方法が、本発明により意図される。これらとしては、リン酸カルシウム沈殿（Ｇ
ｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａ
ｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐ
ａｌ、１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６
；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、直接ミクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ
およびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５）、ＤＮＡ負荷リポソーム（Ｎｉｃｏｌａ
ｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９）、細胞超音波処理（
Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）、高速噴出を使用する遺伝子ボンバードメ
ント（Ｙａｎｇら、１９９０）、およびレセプター媒介トランスフェクション（
ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）が挙げられる。

【０１５１】 一旦、構築物が細胞に送達されると、目的の特定の遺伝子をコードする核酸は
、異なる部位で位置決めされ得、そして発現され得る。特定の実施形態において
、この遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に取り込まれ得る。この
組込みは、相同組換えを介する同種の位置および配向であり得る（遺伝子置換）
か、またはこれは、ランダムな非特異的位置に組み込まれ得る（遺伝子増強）。
なおさらなる実施形態においては、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメン
トとして、細胞内に安定に維持され得る。このような核酸セグメントまたは「エ
ピソーム」は、宿主細胞周期とは独立であるかまたはこの周期に同調する、維持
および複製を可能にするに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達さ
れる方法、および核酸が残る細胞の位置は、使用される発現構築物の型に依存す
る。

【０１５２】 本発明の別の特定の実施形態において、発現構築物は、リポソーム内にトラッ
プされ得る。リポソームとは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体により特
徴付けられる、ベシクルの構造である。多層リポソームは、水性媒体により分離
される、複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁さ
れる場合に、同時に形成する。脂質成分は、自己再配列を起こし、その後、閉じ
た構造を形成し、そして水および溶解した溶質を、脂質二重層の間にトラップす
る（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。カチオン性リポソーム
へのＤＮＡの添加は、リポソームからのトポロジー的移行を引き起こし、必要に
応じて、複屈折の液晶濃縮小球となる（Ｒａｄｌｅｒら、１９９７）。これらの
ＤＮＡ−脂質複合体は、遺伝子治療において使用するための可能な非ウイルスベ
クターである。

【０１５３】 リポソームにより媒介されるインビトロでの外来ＤＮＡの核酸送達および発現
は、非常に成功した。β−ラクタマーゼ遺伝子を使用して、Ｗｏｎｇら（１９８
０）は、リポソームにより媒介される、外来ＤＮＡの送達および発現の可能性を
、培養したニワトリ胚、ＨｅＬａ、およびヘパトーム細胞において、実証した。
Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、静脈内注射の後の、ラットにおける首尾よい
リポソーム媒介遺伝子移入を達成した。「リポフェクション」技術を含む種々の
市販のアプローチもまた、含まれる。

【０１５４】 本発明の特定の実施形態において、リポソームは、赤血球凝集反応性ウイルス
（ＨＶＪ）と複合体形成し得る。このことは、細胞膜との融合を容易にし、そし
てリポソームによりカプセル化されたＤＮＡが細胞に入ることを促進することが
、示された（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。他の実施形態において、リポソーム
は、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体形成し得るか、また
はこのタンパク質とともに使用され得る（Ｋａｔｏら、１９９１）。なおさらな
る実施形態において、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体形
成し得るか、またはこれらとともに使用され得る。インビトロおよびインビボで
の核酸の移入および発現において、このような発現構築物が首尾よく使用された
点で、これらは本発明に適用可能である。

【０１５５】 特定の遺伝子をコードする核酸を細胞内に送達するために使用され得る、他の
ベクター送達系は、レセプター媒介送達ビヒクルである。これらは、ほぼ全ての
真核細胞における、レセプター媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的取
り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異的分布に起因して、送達は、
非常に特異的であり得る（ＷｕおよびＷｕ、１９９３）。

【０１５６】 レセプター媒介遺伝子標的化ビヒクルは、一般に、以下の２つの成分からなる
：細胞レセプター特異的リガンドおよびＤＮＡ結合因子。いくつかのリガンドは
、レセプター媒介遺伝子移入のために使用されてきた。最も広範にわたり特徴付
けられたリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（ＷｕおよびＷｕ、
１９８７）ならびにトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）（Ｗａｇｎｅ
ｒら、１９９０）である。近年、ＡＳＯＲと同じレセプターを認識する合成ネオ
糖タンパク質が、遺伝子送達ビヒクルとして使用され（Ｆｅｒｋｏｌら、１９９
３；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４）、そして内皮増殖因子（ＥＧＦ）もまた、鱗
状癌細胞に遺伝子を送達するために、使用されてきた（Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ ０
２７３０８５）。

【０１５７】 他の実施形態において、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得
る。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、リポソームに組み込まれたラク
トシル−セラミド（ガラクトース末端アシアロガングリオシド（ａｓｉａｌｇａ
ｎｇｌｉｏｓｉｄｅ））を使用し、そして肝細胞によるインスリン遺伝子の取込
みの増加を観察した。

【０１５８】 本発明の別の実施形態において、発現構築物は、単に、裸の組換えＤＮＡまた
はプラスミドからなり得る。この構築物の移入は、細胞膜を物理的にかまたは化
学的に透過可能にする上記方法のいずれかによって、実施され得る。このことは
、インビトロでの移入に特に適用可能であるが、インビボでの使用にも同様に適
用され得る。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４）は、ＣａＰＯ₄沈殿物の形態で、
ポリオーマウイルスＤＮＡを、成体マウスおよび新生マウスの肝臓および脾臓に
首尾よく注射し、活性なウイルス複製および急性の感染を実証した。Ｂｅｎｖｅ
ｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（１９８６）はまた、ＣａＰＯ₄沈殿プラスミド
の直接の腹腔内注射が、トランスフェクトされた遺伝子の発現を生じることを実
証した。ＣＡＭをコードするＤＮＡもまた類似の様式でインビボで移入され得、
そしてＣＡＭを発現し得ることが予測される。

【０１５９】 裸のＤＮＡ発現構築物を細胞内に移入するための、本発明の別の実施形態は、
粒子ボンバードメントを包含し得る。この方法は、ＤＮＡでコーティングされた
微粒子（ｍａｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を、これらが細胞を殺傷すること
なく、細胞膜を貫通して細胞に入ることを可能にする高速まで加速する能力に基
づく（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。小粒子を加速するためのいくつかのデバイス
が、開発された。このようなデバイスの１つは、電流を生じさせるための高圧放
電に依存し、これが次に、原動力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０）。使用さ
れるミクロ噴出物は、タングステンまたは金のビーズのような、生物学的に不活
性な物質からなる。

【０１６０】 特定の実施形態では、遺伝子移入は、エキソビボ条件下で容易に実施され得る
。エキソビボ遺伝子適用とは、動物からの細胞の単離、インビトロでのこの細胞
への核酸の送達、次いで、この改変細胞の動物への戻しをいう。この方法は、動
物からの組織／器官の外科的取り出し、または細胞および組織の初代培養を包含
し得る。

【０１６１】 （ｂ．ウイルス移入） （アデノウイルス） インビボ送達のための好ましい方法の１つは、アデノウ
イルス発現ベクターの使用を包含する。「アデノウイルス発現ベクター」は、構
築物であって、以下：（ａ）この構築物のパッケージングを支持するため、およ
び（ｂ）この構築物にクローニングされているアンチセンスポリヌクレオチド、
タンパク質、ポリヌクレオチド（たとえば、リボザイムまたはｍＲＮＡ）を発現
するために十分なアデノウイルス配列を含む構築物、を包含することを意味する
。この状況では、遺伝子産物が合成される発現は必要でない。

【０１６２】 この発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作型を含む。アデノウイルス
の遺伝子機構の知識としては、３６ｋｂで、直線状の、二本鎖ＤＮＡウイルスで
あり、これは、７ｋｂまでの外来配列を有するアデノウイルスＤＮＡの大きい片
の置換を可能にする（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。レ
トロウイルスに比較して、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み込みを
生じない。なぜなら、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝子毒性なしにエピ
ソーム様式で複製し得るからである。本明細書において用いる場合、用語「遺伝
子毒性（ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）」とは、持続性の遺伝性の宿主細胞遺伝子
変化をいう。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、そして正常な誘導
体の高増幅後にゲノム再配列は検出されなかった。アデノウイルスは、その細胞
周期の段階にかかわらず、実質的に、全ての上皮細胞に感染し得る。今日まで、
アデノウイルス感染は、免疫抑制されていないヒトにおける急性呼吸器疾患のよ
うな穏やかな疾患にしか関連していないようである。

【０１６３】 アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作の容易さ、高い力価、
広範囲の標的細胞および高い感染率のために、遺伝子移入ベクターとしての使用
に特に適切である。ウイルスゲノムの両端は、１００〜２００塩基対の逆方向反
復（ＩＴＲ）を含み、これらは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに
必要なｃｉｓエレメントである。ゲノムの初期（ｅａｒｌｙ）（Ｅ）領域および
後期（ｌａｔｅ）（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始により分割される異
なる転写ユニットを含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノム
および少数の細胞性遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。Ｅ２領
域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製に関するタンパク質の
合成を生じる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現および宿主
細胞シャットオフ（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）に関与する（Ｒｅｎａｎ，１９９０）。
後期遺伝子の産物（大部分のウイルスキャプシドタンパク質を含む）は、主要後
期プロモーター（ＭＬＰ）により生じる単一の一次転写物の有意なプロセシング
の後にのみ発現される。このＭＬＰ（１６．８Ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の
後期の間に特に効率的であり、そしてこのプロモーターから生じるすべてのｍＲ
ＮＡは、それらを翻訳に好ましいｍＲＮＡにする５’−三分節リーダー（ＴＰＬ
）配列を有する。

【０１６４】 Ｅ３領域は、Ａｄ感染細胞の効率的な溶解ならびにＴＮＦ−媒介性細胞溶解お
よび感染細胞のＣＴＬ媒介性溶解の予防に、必要であるようなタンパク質をコー
ドする。一般的に、Ｅ４領域コードは、７のタンパク質をコードすると考えられ
、そのいくつかは、Ｅ２プロモーターを活性化する。宿主のｍＲＮＡ輸送をブロ
ックし、そしてウイルスＲＮＡの細胞質への輸送を増加することを示した。さら
にＥ４産物は、感染の後期に見られる、初期遺伝子発現の減少を、部分的に担う
。Ｅ４はまた、溶解増殖の間のＥ１ＡおよびＥ４（Ｅ１Ｂではない）の発現を阻
害する。いくつかのＥ４タンパク質は、十分なＤＮＡ複製に必要であるが、しか
し、この関与に関するメカニズムは、未知である。Ｅ４はまた、ウイルス後期遺
伝子発現における翻訳後事象；すなわち、溶解増殖における３分からなるリーダ
ーの代替のスプライスに関与する。それにも関わらず、Ｅ４の機能は、ＤＮＡ複
製に完全に必要ではないが、その欠如は、複製を遅らせる。他の機能としては、
ウイルスＤＮＡ合成のネガティブな調整、アデノウイルス感染の間に正常に見ら
れる、副核の認識の誘導、およびウイルス複製、後期ウイルスｍＲＮＡ蓄積、お
よび宿主細胞の転写のシャットオフに必要な他の機能が挙げられる。

【０１６５】 １つの現在の系において、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロ
ウイルスベクターとの間の相同組換えから生じる。プロウイルスベクターと２９
３細胞におけるＡｄ配列の間の可能な組換え、またはｐＪＭ１７プラスミドの場
合、挿入されたｐＢＲ３２２配列の自発的欠損に起因して、野生型アデノウイル
スは、このプロセスから生成され得る。従って、ウイルスの単一クローンを個々
のプラークから単離して、そしてそのゲノム構造を調査することは、重要である
。

【０１６６】 複製欠損である、現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、２９３
（これは、Ａｄ５型ＤＮＡフラグメントによりヒト胎児腎臓細胞から形質転換さ
れて構成的にＥ１タンパク質を発現する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７））のよう
な固有のヘルパー細胞株に依存する。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムに必要
ではない（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ，１９７８）ので、現在のアデノウイル
スベクターは、２９３細胞の助けを伴って、Ｅ１領域、Ｅ３領域のいずれかまた
は両方の領域において外来ＤＮＡを運ぶ（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１
９９１）。事実上、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージ
ングし得（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）、約２ｋｂ余分のＤ
ＮＡのための受容能力を提供する。Ｅ１領域およびＥ３領域において置換可能な
約５．５ｋｂのＤＮＡと組合せて、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は
、７．５ｋｂまでか、またはベクターの全長の約１５％である。８０％以上のア
デノウイルスのウイルスゲノムは、ベクター骨格にあり、そしてベクター骨格細
胞障害性の供給源である。また、複製欠損Ｅ１欠失ウイルスは、不完全である。
例えば、ウイルス遺伝子発現のもれは、高い感染多重度（ＭＯＩ）での現在利用
可能なベクターで、観察されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３；Ｓｈｅｎｋ
，１９７８）。

【０１６７】 ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎臓細胞、筋細胞、造血細胞または他のヒト胚性
間葉細胞もしくは上皮細胞のようなヒト細胞に由来し得る。あるいは、ヘルパー
細胞は、ヒトアデノウイルスに対して許容性の他の哺乳動物種の細胞に由来し得
る。このような細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚性間葉細
胞もしくは上皮細胞が挙げられる。上述のように、好ましいヘルパー細胞株は、
２９３である。

【０１６８】 Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、２９３細胞を培養する改良された方法および
アデノウイルスを増殖させる改良された方法を開示した。１つの形式において、
天然の細胞凝集体を、個々の細胞を、１００〜２００ｍｌの培地を含む１リット
ルのシリコン処理スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ
）に接種することにより増殖させる。４０ｒｐｍで攪拌した後、細胞生存能力を
トリパンブルーを用いて評価する。別の形式において、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイ
クロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）（Ｂｉｂｂｙ Ｓｔｅｒｌｉｎ，Ｓ
ｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を以下のように使用する。５ｍｌの培地に再懸濁
された細胞接種物を、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中のキャリア（５
０ｍｌ）に添加し、そして時々攪拌しながら１〜４時間静置する。次いで、この
培地を５０ｍｌの新鮮な培地と置換し、そして振盪を開始する。ウイルス産生に
関しては、細胞を約８０％のコンフルエンシーまで増殖させ、その後、培地を置
き換え（最終容積の２５％まで）、そしてアデノウイルスを０．０５のＭＯＩで
添加する。培養物を一晩静置し、その後容積を１００％に増加し、さらに７２時
間の振盪を開始する。

【０１６９】 アデノウイルスベクターが複製欠損であるか、または少なくとも条件付きで欠
損であることが必要とされる以外に、アデノウイルスベクターの性質は、本発明
の首尾良い実施に重要とは考えられていない。アデノウイルスは、４２種の異な
る公知の血清型またはサブグループＡ〜Ｆのいずれであり得る。サブグループＣ
のアデノウイルス血清型の５型は、本発明において使用するための条件付き複製
欠損アデノウイルスベクターを得るための好ましい出発物質である。これは、部
分的に、５型アデノウイルスが、多量の生化学的情報、医学情報および遺伝学的
情報が公知であるヒトアデノウイルスであるため、そしてアデノウイルスをベク
ターとして使用するほとんどの構築物のために歴史的に使用されてきたためであ
る。

【０１７０】 上述のように、本発明に従う代表的なベクターは、複製欠損であり、そしてア
デノウイルスＥ１領域を欠いている。従って、Ｅ１コード配列が除去される位置
に、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も簡便であ
る。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は、本発明には重要でな
い。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９
８６）により記載されるようにＥ３置換ベクターにおいて、欠失されたＥ３領域
の代わりに挿入され得るか、またはＥ４領域に挿入され得、ここでヘルパー細胞
株もしくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補完する。

【０１７１】 アデノウイルスは、増殖および操作し易く、かつインビトロおよびインビボで
広い宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高力価（例えば、１ｍｌにつき１０ ⁹ 〜１０¹¹のプラーク形成単位）で得られ得、そしてこれらは高度に感染性であ
る。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。ア
デノウイルスベクターにより送達された外来遺伝子は、エピソーム性であり、従
って、宿主細胞に対する低い遺伝子毒性を有する。野生型アデノウイルスのワク
チン接種の研究（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）において副作
用は報告されておらず、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのこれらの安全性お
よび治療的可能性を示す。

【０１７２】 アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現研究（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１
９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈ
ａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１
９９１）において使用されてきた。動物研究は、組換えアデノウイルスが遺伝子
移入に有用であり得ることを最近に示唆した（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉ
ｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−
Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織へ
の組換えアデノウイルスの投与における研究としては、以下が挙げられる：気管
点滴注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２
），筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３），末梢静脈注射（ＨｅｒｚおよびＧｅ
ｒａｒｄ，１９９３），鼻腔内接種（Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、１９９１），肺への
エアロゾルの投与（Ｂｅｌｌｏｎ，１９９６）、腹腔内投与（Ｓｏｎｇら、１９
９７），胸膜内注射（Ｅｌｓｈａｍｉら、１９９６）、小胞内投与を使用する膀
胱への投与（Ｗｅｒｔｈｍａｎ，ら、１９９６），腹腔内、胸膜内、筋肉内、ま
たは皮下を含む皮下注射（Ｏｇａｗａ，１９８９）、心筋層への心室注射（心臓
，Ｆｒｅｎｃｈら、１９９４），肝臓灌流（肝臓動脈または門脈静脈，Ｓｈｉｒ
ａｉｓｈｉら、１９９７）および脳への定位的な接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓ
ａｌｌｅら、１９９３）。

【０１７３】 （レトロウイルス） レトロウイルスは、逆転写プロセスにより感染細胞においてそれらのＲＮＡを
二本鎖ＤＮＡに変換する能力で特徴付けられる、一本鎖ＲＮＡウイルスの群であ
る（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、生じたＤＮＡは、プロウイルスとして
細胞の染色体に安定に組込まれ、そしてウイルスタンパク質の合成を指向する。
この組み込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列
の保持を生じる。このレトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ
、およびｅｎｖ）を含有し、これらは、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵
素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする。ｇａｇ遺伝子の上流に見出
される配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングについてのシグナルを含む
。２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列が、このウイルスゲノムの５’末端および３
’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列
を含み、そしてまた、宿主細胞ゲノムにおける組み込みに必要とされる（Ｃｏｆ
ｆｉｎ、１９９０）。

【０１７４】 レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸は
、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損である
ウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子
、およびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッ
ケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら、１９８３）。ｃＤＮＡを含む組換え
プラスミドが、レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共に（例えば
、リン酸カルシウム沈降により）この細胞株に導入される場合、このパッケージ
ング配列は、この組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子にパッケージ
ングされるのを可能にし、次いでこのウイルス粒子が培養培地中に分泌される（
ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔａｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６
；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、この組換えレトロウイルスを含む培地は、
回収され、必要に応じて濃縮され、そして遺伝子移入に使用される。レトロウイ
ルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染し得る。しかし、組み込みおよび安
定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。

【０１７５】 レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするように設計された新規な
アプローチは、ラクトース残基のウイルスエンベロープへの化学的付加による、
レトロウイルスの化学的改変に基づいて、最近開発された。この改変は、シアロ
糖タンパク質レセプターを介する肝細胞の特異的感染を可能にし得る。

【０１７６】 組換えレトロウイルスの標的化への異なるアプローチが設計され、このアプロ
ーチにおいて、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体
、および特異的細胞レセプターに対するビオチン化抗体が使用された。これらの
抗体は、ビオチン成分を介して、ストレプトアビジンを使用して結合された（Ｒ
ｏｕｘら、１９８９）。主要組織適合抗原複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原
に対する抗体を使用して、これらの表面抗原を保有する種々のヒト細胞の、イン
ビトロでのエコトロピックウイルスでの感染を実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９
）。

【０１７７】 本発明のすべての局面におけるレトロウイルスベクターの使用に対して特定の
制限が存在する。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノム中のラ
ンダムな部位に組込まれる。このことは、宿主遺伝子の妨害によるか、または隣
接する遺伝子の機能に干渉し得るウイルス調節配列の挿入により、挿入変異誘発
を引き起こし得る（Ｖａｒｍｕｓら、１９８１）。欠損性レトロウイルスベクタ
ーの使用に関連する別の問題は、パッケージング細胞における野生型の複製コン
ピテントなウイルスの潜在的出現である。これは、組換えウイルス由来のインタ
クトな配列が、宿主細胞ゲノムに組み込まれたｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、ｅｎｖ
配列の上流に挿入する組換え事象から生じ得る。しかし、新しいパッケージング
細胞株が現在利用可能であり、組換えの可能性はかなり減少するはずである（Ｍ
ａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、１９９０）。

【０１７８】 （ヘルペスウイルス） 単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）は、神経親和性であるので、神経系障害の処置に
おいてかなりの興味を生じた。さらに、宿主細胞染色体に組み込まれることも、
さもなくば宿主細胞の代謝を変化させることもなく、非分裂神経細胞における潜
在性の感染を確立するための、ＨＳＶの能力は、潜伏の間、活性であるプロモー
ターの存在に加えて、ＨＳＶを魅力的なベクターにする。そして多くの注目が、
ＨＳＶの神経親和性の適用に集中したが、このベクターはまた、その広い宿主範
囲を考えると、他の組織のために開発され得る。

【０１７９】 ＨＳＶを魅力的なベクターにする別の因子は、ゲノムのサイズおよび構成であ
る。ＨＳＶは大きいので、多数の遺伝子または発現カセットの取り込みは、他の
小さなウイルス系よりも、問題になり難い。さらに、異なる能力（時間的、強度
など）を有する異なるウイルス制御配列の能力は、他の系よりも広い範囲で発現
の制御を可能にする。ウイルスが、遺伝的操作をさらに容易にする、比較的少な
いスプライスされたメッセージを有することは、また有利である。

【０１８０】 ＨＳＶはまた、操作が比較的容易であり、そして高い力価で増殖し得る。従っ
て、十分なＭＯＩを得るために必要な量および繰り返しの投与の必要性の少ない
ことの両方の点に関して、送達には問題が少ない。遺伝子移入ベクターとしての
ＨＳＶの総説については、Ｇｌｏｒｉｏｓｏら、（１９９５）を参照のこと。

【０１８１】 サブタイプ１および２と呼ばれるＨＳＶは、ヒトの出くわす最も共通な感染因
子である、エンベロープ化ウイルスであり、世界中で、数百万のヒト被験体を感
染する。大きな、複雑な、２本鎖ＤＮＡゲノムは、数ダースの異なる遺伝子産物
をコードし、そのいくつかは、スプライスされた転写物に由来する。ビリオンお
よびエンベロープ構造成分に加えて、ウイルスは、多くの他のタンパク質（プロ
テアーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ｓｓＤＮＡ結
合タンパク質、ヘリカーゼ／プライマーゼ、ＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ、ｄＵＴ
Ｐａｓｅおよびその他を含む）をコードする。

【０１８２】 ＨＳＶ遺伝子は、いくつかの群を形成し、その発現は協調的に調節され、そし
てカスケード様式で連続して定められる（ＨｏｎｅｓｓおよびＲｏｉｚｍａｎ，
１９７４；ＨｏｎｅｓｓおよびＲｏｉｚｍａｎ １９７５；Ｒｏｉｚｍａｎおよ
びＳｅａｒｓ，１９９５）。感染後に発現される第１のセットの遺伝子である、
α遺伝子の発現は、ビリオンタンパク質数１６またはα形質導入因子によって増
強される（Ｐｏｓｔら、１９８１；ＢａｔｔｅｒｓｏｎおよびＲｏｉｚｍａｎ，
１９８３）。β遺伝子の発現は、機能的α遺伝子産物（最も特にＩＣＰ４（α４
遺伝子によってコードされる））を必要とする（ＤｅＬｕｃａら、１９８５）。
主にビリオン構造タンパク質をコードする異種の群の遺伝子である、γ遺伝子は
、最適な発現のために、ウイルスＤＮＡ合成の開始を必要とする（Ｈｏｌｌａｎ
ｄら、１９８０）。

【０１８３】 ゲノムの複雑さに一致して、ＨＳＶの生活環は、かなり複雑である。ウイルス
粒子の合成、そして最終的には細胞死を生じる溶解サイクルに加えて、ウイルス
は、まだ現在定義されていないシグナルが、溶解サイクルの再発を誘発するまで
、ゲノムが神経節に維持される潜伏段階に入る能力を有する。ＨＳＶの無毒性改
変体が開発され、そして遺伝子移入の際における使用に容易に利用可能である（
米国特許第５，６７２，３４４号）。

【０１８４】 （アデノ随伴ウイルス） 最近、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、より一般に使用されるレトロウイル
スおよびアデノウイルスベクターの強力な代替として現れた。レトロウイルスお
よびアデノウイルスに媒介される遺伝子移入についての研究は、前者の強力な腫
瘍形成特性、および後者に関する免疫原性の問題についての関心を生じ、ＡＡＶ
は、任意のこのような病理学的な指標に関連しなかった。

【０１８５】 さらに、ＡＡＶは、他のベクターよりも、より望ましくする、いくつかの独特
の特徴を有する。レトロウイルスとは異なり、ＡＡＶは、非分裂細胞に感染し得
る；野生型ＡＡＶは、部位特異的様式での、ヒト細胞の第１９染色体への組み込
みによって特徴付けられ（ＫｏｔｉｎおよびＢｅｒｎｓ，１９８９；Ｋｏｔｉｎ
ら、１９９０；Ｋｏｔｉｎら、１９９１；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９９１）；そ
してＡＡＶはまた、抗腫瘍形成を保有する（Ｏｓｔｒｏｖｅら、１９８１；Ｂｅ
ｒｎｓおよびＧｉｒａｕｄ，１９９６）。組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ＩＴ
Ｒ間の目的のＤＮＡ配列を分子的にクローニングし、野生型ＡＡＶゲノムの全体
のコード配列を除去することによって、構築される。このように生じたＡＡＶベ
クターは、野生型ＡＡＶの任意のコード配列を欠き、なお、インビトロおよびイ
ンビボの両方での形質転換の際に、安定な染色体の組み込み特性および組換え遺
伝子の発現特性を保持する（Ｂｅｒｎｓ，１９９０；ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅ
ｎｓｋｙ，１９８７；Ｂｅｒｔｒａｎら、１９９６；Ｋｅａｒｎｓら、１９９６
；Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら、１９９７ａ）。最近まで、ＡＡＶは、ほとんどす
べての細胞型を感染し、そして種の障壁さえも超えると考えられていた。しかし
、ＡＡＶ感染は、レセプター媒介性であることが現在決定された（Ｐｏｎｎａｚ
ｈａｇａｎら、１９９６；Ｍｉｚｕｋａｍｉら、１９９６）。

【０１８６】 ＡＡＶウイルスは、約４７００の塩基対の、線状の一本鎖ＤＮＡを利用する。
逆方向末端反復は、ゲノムに隣接する。２つの遺伝子がゲノム内に存在し、多数
の異なる遺伝子産物を生じる。第一にｃａｐ遺伝子は、３つの異なるビリオンタ
ンパク質（ＶＰ）（ＶＰ−１、ＶＰ−２およびＶＰ−３と命名する）を産生する
。第二に、ｒｅｐ遺伝子は、４つの非構成的タンパク質（ＮＳ）をコードする。
これらのｒｅｐ遺伝子産物のうちの１つ以上が、ＡＡＶ転写のトランス活性化を
担う。ＡＡＶの配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３），および米国特許
第５，２５２，４７９号（その全体が、本明細書中に参考として具体的に援用さ
れる）によって提供される。

【０１８７】 ＡＡＶにおける３つのプロモーターを、ゲノムにおけるマップユニット中での
それらの位置によって、命名する。これらは、左から右へと、ｐ５、ｐ１９およ
びｐ４０である。転写は、６つの転写物を生じ、３つのプロモーターの各々にお
いて２つが開始され、各対のうちの一方が、スプライシングされる。マップ単位
４２−４６に由来するスプライス部位は、各転写物について同一である。４つの
非構造的タンパク質は、見かけ上より長い転写物に由来し、そして３つのビリオ
ンタンパク質はすべて、最も小さい転写物から生じる。

【０１８８】 ＡＡＶは、ヒトにおいて任意の病的状態をともなわない。興味深いことに、効
率的な複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメ
ガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、そして勿論、アデノウイルスのようなウイ
ルスからの「補助」機能を必要とする。これらのヘルパーのなかで最も特徴付け
られているのはアデノウイルスであり、そしてこのウイルスの多くの「初期」機
能がＡＡＶ複製を補助することが示されている。ＡＡＶｒｅｐタンパク質の低レ
ベル発現がＡＡＶの構造的発現を阻止すると考えられており、そしてヘルパーウ
イルス感染がこのブロックを除去すると考えられている。

【０１８９】 （ワクシニアウイルス） ワクシニアウイルスベクターが広く用いられている
。それらの構築の容易さ、得られる相対的に高いレベルの発現、広い宿主範囲お
よびＤＮＡを保持する大きな能力のためである。ワクシニアは、顕著な「Ａ−Ｔ
」優勢を示す約１８６ｋｂの直線状の二本鎖ＤＮＡゲノムを含む。約１０．５ｋ
ｂの逆向き末端反復がこのゲノムに隣接する。必須遺伝子の大部分は、ポックス
ウイルスの間で最も高度に保存されている中央領域内にマップされるようである
。ワクシニアウイルス中の推定されたオープンリーディングフレームは、１５０
〜２００の数である。両鎖がコード化されているが、リーディングフレームの広
い重複は一般的ではない。

【０１９０】 少なくとも２５ｋｂがこのワクシニアウイルスゲノム中に挿入され得る（Ｓｍ
ｉｔｈおよびＭｏｓｓ、１９８３）。プロトタイプのワクシニアウイルスベクタ
ーは、相同的組換えによりウイルスチミジンキナーゼ遺伝子中に挿入された移入
遺伝子を含む。ベクターは、ｔｋ表現型を基礎に選択される。脳心筋炎ウイルス
の非翻訳リーダー配列を含み、発現のレベルは従来ベクターの発現のレベルより
高く、移入遺伝子は、２４時間以内に感染された細胞のタンパク質の１０％また
はそれ以上に蓄積する（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら、１９８９）。

【０１９１】 ｃ．選択方法 初期哺乳動物細胞培養は、種々の方法で調製され得る。細胞が、インビトロお
よび発現構築物と接触している間に生存していることを維持するために、細胞が
正確な比率の酸素および二酸化炭素、および栄養物との接触を維持するが、微生
物汚染から保護されていることを確実にすることが必要である。細胞培養技法は
、文献に十分に開示されており、そして本明細書に参考として援用する（Ｆｒｅ
ｓｈｎｅｒ、１９９２）。

【０１９２】 先行する記載の１つの実施形態は、タンパク質の産生に細胞を不死化するため
の遺伝子移入の使用を含む。目的のタンパク質の遺伝子は、適切な宿主細胞中に
上記のように移入され得て、適切な条件下の細胞の培養が続く。実質的に任意の
ポリペプチドの遺伝子がこの様式で利用され得る。組換え発現ベクターの生成、
およびその中に含まれるエレメントは、上記で論議されている。あるいは、産生
されるべきタンパク質は、問題の細胞により通常合成される内因性タンパク質で
あり得る。

【０１９３】 有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａ細胞およびチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞株であるＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、Ｈ
ｅｐＧ２、ＮＩＨ３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞である。さらに、挿入され
た配列の発現を調整するか、または所望の様式で遺伝子産物を改変およびプロセ
ッシングする宿主細胞株が選択され得る。このようなタンパク質産物の改変（例
えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）は、タンパク質の機能
にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセッシン
グおよび改変のための特徴的および特異的機構を有している。適切な細胞株また
は宿主系が、発現される外来タンパク質の正確な改変およびプロセッシングを確
実にするために選択され得る。

【０１９４】 従って、細胞中への発現構築物の導入の後、レポーター遺伝子の発現は、従来
手段により決定され得る。レポーター遺伝子の産物を検出する任意のアッセイは
、このレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質を直接検出することによ
るか、またはレポーター遺伝子にコードされる酵素の酵素的産物を検出すること
によるかのいずれかであり、本発明の使用に適切である。アッセイは、比色、蛍
光または発光アッセイ、またはタンパク質タグの場合には、ラジオイムノアッセ
イまたはその他の免疫学的アッセイでさえ含み得る。トランスフェクション効率
は、レポーター遺伝子に作動可能に連結された構成的に活性なプロモーターを含
む発現構築物を同時トランスフェクトすることによりモニターされ得る。

【０１９５】 多くの選択系が用いられ得、これには、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ
−細胞中の、それぞれＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラー
ゼ遺伝子を含むがこれらに限定されるわけではない。また、選択の基礎として抗
代謝物耐性が用いられ得、耐性を付与するｄｈｆｒ；ミコフェノール酸に対する
耐性を付与するｇｐｔ；アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与するｎｅ
ｏ；およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏがある。

【０１９６】 動物細胞は、インビトロで２つの様式で増殖され得る：培養の集団がすべて懸
濁液で生育する非固定依存性細胞としてか、またはそれらの増殖に固体支持体へ
の付着を必要とする固定依存性細胞として（すなわち、単層型の細胞増殖）であ
る。

【０１９７】 （Ｇ．実施例） 以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を示すために含められる。これら実
施例に開示される技法は、本発明の実施において良好に機能するために本発明者
により発見された代表的技法に従い、そしてそれ故、その実施のために好適な様
式を構成すると考えられ得ることが当業者により認識されるべきである。しかし
、当業者は、現在の開示を考慮して、開示されている特定の実施形態において、
多くの改変がなされ得て、そしてなお本発明の思想および範囲から逸脱すること
なく同様または類似の結果を得ることを認識すべきである。

【０１９８】 （実施例１） （材料および方法） （初代ラット心筋細胞の調製） 心筋細胞培養を、１日齢の新生児ラット心臓
の解離により調製し、そして線維芽細胞を除去するために鑑別的にプレートに撒
いた。肥厚応答を誘導するため、ＡｎｇＩＩおよびＰＥを、血清フリーＭ１９９
培地中、心筋細胞培養に、それぞれ１０ｎＭおよび１０μＭで添加する。いずれ
かのアゴニストを含む培養培地を、７２時間の期間について１２時間毎に交換す
る。

【０１９９】 （免疫細胞化学） 初代心筋細胞における筋節組織化を可視化するために、抗
−α−アクチニンマウスモノクローナル抗体（シグマ）を用いる。細胞を１×Ｐ
ＢＳ中で洗浄し、３．７％パラホルムアルデヒド中で５分間固定化し、１×ＰＢ
Ｓで３回洗浄し、次いで２％ウマ血清、２％ＢＳＡ、および０．１％ＮＰ４０を
含む１×ＰＢＳ中で３０分間予備ブロックする。抗−α−アクチニン抗体を、新
鮮予備ブロック溶液中、１：８００の希釈で添加し、そしてさらに３０分インキ
ュベートする。次いで、細胞を、０．１％ＮＰ４０をともなう１×ＰＢＳ中で３
回洗浄する。次いで、抗マウスＴＲＩＴＣ結合二次抗体を、予備ブロック溶液中
に１：４００の希釈で３０分間添加し、そして細胞を、再び、０．１％ＮＰ４０
を含む１×ＰＢＳ中で３回洗浄する。ＤＮＡのための核染色は、ＰＢＳ中の０．
５μｇ／ｍｌのビス−ベンズイミドを用いて１５分、次いでＰＢＳを用いた３回
のリンスによって行う。

【０２００】 （ＲＮＡ分析） 総ＲＮＡを回収し、そしてＴｒｉａｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）を推奨されるように用いて精製した。野生型およびトランスジェニック
心臓から、および培養された心筋細胞からのＲＮＡを、先に記載のように（Ｊｏ
ｎｅｓら、１９９６）オリゴヌクレオチドプローブのパネルに対するドットブロ
ットハイブリダイゼーションに供した。

【０２０１】 （組織化学） 野生型およびトランスジェニックマウスからの心臓を、組織学
的分析に供した。簡単に述べれば、心臓を回収し、ＰＢＳで緩衝化した１０％ホ
ルマリン中で一晩固定し、エタノール中で脱水し、キシレン次いでパラフィン中
に移した。パラフィンに包埋した心臓を、４μｍで切片化し、次いで慣用的な組
織化学的検査のためにヘマトキシリンおよびエオシンを用いてか、またはコラー
ゲンについてＭａｓｓｏｎトリクロム（ＷｏｏｄｓおよびＥｌｌｉｓ、１９９４
）を用いて染色した。

【０２０２】 （実施例２） （心臓遺伝子発現におけるＭＥＦ２の役割） （構造−機能研究） ４つの脊椎動物ＭＥＦ２遺伝子があり、その産物を図１
に示す。広範な変異分析により、ＭＥＦ２タンパク質の機能的ドメインが特徴付
けられている（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９５；Ｍａｒｔｉｎら、１９９３；
Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９６ａ；１９９６ｂ）。これらの研究は、Ｎ末端の
ＭＡＤＳ−ｂｏｘがＤＮＡ結合および二量体化を媒介することを示す。隣接する
ＭＥＦ２ドメインが、ＤＮＡ結合親和性に影響し、かつ筋原性ｂＨＬＨタンパク
質と相互作用し、そしてＭＥＦ２因子のＣ末端領域が、複数の独立の転写活性化
ドメインを含む。

【０２０３】 （ＭＥＦ２および筋原性ｂＨＬＨ因子による筋肉転写の協働的活性化） 骨格
筋系列において、ＭＥＦ２は、ｂＨＬＨ転写因子のＭｙｏＤファミリーのメンバ
ーと組み合わさって作用し、筋肉遺伝子転写を活性化する。ＭＥＦ２タンパク質
のＭＡＤＳ−ｂｏｘが、筋原性因子のｂＨＬＨ領域と直接相互作用することが示
されている（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９５）。このＭＥＦ２因子による筋肉
遺伝子発現のコンビナトリアル制御の生化学的モデルは、ＭＥＦ２が、すべての
タイプの筋原細胞、骨格、心臓および内臓の分化の必須コファクターであること
を示したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける遺伝的研究（Ｌｉｌｌｙら、１９９５；
Ｂｏｕｒら、１９９５）により支持されている。

【０２０４】 （ＭＥＦ２リン酸化） ホスホペプチドマッピング研究は、ＭＥＦ２因子が複
数のリン酸化部位を含むことを示す。ＭＡＤＳ−ｂｏｘ中のカゼインキナーゼＩ
Ｉ（ＣＫＩＩ）部位がＤＮＡに対するＭＥＦ２Ｃの親和性を増大することが示さ
れている（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９６ｃ）。この部位は、Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓからヒトに至る範囲の生物においてすべての既
知のＭＥＦ２タンパク質で保存されており、ＭＥＦ２機能に対するその重要性に
一致する。この部位が調節されたリン酸化を受けるか否かはまだ決定されていな
い。現在まで規定されたＭＥＦ２Ｃおよびリン酸化部位の略図を図３に示す。

【０２０５】 ＭＥＦ２Ｃの転写活性が、活性化ＰＫＣの存在下で劇的に増大されることもま
た示される。ＭＥＦ２ＣおよびＰＫＣの活性化形態の発現ベクターとともに、Ｍ
ＥＦ２依存レポーター遺伝子を用いた線維芽細胞のトランスフェクションは、Ｄ
ＮＡ結合における見かけの増加なくして、転写活性における１０倍以上の増加を
生じる。これらの結果は、ＭＥＦ２ＣがＰＫＣの特定の転写効果を媒介し得るこ
とを示唆する。

【０２０６】 （ＭＥＦ２遺伝子ノックアウト） 遺伝子標的化により、ＥＳ細胞およびトラ
ンスジェニックマウス中の４つのＭＥＦ２遺伝子が不活性化される。ＭＥＦ２Ｃ
を欠くマウスは、右心室の不在および血管系形成欠陥を含む重篤な心臓血管欠損
から、Ｅ９．５で死ぬ（Ｌｉｎら、１９９７）。さらに、α−ＭＨＣ、α−心臓
アクチン、およびＡＮＦを含む心臓収縮タンパク質遺伝子のサブセットが分化す
る心臓で発現されない。対照的に、ミオシン軽鎖２Ａおよび−２Ｖのようないく
つかのその他の心臓遺伝子は、ＭＥＦ２Ｃ変異体胚の心臓中正常レベルで発現さ
れ、これらはＭＥＦ２Ｃ依存性でなかったことが示された。これらの遺伝子もま
た、それらのプロモーター中に、必須のＭＥＦ２結合部位を含むので、ＭＥＦ２
ファミリーの別のメンバーが、ＭＥＦ２Ｃの不在下でそれらの発現を支持し得る
ようである。ＭＥＦ２Ｂは、初期の心臓でＭＥＦ２Ｃと同時発現され、そしてＭ
ＥＦ２Ｃ変異体胚中でアップレギュレートされ、それを、ＭＥＦ２Ｃと重複する
役割を部分的に演じるためのおそらく候補にする。心臓遺伝子のサブセットがＭ
ＥＦ２Ｃに依存するという知見は、筋肉遺伝子が、ＭＥＦ２ファミリーの異なる
メンバー間を識別し得ることを示す。

【０２０７】 （実施例３） （肥厚シグナル伝達によるインビトロのＭＥＦ２活性の誘導） Ｔ細胞におけるカルシウム依存性シグナル伝達経路に応答するＭＥＦ２の能力
を考慮して、本発明者らは、同一の経路がまた、心筋細胞においてＭＥＦ２を活
性化するか否かを調査した。図４に示されるように、活性化カルシノイリンまた
はＣａＭＫＩＶは、トランスフェクトされた心筋細胞において、ＭＥＦ２−依存
性ルシフェラーゼレポーター遺伝子をアップレギュレートし得、そして一緒にこ
れらのカルシウム感受性シグナル伝達酵素は、ＭＥＦ２依存性遺伝子発現を相乗
的に活性化する。ＤＮＡ結合アッセイでは、活性化カルシノイリンまたはＣａＭ
ＫＩＶに応答するＭＥＦ２ ＤＮＡ結合活性における増加は観察されず、ＭＥＦ
２転写活性化における増加が翻訳後の機構を反映することを示唆する。転写活性
化ドメイン（ＴＡＤ）を含むが、ＤＮＡ結合および二量体化に必要なＭＡＤＳお
よびＭＥＦ２ドメインを欠く、ＭＥＦ２ＣのＣ末端を、酵母転写因子ＧＡＬ４の
ＤＮＡ結合ドメインに融合するとき、得られるＧＡＬ４−ＭＥＦ２Ｃ融合タンパ
ク質は、カルシノイリンおよびＣａＭＫＩＶに対する感受性を保持する。このＧ
ＡＬ４−ＭＥＦ２Ｃ融合タンパク質はまた、肥厚アゴニストであるフェニルエフ
リン（ＰＥ）を用いる心筋細胞の刺激により活性化される。ともに、これらの結
果は、ＭＥＦ２Ｃの転写活性化ドメインが肥厚シグナル伝達経路の核の標的であ
ることを示す。

【０２０８】 （実施例４） （ＭＥＦ２指標マウスの作出） このインビトロアッセイは、ＭＥＦ２が、心筋細胞における肥厚シグナル伝達
経路の重要な下流標的であるという結論を支持する。これらの観察を、肥厚刺激
の時間経過が延長され、そしてインタクトな心臓の生理学が培養された心筋細胞
とは異なる、インビボセッティングに拡張するため、ｌａｃＺ移入遺伝子の活性
化による心臓中のＭＥＦ２活性化を忠実に示す、高感度かつ特異的マウス株を開
発した。これらのマウスは、デスミン（ｄｅｓｍｉｎ）遺伝子からのＭＥＦ２部
位の３つのタンデムコピーがヒートショックタンパク質（ｈｓｐ）−６８プロモ
ーターの上流にクローン化され、すべての細胞において基礎レベルで発現される
移入遺伝子、およびｌａｃＺレポーター（図５）を用いて作出した。この構築物
を作出するために用いたＭＥＦ２部位の配列は以下の通りである： ＧＧＣＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＡＴＡＡＡＴＡＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＴ
ＡＴＴＴＣＡ ＭＥＦ２部位には上記の配列で下線を引いてある。本発明者らは、この移入遺
伝子の発現パターンを、出生前および出生後生活を通じて特徴付けた。胚形成の
間、このＭＥＦ２部位依存性移入遺伝子は、発生する筋肉細胞系列中で発現され
（図６）、心臓、骨格、および平滑筋遺伝子発現の活性化にとってＭＥＦ２因子
の重要性と一致する。しかし、誕生後、この移入遺伝子の発現は、組織の比色ｌ
ａｃＺ染色により検出不能であるレベルまでダウンレギュレートされる。

【０２０９】 （実施例５） （活性化ＣａＭＫＩＶ発現に応答するインビボの心臓肥厚化） 初代心筋細胞において肥厚応答性プロモーターを誘導するＣａＭキナーゼＩお
よびＩＶの能力を考慮して、ＣａＭキナーゼシグナル伝達がまた、インビボで心
臓肥厚化を誘導し得るか否かを調査するために研究を拡大した。α−ＭＨＣプロ
モーターの制御下にある活性化ＣａＭＫＩＶをコードする移入遺伝子を用いてト
ランスジェニックマウスを生成した。

【０２１０】 α−ＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶ移入遺伝子を保持する４つの独立のマウス系列を得
た。３つの系列は、この移入遺伝子の単一コピーを持ち、そして１つの系列は、
３コピーを持っていた。原種トランスジェニックマウスをＣ５７ＢＬ／６マウス
に交配し、Ｆ１子孫を生成した。移入遺伝子発現は、外因性ＣａＭＫＩＶの３’
非翻訳領域に特異的なプローブを用いるノザン分析により決定した。これらのト
ランスジェニック系列の各々は、心臓で、ＣａＭＫＩＶ移入遺伝子を発現した。

【０２１１】 １ヶ月齢で開始したこれらマウスの心臓の試験は、劇的な拡大を示した。これ
らトランスジェニック動物の体重に対する心臓重量の比率は、１ヶ月齢で野生型
より再現可能に２倍大きく、そして心臓疾患の進行の速度は、４つのトランスジ
ェニック系列で同様であった。この移入遺伝子を推定５０コピー持つさらなるト
ランスジェニックマウスは、３週齢で死亡し、そして異常に膨張した心筋症を示
した。この動物における初期死滅性および生存可能な系列は、この移入遺伝子を
わずか１〜３コピー有していたという事実は、活性化ＣａＭＫＩＶが比較的低レ
ベルで寛容であり得るに過ぎない高度に潜在的な肥厚刺激物であることを示し得
る。

【０２１２】 トランスジェニック心臓の組織学的分析は、明らかな心筋細胞の膨大および組
織崩壊を示した（図７）。２ヶ月齢までに、広範な間質性線維症が、マッソン三
色染料によって観察された。心臓において活性化されたカルシニューリンを発現
し、そして８週齢までに拡張型心筋症を発症し、次いで、突然死の高い傾向にあ
るマウスと対照的に、α−ＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶは、拡張型心臓の表現型に進行
せず、そして正常な寿命を示した。肥大性増殖の程度はまた、カルシニューリン
トランスジェニックマウスと比較して、ＣａＭＫＩＶにおいて小さくかつその時
間経過は遅かった。

【０２１３】 （実施例６） （α−ＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶトランスジェニックマウスの心臓における胎児心
臓遺伝子の上方制御） 本発明者らは、心臓由来のＲＮＡのノーザン分析によって、ＣａＭＫＩＫトラ
ンスジェニックマウスにおけるいくつかの肥大応答性の心臓遺伝子の発現を試験
した。肥大性のトランスジェニック心臓において、ＡＮＦ転写物は上方制御され
たが、α−ＭＨＣ転写物は下方制御され、これは、肥大性の心臓において生じる
ことが公知の遺伝子発現における変化と一致する。ＧＡＰＤＨ転写物を、サンプ
ルの等価量のＲＮＡロードを確認するために測定した。

【０２１４】 （実施例７） （α−ＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶトランスジェニックマウスにおける変化した心臓
機能） 経胸壁超音波心臓図検査を使用して、α−ＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶトランスジェ
ニックマウスにおいて、心臓機能を特徴付けた。表１に要約されるように、コン
トロールの同腹仔と比較して、トランスジェニックにおいて、左心室質量におけ
る劇的かつ統計学的に有意な増加およびそれに付随する部分的短縮（ｆｒａｃｔ
ｉｏｎａｌ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）の減少が存在した。これらの変化は、肥大
が心不全へ進行することを示す。

【０２１５】 （表１．超音波心臓図検査分析）

【０２１６】

【表１】 （実施例８） （ＣａＭＫＩＶはインビボでＭＥＦ２の転写活性を増強する） 本発明者らは、ＣａＭＫＩＶが、トランスフェクトされた心筋細胞におけるＭ
ＥＦ２因子の転写活性を刺激することを、先に見い出した。インビボでのインタ
クトな心臓におけるＣａＭＫＩＶの活性化もまた、ＭＥＦ２の転写活性における
増加を導くか否かを決定するために、高い親和性のＭＥＦ２部位の３つの直列コ
ピーの制御下にｌａｃＺレポーター遺伝子を保有する、トランスジェニックマウ
ス系統を使用した。このＭＥＦ２依存性のレポーター遺伝子の発現は、胚形成の
間での転写的に活性なＭＥＦ２タンパク質の発現を反映するが、出生後、このト
ランスジーンの発現は、低レベルに減少する。これはおそらく、ＭＥＦ２タンパ
ク質もまた、この段階で活性が低下するからである（Ｎａｙａら、１９９９）。

【０２１７】 成体心臓において、このＭＥＦ２依存性ｌａｃＺトランスジーンは、基底レベ
ルで発現される。しかし、このトランスジーンが、α−ＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶト
ランスジーンを有するトランスジェニック系統内に導入された場合、ｌａｃＺ発
現は、肥大に伴って、劇的に上方制御された（図８）。定量的β−ガラクトシダ
ーゼアッセイは、この肥大性の心臓におけるＭＥＦ２の転写活性における１００
倍を超える増加を示した。

【０２１８】 ＭＥＦ２−ｌａｃＺ発現の上方制御が、ＣａＭＫＩＶシグナル伝達に対する特
異的な応答であるかまたは肥大に対する一般的な応答であるかを決定するために
、このＭＥＦ２指標マウスを、α−ＭＨＣ−カルシニューリントランスジーンを
保有するマウス系統と交配させた。これらのマウスにおける肥大の程度は、Ｃａ
ＭＫＩＶトランスジェニックにおける程度より、はるかにより明らかであり、心
臓は、２ヶ月齢までに正常よりも約３倍大きく膨大された。ＣａＭＫＩＶトラン
スジェニックマウスの心臓全体にわたるｌａｃＺトランスジーンの劇的かつ均等
な活性化とは対照的に、カルシニューリントランスジェニックマウスにおいて、
ｌａｃＺ発現は、心筋細胞の散在したクラスターにおいてのみ観察された。従っ
て、カルシニューリンが、ＣａＭＫＩＶよりも、はるかにより強力な肥大の誘導
物質であるという事実にも関わらず、カルシニューリンは、ＭＥＦ２−ｌａｃＺ
トランスジーンのはるかに弱い誘導物質であった。本発明者らは、ＭＥＦ２が、
インタクトな心臓においてＣａＭＫＩＶシグナル伝達に特異的に応答すると結論
付ける。

【０２１９】 （実施例９） （ＣａＭＫＩＶはＤＮＡ結合活性に影響することなくＭＥＦ２の転写活性を刺
激する） ＣａＭＫＩＶに応答するＭＥＦ２依存性ｌａｃＺトランスジーンの発現におけ
る増加は、ＭＥＦ２タンパク質の増加または既存のＭＥＦ２タンパク質の転写活
性の増加を反映し得た。これらの可能性を見分けるために、ウエスタンブロット
およびゲル易動度シフトアッセイを、野生型およびＣａＭＫＩＶトランスジェニ
ックの同腹仔の心臓から抽出した核を用いて行った。ＭＥＦ２ ＤＮＡ結合活性
のレベルは、野生型、ＣａＭＫＩＶトランスジェニックおよびカルシニューリン
トランスジェニック由来の心臓抽出物において比較可能であった。これらの結果
は、ＭＥＦ２の初期心臓由来の結果と一致する。従って、ＭＥＦ２は、２つの異
なるドメインを介して肥大シグナルを受け取り、そしてその後、下流の肥大遺伝
子を活性化する。

【０２２０】 （実施例１０） （酵母ツーハイブリッド系を用いるＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５のＭＥＦ２相
互作用領域の局在化） 酵母ツーハイブリッド系を使用して、本発明者らは、ＭＥＦ２／ＨＤＡＣ４お
よびＨＤＡＣ５の結合領域を局在化した。このツーハイブリッドスクリーニング
において使用したＭＥＦ２ベイト（ｂａｉｔ）は、ＧＡＬ４−ＭＥＦ２（１−８
６）およびＭＥＦ２（１−１１７）−ＧＡＬ４であった（図９Ａ）。図９Ａは、
このツーハイブリッドスクリーニングの「プレイ（ｐｒｅｙ）」としてレスキュ
ーされるｃＤＮＡによってコードされる、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５ならびに
異なる領域のタンパク質を示す。ＨＤＡＣ４および５の両方のＮ末端ドメインに
おける１８アミノ酸領域は、ＭＥＦ２結合ドメインを含む。このドメインは、Ｈ
ＤＡＣ１、２、３および６には存在しない（図１０）。

【０２２１】 （実施例１１） （ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５はＭＥＦ２に結合しそしてＭＥＦ２活性を抑制
する） Ｃｏｓ細胞を、示されるように、Ｆｌａｇエピトープを有するＨＤＡＣをコー
ドする発現ベクターおよびＭＥＦ２ Ａ、ＣまたはＤをコードする発現ベクター
で、一過的にトランスフェクトした。次いで、細胞を溶解し、そして抽出物を抗
Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降し、その後、抗ＭＥＦ２または抗Ｆｌａｇでウエスタン
ブロットを行った（図１２）。上パネルは、抗ＭＥＦ２ウエスタンブロットの結
果を示す。ＨＤＡＣ４および５は、各ＭＥＦ２因子と相互作用するが、ＨＤＡＣ
１および３は、相互作用しなかった。下パネルは、抗Ｆｌａｇウエスタンブロッ
トの結果を示し、各抽出物中の比較可能な量の外因性ＨＤＡＣタンパク質の存在
を実証する。これらの結果は、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５の両方がＭＥＦ２と
相互作用することを示す。この実験の概略図を、その下に示す。

【０２２２】 同様に、Ｃｏｓ細胞を、Ｆｌａｇエピトープを有する、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ
５またはＮ末端を欠いている欠失変異体（ＨＤＡＣ ５−ΔＮ）をコードする発
現ベクターおよびＭＥＦ２Ｃをコードする発現ベクターで、一過的にトランスフ
ェクトした。次いで、細胞を溶解し、そして抽出物を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降
し、その後、抗ＭＥＦ２ウエスタンブロットを行った（図１３）。上パネルは、
抗Ｆｌａｇ免疫沈降、その後の抗ＭＥＦ２ウエスタンブロットの結果を示す。下
パネルは、免疫沈降反応を伴わない、抗ＭＥＦ２ウエスタンブロットの結果を示
し、これは、各抽出物中の比較可能な量の外因性ＨＤＡＣタンパク質の存在を実
証する。これらのデータは、ＨＤＡＣ５のＮ末端が、ＨＤＡＣ５とＭＥＦ２との
間の相互作用に必要とされることを実証する。この実験の概略図を、その下に示
す。

【０２２３】 別の例において、Ｃｏｓ細胞を、その示されたＭＥＦ２因子をコードする発現
ベクター、ＨＤＡＣアイソフォームまたはアミノ末端ＭＥＦ２結合ドメインを欠
失しているＨＤＡＣ５をコードする発現ベクターと共に、ＭＥＦ２レポータープ
ラスミド（ＭＥＦ２×２−ルシフェラーゼ）で、一過的にトランスフェクトした
（図１４）。これらのデータは、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５が、ＭＥＦ２Ａ、
ＭＥＦ２ＣおよびＭＥＦ２Ｄの転写活性を抑制することを実証する。ＶＰ１６で
のＭＥＦ２転写活性化ドメインの置換は、ＨＤＡＣが抑制する能力を減少する。
また、アミノ末端を欠失するＨＤＡＣ５（ＨＤＡＣ ５ΔＮ）は、抑制すること
ができない。

【０２２４】 異なるシグナル伝達経路によるＭＥＦ２の活性化に対するＨＤＡＣ５の効果を
調査した。１０Ｔ１／２線維芽細胞を、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインに融合し
た全長ＭＥＦ２Ｃ（ＧＡＬ−ＭＥＦ２Ｃ）をコードする発現ベクターおよび示し
たシグナル伝達分子をコードするベクターと共に、ＧＡＬ４−依存性ルシフェラ
ーゼレポーター（Ｇ５−ｌｕｃ）で、一過的にトランスフェクトした。２日後、
細胞を収集し、そしてルシフェラーゼ活性を測定した（図１５）。ＨＤＡＣ５が
、ＭＫＫ６、カルシニューリン（ＣＮ）およびＣａＭキナーゼに応答してＭＥＦ
２活性化をブロックすることが観察された。

【０２２５】 活性化ＣａＭＫＩＶおよびＭＡＰキナーゼＭＫＫ６が、ＭＥＦ２Ｃの異なるド
メインを活性化することもまた実証した。１０Ｔ１／２細胞を、示したＨＤＡＣ
の存在下で、ＧＡＬ４−依存性ルシフェラーゼレポーターおよびＧＡＬ４に融合
した全長ＭＥＦ２Ｃ（ＧＡＬ４−ＭＥＦ２Ｃ）またはＧＡＬ４に融合したカルボ
キシル末端活性化ドメイン（ＧＡＬ４−ＭＥＦ２Ｃ−ＴＡＤ）で、一過的にトラ
ンスフェクトした（図１６）。ＨＤＡＣ４およびＨＡＤＣ５は、全長ＭＥＦ２Ｃ
を抑制するが、ＭＥＦ２Ｃ転写活性化ドメインを抑制しない。なぜなら、ＭＥＦ
２Ｃ転写活性化ドメインは、ＨＤＡＣ結合モチーフを欠失しているからである。

【０２２６】 肥大シグナルによるＭＥＦ２−ＨＤＡＣ相互作用の崩壊を示す概略図を、図１
７に示す。ＭＥＦ２へのＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５の結合は、心筋細胞におけ
るＭＥＦ２依存性遺伝子の抑制を生じる。ＣａＭキナーゼを活性化する肥大シグ
ナルでの心筋細胞の刺激時に、ＨＤＡＣ４およびＨＡＤＣ５は、ＭＥＦ２から解
離され、そして下流の遺伝子が活性化され、これが、肥大を導く。

【０２２７】 （実施例１２） （ＨＤＡＣの細胞内局在） 本発明者らは、ＣａＭキナーゼシグナル伝達の活性化が、ＭＥＦ２活性を刺激
し、そしてＨＤＡＣの阻止効果に打ち勝つことを示した。免疫沈降実験において
、本発明者らはまた、活性化されたＣａＭキナーゼが、ＨＤＡＣをＭＥＦ２から
解離することによって作用し、これによって、ＭＥＦ２が、増殖および肥大に関
与するその標的遺伝子に対してスイッチを入れることが可能になることを示す。
欠失マッピング実験は、ＨＤＡＣが、ＣａＭキナーゼシグナルに対する標的であ
ることを示した。ＭＥＦ２のＨＤＡＣ媒介抑制を打ち勝ってそしてＨＤＡＣ−Ｍ
ＥＦ２複合体を解離させる活性化されたＣａＭＫの能力を考慮して、本発明者ら
は、ＣａＭＫシグナル伝達がまた、ＨＤＡＣ５の細胞内分布を変更するか否かを
さらに調査することを選択した（図１９）。

【０２２８】 活性化されたＣａＭＫの非存在下で、ＭＥＦ２ＣおよびＨＤＡＣ５は、核にお
いて排他的に同時発現される。対照的に、ＣａＭＫＩまたはＣａＭＫＩＶの活性
形態を構成的に発現する細胞においては、ＨＤＡＣ５は、細胞質中にあった。Ｍ
ＥＦ２Ｃは、ＣａＭＫ発現細胞中で核に保持され、これは、ＣａＭＫシグナル伝
達が、ＭＥＦ２−ＨＤＡＣ複合体の崩壊し、そしてＭＥＦ２依存性転写を刺激す
るという知見と一致する。

【０２２９】 原理的には、ＨＤＡＣ５の核からの排除は、核への移入の阻害または核からの
搬出の刺激を生じ得る。これらの可能性を見分けるために、ＨＤＡＣ５−グリー
ン経口タンパク質（ＧＦＰ）キメラ分子の細胞内分布を、レプトマイシンＢ（Ｌ
ｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｂ）（核からの搬出をブロックする真菌毒素）に曝した細
胞においてモニターした。ＣａＭＫ１発現細胞において、ＨＤＡＣ５は、細胞質
に局在される。レプトマイシンＢでのＣａＭＫ１発現細胞の処理は、４時間の時
間経過での、細胞質から核へのＨＤＡＣ５のトランスロケーションを生じる。こ
れらの結果は、核への移入が、ＣａＭＫシグナル伝達によって影響されないこと
を実証し、そしてＣａＭＫシグナル伝達が、ＨＤＡＣ５の核からの搬出を刺激す
ることを示す。

【０２３０】 核局在およびＣａＭＫシグナル伝達に対する応答を制御するＨＤＡＣ５におけ
る配列を同定するために、本発明者らは、ＨＤＡＣ５の一連のカルボキシル末端
短縮変異体を作製し、間接的な免疫蛍光によってそれらの細胞内分布を試験した
。約１８個の変異体の分析は、ＣａＭＫ依存性の核からの搬出を担う残基２５９
と６６１との間の特定の領域を局在化した。広範な変異誘発と組み合わせた、リ
ン酸化マッピング実験は、ＨＤＡＣ５の３つの重要なリン酸化部位（セリン２５
９、４９８および６６１）を同定し、これらは、ＣａＭＫ活性化に応答してリン
酸化され得る。その後の変異誘発実験は、セリン４９８が、ＭＥＦ２からのＨＤ
ＡＣの脱離、およびその後のＣａＭＫ依存性リン酸化を担う、重要なアミノ酸で
あることを実証した（図２０）。

【０２３１】 ＣａＭＫ依存性リン酸化およびＭＥＦ２からのＨＤＡＣ５の解離を調節する機
構を調査するために、本発明者らは、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５のアミノ末端
部分を、酵母におけるｃＤＮＡライブラリーのツーハイブリッドスクリーニング
における「ベイト」として使用し、相互作用調節タンパク質を見い出した。これ
らの研究は、シャペロンタンパク質１４−３−３の異なるアイソフォームをコー
ドする、１００を超えるｃＤＮＡの同定を得た。前の研究は、１４−３−３タン
パク質が、ホスホセリン残基に結合し、そして従って、細胞内リン酸化依存性シ
ャペロンタンパク質として作用することを実証した。さらなる変異分析は、１４
−３−３が、ＨＤＡＣ５がセリン２５９および４９８でリン酸化された場合に、
ＨＤＡＣ５を結合することを示した。１４−３−３はまた、リン酸化された残基
６６１（これは、酵母において構成的にリン酸化されるようであり、従って、こ
の相互作用の初期の検出を担った）を認識する。

【０２３２】 本発明者らの現在のモデルに従って、ＨＤＡＣ５は、ＭＥＦ２との複合体とし
て核に存在し、ＭＥＦ２依存性遺伝子を抑制する。ＣａＭＫシグナルを受け取る
と、ＨＤＡＣ５は、残基４９８でリン酸化され、これが、そのＭＥＦ２との会合
を妨げ、そしてその１４−３−３との会合を可能にする。次いで、１４−３−３
への結合は、核から細胞質へＨＤＡＣ５のエスコートに必須である（図２１）。

【０２３３】 これらの実験は、ＣａＭＫを含む肥大シグナルがＭＥＦ２を活性化し得る機構
の、正確な分子的詳細を指摘した。これらはまた、ＨＤＡＣ５キナーゼについて
のアッセイ、および抗肥大性のこのようなキナーゼのインヒビターを同定するた
めの高スループット化学スクリーニングを示唆する。このタイプのアッセイの模
式図を、図２２に示す。このアッセイに従って、２５９位および４９８位のセリ
ン残基を含むＨＤＡＣ５の領域を、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインに融合し、そ
してベイトとして使用する。次いで、この構築物を、ＧＡＬ４結合部位を使用し
てＬａｃＺレポーターならびに陽性または陰性の選択マーカーの発現を駆動する
、酵母スクリーン中に発現させる。ＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合した１４
−３−３を含むプラスミドもまた、酵母株内に導入されるが、これらは、ＨＤＡ
Ｃ５「ベイト」と会合することができない。なぜなら、ＨＤＡＣ５中のセリン３
５９および４９８は、おそらく酵母においてリン酸化されないからである。従っ
て、１４−３−３「プレイ」とＨＤＡＣ「ベイト」との間の相互作用は、リン酸
化を必要とする。ヒト心臓由来のｃＤＮＡライブラリーの酵母への導入は、１４
−３−３とＨＤＡＣとの間の相互作用を再構成する能力に基づいて、ＨＤＡＣを
リン酸化するキナーゼを同定する。さらに、この同じ系が、高スループット薬物
スクリーニングに使用され、この同じ相互作用を錯乱させる抗肥大性化合物を同
定し得る。

【０２３４】 本明細書中に開示および特許請求した組成物および方法の全ては、本発明の開
示を考慮して過度の実験を伴うことなく行われ得、そして完成され得る。本発明
の組成物および方法は、好ましい実施形態について記載されたが、これらの組成
物および方法、ならびに本明細書中に記載される方法の工程または工程の順序に
対して、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく改変がなされ得るこ
とが、当業者に明らかである。より詳細には、化学的および物理的の両方で関連
する特定の薬剤が、本明細書中に記載の薬剤と置換され得、同じまたは類似の結
果が達成されることが明らかである。当業者に明らかである全てのこのような類
似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲に定義されるように、本発明の精
神、範囲および概念内にあるとみなされる。

【０２３５】 （参考文献） 以下の参考文献は、これらが本明細書中上記に示されるものを補充する、例示
的な手順または他の詳細を提供する程度まで、本明細書中に参考として詳細に援
用される。 米国特許第５，３５９，０４６号 米国特許第４，３６７，１１０号 米国特許第４，４５２，９０１号 米国特許第４，６６８，６２１号 米国特許第４，８７３，１９１号 米国特許第５，７０８，１５８号 米国特許第５，２５２，４７９号 米国特許第５，６７２，３４４号 ＷＯ８４／０３５６４。

【０２３６】

【表２】 以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに
実証するために含まれる。本発明は、これらの図面のうちの１以上を、本明細書
中に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによっ
て、より良好に理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＭＥＦ２イソ型の模式図。

【図２】 ＭＥＦ２活性を調節するカルシウム依存性シグナル伝達系。種々の細胞外刺激
は、細胞内カルシウムの上昇をもたらし、これにより、カルシニューリン、ＣＡ
Ｍキナーゼ、ＰＫＣおよびＭＡＰキナーゼを含む、複数の細胞内シグナル伝達系
が活性化される。これらのシグナルは全てＭＥＦ２を活性化し、そして心肥大を
もたらす。

【図３】 ＭＥＦ２Ｃにおける既知のリン酸化部位の位置。

【図４】 ＣａＭＫＩＶおよびカルシニューリンは相乗作用して、ＭＥＦ２依存性レセプ
ター遺伝子を活性化する。

【図５】 ＭＥＦ２依存性ｌａｃＺレセプター遺伝子の図。デスミン遺伝子からの３つの
タンデムコピーのＭＥＦ２結合部位が、ｈｓｐ６８プロモーターの制御下でｌａ
ｃＺレポーターの上流にクローニングされた。

【図６】 ＭＥＦ２部位依存性ｌａｃＺ導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウス
胚のｌａｃＺ染色。ＭＥＦ２−ｌａｃＺ導入遺伝子を用いて、トランスジェニッ
クマウスの系統を作製した。ｌａｃＺ発現について染色した、Ｅ１０．５のトラ
ンスジェニックマウス胚を示す。

【図７】 野生型マウスおよびａＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶマウスの心臓の組織学的切片。非
トランスジェニックマウスおよびａＭＨＣ−ＣａＭＫＩＶトランスジェニックマ
ウスを８週齢で屠殺し、心臓を切片化し、そしてＨ＆Ｅで染色した。ａＭＨＣ−
ＣａＭＫＩＶ系統においては少なくとも２倍の心臓拡張が存在する。ｌｖ、左心
室；ｒｖ，右心室。

【図８】 ｌａｃＺについて染色したＭＥＦ２インジケーターマウス由来の心臓。左の心
臓は、正常マウス由来であり、そして右の心臓は、α−ミオシン重鎖プロモータ
ーの制御下で心臓において特異的に発現される、活性化されたＣａＭＫＩＶ導入
遺伝子を保有するマウス由来である。ｌａｃＺ発現は、ＣａＭＫＩＶトランスジ
ェニック心臓において特異的に活性化される。このことは、ＭＥＦ２活性化が、
インビボでのＣａＭＫＩＶシグナル伝達経路において下流の工程であることを実
証する。

【図９】 図９Ａおよび図９Ｂ。酵母ツーハイブリッド系での、ＨＤＡＣ ４およびＨＤ
ＡＣ ５のＭＥＦ２相互作用領域の位置決定。Ａ）ツーハイブリッドスクリーニ
ングにおいて使用したＭＥＦ２ベイト（ｂａｉｔ）の模式図；ＧＡＬ４−ＭＥＦ
２（１−８６）およびＭＥＦ２（１−１１７）−ＧＡＬ４。（Ｂ）ツーハイブリ
ッドスクリーニングにおいて「プレイ（ｐｒｅｙ）」としてレスキューされたｃ
ＤＮＡによってコードされるこのタンパク質のＨＤＡＣ ４およびＨＤＡＣ ５
、ならびに種々の領域の模式図。レスキューされたＨＤＡＣ ｃＤＮＡは、その
アミノ末端可変領域において黒く示した１８アミノ酸領域（それぞれ、ＨＤＡＣ
４およびＨＤＡＣ ５の残基１６３〜１８０および１７５〜１９２）が重複し
ている。ＨＤＡＣ触媒ドメインは、このタンパク質の極くＣ末端に位置する。

【図１０】 ＨＤＡＣタンパク質の模式図。６つの異なるＨＤＡＣが脊椎動物生物からクロ
ーニングされた。全てのものが、触媒領域における相同性を共有する。ＨＤＡＣ
４およびＨＤＡＣ ５は、他のＨＤＡＣには見出されない独特のアミノ末端伸
長部を有する。このアミノ末端領域は、ＭＥＦ２結合ドメインを含む。

【図１１】 遺伝子発現の制御におけるヒストンアセチラーゼおよびデアセチラーゼの役割
の模式図。ヒストンアセチラーゼ（ＨＡ）の活性とデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）
の活性との間の平衡が、ヒストンアセチル化のレベルを決定する。アセチル化さ
れたヒストンは、クロマチンの弛緩および遺伝子転写の活性化を引き起こし、一
方、脱アセチル化されたクロマチンは一般に、転写的に不活性である。ＨＡおよ
びＨＤＡＣ複合体の種々のタンパク質成分を示す。

【図１２】 ＨＤＡＣ ４およびＨＤＡＣ ５とＭＥＦ２因子とのインビボでの免疫共沈。
Ｃｏｓ細胞を、示したようなＦｌａｇエピトープを有するＨＤＡＣ、およびＭＥ
Ｆ２ Ａ、ＭＥＦ２ ＣまたはＭＥＦ２ Ｄをコードする発現ベクターで一過的
にトランスフェクトした。次いで、細胞を溶解し、そして抽出物を抗Ｆｌａｇ抗
体で免疫沈降し、次いで、抗ＭＥＦ２ウェスタンブロットまたは抗Ｆｌａｇウェ
スタンブロットを行った。上のパネルは、抗ＭＥＦ２ウェスタンブロットの結果
を示す。ＨＤＡＣ ４およびＨＤＡＣ ５は、各ＭＥＦ２因子と相互作用するが
、ＨＤＡＣ １もＨＤＡＣ ３も、相互作用しない。下のパネルは、抗Ｆｌａｇ
ウェスタンブロットの結果を示し、そして各抽出物中の匹敵する量の外因性ＨＤ
ＡＣタンパク質の存在を実証する。この実験の模式図を、下に示す。

【図１３】 ＨＤＡＣ ５の、ＭＥＦ２Ｃとの免疫共沈は、ＨＤＡＣ ５のＮ末端を必要と
する。Ｃｏｓ細胞を、ＦｌａｇエピトープおよびＭＥＦ２Ｃとともに、ＨＤＡＣ
４、ＨＤＡＣ ５またはＮ末端を欠く欠失変異体（ＨＤＡＣ ５−ＤＮ）をコ
ードする発現ベクターで一過的にトランスフェクトした。次いで、細胞を溶解し
、そして抽出物を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫共沈し、その後抗ＭＥＦ２ウェスタンブ
ロットを行った。上のパネルは、抗Ｆｌａｇ免疫共沈、その後の抗ＭＥＦ２ウェ
スタンブロットの結果を示す。下のパネルは、免疫沈降反応を伴わない抗ＭＥＦ
２ウェスタンブロットの結果を示し、そして各抽出物中の匹敵する量の外因性Ｈ
ＤＡＣタンパク質の存在を実証する。この実験の模式図を下に示す。

【図１４】 図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃおよび１４Ｄ。ＨＤＡＣ ４およびＨＤＡＣ
５によるＭＥＦ２活性の抑制。示されたＭＥＦ２因子、ＨＤＡＣイソ型またはア
ミノ末端ＭＥＦ２結合ドメインを欠くＨＤＡＣ ５をコードする発現ベクターと
ともに、ＭＥＦ２レポータープラスミドであるＭＥＦ２ｘ２−ルシフェラーゼで
一過的にトランスフェクトされたＣｏｓ細胞。ＨＤＡＣ ４およびＨＤＡＣ ５
は、ＭＥＦ２Ａ、ＭＥＦ２ＣおよびＭＥＦ２Ｄの転写活性を抑制する。ＶＰ１６
によるＭＥＦ２転写活性化ドメインの置換は、ＨＤＡＣの抑制能を低下させる。
アミノ末端を欠くＨＤＡＣ ５（ＨＤＡＣ ５ＤＮ）は抑制することができない
。

【図１５】 異なるシグナル伝達経路によるＭＥＦ２の活性化に対するＨＤＡＣ ５の効果
。１０Ｔ１／２線維芽細胞を、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインに融合した全長Ｍ
ＥＦ２Ｃ（ＧＡＬ−ＭＥＦ２Ｃ）をコードする発現ベクターおよび示したシグナ
ル伝達分子をコードするベクターと一緒にＧＡＬ４依存性ルシフェラーゼレポー
ター（Ｇ５−ｌｕｃ）で一過的にトランスフェクトした。２日後、細胞を収集し
、そしてルシフェラーゼ活性を測定した。ＨＤＡＣ ５は、ＭＫＫ６、カルシニ
ューリン（ＣＮ）およびＣａＭキナーゼに応答してＭＥＦ２活性化をブロックす
る。

【図１６】 活性化されたＣａＭＫＩＶおよびＭＡＰキナーゼＭＫＫ６は、ＭＥＦ２Ｃの異
なるドメインを活性化する。１０Ｔ１／２細胞を、ＧＡＬ４依存性ルシフェラー
ゼレポーターおよびＧＡＬ４に融合した全長ＭＥＦ２Ｃ（ＧＡＬ４−ＭＥＦ２Ｃ
）またはＧＡＬ４に融合したカルボキシル末端トランス活性化ドメイン（ＧＡＬ
４−ＭＥＦ２Ｃ−ＴＡＤ）で、示したＨＤＡＣの存在下で一過的にトランスフェ
クトした。ＨＤＡＣ ４およびＨＤＡＣ ５は、全長ＭＥＦ２Ｃを抑制するが、
ＭＥＦ２Ｃ転写活性化ドメインを抑制しない。なぜなら、これは、ＨＤＡＣ結合
モチーフを欠くからである。

【図１７】 肥大シグナルによるＭＥＦ２−ＨＤＡＣ相互作用の破壊を示す模式図である。
ＭＥＦ２に対するＨＤＡＣ ４またはＨＤＡＣ ５の結合は、心筋細胞における
ＭＥＦ２依存性遺伝子の抑制をもたらす。ＣａＭキナーゼを活性化する肥大シグ
ナルでの心筋細胞の刺激によって、ＨＤＡＣ ４およびＨＤＡＣ ５は、ＭＥＦ
２から解離され、そして下流の遺伝子が活性化されて、肥大をもたらす。

【図１８】 ＮＦＡＴおよびＭＥＦ２の活性化をもたらす、平行肥大シグナル伝達経路の模
式図。

【図１９】 ＣａＭＫシグナル伝達に応答したＨＤＡＣ ５の核輸送。エピトープタグ化Ｈ
ＤＡＣ ５およびＭＥＦ２Ｃを発現する細胞を、免疫蛍光によって分析した。Ｃ
ａＭＫの非存在下で、ＨＤＡＣ ５およびＭＥＦ２は核において会合している。
しかし、ＣａＭＫＩが活性化されている細胞においては、ＨＤＡＣ ５は核から
排除され、そしてＭＥＦ２は核に局在したままである。

【図２０】 重要なリン酸化部位の位置を伴った、ＨＤＡＣ ５の模式図。核局在化配列（
ＮＬＳ）およびカルボキシル末端ＨＤＡＣドメインの位置を伴ったＨＤＡＣ ５
の図を示す。セリン２５９、４９８および６６１は各々リン酸化され得、そして
１４−３−３を補充する。セリン４９８は、リン酸化後のＨＤＡＣからのＭＥＦ
２の解離を担う。

【図２１】 ＨＤＡＣによるＣａＭＫシグナル伝達およびＭＥＦ２活性の調節に関与する事
象の図。ＨＤＡＣ ５とＭＥＦ２との会合は、胎仔筋肉遺伝子および他の肥大遺
伝子の提示をもたらす。ＣａＭＫシグナル伝達は、ＨＤＡＣ ５をリン酸化して
、ＭＥＦ２とのその会合を妨げる。一旦リン酸化されると、ＨＤＡＣ ５は、核
において１４−３−３と係合して、これは次いで、細胞質への核輸送をもたらす
。ＨＤＡＣ ５ホスファターゼはおそらく、その細胞質においてＨＤＡＣ ５に
対する重要な残基からリン酸基を除去して、このタンパク質の核への再度の侵入
をもたらす。この経路は、ＨＤＡＣリン酸化および１４−３−３相互作用を介し
たＭＥＦ２活性化の制御の複数の調節点を同定する。

【図２２】 肥大シグナル伝達およびＭＥＦ２活性化のインヒビターを検出するためのアッ
セイの模式図。このアッセイに従って、ＨＤＡＣ ５は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合
ドメインに融合される。この構築物は、組み込まれた、ＬａｃＺについてのレポ
ーター遺伝子ならびに他の正または負の選択マーカーを保有する酵母において発
現される。１４−３−３がＧＡＬ４の活性化ドメインに融合されている、第２の
構築物が作製される。酵母におけるこの構築物の発現は、組み込まれたマーカー
遺伝子を活性化しない。なぜなら、これは、非リン酸化ＨＤＡＣ ５−ＧＡＬ４
と係合できないからである。次いで、この酵母株を用いて、ＨＤＡＣ ５のリン
酸化の際に、これを１４−３−３に係合することができて、選択マーカーの活性
化をもたらすＨＤＡＣキナーゼについてスクリーニングする。次いで、このよう
なキナーゼは、リン酸化の阻害の結果として、１４−３−３とＨＤＡＣ ５との
間のタンパク質−タンパク質相互作用を妨げる、化学インヒビターについてスク
リーニングされ得る。このようなインヒビターは、心肥大のインヒビターとして
作用すると予想される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ Ａ６１Ｐ 9/00 1/54 Ｃ１２Ｑ 1/48 1/66 1/54 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/66 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ル， ジアンロン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02169， クインシー， エルム ストリ ート ナンバーエイ11 123 (72)発明者 マッキンセイ， ティモシー エイ． アメリカ合衆国 テキサス 75220， ダ ラス， クローバー レーン 3884 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA35 BB14 BB22 BB24 BB51 CB01 CB17 DA13 DA36 FB01 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA10 CA04 CA12 DA02 DA12 EA04 HA08 HA15 HA17 4B063 QA01 QA08 QA19 QQ02 QQ08 QQ26 QQ44 QQ48 QQ58 QQ95 QR01 QR06 QR14 QR20 QR31 QR32 QR33 QR56 QR58 QR59 QR62 QR63 QR72 QR77 QS05 QS40 QX02 4C084 AA02 AA13 AA17 BA01 BA08 BA23 BA35 BA44 CA17 CA18 DC01 MA02 NA13 NA14 ZA362 4C087 AA01 BC83 CA12 MA02 NA13 NA14 ZA36

Claims (83)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 心肥大のインヒビターを同定するための方法であって、以下
   ： （ａ）ＨＤＡＣ４酵素またはＨＤＡＣ５酵素の供給源を提供する工程； （ｂ）該酵素を候補物質と接触させる工程； （ｃ）工程（ｂ）における該酵素機能を決定する工程；および （ｄ）工程（ｃ）における該酵素機能を、該候補物質の非存在下における該
   酵素の酵素機能と比較する工程、 を含み、ここで、該候補物質の非存在下における酵素機能と比較した場合の、該
   候補物質の存在下における増加した酵素機能が、心肥大のインヒビターとして該
   候補物質を同定する、方法。
2. 【請求項２】 前記酵素が精製ＨＤＡＣ４にある、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記酵素が精製ＨＤＡＣ５にある、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記酵素がＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５の混合物である、請
   求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記混合物が心臓細胞中である、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記心臓細胞が実験動物中である、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記酵素機能が、インビトロ脱アセチル化反応によって決定
   される、請求項２に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記酵素機能が、インビトロ脱アセチル化反応によって決定
   される、請求項３に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記酵素機能が、前記細胞中のヒストンアセチル化状態によ
   って決定される、請求項５に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記酵素機能が、前記動物の前記心臓細胞中のヒストンア
    セチル化状態によって決定される、請求項６に記載の方法。
11. 【請求項１１】 心臓細胞中の遺伝子発現のモジュレーターを同定するため
    の方法であって、以下： （ａ）ＭＥＦ２のＨＤＡＣ結合領域を提供する工程； （ｂ）該ＭＥＦ２のＨＤＡＣ結合領域をＨＤＡＣ４のＭＥＦ２結合領域また
    はＨＤＡＣ５のＭＥＦ２結合領域および候補物質と接触させる工程； （ｃ）工程（ｂ）における該結合を決定する工程；ならびに （ｄ）工程（ｃ）における該結合を、該候補物質の非存在下における該ＭＥ
    Ｆ２のＨＤＡＣ結合領域とＨＤＡＣ４のＭＥＦ２結合領域またはＨＤＡＣ５のＭ
    ＥＦ２結合領域との結合と比較する工程、 を含み、ここで、該候補物質の存在下の結合と非存在下の結合との間の差異が、
    心臓遺伝子発現のモジュレーターとして該候補物質を同定する、方法。
12. 【請求項１２】 前記ＭＥＦ２のＨＤＡＣ結合領域がＭＥＦ２の１〜８６を
    含む、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記ＭＥＦ２のＨＤＡＣ結合領域がＭＥＦ２の残基１〜１
    １７を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記ＭＥＦ２のＨＤＡＣ結合領域がＭＥＦ２の全長を含む
    、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記ＨＤＡＣ４のＭＥＦ２結合領域または前記ＨＤＡＣ５
    のＭＥＦ２結合領域が、ＨＤＡＣ４の残基１６３〜１８０またはＨＤＡＣ５の残
    基１７５〜１９２を含む、請求項１１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記ＨＤＡＣ４のＭＥＦ２結合領域または前記ＨＤＡＣ５
    のＭＥＦ２結合領域が、ＨＤＡＣの全長を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 請求項１１に記載の方法であって、ここで、ＭＥＦ２のＨ
    ＤＡＣ結合領域およびＨＤＡＣ４のＭＥＦ２結合領域またはＨＤＡＣ５のＭＥＦ
    ２結合領域が、個々に、クエンチ可能なマーカーおよびクエンチング因子を含む
    、方法。
18. 【請求項１８】 請求項１４に記載の方法であって、ここで、ＨＤＡＣ４の
    ＭＥＦ２結合領域またはＨＤＡＣ５のＭＥＦ２結合領域が、転写因子に融合され
    、そして該結合が、レポーター発現カセットの転写活性化によって測定される、
    方法。
19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記レポータ
    ーカセットが、β−ガラクトシダーゼ、ｌａｃＺおよびＧＦＰルシフェラーゼか
    らなる群から選択される検出可能なマーカーをコードする、方法。
20. 【請求項２０】 動物における心肥大を処置するための方法であって、少な
    くとも１つのＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５を該動物中の心臓組織に提供する工程
    を包含する、方法。
21. 【請求項２１】 ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５の両方が提供される、請求項
    ２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記少なくと
    も１つのＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５が、心臓において活性なプロモーターの制
    御下で、ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５をコードする発現カセットを前記心臓組織
    に転移させることによって提供される、方法。
23. 【請求項２３】 請求項２０に記載の方法であって、前記発現カセットが、
    ウイルス発現ベクターであり、そして、該ウイルス発現ベクターを含むウイルス
    粒子を用いた前記心臓組織の感染によって転移が達成される、方法。
24. 【請求項２４】 前記ウイルス発現ベクターが、アデノウイルス、レトロウ
    イルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスから
    誘導される、請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 従来の冠状動脈性心疾患剤の処方物を前記動物に投与する
    工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
26. 【請求項２６】 動物における心肥大を処置するための方法であって、ＨＤ
    ＡＣ４アゴニストまたはＨＤＡＣ５アゴニストを該動物に提供する工程を包含す
    る、方法。
27. 【請求項２７】 前記アゴニストがＨＤＡＣ４合成またはＨＤＡＣ５合成を
    増加させる、請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記アゴニストがＨＤＡＣ４安定性またはＨＤＡＣ５安定
    性を増加させる、請求項２６に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記アゴニストがＨＤＡＣ４活性またはＨＤＡＣ５活性を
    増加させる、請求項２６に記載の方法。
30. 【請求項３０】 従来の冠状動脈性心疾患剤の処方物を前記動物に投与する
    工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
31. 【請求項３１】 心肥大を発生する危険性がある被験体を同定するための方
    法であって： （ａ）生物学的サンプルを該被験体から得る工程；および （ｂ）該サンプルの細胞中のＨＤＡＣ４遺伝子型またはＨＤＡＣ５遺伝子型
    を評価する工程、 を包含する、方法。
32. 【請求項３２】 前記評価する工程が、ＨＤＡＣ４ポリヌクレオチド配列ま
    たはＨＤＡＣ５ポリヌクレオチド配列を決定することを含む、請求項３１に記載
    の方法。
33. 【請求項３３】 前記ポリヌクレオチド配列がコード配列である、請求項３
    ２に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記評価する工程が、ＨＤＡＣ４のＲＦＬＰパターンまた
    はＨＤＡＣ５のＲＦＬＰパターンを決定することを含む、請求項３１に記載の方
    法。
35. 【請求項３５】 前記評価する工程が、ＨＤＡＣ４の転写物もしくは遺伝子
    またはＨＤＡＣ５の転写物もしくは遺伝子のサイズを決定することを含む、請求
    項３１に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記評価する工程が、ＨＤＡＣ４の転写物もしくは遺伝子
    またはＨＤＡＣ５の転写物もしくは遺伝子を増幅することをさらに含む、請求項
    ３１に記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記生物学的サンプルが心臓組織である、請求項３１に記
    載の方法。
38. 【請求項３８】 以下の工程： （ａ）ＨＤＡＣ４酵素またはＨＤＡＣ５酵素の供給源を提供する工程； （ｂ）該酵素を候補物質と接触させる工程； （ｃ）工程（ｂ）における該酵素機能を決定する工程；および （ｄ）工程（ｃ）における該酵素機能を、該候補物質の非存在下における該
    酵素の酵素機能と比較する工程であって、ここで、該候補物質の非存在下におけ
    る酵素機能と比較した場合の、該候補物質の存在下における減少した酵素機能が
    、心肥大のインヒビターとして該候補物質を同定する、工程、 を包含する方法に従って同定された心肥大のインヒビター。
39. 【請求項３９】 心臓細胞における遺伝子発現のモジュレーターを同定する
    ための方法であって、以下： （ａ）ＭＥＦ２のＨＤＡＣ結合領域を提供する工程； （ｂ）該ＭＥＦ２のＨＤＡＣ結合領域をＨＤＡＣ４のＭＥＦ２結合領域また
    はＨＤＡＣ５のＭＥＦ２結合領域および候補物質と接触させる工程； （ｃ）工程（ｂ）における該結合を決定する工程；ならびに （ｄ）工程（ｃ）における該結合を、該候補物質の非存在下における該ＭＥ
    Ｆ２のＨＤＡＣ結合領域とＨＤＡＣ４のＭＥＦ２結合領域またはＨＤＡＣ５のＭ
    ＥＦ２結合領域との結合と比較する工程であって、ここで、該候補物質の存在下
    の結合と非存在下の結合との間の差異が、心臓の遺伝子発現のモジュレーターと
    して該候補物質を同定する、工程、 を包含する、方法。
40. 【請求項４０】 前記モジュレーターを調製する工程をさらに包含する、請
    求項３９に記載の方法。
41. 【請求項４１】 ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５の１つ以上の機能的対立遺伝
    子を欠く、非ヒトトランスジェニック動物。
42. 【請求項４２】 前記動物がＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５の全ての機能的対
    立遺伝子を欠く、請求項４１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
43. 【請求項４３】 前記非ヒト動物が、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤ
    ギおよびウシからなる群より選択される、請求項４１に記載の非ヒトトランスジ
    ェニック動物。
44. 【請求項４４】 ＭＥＦ２調節プロモーターの制御下で検出可能なマーカー
    遺伝子をさらに含む、請求項４１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
45. 【請求項４５】 前記ＭＥＦ２調節プロモーターがＮＧＦＩ−Ｂプロモータ
    ーである、請求項４４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
46. 【請求項４６】 前記検出可能なマーカー遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ
    、ルシフェラーゼおよびＧＦＰルシフェラーゼからなる群より選択される、請求
    項４４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
47. 【請求項４７】 ＨＤＡＣリン酸化のモジュレーターを同定するための方法
    であって、以下： （ａ）ＨＤＡＣのリン酸化を支持する条件下において、該ＨＤＡＣの供給源
    を提供する工程； （ｂ）該ＨＤＡＣを候補物質と接触させる工程； （ｃ）該ＨＤＡＣ中の１つ以上のセリン残基のリン酸化状態を決定する工程
    ；および （ｄ）工程（ｃ）のＨＤＡＣのリン酸化状態を、候補物質の存在下でのＨＤ
    ＡＣと比較する工程、 を包含し、ここで、該候補物質の非存在下での酵素機能と比較した場合の、該候
    補物質の存在下での該ＨＤＡＣのリン酸化状態における変化が、ＨＤＡＣリン酸
    化のモジュレーターとして該候補物質を同定する、方法。
48. 【請求項４８】 前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ５である、請求項４７に記載の方
    法。
49. 【請求項４９】 前記セリン残基が、２５９、４９８および６６１からなる
    群より選択される、請求項４８に記載の方法。
50. 【請求項５０】 前記セリン残基が２５９である、請求項４９に記載の方法
    。
51. 【請求項５１】 前記セリン残基が４９８である、請求項４９に記載の方法
    。
52. 【請求項５２】 前記セリン残基が６６１である、請求項４９に記載の方法
    。
53. 【請求項５３】 前記リン酸化状態が、前記ＨＤＡＣの１４−３−３への結
    合によって決定される、請求項４７に記載の方法。
54. 【請求項５４】 請求項５３に記載の方法であって、ここで、ＨＤＡＣの１
    ４−３−３への結合は、ＨＤＡＣのＧＡＬ４融合および１４−３−３のＧＡＬ４
    融合がマーカー遺伝子の転写を開始する能力によって決定される、方法。
55. 【請求項５５】 前記マーカー遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光
    タンパク質またはルシフェラーゼである、請求項５４に記載の方法。
56. 【請求項５６】 前記ＨＤＡＣが宿主細胞中に位置する、請求項４７に記載
    の方法。
57. 【請求項５７】 前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項５６に記載の方法
    。
58. 【請求項５８】 前記リン酸化状態がＨＤＡＣの細胞下局在を決定すること
    によって決定される、請求項４７に記載の方法。
59. 【請求項５９】 ＨＤＡＣリン酸化のモジュレーターを調製する方法であっ
    て、以下： （ａ）ＨＤＡＣのリン酸化を支持する条件下において、該ＨＤＡＣの供給源
    を提供する工程； （ｂ）該ＨＤＡＣを候補物質と接触させる工程； （ｃ）該ＨＤＡＣ中の１つ以上のセリン残基のリン酸化状態を決定する工程
    ； （ｄ）工程（ｃ）のＨＤＡＣのリン酸化状態を、候補物質の存在下でのＨＤ
    ＡＣと比較する工程であって、ここで、該候補物質の非存在下での酵素機能と比
    較した場合の、該候補物質の存在下での該ＨＤＡＣのリン酸化状態における変化
    が、ＨＤＡＣリン酸化のモジュレーターとしての該候補物質を同定する、工程；
    および （ｅ）該モジュレーターを調製する工程、 を包含する、方法。
60. 【請求項６０】 前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ４である、請求項５９に記載の方
    法。
61. 【請求項６１】 前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ５である、請求項５９に記載の方
    法。
62. 【請求項６２】 以下の工程： （ａ）ＨＤＡＣのリン酸化を支持する条件下において、該ＨＤＡＣの供給源
    を提供する工程； （ｂ）該ＨＤＡＣを候補物質と接触させる工程； （ｃ）該ＨＤＡＣ中の１つ以上のセリン残基のリン酸化状態を決定する工程
    ；および （ｄ）工程（ｃ）のＨＤＡＣのリン酸化状態を、候補物質の存在下でのＨＤ
    ＡＣと比較する工程、を包含する方法であって、 ここで、該候補物質の非存在下での酵素機能と比較した場合の、該候補物質の存
    在下での該ＨＤＡＣのリン酸化状態における変化が、ＨＤＡＣリン酸化のモジュ
    レーターとしての該候補物質を同定する、 方法に従って同定されたＨＤＡＣリン酸化のモジュレーター。
63. 【請求項６３】 前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ４である、請求項６２に記載の方
    法。
64. 【請求項６４】 前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ５である、請求項６２に記載の方
    法。
65. 【請求項６５】 心肥大のインヒビターを調製するための方法であって、以
    下： （ａ）ＨＤＡＣ４酵素またはＨＤＡＣ５酵素の供給源を提供する工程； （ｂ）該酵素を候補物質と接触させる工程； （ｃ）工程（ｂ）における該酵素機能を決定する工程； （ｄ）工程（ｃ）における該酵素機能を、該候補物質の非存在下における該
    酵素の酵素機能と比較する工程であって、ここで、該候補物質の非存在下におけ
    る酵素機能と比較した場合の、該候補物質の存在下における増加した酵素機能が
    、心肥大のインヒビターとして該候補物質を同定する、工程；および （ｅ）該インヒビターを調製する工程 を包含する、方法。
66. 【請求項６６】 前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ４である、請求項６５に記載の方
    法。
67. 【請求項６７】 前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ５である、請求項６５に記載の方
    法。
68. 【請求項６８】 動物における心肥大を処置するための方法であって、ＨＤ
    ＡＣリン酸化のインヒビターを動物に提供する工程を包含する、方法。
69. 【請求項６９】 前記動物がヒトである、請求項６８に記載の方法。
70. 【請求項７０】 前記インヒビターがＣａｍキナーゼのインヒビターである
    、請求項６８に記載の方法。
71. 【請求項７１】 前記ＣａｍキナーゼのインヒビターがＫＮ６２である、請
    求項７０に記載の方法。
72. 【請求項７２】 第２の薬学的組成物を前記動物に提供する工程をさらに包
    含する、請求項６８に記載の方法。
73. 【請求項７３】 請求項６２に記載の方法であって、ここで、前記第２の薬
    剤が、「βブロッカー」、抗高血圧剤、強心剤、抗血栓剤、血管拡張剤、ホルモ
    ンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、サイトカインインヒビター／
    サイトカインブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、ホスホジエステラー
    ゼインヒビターおよびアンギオテンシン２型アンタゴニストからなる群より選択
    される、方法。
74. 【請求項７４】 前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ４である、請求項６８に記載の方
    法。
75. 【請求項７５】 前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ５である、請求項６８に記載の方
    法。
76. 【請求項７６】 第２の薬剤を前記動物に提供する工程をさらに包含する、
    請求項２６に記載の方法。
77. 【請求項７７】 ＨＤＡＣ４が提供される、請求項２６に記載の方法。
78. 【請求項７８】 ＨＤＡＣ５が提供される、請求項２６に記載の方法。
79. 【請求項７９】 前記動物がヒトである、請求項２６に記載の方法。
80. 【請求項８０】 ＨＤＡＣキナーゼを同定する方法であって、以下： （ａ）ＨＤＡＣのセリン残基をリン酸化しない宿主細胞においてＨＤＡＣ−
    ＧＡＬ４融合物および１４−３−３−ＧＡＬ４融合物を提供する工程であって、
    ここで、該宿主細胞は、ＧＡＬ４によって誘導されるプロモーターの制御下であ
    るマーカー遺伝子をさらに含む、工程； （ｂ）工程（ａ）の該宿主細胞をｃＤＮＡライブラリーを用いて形質転換す
    る工程；ならびに （ｃ）該マーカー遺伝子の発現を決定する工程、 を包含し、 ここで、細胞による該マーカー遺伝子の発現は、該細胞を、ＨＤＡＣキナーゼを
    コードするｃＤＮＡを含むとして同定する、 方法。
81. 【請求項８１】 前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ４である、請求項８０に記載の方
    法。
82. 【請求項８２】 前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ５である、請求項８０に記載の方
    法。
83. 【請求項８３】 前記ＨＤＡＣ５が６６１位においてセリンを欠く、請求項
    ８２に記載の方法。