ES2236415T3 - Inhibicion de la histona desacetilasa para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca. - Google Patents
Inhibicion de la histona desacetilasa para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca.Info
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Abstract
Uso de un inhibidor de histona desacetilasa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hipertrofia cardiaca patológica e insuficiencia cardiaca.
Description
Inhibición de la histona desacetilasa para el
tratamiento de la hipertrofia cardiaca.
El gobierno posee derechos sobre la presente
invención de acuerdo con el número de subvención NIH RO1 HL61544 de
los National Institutes of Health. La presente invención reivindica
el beneficio de la prioridad sobre los documentos de nº. de serie
provisional U.S. 60/325.311, presentado el 27 de septiembre de 2001
y 60/334.041, presentado el 31 de octubre de 2001.
La presente invención se refiere al uso de
inhibidores de HDAC para tratar hipertrofia cardiaca e insuficiencia
cardiaca.
La hipertrofia cardiaca en respuesta a una carga
de trabajo aumentada impuesta al corazón es un mecanismo adaptativo
fundamental. Es un proceso especializado que refleja un aumento
cuantitativo del tamaño y masa celulares (en lugar del número de
células) como resultado de cualquiera o una combinación de estímulos
neurales, endocrinos o mecánicos. La hipertensión, otro factor
implicado en la hipertrofia cardiaca, es un precursor frecuente de
insuficiencia cardiaca congestiva. Cuando aparece insuficiencia
cardiaca, el ventrículo izquierdo habitualmente se hipertrofia y se
dilata, y se reducen los índices de función sistólica, tales como la
fracción de eyección. Claramente, la respuesta hipertrófica cardiaca
es un síndrome complejo y la elucidación de las rutas que conducen a
la hipertrofia cardiaca será beneficiosa en el tratamiento de
enfermedades cardiacas resultantes de diversos estímulos.
Una familia de factores de transcripción, la
familia del factor 2 potenciador de miocito (MEF2), está implicada
en la hipertrofia cardiaca. Por ejemplo, una variedad de estímulos
puede elevar el nivel de calcio intracelular, dando como resultado
una cascada de sistemas de señalización o rutas intracelulares,
incluyendo calcineurina, CAM quinasas, PKC y MAP quinasas. Todas
estas señales activan el MEF2 y dan como resultado hipertrofia
cardiaca. Sin embargo, no se comprende aún completamente cómo los
diversos sistemas de señalización ejercen sus efectos sobre el MEF2
y modulan su señalización hipertrófica. Es conocido que ciertas
proteínas histona desacetilasas, HDAC 4, HDAC 5, HDAC 7, HDAC 9 y
HDAC 10, están implicadas en la modulación de la actividad MEF2.
Se han clonado once HDAC diferentes de organismos
vertebrados. Todas comparten homología en la región catalítica. Las
histona acetilasas y desacetilasas desempeñan un papel importante en
el control de la expresión génica. El equilibrio entre actividades
de histona acetilasas, habitualmente denominadas acetiltransferasas
(HAT) y desacetilasas (HDAC), determina el nivel de acetilación de
histona. En consecuencia, las histonas acetiladas causan la
relajación de la cromatina y la activación de la transcripción
génica, mientras que la cromatina desacetilada es generalmente
transcripcionalmente inactiva. En un informe previo, el laboratorio
de los inventores demostró que HDAC 4 y 5 dimerizan con MEF2 y
reprimen la actividad transcripcional de MEF2 y, además, que esta
interacción requiere la presencia de la terminación N de las
proteínas HDAC 4 y 5. McKinsey et al. (2000 a, b).
En un contexto distinto, recientes
investigaciones han destacado también el importante papel de las
HDAC en la biología del cáncer. De hecho, se está ensayando en
diversos inhibidores de HDAC su capacidad de inducir la
diferenciación y/o apoptosis celular en células cancerosas. Marks
et al. (2000). Dichos inhibidores incluyen suberoilanilida de
ácido hidroxámico (SAHA) (Butler et al., 2000; Marks et
al., 2001); bis-hidroxamida del ácido
m-carboxicinámico (Coffey et al., 2001) y piroxamida
(Butler et al., 2001). Estos estudios se han resumido en la
indicación de que "los HPC basados en ácido hidroxámico,
particularmente SAHA y piroxamida, son inhibidores potentes de HDAC
in vitro e in vivo, e inducen la detención del
crecimiento, la diferenciación o la muerte celular apoptótica de
células transformadas ... [y por tanto] son compuestos importantes
entre la familia de los HPC basados en ácido hidroxámico y están
actualmente en ensayos clínicos de fase I". Marks et al.
(2000). Hasta la fecha, no se han reseñado informes sobre los
efectos de los inhibidores de HDAC sobre la hipertrofia de células
musculares y la respuesta al estrés.
Por tanto, según la presente invención, se
proporciona el uso de inhibidores de histona desacetilasa para la
preparación de un medicamento para tratar hipertrofia cardiaca
patológica e insuficiencia cardiaca, que comprende (a) identificar
un paciente que tiene hipertrofia cardiaca; y (b) administrar al
paciente un inhibidor de histona desacetilasa. Administrar puede
comprender administración intravenosa, oral, transdérmica, por
liberación sostenida, en supositorio o sublingual. El tratamiento
puede comprender además administrar un segundo régimen terapéutico
tal como un betabloqueante, un ióntropo, diurético,
ACE-I, antagonista de AII o bloqueante de
Ca^{++}. El segundo régimen terapéutico puede administrarse al
mismo tiempo que el inhibidor de histona desacetilasa, o antes o
después que el inhibidor de histona desacetilasa. El tratamiento
puede mejorar uno o más síntomas de insuficiencia cardiaca tales
como proporcionar una capacidad de ejercicio aumentada, un volumen
de eyección de sangre, presión diastólica ventricular izquierda
terminal, presión capilar pulmonar de enclavamiento, rendimiento
cardiaco, índice cardiaco, presiones arteriales pulmonares,
dimensiones sistólica y diastólica ventricular izquierda terminal,
tensión de pared ventricular izquierda y derecha, tensión de pared y
grosor de pared, morbilidad y mortalidad aumentados relacionados con
la enfermedad.
En aún otra realización, se proporciona el uso de
inhibidores de histona desacetilasa para la preparación de un
medicamento para prevenir hipertrofia cardiaca patológica e
insuficiencia cardiaca, que comprende: (a) identificar un paciente
con riesgo de desarrollar hipertrofia cardiaca; y (b) administrar al
paciente un inhibidor de histona desacetilasa. La administración
puede comprender administración intravenosa, oral, transdérmica, por
liberación sostenida, en supositorio o sublingual. El paciente con
riesgo puede exhibir una o más de hipertensión incontrolada de larga
duración, enfermedad valvular no corregida, angina crónica y/o
infarto de miocardio reciente.
Según las realizaciones precedentes, el inhibidor
de histona desacetilasa puede ser cualquier molécula que efectúe una
reducción de la actividad de una histona desacetilasa. Esto incluye
proteínas, péptidos, moléculas de ADN (incluyendo ADN sin sentido),
moléculas de ARN (incluyendo ARNi y sin sentido) y moléculas
pequeñas. Las moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitación,
tricostatina A, (TSA), trapoxina B, MS 275-27,
bis-hidroxamida del ácido m-carboxicinámico,
depudecina, oxamflatina, apicidina, suberoilanilida del ácido
hidroxámico, Scriptaid, piroxamida,
3-(4-aroil-1H-pirrol-2-il)-N-hidroxi-2-propenamida
del ácido
2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico
y FR 901228. Adicionalmente, las siguientes referencias describen
inhibidores de histona desacetilasa que pueden seleccionarse para
uso en la presente invención: documentos AU 9.013.101, AU 9.013.201,
AU 9.013.401, AU 6.794.700, EP 1.233.958, EP 1.208.086, EP
1.174.438, EP 1.173.562, EP 1.170.008, EP 1.123.111, JP 2001/348340,
U.S. 2002/103192, U.S. 2002/65282, U.S. 2002/61860, WO 02/51842, WO
02/50285, WO 02/46144, WO 02/46129, WO 02/30879, WO 02/26703, WO
02/26696, WO 01/70675, WO 01/42437, WO 01/38322, WO 01/18045, WO
01/14581, Furumai et al., (2002), Hinnebusch et al.
(2002), Mai et al. (2002), Vigushin et al. (2002),
Gottlicher et al., (2001), Jung (2001), Komatsu et al.
(2001); Su et al. (2000).
Los siguientes dibujos forman parte de la
presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar
adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La
invención puede comprenderse mejor por referencia a uno o más de
estos dibujos en combinación con la descripción detallada de
realizaciones específicas presentada en la presente memoria.
Fig. 1A-C. La TSA altera la
represión génica inducida por agonista. Se trataron miocitos
cardiacos cultivados con PE (20 \mumol/l) o IL-1
(1 ng/ml) durante 48 h. Se añadió TSA (30 nmol/l) 30 min antes del
tratamiento con PE o IL-1. Se ensayó la expresión de
ARNm específico de miocito (SERCA2a (Fig. 1A), \alphaMyHC (Fig.
1B), \betaMyHc (Fig. 1C)) en 5 \mug de ARN total mediante el
ensayo de protección de ARNasa. Los datos medios son de 4 cultivos,
y se presentan como % del control después de normalización con la
señal GAPDH.
Fig. 2A-D. La sobreexpresión
de HDAC reprime promotores específicos de músculo. Se
transfectaron miocitos cultivados durante 72 h con vectores de
expresión (2 \mug por \sim3 x 10^{5} células) de HDAC 1, 4, 5
marcado con Flag (o su vector de cadena principal) y marcadores CAT
(5 \mug) para genes SERCA (Fig. 2A), \alphaMyHC (Fig. 2B),
\betaMyHC (Fig. 2C y 2D), más fosfatasa alcalina secretada
impulsada por SV40 (SEAP, 1 \mug, Clontech). Se utilizó TSA a 30
nmol/l, y se añadió justo después de la transfección. Se añadió PE
22 (20 \mumol/l) 24 h después, y se realizaron ensayos de CAT
después de 48 horas adicionales. Los datos medios son de n= 3
cultivos diferentes, y se presentan como % de pCMV después de
normalización de la actividad SEAP en el medio. Se confirmó la
sobreexpresión de HDAC por transferencia Western de Flag.
Fig. 3A-D. Los inhibidores de
HDAC bloquean la activación del informador ANF mediante fenilefrina
sin citotoxicidad. Se cotransfectaron cardiomiocitos de rata
neonatal con un total de 1 \mug de fragmento promotor ANF de 3 kB
y plásmidos CMV-Lac Z. (Fig. 3A) El promotor ANF es
mínimamente activo en cardiomiocitos no estimulados. La adición de
inhibidores de HDAC no induce la actividad promotora ANF, pero el
cotratamiento de cardiomiocitos con fenilefrina y un inhibidor de
HDAC (TSA (85 nM), NaBut (5 mM) o toxina HC (5 ng/ml)) prevenía la
activación del promotor ANF mediante fenilefrina (100 \muM). (Fig.
3B) Expresión de lac Z mediante el promotor constitutivo CMV. El
tratamiento con inhibidores de HDAC aumentó la actividad CMV con y
sin cotratamiento con fenilefrina. (Fig. 3C y 3D) Las gráficas
muestran que las medidas de actividad adenilato quinasa permanecen
constantes en el medio después de X horas de cultivar cardiomiocitos
en ausencia o presencia de los estimulantes hipertróficos FBS, PE o
ET-1.
Fig. 4A-C. Los inhibidores de
HDAC previenen la expresión de ANF endógeno inducida normalmente por
agonistas hipertróficos. (Fig 4A) La gráfica muestra la suma de
diversos experimentos de transferencia puntual (n= 4). Como en los
experimentos de transfección, la fenilefrina (100 \muM) induce la
expresión de ANF más de tres veces. El tratamiento con inhibidores
de HDAC (TSA 85 nM, butirato de sodio 5 mM, toxina HC 5 ng/ml)
bloquea la acumulación del mensaje ANF. (Fig. 4B y C) Las gráficas
muestran una reducción de la detección quimioluminiscente de ANF en
el medio de cultivo con concentraciones crecientes de los
inhibidores de HDAC TSA (Fig. 4B) y butirato de sodio (Fig. 4C)
cuando se cocultivan con los estimulantes hipertróficos FBS, PE o
ET-1.
Fig. 5A-B. El tratamiento de
cardiomiocitos con inhibidores de HDAC bloquea el programa génico
fetal asociado a hipertrofia cardiomiocítica. (Fig. 5A) La
gráfica muestra los cambios en número de veces de la expresión de
\alphaSK-actina por fenilefrina y la falta de
activación génica en muestras tratadas con TSA. (Fig. 5B) La gráfica
muestra los cambios en número de veces de la expresión de ARN de
\alphaMyHC y \betaMyHC. El tratamiento con fenilefrina induce la
activación de la expresión de \betaMyHC (gen fetal) en
cardiomiocitos; mientras que la fenilefrina sola no activa el gen
\alphaMyHC, la isoforma adulta. El tratamiento con TSA previno la
activación de \betaMyHC, pero estimuló la expresión de
\alphaMyHC. Las gráficas representan tres o más experimentos
independientes.
Fig. 6. Los efectos del tratamiento con TSA
sobre la reorganización de los sarcómeros y la síntesis de
proteína. Las gráficas de las medidas de proteína ribosómica S6
en cardiomiocitos muestran que la fenilefrina y el suero aumentan la
síntesis de proteína en cardiomiocitos. El tratamiento de
cardiomiocitos con TSA no altera este aumento después de 6 horas
(gráficos a la izquierda). Los gráficos a la derecha muestran el
contenido de proteína ribosómica S6 en cardiomiocitos después de 24
horas de cotratamiento con PE y concentraciones crecientes de TSA, o
con suero y concentraciones crecientes de TSA.
Fig. 7A-B. La TSA induce la
activación de genes que están implicados en la diferenciación de
cardiomiocitos. (Fig. 7A) Se activaron tres genes por la
fenilefrina y se desactivaron por la TSA. (Fig. 7B) Se inactivaron
cuatro genes por la fenilefrina y se activaron por la TSA
(resultados de un chip de fenilefrina, dos chips de fenilefrina/TSA
y un chip de TSA).
La insuficiencia cardiaca es una de las causas
principales de morbilidad y mortalidad en el mundo. Sólo en los
EE.UU., las estimaciones indican que 3 millones de personas viven
actualmente con cardiomiopatía y otras 400.000 se diagnostican cada
año. La cardiomiopatía dilatada (DCM), también designada como
"cardiomiopatía congestiva", es la forma más común de
cardiomiopatía y tiene una prevalencia estimada de casi 40 por
100.000 individuos (Durand et al, 1995). Aunque existen otras
causas de DCM, la cardiomiopatía dilatada familiar se ha indicado
como representativa de aproximadamente un 20% de la DCM
"idiopática". Aproximadamente la mitad de los casos de DCM son
idiopáticos, estando asociado el resto a procesos patológicos
conocidos. Por ejemplo, ciertos fármacos utilizados en la
quimioterapia del cáncer (por ejemplo, doxorubicina y daunorubicina)
pueden dar como resultado una grave lesión miocárdica. Además,
muchos pacientes con DCM son alcohólicos crónicos. Afortunadamente
para estos pacientes, la progresión de la disfunción miocárdica
puede detenerse o invertirse si se reduce o se detiene el consumo de
alcohol al principio del transcurso de la enfermedad. La
cardiomiopatía periparto es otra forma idiopática de DMC, así como
la enfermedad asociada a secuelas infecciosas. En suma, las
cardiomiopatías, incluyendo DMC, son problemas de salud pública
significativos.
Ya que la cardiomiopatía misma no produce
típicamente ningún síntoma hasta que el daño cardiaco es
suficientemente grave para producir insuficiencia cardiaca, los
síntomas de cardiomiopatía son los asociados a insuficiencia
cardiaca. Estos síntomas incluyen falta de aliento, fatiga con el
ejercicio, incapacidad de tumbarse sin faltar el aliento (ortopnea),
dispnea nocturna paroxísmica, dimensiones cardiacas ensanchadas y/o
hinchamiento de la parte inferior de las piernas. Los pacientes
presentan también a menudo presión sanguínea aumentada, sonidos
extracardiacos, murmullos cardiacos, embolias pulmonares y
sistémicas, dolor de pecho, congestión pulmonar y palpitaciones.
Además, la DCM causa fracciones de eyección reducida (concretamente
una medida tanto de la función sistólica intrínseca como de la
remodelación). La enfermedad se caracteriza adicionalmente por
dilatación ventricular y función sistólica gravemente alterada
debido a la contractilidad miocárdica disminuida, lo que da como
resultado insuficiencia cardiaca dilatada en muchos pacientes. Los
corazones afectados experimentan también remodelación
celular/cameral como resultado de la disfunción
miocitíca/miocárdica, que contribuye al "fenotipo DCM". A
medida que progresa la enfermedad, los síntomas progresan también.
Los pacientes con cardiomiopatía dilatada tienen también una
incidencia aumentada en gran medida de arritmias con riesgo para la
vida, incluyendo taquicardia ventricular y fibrilación ventricular.
En estos pacientes, un episodio de síncope (desmayo) se considera
como precursor de muerte repentina.
El diagnóstico de cardiomiopatía dilatada depende
típicamente de la demostración de cámaras cardiacas agrandadas,
particularmente ventrículos agrandados. El agrandamiento es
observable habitualmente con rayos X pectorales, pero se evalúa más
exactamente utilizando ecocardiogramas. La DCM es a menudo difícil
de distinguir de miocarditis aguda, enfermedad cardiaca valvular,
enfermedad arterial coronaria y enfermedad cardiaca hipertensiva.
Una vez se ha realizado el diagnóstico de cardiomiopatía dilatada,
se hacen todo tipo de esfuerzos por identificar y tratar las causas
potencialmente reversibles y prevenir daño cardiaco adicional. Por
ejemplo, la enfermedad arterial coronaria y la enfermedad cardiaca
valvular deben descartarse. Hay que dirigirse a anemia, taquicardias
anormales, deficiencias nutricionales, alcoholismo, enfermedad
tiroidea y/u otros problemas y controlarlos.
Durante los intentos de identificar y estabilizar
la causa subyacente de la cardiomiopatía, se instituye generalmente
un tratamiento para minimizar los síntomas y optimizar la eficacia
del corazón defectuoso. La medicación sigue siendo lo más importante
del tratamiento, aunque no hay tratamientos específicos para
cardiomiopatía dilatada distintos de los utilizados en los casos de
insuficiencia cardiaca en general. La cirugía de transplante es una
opción. Es más, la cardiomiopatía dilatada se ha indicado como la
causa más común de transplante cardiaco en los EE.UU.
El tratamiento no farmacológico se utiliza
principalmente como coadyuvante del tratamiento farmacológico. Un
medio de tratamiento no farmacológico implica reducir el sodio en la
dieta. Además, el tratamiento no farmacológico abarca también la
eliminación de ciertos fármacos desencadenantes, incluyendo agentes
inotrópicos negativos (por ejemplo ciertos bloqueantes de canal de
calcio y fármacos antiarrítmicos como disopiramida), cardiotoxinas
(por ejemplo anfetaminas) y expansores del volumen plasmático (por
ejemplo agentes antiinflamatorios no esteroideos y
glucocorticoides).
El tratamiento con agentes farmacológicos
representa el mecanismo primario para reducir o eliminar las
manifestaciones de insuficiencia cardiaca. Los diuréticos
constituyen la primera línea de tratamiento para insuficiencia
cardiaca leve a moderada. Desgraciadamente, muchos de los diuréticos
utilizados habitualmente (por ejemplo las tiazidas) tienen numerosos
efectos adversos. Por ejemplo, ciertos diuréticos pueden aumentar el
colesterol y triglicéridos séricos. Además, los diuréticos son
generalmente ineficaces para pacientes que padecen insuficiencia
cardiaca grave.
Si los diuréticos son ineficaces, pueden
utilizarse agentes vasodilatadores; los inhibidores de enzima
conversora de angiotensina (ACE) (por ejemplo enalopil y lisinopril)
no sólo proporcionan alivio sintomático, sino que se ha reseñado
también que reducen la mortalidad (Young et al., 1989). De
nuevo, sin embargo, los inhibidores de ACE están asociados a efectos
adversos que dan como resultado que estén contraindicados en
pacientes con ciertos estados patológicos (por ejemplo estenosis
arterial renal).
De forma similar, la terapia con agente
inotrópico (es decir, un fármaco que mejora el rendimiento cardiaco
aumentando la fuerza de la contracción del músculo miocárdico) puede
estar también indicada si los diuréticos no dan como resultado un
alivio adecuado. El agente inotrópico más habitualmente utilizado
por pacientes ambulatorios es digital. Sin embargo, está asociado a
una serie de reacciones adversas, incluyendo problemas
gastrointestinales y disfunción del sistema nervioso central.
Por tanto, los agentes farmacológicos utilizados
habitualmente tienen graves inconvenientes en poblaciones
particulares de pacientes. La disponibilidad de nuevos agentes
seguros y eficaces sería indudablemente beneficiosa para pacientes
que no pueden utilizar las modalidades farmacológicas actualmente
disponibles o que no reciben un alivio adecuado por estas
modalidades. El pronóstico para pacientes con DCM es variable, y
depende del grado de disfunción ventricular, ocurriendo la mayoría
de muertes al cabo de cinco años del diagnóstico.
Los inventores han mostrado anteriormente que el
MEF2 se activa por la fosforilación por MAP quinasa de tres sitios
conservados en su dominio de activación
carboxi-terminal (véase Katoh, et al., 1998).
La señalización de CaMK activa también el MEF2 al fosforilar las
HDAC de clase II, las cuales se expresan a altos niveles en corazón
adulto, en el que pueden reprimir la actividad MEF2. Tras la
fosforilación, estas HDAC se unen a
14-3-3, y se disocian de MEF2, con
translocación resultante al núcleo y activación de la transcripción
dependiente de MEF2. Los mutantes de HDAC de clase II que no pueden
fosforilarse no pueden separarse de MEF2 y bloquean
irreversiblemente la expresión de genes diana MEF2.
El documento WO 01/14581 da a conocer que las
enzimas HDAC desempeñan un papel inhibitorio importante en la
hipertrofia cardiaca. Aumentar la actividad enzimática de HDAC se
describe como curativo para la hipertrofia cardiaca.
Se ha mostrado también que un adenovirus que
codifica un mutante no fosforilable de HDAC 5 es capaz de prevenir
la hipertrofia cardiomiocítica in vitro en respuesta a
diversas rutas de señalización (véase, Lu et al., 2000).
Estos hallazgos sugieren que la fosforilación de estos sitios
conservados en HDAC de clase II es una etapa esencial para iniciar
la hipertrofia cardiaca. Basándose en este hallazgo, podría
esperarse que la inhibición de la actividad HDAC por TSA daría como
resultado la inducción de hipertrofia cardiaca debido a la depresión
de los genes sensibles hipertróficos. Por el contrario, los
presentes inventores encontraron en cambio que la TSA realmente
previene la hipertrofia cardiaca. Estos hallazgos inesperados
sugieren que son necesarias al menos algunas HDAC para hipertrofia,
y que la inhibición de la actividad catalítica de HDAC puede
prevenir la activación de genes hipertróficos.
¿Cómo pueden explicarse estos resultados
aparentemente conflictivos?. Un modelo argumenta que las HDAC de
clase I y II pueden controlar distintos conjuntos de genes en los
cardiomiocitos. Según este modelo, las HDAC de clase II
interaccionan con y reprimen la actividad de factores de
transcripción tales como MEF2, que son necesarios para la
hipertrofia, lo que explicaría porqué mutantes no fosforilables de
HDAC de clase II bloquean la hipertrofia. En contraposición, se
propone que las HDAC de clase I, HDAC 1 y HDAC 3 particularmente,
suprimen la expresión de genes antihipertróficos. Por tanto, la
exposición de cardiomiocitos a TSA daría como resultado la
desrepresión de estos genes antihipertróficos y un bloqueo de la
hipertrofia. Este modelo predice también que la actividad de dichos
genes antihipertróficos sería dominante frente a la actividad de las
HDAC de clase II, puesto que ellos también se reprimen por TSA, lo
que se esperaría que desreprimiera el programa hipertrófico.
En cualquier caso, e independientemente de la
base molecular precisa, la presente invención muestra que,
sorprendentemente, los inhibidores de HDAC son beneficiosos en el
tratamiento de hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiaca.
Los nucleosomas, el esqueleto principal del
plegamiento de cromatina, son estructuras macromoleculares dinámicas
que influyen en las conformaciones de solución de cromatina (Workman
y Kingston, 1998). El núcleo de nucleosoma está compuesto por las
proteínas histonas H2A, HB, H3 y H4. La acetilación de histona causa
que los nucleosomas y organizaciones nucleosómicas se comporten con
propiedades biofísicas alteradas. El equilibrio entre actividades
histona acetiltransferasas (HAT) y desacetilasas (HDAC) determina el
nivel de acetilación de histona. Las histonas acetiladas causan la
relajación de la cromatina y la activación de la transcripción
génica, mientras que la cromatina desacetilada es generalmente
transcripcionalmente inactiva.
Se han clonado once HDAC diferentes de organismos
vertebrados. Las tres primeras HDAC humanas identificadas fueron
HDAC 1, HDAC 2 y HDAC 3 (denominadas HDAC humanas de clase I), y la
HDAC 8 (Van den Wyngaert et al., 2000) se ha añadido a esta
lista. Recientemente, se han clonado e identificado (Grozinger et
al., 1999; Zhou et al. 2001; Tong et al., 2002)
las HDAC humanas de clase II HDAC 4, HDAC 5, HDAC 6, HDAC 7, HDAC 9
y HDAC 10 (Kao et al. 2000). Adicionalmente, se ha
identificado la HDAC 11, pero no se ha clasificado todavía como de
clase I o clase II (Gao et al., 2002). Todas comparten
homología en la región catalítica. Las HDAC 4, 5, 7, 9 y 10, sin
embargo, tienen una extensión amino-terminal única
no encontrada en otras HDAC. Esta región
amino-terminal contiene el dominio de unión a MEF2.
Se ha mostrado que las HDAC 4, 5 y 7 están implicadas en la
regulación de la expresión génica cardiaca y, en realizaciones
particulares, en la represión de la actividad transcripcional de
MEF2. El mecanismo exacto mediante el que las HDAC de clase II
reprimen la actividad MEF2 no se comprende totalmente. Es una
posibilidad que la unión de HDAC a MEF2 inhiba la actividad
transcripcional de MEF2, competitivamente o bien desestabilizando la
conformación nativa transcripcionalmente activa de MEF2. También es
posible que las HDAC de clase II requieran dimerización con MEF2
para localizar o posicionar la HDAC en la proximidad de histonas
para que proceda la desacetilación.
Se han identificado una variedad de inhibidores
de histona desacetilasa. Los usos propuestos varían ampliamente,
pero se enfocan principalmente en la terapia del cáncer. Saunders
et al. (1999), Jung et al. (1997), Jung et al.
(1999), Vigushin et al. (1999), Kim et al. (1999),
Kitazomo et al. (2001), Vigusin et al. (2001),
Hoffmann et al. (2001), Kramer et al. (2001), Massa
et al. (2001), Komatsu et al. (2001), Han et
al. (2001). Dicha terapia es el objeto de un ensayo clínico en
fase I patrocinado por los NIH para tumores sólidos y linfoma no de
Hodgkin. Las HDAC aumentan también la transcripción de transgenes,
constituyendo así un posible coadyuvante para la terapia génica.
Yamano et al. (2000), Su et al. (2000).
Las HDAC pueden inhibirse mediante una serie de
mecanismos diferentes, proteínas, péptidos y ácidos nucleicos
(incluyendo moléculas sin sentido y de ARNi). Los procedimientos son
ampliamente conocidos por los expertos en la técnica de clonación,
transferencia y expresión de constructos genéticos, que incluyen
vectores virales y no virales y liposomas. Los vectores virales
incluyen adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, virus
Vaccinia y herpesvirus.
Se contemplan también inhibidores de molécula
pequeña. Quizás el inhibidor de molécula pequeña más ampliamente
conocido de la función de HDAC sea la tricostatina A, un ácido
hidroxámico Se ha mostrado que induce la hiperacetilación y causa la
reversión de células transformadas con ras a morfología
normal (Taunton et al., 1996) e induce la inmunosupresión en
un modelo de ratón (Takahashi et al., 1996). Está
comercialmente disponible en BIOMOL Research Labs, Inc., Plymouth
Meeting, PA.
Las siguientes referencias describen todas
inhibidores de HDAC que pueden encontrar uso en la presente
invención: documentos AU 9.103.101, AU 9.013.201, AU 9.013.401, AU
6.794.700, EP 1.233.958, EP 1.208.086, EP 1.174.438, EP 1.173.562,
EP 1.170.008, EP 1.123.111, JP 2001/348340, US 2002/103192, US
2002/65282, US 2002/61860, WO 02/51842, WO 02/50285, WO 02/46144, WO
02/46129, WO 02/30879, WO 02/26703, WO 02/26696, WO 01/70675, WO
01/42437, WO 01/38322, WO 01/18045, WO 01/14581, Furumai et
al. (2002), Hinnebusch et al. (2002), Mai et al.
(2002), Vigushin et al. (2002), Gottlicher et al.
(2001), Jung (2001), Komatsu (2001), Su et al. (2000).
Se muestran ejemplos de algunos inhibidores
específicos de HDAC en la Tabla 1.
Inhibidor | Tipo de compuesto | Organismo |
Trapoxina B | Derivado de porfirina | H. ambiens |
MS-27-275 | Derivado de benzamida | |
Scriptaid | Ácido hidroxámico | |
FR901228 | Ciclopéptido | C. violaceum |
(nº 968) | ||
Depudecina | Metabolito fúngico | A. brassiciola |
Oxamflatina | Sulfonamida aromática | |
Piroxamida (suberoil-3-aminopiridinamida del ácido | ||
hidroxámico) | Ácido hidroxámico | |
Ácido 2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico (AEO) | Cetona | |
3-(4-Aroil-1H-pirrol-2-il)-N-hidroxi-2-propenamida | Propenamida | |
Suberoilanilida del ácido hidroxámico | Ácido hidroxámico | |
Bis-hidroxiamida de ácido m-carboxicinámico | Ácido hidroxámico |
Inhibidor | Tipo de compuesto | Organismo |
Apicidina^{1} | Ciclopéptido | Fusarium spp. |
CHAP1 (tricostatina A + trapoxina B) | Derivados hidroxámico/de porfirina | |
^{1}ciclo(N-O-metil-L-triptofanil-L-isoleucinil-D-pipecolinil-L-2-amino-8- oxodecanoílo) |
En una realización de la presente invención, se
proporciona el uso de inhibidores de HDAC para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de hipertrofia cardiaca. Con los
fines de la presente solicitud, el tratamiento comprende reducir uno
o más de los síntomas de hipertrofia cardiaca, tales como capacidad
de ejercicio reducida, volumen de eyección de sangre reducido,
presión diastólica ventricular izquierda terminal aumentada, presión
capilar pulmonar de enclavamiento aumentada, rendimiento cardiaco e
índice cardiaco reducido, presiones arteriales pulmonares
aumentadas, dimensiones sistólica y diastólica ventricular izquierda
terminal aumentadas y tensión de pared del ventrículo izquierdo,
tensión de pared y grosor de pared aumentadas, e igual para el
ventrículo derecho. Además, el uso de inhibidores de HDAC puede
prevenir que aparezca hipertrofia cardiaca y sus síntomas
asociados.
Los regímenes de tratamiento variarán dependiendo
de la situación clínica. Sin embargo, el mantenimiento a largo plazo
parece ser apropiado en la mayoría de las circunstancias. Puede ser
también deseable tratar la hipertrofia con inhibidores de HDAC
intermitentemente, tal como en una breve ventana durante la
progresión de la enfermedad. Actualmente, el ensayo indica que la
dosificación óptima para un inhibidor de HDAC será la dosis máxima
antes de que aparezca toxicidad significativa.
En otra realización, se prevé el uso de la
inhibición de HDAC en combinación con otras modalidades
terapéuticas. Por tanto, además de las terapias descritas
anteriormente, pueden proporcionarse también al paciente más
terapias cardiacas farmacéuticas "estándar". Los ejemplos de
terapias estándar incluyen, sin limitación, los denominados
"betabloqueantes", antihipertensivos, cardiotónicos,
antitrombóticos, vasodilatadores, antagonistas hormonales,
ióntropos, diuréticos, antagonistas de endotelina, bloqueantes de
canal de calcio, inhibidores de fosfodiesterasas, inhibidores de
ACE, antagonistas de angiotensina de tipo 2 y
bloqueantes/inhibidores de citoquina.
Las combinaciones pueden conseguirse poniendo en
contacto células cardiacas con una sola composición o formulación
farmacológica que incluye ambos agentes, o poniendo en contacto la
célula con dos composiciones o formulaciones distintas al mismo
tiempo, incluyendo una composición el constructo de expresión e
incluyendo la otra el agente. Como alternativa, la terapia de
inhibidor de HDAC puede preceder o seguir a la administración del
otro agente en intervalos de minutos a semanas. En realizaciones en
las que el otro agente y el constructo de expresión se aplican
separadamente a la célula, se aseguraría generalmente que no pase un
periodo significativo de tiempo entre el momento de cada suministro,
de tal modo que el agente y el constructo de expresión sigan siendo
capaces de ejercer ventajosamente un efecto combinado sobre la
célula. En tales casos, se contempla que se pondría típicamente en
contacto la célula con ambas modalidades a aproximadamente
12-24 horas entre sí y, más preferiblemente, a
aproximadamente 6-12 horas entre sí, siendo el más
preferido un tiempo de retardo de sólo aproximadamente 12 horas. En
algunas situaciones, puede ser deseable extender el periodo de
tiempo para tratamiento significativamente, sin embargo, cuando
transcurren varios días (2, 3, 4, 5, 6 ó 7) a varias semanas (1, 2,
3, 4, 5, 7, ó 8) entre las administraciones respectivas.
Es también concebible que se desee más de una
administración de un inhibidor de HDAC, o el otro agente. A este
respecto, pueden emplearse diversas combinaciones. A modo de
ilustración, cuando el inhibidor de HDAC es "A" y el otro
agente es "B", son ejemplares las siguientes permutaciones
basadas en 3 y 4 administraciones:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A
BB/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/BA B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B.
Se contemplan igualmente otras combinaciones.
Cuando se contemplan aplicaciones clínicas, se
prepararán composiciones farmacéuticas en una forma apropiada para
la aplicación pretendida. Generalmente, esto abarcará preparar
composiciones que están esencialmente exentas de pirógenos, así como
de otras impurezas que podrían ser nocivas para seres humanos o
animales.
Generalmente, se deseará emplear sales y tampones
apropiados para volver estables los vectores de suministro y
permitir la captación por células diana. Se emplearán también
tampones cuando se introducen células recombinante en un paciente.
Las composiciones acuosas de la presente invención comprenden una
cantidad eficaz del vector o células, disuelta o dispersada en un
vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. La expresión
"farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable" designa
entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones
adversas, alérgicas u otras indeseadas cuando se administran a un
animal o un ser humano. Como se utiliza en la presente memoria,
"vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye disolventes,
tampones, soluciones, medios de dispersión, recubrimientos, agentes
antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de
la absorción y similares aceptables para uso en la formulación de
productos farmacéuticos, tales como productos farmacéuticos
adecuados para administración a seres humanos. El uso de dichos
medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien
conocido en la técnica. Excepto en la medida en que algún medio o
agente convencional sea incompatible con los ingredientes activos de
la presente invención, está contemplado su uso en composiciones
terapéuticas. Pueden incorporarse también ingredientes activos
suplementarios a las composiciones, a condición de que no inactiven
los vectores o células de las composiciones.
Las composiciones activas de la presente
invención pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La
administración de estas composiciones según la presente invención
puede ser mediante cualquier vía común a condición de que el tejido
diana esté accesible por esa vía. Esto incluye oral, nasal o bucal.
Como alternativa, la administración puede ser inyección
intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o
intravenosa. Dichas composiciones se administrarían normalmente en
forma de composiciones farmacéuticamente aceptables, como se
describe anteriormente.
Los compuestos activos pueden administrarse
también por vía parenteral o intraperitoneal. A modo de ilustración,
las soluciones de compuestos activos en forma de base libre o sales
farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua
adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como
hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones pueden prepararse también en
glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en
aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas
preparaciones contienen generalmente un conservante para prevenir el
crecimiento de microorganismos.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso
inyectable incluyen, por ejemplo, soluciones o dispersiones acuosas
estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de
soluciones o dispersiones inyectables estériles. Generalmente, estas
preparaciones son estériles y fluidas en la medida en que exista una
fácil inyectabilidad. Las preparaciones deben ser estables en las
condiciones de fabricación y almacenamiento y deben conservarse
frente a la acción contaminante de microorganismos tales como
bacterias y hongos. Los disolventes o medios de dispersión
apropiados pueden contener, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por
ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y
similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La
fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de
un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del
tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el
uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos
puede realizarse mediante diversos agentes antibacterianos y
antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido
sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible
incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro de sodio.
La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede
realizarse mediante el uso en las composiciones de agentes
retardantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio
y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden
prepararse incorporando los compuestos activos en una cantidad
apropiada a un disolvente, junto con cualquier otro ingrediente (por
ejemplo como se enumeran anteriormente) según se desee, seguido de
esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se
preparan incorporando los diversos ingredientes activos
esterilizados a un vehículo estéril que contiene el medio de
dispersión básico y los otros ingredientes deseados, por ejemplo,
como se enumeran anteriormente. En el caso de polvos estériles para
la preparación de soluciones inyectables estériles, los
procedimientos preferidos de preparación incluyen técnicas de secado
a vacío y liofilización que proporcionan un polvo del (de los)
ingrediente(s) activo(s) más cualquier ingrediente
deseado adicional a partir de una solución anteriormente
esterilizada por filtración del mismo.
Para administración oral, pueden incorporarse
generalmente excipientes a los polipéptidos de la presente invención
y utilizarse en forma de colutorios y dentífricos no ingeribles.
Puede prepararse un colutorio incorporando el ingrediente activo en
la cantidad necesaria a un disolvente apropiado, tal como una
solución de borato de sodio (solución de Dobell). Como alternativa,
el ingrediente activo puede incorporarse a un lavado antiséptico que
contiene borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio. El
ingrediente activo puede dispersarse también en dentífricos,
incluyendo: geles, pastas, polvos y suspensiones. El ingrediente
activo puede añadirse en una cantidad terapéuticamente eficaz a una
pasta dentífrica que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos,
agentes aromatizantes, agentes espumantes y humectantes.
Las composiciones de la presente invención pueden
formularse generalmente en una forma neutra o salina. Las sales
farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, sales de adición
de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína)
derivadas de ácidos inorgánicos (por ejemplo ácido clorhídrico o
fosfórico), o de ácidos orgánicos (por ejemplo acético, oxálico,
tartárico, mandélico y similares). Las sales formadas con los grupos
carboxilo libres de la proteína pueden derivar también de bases
inorgánicas (por ejemplo hidróxidos sódico, potásico, amónico,
cálcico o férrico) o de bases orgánicas (por ejemplo isopropilamina,
trimetilamina, histidina, procaína y similares).
Tras la formulación, las soluciones se
administran preferiblemente de manera compatible con la formulación
de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente
eficaz. Las formulaciones pueden administrarse fácilmente en una
variedad de formas de dosificación tales como soluciones
inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares. Para
administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo,
generalmente la solución se tampona adecuadamente y el diluyente
líquido se hace primero isotónico, por ejemplo, con suficiente
solución salina o glucosa. Dichas soluciones acuosas pueden
utilizarse, por ejemplo, para administración intravenosa,
intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Preferiblemente, se
emplean medios acuosos estériles como se conoce por los expertos en
la técnica, particularmente a la vista de la presente descripción. A
modo de ilustración, puede disolverse una dosis individual en 1 ml
de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de fluido de
hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión
(véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15ª
edición, páginas 1035-1038 y
1570-1580). Aparecerá necesariamente cierta
variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto
que se esté tratando. La persona responsable de la administración
determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto
individual. Además, para administración humana, las preparaciones
deben satisfacer los estándares de esterilidad, pirogenicidad,
seguridad general y pureza requeridos por los estándares de la
"FDA Office of Biologicals".
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "insuficiencia cardiaca" se utiliza ampliamente para
indicar cualquier afección que reduce la capacidad del corazón de
bombear sangre. Como resultado, se desarrollan congestión y edema en
los tejidos. Lo más frecuentemente, la insuficiencia cardiaca está
causada por una contractilidad reducida del miocardio como resultado
de un flujo de sangre coronaria reducido; sin embargo, muchos otros
factores pueden dar como resultado insuficiencia cardiaca,
incluyendo daño en las válvulas cardiacas, deficiencia vitamínica y
enfermedad muscular cardiaca primaria. Aunque los mecanismos
fisiológicos precisos de la insuficiencia cardiaca no se comprenden
enteramente, se cree que la insuficiencia cardiaca implica
trastornos de varias propiedades autónomas cardiacas, incluyendo
respuestas simpáticas, parasimpáticas y barorreceptoras. La
expresión "manifestaciones de insuficiencia cardiaca" se
utiliza ampliamente para abarcar todas las secuelas asociadas a
insuficiencia cardiaca, tales como falta de aliento, edema
crateriforme, hígado ensanchado ablandado, venas del cuello
hinchadas, estertores pulmonares y similares, incluyendo los
hallazgos de laboratorio asociados a insuficiencia cardiaca.
El término "tratamiento" o equivalentes
gramaticales abarca la mejora y/o la reversión de los síntomas de
insuficiencia cardiaca (concretamente la capacidad del corazón de
bombear sangre). La "mejora de la función fisiológica" del
corazón puede evaluarse utilizando cualquiera de las medidas
descritas en la presente memoria (por ejemplo, medida de la fracción
de eyección, acortamiento fraccional, dimensión interna ventricular,
ritmo cardiaco, etc.), así como cualquier efecto sobre la
supervivencia del animal. En el uso de modelos animales, se compara
la respuesta de animales transgénicos tratados y animales
transgénicos no tratados utilizando cualquiera de los ensayos
descritos en la presente memoria (además, pueden incluirse animales
transgénicos tratados y no tratados como controles). Un compuesto
que causa una mejora en cualquier parámetro asociado a insuficiencia
cardiaca utilizado en los procedimientos de examen de la presente
invención puede identificarse así como un compuesto terapéutico.
El término "cardiomiopatía dilatada" designa
un tipo de insuficiencia cardiaca caracterizado por la presencia de
un ventrículo izquierdo dilatado simétricamente con mala función
contráctil sistólica y, además, implica frecuentemente al ventrículo
derecho.
El término "compuesto" designa cualquier
entidad química, farmacéutica, fármaco y similar que pueda
utilizarse para tratar o prevenir una enfermedad, malestar,
afección, o trastorno de la función corporal. Los compuestos
comprenden tanto compuestos terapéuticos conocidos como potenciales.
Puede determinarse que un compuesto es terapéutico mediante examen
utilizando los procedimientos de examen de la presente invención. Un
"compuesto terapéutico conocido" designa un compuesto
terapéutico que ha mostrado (por ejemplo mediante ensayos animales o
experiencia anterior con administración a seres humanos) que es
eficaz en dicho tratamiento. En otras palabras, un compuesto
terapéutico conocido no está limitado a un compuesto eficaz en el
tratamiento de insuficiencia cardiaca.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "agonista" designa moléculas o compuestos que imitan la
acción de un compuesto "nativo" o "natural". Los agonistas
pueden ser homólogos de estos compuestos naturales respecto a la
conformación, carga u otras características. Por tanto, los
agonistas pueden reconocerse mediante receptores expresados en
superficies celulares. Este reconocimiento puede dar como resultado
cambios fisiológicos y/o bioquímicos en la célula, de tal modo que
la célula reacciona ante la presencia del agonista de la misma
manera que si estuviera presente el compuesto natural. Los agonistas
pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o
cualquier otra molécula que interaccione con una molécula, receptor
y/o ruta de interés.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "hipertrofia cardiaca" designa el proceso en el que los
miocitos cardiacos adultos responden al estrés mediante un
crecimiento hipertrófico. Dicho crecimiento se caracteriza por
aumentos del tamaño celular sin división celular, ensamblaje de
sarcómeros adicionales en la célula para maximizar la generación de
fuerza y una activación del programa génico cardiaco fetal. La
hipertrofia cardiaca está a menudo asociada a un riesgo aumentado de
morbilidad y mortalidad, y por tanto los estudios dirigidos a la
comprensión de los mecanismos moleculares de la hipertrofia cardiaca
podrían tener un impacto significativo sobre la salud humana.
Como se utilizan en la presente memoria, los
términos "antagonista" e "inhibidor" designan moléculas o
compuestos que inhiben la acción de un factor celular que puede
estar implicado en hipertrofia cardiaca. Los antagonistas pueden ser
homólogos o no de estos compuestos naturales con respecto a
conformación, carga u otras características. Por tanto, los
antagonistas pueden reconocerse mediante los mismos o diferentes
receptores que son reconocidos por un agonista. Los antagonistas
pueden tener efectos alostéricos los cuales previenen la acción de
un agonista. Como alternativa, los antagonistas pueden prevenir la
función del agonista. En contraposición con los agonistas, los
compuestos antagonísticos no dan como resultado cambios patológicos
y/o bioquímicos en la célula, de modo que la célula reacciona en
presencia del antagonista de la misma manera que si el factor
celular estuviera presente. Los antagonistas e inhibidores pueden
incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o cualquier otra
molécula que se une o interaccione con un receptor, molécula y/o
ruta de interés.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "modular" designa un cambio o una alteración en la
actividad biológica. La modulación puede ser un aumento o reducción
de la actividad proteica, un cambio en las características de unión
o cualquier otro cambio en las propiedades biológicas, funcionales o
inmunológicas asociadas a la actividad de una proteína u otra
estructura de interés. El término "modulador" designa cualquier
molécula o compuesto que es capaz de cambiar o alterar la actividad
biológica como se describe anteriormente.
El término "antagonista de receptor
\beta-adrenérgico" designa un compuesto o
entidad química que es capaz de bloquear, parcial o completamente,
el tipo beta (\beta) de adrenoreceptores (concretamente,
receptores del sistema adrenérgico que responden a catecolaminas,
especialmente norepinefrina). Algunos antagonistas de receptor
\beta-adrenérgico exhiben un grado de
especificidad por un subtipo de receptor (generalmente \beta1);
dichos antagonistas se denominan "antagonistas de receptor
adrenérgico específicos de \beta1" y "antagonistas de
receptor adrenérgico específicos de \beta2". El término
"antagonista de receptor \beta-adrenérgico"
designa compuestos químicos que son antagonistas selectivos y no
selectivos. Los ejemplos de antagonistas de receptor
\beta-adrenérgico incluyen, pero sin limitación,
acebutolol, atenolol, butoxamina, carteolol, esmolol, labetolol,
metoprolol, nadolol, penbutolol, propanolol y timolol. El uso de
derivados de antagonistas de receptor
\beta-adrenérgico conocidos está abarcado por los
procedimientos de la presente invención. Es más, cualquiera
compuesto que se comporte funcionalmente como un antagonista de
receptor \beta-adrenérgico está abarcado por los
procedimientos de la presente invención.
Los términos "inhibidor de enzima conversora de
angiotensina" o "inhibidor de ACE" designan un compuesto o
entidad química que es capaz de inhibir, parcial o completamente, la
enzima implicada en la conversión de la relativamente inactiva
angiotensina I en la activa angiotensina II en el sistema
renina-angiotensina. Además, los inhibidores de ACE
inhiben simultáneamente la degradación de bradiquinina, lo que
probablemente potencia significativamente el efecto antihipertensivo
de los inhibidores de ACE. Los ejemplos de inhibidores de ACE
incluyen, pero sin limitación, benazepril, captopril, enalopril,
fosinopril, lisinopril, quiapril y ramipril. El uso de derivados de
inhibidores de ACE conocidos está abarcado por los procedimientos de
la presente invención. Es más, cualquier compuesto que se comporte
funcionalmente como un inhibidor de ACE está abarcado por los
procedimientos de la presente
invención.
invención.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "genotipo" designa la composición genética real de un
organismo, mientras que "fenotipo" designa los rasgos físicos
presentados por un individuo. Además, el "fenotipo" es el
resultado de la expresión selectiva del genoma (concretamente, es
una expresión del historial celular y su respuesta al entorno
extracelular). Es más, el genoma humano contiene una estimación de
30.000-35.000 genes. En cada tipo celular, sólo se
expresa una pequeña fracción (concretamente 10-15%)
de esos genes.
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar
adicionalmente diversos aspectos de la invención. Debe apreciarse
por los expertos en la técnica que las técnicas dadas a conocer en
los ejemplos siguientes representan técnicas y/o composiciones
descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la
invención, y por tanto puede considerarse que constituyen modos
preferidos para su práctica.
Cultivo celular. Se sembraron miocitos
ventriculares de ratas de un día de edad a baja densidad en MEM con
5% de suero de ternero, y se estudiaron en MEM exento de suero. Se
trataron los cultivos con PE (nº. P6126,
Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO),
IL-1 (nº. 501-RL, R&D Systems,
Minneapolis, MN), TSA (nº. GR-309, BIOMOL Research
Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA) o sus vehículos (ácido
ascórbico para PE; albúmina de suero bovino para
IL-1; dimetilsulfóxido para TSA).
Detección de residuos de lisina
acetilados. Se sometió el extracto celular total a análisis de
transferencia Western utilizando anticuerpos de Cell Signaling
Technology (Beverly, MA) (anticuerpo de lisina acetilada: nº. 9441,
anticuerpo de histona H3 acetilada en la lisina 9: nº. 9671,
anticuerpo de histona H3 acetilada en la lisina 23: nº. 9674,
anticuerpo de histona H3: nº. 9712). Se examinó la localización
nuclear de la histona H3 acetilada mediante inmunotinción utilizando
los mismos anticuerpos.
Cuantificación de la hipertrofia de miocitos y
expresión de ARNm específico de miocitos. Se cuantificó el
crecimiento de miocitos cultivados mediante el contenido de proteína
radiomarcada después de incubación continua con
^{14}C-fenilalanina. Para la evaluación del
programa génico miocítico, se extrajo el ARN total de células con
TRIZol (GIBCO, Carlsbad, California) y se utilizó en un ensayo de
protección de ARNasa con sondas de SERCA,
\alpha/\beta-MyHC, ANP, BNP y
\alpha-actina cardiaca. Todas las muestras
incluían también gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como
control interno para la carga de ARN.
Transfección. Se transfectaron miocitos
utilizando coprecipitación con fosfato de calcio con vectores de
expresión marcados con Flag dirigidos por el promotor de
citomegalovirus para HDAC 1, 4, 5 y plásmidos informadores que
portan los promotores de rata para SERCA (3500 pb), \alphaMyHC
(2900 pb) o \betaMyHC (3300 pb) que activan la expresión del gen
de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Se evaluó la expresión
informadora después de 48 horas como se describió anteriormente, con
corrección de la eficacia de transfección con SEAP (BD Biosciences
Clontech, Palo Alto, CA). Se confirmó la sobreexpresión de HDAC
mediante análisis de transferencia Western utilizando anticuerpo M2
anti-Flag (Sigma-Aldrich Corp., St.
Louis, MO).
La TSA aumenta la acetilación de proteína en
miocitos cardiacos. Los experimentos iniciales se dirigieron a
confirmar que la TSA era capaz de inhibir la actividad HDAC en
miocitos cardiacos, razonando que esto debería dar como resultado un
aumento global de la acetilación de proteína. El grado de
acetilación se determinó utilizando anticuerpos específicos de
residuos de lisina acetilados. Los inventores mostraron tanto
mediante análisis de transferencia Western como mediante análisis de
inmunofluorescencia celular que la exposición a TSA durante 24 horas
aumentaba eficazmente los residuos de lisina acetilados en una serie
de proteínas, y específicamente en aquellas de histona H3.
La TSA potencia el crecimiento inducido por
agonista, pero invierte la represión del gen asociado a la
hipertrofia. Aunque la TSA por sí misma no tuvo efecto sobre el
crecimiento de miocitos, los inventores encontraron que se
potenciaban las respuestas hipertróficas individuales tanto ante PE
como IL-1. Ambos estímulos hipertróficos
desactivaron la expresión de SERCA (Fig. 1A) y \alphaMyHC (Fig.
1B) y la exposición combinada a ambos agonistas dio como resultado
una represión adicional. En contraposición, la TSA aumentó la
expresión basal tanto de ARNm de SERCA2a como de \alphaMyHC. El
pretratamiento con TSA dio también como resultado una inversión
sustancial de la represión de la expresión de SERCA por ambos
estímulos hipertróficos. Notablemente, aunque la TSA dio como
resultado una inversión casi completa del efecto de PE sobre la
expresión de \alphaMyHC, este efecto fue menos prominente en el
caso de células tratadas con IL-1 (o cotratadas).
Los inventores mostraron anteriormente que el cotratamiento de
miocitos cardiacos tanto con PE como con IL-1
suprimía la inducción habitual por PE de la expresión de
\alphaMyHC en casi un 50%. Es intrigante que aunque la TSA no tuvo
efecto sobre la expresión basal ni la inducción por PE de este gen,
aumentó la expresión de \alphaMyHC en presencia de
IL-1 sola e invirtió el efecto de
IL-1 en células cotratadas con
PE/IL-1. Se observó también una inversión similar
con el gen sACT (Wang y Long, datos no publicados). Notablemente, la
TSA no afectó a la expresión génica de la
\alpha-actina cardiaca, ANP ni BNP bajo ninguna
condición de tratamiento hipertrófico (datos no mostrados).
Sobreexpresión de actividades promotoras
reprimidas por HDAC de genes específicos de miocito. De acuerdo
con los estudios de expresión de ARNm para estos genes diana, la TSA
aumentó también las actividades promotoras basales de ambos genes
SERC2 (Fig. 2A) y \alphaMyHC (Fig. 2B), pero no la de \betaMyHC
(Fig. 2C). Además, la contransfección de estos constructos con
vectores de expresión de HDAC 1 ó 4 redujo también las actividades
promotoras de ambos genes SERCA (Fig. 2A) y \alphaMyHC (Fig. 2D).
En contraposición, sin embargo, la HDAC5 no consiguió inhibir las
actividades promotoras de ningún gen a pesar de niveles de expresión
similares a los de otras isoformas (datos no mostrados).
Notablemente, los tres constructos de HDAC fueron capaces de atenuar
el aumento inducido por PE de actividad promotora de \alphaMyHC
(Fig. 2D).
Aislamiento de cardiomiocitos. Se
recogieron corazones de ratas hembra Sprague-Dawley
preñadas de 15 días (Harlan, Houston, TX). Después de triturar en
solución salina tamponada con fosfato, se aislaron los
cardiomiocitos de las fracciones de digestión sucesiva con solución
al 0,1% (p/v) de pancreatina (Sigma, St. Louis, MO). Se recogieron
las fracciones, se resuspendieron en medio de siembra, se reunieron
y después se sembraron durante 2 horas para separar los fibroblastos
de la población de cardiomiocitos. Se recogieron las células
suspendidas y se sembraron en discos de 6 pocillos a 1 x 10^{6}
células/pocillo para experimentos de transfección e
inmunofluorescencia, y a 2 x 10^{6} células en discos de 10 cm
para análisis de ARN.
Ensayo de transcripción. 24 horas después
de la siembra, se transfectaron células con un total de 1 \mug/ml
durante 5 horas utilizando reactivo Lipofectamine Plus (Invitrogen,
Carlsbad, CA). Se incubaron las células transfectadas durante 24
horas y después se trataron durante 24 horas adicionales. Se lisaron
las células y se ensayó en sus lisados la luminiscencia con el
sistema de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI) utilizando un
luminómetro Lucysoft 2 (Rosys Anthos, New Castle, DE).
Quimioluminiscencia. Se sembraron
cardiomiocitos neonatales en placas de 96 pocillos y se trataron
durante 72 horas. Se lavaron las células dos veces con 1 x PBS, se
fijaron en 4% de paraformaldehído/1 x PBS, y se permeabilizaron con
Triton-X100 al 0,1%. Después de bloquear, se
incubaron las células durante 1 h con anticuerpo monoclonal
anti-ANF 10 \mug/ml (Biodesign). Se lavaron dos
veces los pocillos con 1% de BSA/1 x PBS y después se incubaron
durante 1 h con IgG-Fc-HRP de cabra
anti-ratón (Jackson Labs, localización) a 1:1000 en
1 x PBS/1% de BSA. Se lavaron las células dos veces con 1% de BSA/1
x PBS, dos veces con 1 x PBS y después se transfirieron en seco. Se
añadió luminol (Pierce, Rockford, IL) y se detectó la
quimioluminiscencia en un lector de placa Fusion (Perkin
Elmer/Packard).
Análisis de transferencia puntual. Se
aisló el ARN total de cardiomiocitos no tratados, tratados con
fenilefrina, tratados con TSA o cotratados con fenilefrina y TSA. Se
transfirió 1 \mug de ARN a nitrocelulosa (Bio-Rad,
Hercules, CA) y se hibridó a 50ºC durante 14 h con oligonucleótidos
marcados terminales. (ANF,
5'-aatgtgaccaagctgcgt
gacacaccacaagggcttaggatcttttgcgatctgctcaag-3', SEC Nº ID 1; actina \alphaSK 5'-tggagcaaaacagaatggctggctttaatgctt
caagttttccatttcctttccacaggg-3', SEC Nº ID 2; \alphaMyHC, 5'-cgaacgtttatgtttattgtggattggccacagcgagggtctgctggagagg-3', SEC Nº ID 3, \betaMyHC, 5'- gcttat tctgcttccacctaaagggctgttgcaaa ggctccaggtctgagggcttc-3', SEC Nº ID 4, GAPDH, 5'-ggaacatgtagaccatgtag ttgaggtcaatgaag-3', SEC Nº ID 5). Se lavaron las transferencias dos veces con solución de 2 x SSC/0,5% de SDS y se expusieron a película (Kodak, Rochester, NY) o phosphoimager (Amersham Bioscience, Sunnyvale, CA). Se midió la intensidad de la hibridación de las sondas utilizando ImageQuant© (Amersham Bioscience, Sunnyvale, CA).
gacacaccacaagggcttaggatcttttgcgatctgctcaag-3', SEC Nº ID 1; actina \alphaSK 5'-tggagcaaaacagaatggctggctttaatgctt
caagttttccatttcctttccacaggg-3', SEC Nº ID 2; \alphaMyHC, 5'-cgaacgtttatgtttattgtggattggccacagcgagggtctgctggagagg-3', SEC Nº ID 3, \betaMyHC, 5'- gcttat tctgcttccacctaaagggctgttgcaaa ggctccaggtctgagggcttc-3', SEC Nº ID 4, GAPDH, 5'-ggaacatgtagaccatgtag ttgaggtcaatgaag-3', SEC Nº ID 5). Se lavaron las transferencias dos veces con solución de 2 x SSC/0,5% de SDS y se expusieron a película (Kodak, Rochester, NY) o phosphoimager (Amersham Bioscience, Sunnyvale, CA). Se midió la intensidad de la hibridación de las sondas utilizando ImageQuant© (Amersham Bioscience, Sunnyvale, CA).
Inmunotinción. Se recubrieron cubreobjetos
de vidrio con laminina (Invitrogen, Carlsbad, CA) solubilizando la
laminina en 1 x PBS (40 \mug/ml), sumergiendo los cubreobjetos en
la solución y dejándolos secar al aire. Se trataron las células
durante 24 horas, se lavaron, se fijaron durante 10 min con
formaldehído al 3,7%, se lavaron con 1 x PBS y se permeabilizaron
con 1 x PBS que contenía 3% de BSA y 0,1% de NP-40
(Sigma, St. Louis, MO). Los anticuerpos primarios estaban en 1 x PBS
que contenía 3% de BSA y 0,1% de NP-40 durante 30
min, después se lavaron tres veces con 1 x PBS. Se incubaron los
anticuerpos secundarios con FITC o TRITC (Vector Laboratories, Inc.,
Burlingame, CA) (1:200) en la misma solución tampón que los
anticuerpos primarios, después se lavaron con 1 x PBS, se cubrieron
y se visualizaron posteriormente. Se capturaron las imágenes
utilizando una cámara digital (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City,
Japón).
Síntesis de proteína. Se incubaron
cardiomiocitos con leucina tritiada (1,0 \muCi/ml; 172 Ci/mmol de
actividad específica) (ICN Biochemicals, Inc., Irvine, CA) en medio
RPMI tratado (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 6 horas de
incubación, se lavaron dos veces las células con 1 x PBS, después se
incubaron en TCA al 10% en hielo durante 30 min. Después, se lavaron
las células dos veces con TCA al 5%, una vez con agua, y después se
lisaron en NaOH 0,25. Se midieron los lisados en un sexto de volumen
de fluido de centelleo mediante un contador de centelleo (Beckman,
Fullerton, CA).
Protocolo de S6 ribosomal. Después de
bloquear, se incubaron las células en 1% de BSA/1 x PBS que contenía
anti-proteína S6 50 \mug/ml (Cell Signaling,
localización) durante 1 h. Después de lavar, se incubaron las
células con IgG-HRP (Jackson Labs, localización) a
una dilución 1:400. Se lavaron después las células dos veces con 1%
de BSA/1 x PBS, después se transfirieron en seco. Se añadió luminol
(Pierce, Rockford, IL) y se detectó la quimioluminiscencia en un
lector Fusion (Perkin-Elmer/Packard).
Chip génico y análisis. Se aisló ARN
utilizando trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) a partir de
cardiomiocitos neonatales de rata no tratados, tratados con
fenilefrina, tratados con TSA y cotratados con fenilefrina/TSA. Se
prepararon los ARN y se hibridaron con chips U34A (Affymetrix, Inc.,
Santa Clara, CA) según los protocolos de Affymetrix. Se detectó la
intensidad de hibridación, se determinaron los cambios en la
expresión génica y se analizaron mediante Micro Array Suite 5.0
(Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA).
Debido a que las histona desacetilasas (HDAC)
regulan la expresión génica, los inventores analizaron si la
inhibición de HDAC alteraría la expresión de genes asociados a
hipertrofia cardiaca. El factor natriurético auricular (ANF) es uno
de dichos genes, y su expresión aumenta en presencia de agonistas
hipertróficos. Para determinar si la inhibición de HDAC afecta a la
activación del gen ANF, se realizaron experimentos de transfección
con el promotor ANF y se trataron cardiomiocitos transfectados con
fenilefrina y varios inhibidores de HDAC. El tratamiento de
cardiomiocitos con tricostatina (TSA), butirato de sodio (NaBut) o
toxina HC (HC) no activó el promotor ANF. Los inhibidores de HDAC,
sin embargo, bloquearon completamente la activación del promotor
mediante tratamiento con fenilefrina (Fig. 3A). Este efecto fue
específico, debido a que los cardiomiocitos tratados con cada
inhibidor de HDAC solo o junto con fenilefrina aumentaron la
actividad transcripcional del informador CMB-Lac Z
(Fig. 3B), indicando que la acción de estos agentes farmacológicos
era específica del control transcripcional de ANF y no de la
inhibición transcripcional general.
Los inventores examinaron después si dosis
crecientes de TSA y butirato de sodio eran citotóxicas para
cardiomiocitos cultivados. Para determinar la mortalidad celular, se
ensayó la liberación de adenilato quinasa de cardiomiocitos en el
medio de cultivo. Este ensayo es una medida conocida de la
integridad de la membrana celular: las membranas se vuelven más
permeables en células moribundas causando que las células liberen
adenilato quinasa. Aumentar las dosis de TSA (hasta 100 nM) y
butirato de sodio (hasta 25 nM) hizo poco por aumentar la adenilato
ciclasa en el medio de cultivo, indicando una ausencia de muerte
celular aumentada por TSA y butirato de sodio (Fig. 3C y 3D). En los
experimentos de un solo punto temporal, se utilizaron TSA 85 nM o
butirato de sodio 5 mM, de modo que estos resultados indican que la
inactivación de la transcripción de ANF es un efecto directo de la
inhibición de HDAC y no una consecuencia indirecta de la
citotoxicidad por los inhibidores de HDAC.
Para determinar si la expresión génica endógena
es paralela a los resultados de transfección, los inventores
observaron los niveles de ARN endógeno de ANF de cardiomiocitos en
diversas condiciones de tratamiento. El análisis de transferencia
puntual de ARN de cardiomiocitos tratados con fenilefrina mostró un
aumento de aproximadamente 3 veces en la expresión de ANF en
respuesta al tratamiento con fenilefrina; sin embargo, el
cotratamiento de células tratadas con fenilefrina con los diferentes
inhibidores de HDAC (TSA, NaBut o toxina HC) previno la respuesta de
ANF inducida por fenilefrina (Fig. 4A), de acuerdo con los
resultados de transfección citados anteriormente.
Los datos anteriores han mostrado que una baja
dosis de TSA puede inducir la expresión de ANF mediante la
acetilación del locus de ANF y mediante la inactivación del represor
de la transcripción NRSE. Para averiguar si hay un efecto
dependiente de la dosis de los inhibidores de HDAC, los inventores
examinaron la expresión de ANF después de tratar cardiomiocitos
primarios con concentraciones crecientes de TSA (Fig. 4B) y butirato
de sodio (Fig. 4C) en ausencia y presencia de los estimulantes
hipertróficos suero (FBS), fenilefrina (PE) o
endotelina-1 (ET-1). A dosis muy
bajas (0,2 nM) de butirato de sodio (Fig. 4C), los inventores
observaron un aumento de casi dos veces en la expresión de ANF.
Había sólo un aumento marginal con TSA (Fig. 4B). Sin embargo, los
inhibidores de HDAC a todas las demás concentraciones no indujeron
la producción de ANF, y con concentraciones crecientes,
contrarrestaron la inducción de la expresión de ANF observada
normalmente después de tratar cardiomiocitos cultivados con los
estimulantes de crecimiento FBS, PE y ET-1 (Fig. 4B
y C). Las concentraciones mínimas que inhibían la respuesta
hipertrófica de cada estimulante de crecimiento fueron TSA 40 nM y
butirato de sodio 5 mM, que imitaban la reducción de tres a cuatro
veces en la transcripción de ANF observada en la transfección y los
experimentos de transferencia puntual. Estas dosis estaban muy por
debajo del umbral de citotoxicidad.
La hipertrofia cardiaca está asociada a la
reprogramación de genes fetales además de ANF. Los inventores
deseaban determinar si otros miembros de la cascada génica fetal
estaban afectados por el tratamiento con TSA. El análisis
cuantitativo del cambio en veces de la expresión de
\alpha-sk y \betaMyHC, además de ANF, mostró que
la inhibición de HDAC daba como resultado la supresión de otros
genes activados por el estimulante hipertrófico fenilefrina (Fig. 5A
y B). Adicionalmente, además de desactivar la isoforma de cadena de
miosina fetal, isoforma (\betaMyHC), el tratamiento con TSA de
miocitos cardiacos indujo la expresión de \alphaMyHC, la isoforma
de cadena pesada de miosina adulta normalmente reducida en
cardiomiocitos hipertróficos (Fig. 5B). Estos datos tomados
conjuntamente indican que la inhibición de HDAC suprime la
reprogramación transcripcional de la cascada génica asociada a la
hipertrofia cardiomiocítica.
La tinción de proteína ANF mostró que los
cardiomiocitos tratados con fenilefrina o suero inducían una
acumulación perinuclear de proteína ANF en comparación con células
no estimuladas (datos no mostrados). Los cardiomiocitos tratados con
TSA carecían de acumulación de proteína ANF, y la adición de TSA a
cardiomiocitos tratados con fenilefrina o con suero redujo
drásticamente la acumulación de proteína ANF. La tinción
inmunocitoquímica de \alpha-actinina mostró que la
inhibición de HDAC antagonizaba la reorganización del sarcómero,
otro fenómeno asociado a la hipertrofia cardiomiocítica. Los
cardiomiocitos no estimulados mantenían una forma amorfa sin
organización estructural aparente del sarcómero
(\alpha-actinina). Los agonistas hipertróficos
fenilefrina, suero y ET-1 estimulaban potencialmente
la organización del sarcómero como parte de una estructura
citoesquelética altamente ordenada. De forma interesante, la TSA
afectó a la morfología cardiomiocítica. Aunque las células tratadas
con TSA no cambiaron de tamaño, tendían a adquirir una apariencia
"estrellada" al crecer extensiones estrechas desde el cuerpo
principal de la célula. Sin embargo, carecían de la organización del
sarcómero. El efecto del tratamiento con TSA fue más drástico en
presencia de estimulantes del crecimiento, porque afectó a la
morfología hipertrófica inducida normalmente por fenilefrina, suero
o ET-1. Los cardiomiocitos tratados con TSA carecían
de sarcómeros totalmente organizados.
Los inventores determinaron después si la TSA
antagonizaba el aumento de síntesis de proteína asociado normalmente
a la respuesta hipertrófica ensayando los cambios en la síntesis de
proteína y midiendo la acumulación de contenido de proteína de la
subunidad ribosómica S6. La fenilefrina potenció la síntesis de
proteína en los miocitos cardiacos por un factor de 2 después de 6
horas de estimulación; sin embargo, el cocultivo de fenilefrina con
los inhibidores de HDAC TSA y butirato de sodio tuvo poco efecto
sobre la estimulación de la síntesis de proteína inducida
normalmente por fenilefrina (Fig. 6). Sin embargo, 24 horas después
del cotratamiento, los inhibidores de HDAC antagonizaron la síntesis
de proteína inducida normalmente por PE o suero de manera
dependiente de la dosis (Fig. 6). Esto sugiere que la prevención de
la organización del sarcómero por la inhibición de HDAC es un efecto
específico de la regulación de la transcripción.
Trabajos anteriores han mostrado que el
tratamiento con TSA de levadura da como resultado un cambio en la
expresión génica en sólo un subconjunto de genes. Si esto es cierto
para los cardiomiocitos, entonces es posible que un número limitado
de genes sea responsable de la supresión del fenotipo hipertrófico.
Para identificar estos genes, los inventores ensayaron la expresión
de aproximadamente 8.000 genes mediante matriz de chip génico. El
análisis gráfico posterior de los ensayos de expresión entre los
cambios génicos en las células tratadas con fenilefrina y
fenilefrina/TSA revelaron que la mayoría de los genes se agrupaba
linealmente. La mayoría de los transcriptos permanecía relativamente
sin cambios (menos de un cambio de 3 veces en la expresión génica)
entre el chip hibridado con ARN de células tratadas con fenilefrina
y el chip hibridado con ARN de células tratadas con fenilefrina/TSA.
Esto sugiere que el número relativo de genes responsables de la
supresión del crecimiento de cardiomiocito inducido por fenilefrina
mediante tratamiento con TSA es bajo.
A partir del número reducido de genes cuyos
niveles de expresión se alteraron por fenilefrina, TSA o su
combinación, los inventores identificaron siete genes que tenían una
diferencia consistente de dos o más veces entre los grupos de
tratamiento con fenilefrina y tratados con TSA: fenilefrina/TSA y
TSA. Se activaron tres genes por el tratamiento con fenilefrina y se
desactivaron por TSA: citocromo oxidasa subunidad VIII, proteína de
complejo T de ratón y proteína 3 de unión a factor de crecimiento de
insulina (Fig. 7A).Los 4 genes desactivados por fenilefrina y
activados por TSA fueron proteína grande asociada al microtúbulo
tau, ubiquitina hidrolasa carboxil-terminal,
glicoproteína de superficie celular de Thy-1 y
antígeno MyHC de clase I (Fig. 7B). El análisis Northern confirmó
los resultados de expresión de la matriz de chip génico (datos no
mostrados).
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1. Uso de un inhibidor de histona desacetilasa en
la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hipertrofia
cardiaca patológica e insuficiencia cardiaca.
2. Uso de la reivindicación 1, en el que dicho
inhibidor de histona desacetilasa se selecciona del grupo
constituido por tricostatina A, trapoxina B, MS
275-27, bis-hidroxamida del ácido
m-carboxicinámico, depudecina, oxamflatina, apicidina,
suberoilanilida del ácido hidroxámico, Scriptaid, piroxamida,
3-(4-aroil-1H-pirrol-2-il)-N-hidroxi-2-propenamida
del ácido
2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico
y FR 901228.
3. Uso de la reivindicación 1, en el que el
medicamento se formula para administración intravenosa.
4. Uso de la reivindicación 1, en el que el
medicamento se formula para administración oral, transdérmica, por
liberación sostenida, en supositorio o sublingual.
5. Uso de la reivindicación 1, en el que el
medicamento se formula para su administración junto con un segundo
fármaco terapéutico.
6. Uso de la reivindicación 5, en el que dicho
segundo fármaco terapéutico se selecciona del grupo constituido por
un betabloqueante, un ióntropo, un diurético, un
ACE-I o antagonista de AII y un bloqueante de
Ca^{++}.
7. Uso de la reivindicación 5, en el que dicho
segundo fármaco terapéutico se formula para su administración en el
mismo momento que dicho medicamento inhibidor de histona
desacetilasa.
8. Uso de la reivindicación 5, en el que dicho
segundo fármaco terapéutico se formula para su administración antes
o después de la administración de dicho medicamento inhibidor de
histona desacetilasa.
9. Uso de la reivindicación 1, en el que el
tratamiento de hipertrofia cardiaca patológica comprende la mejora
de uno o más síntomas de hipertrofia cardiaca.
10. Uso de la reivindicación 9, en el que dichos
uno o más síntomas de hipertrofia cardiaca se selecciona(n)
de una capacidad de ejercicio aumentada, un volumen incrementado de
eyección de sangre, presión diastólica ventricular izquierda
terminal, presión capilar pulmonar de enclavamiento, rendimiento
cardiaco, índice cardiaco, presiones arteriales pulmonares,
dimensiones sistólica y diastólica ventricular izquierda terminal,
tensión de pared ventricular izquierda y derecha o tensión de pared,
morbilidad y mortalidad relacionados con la enfermedad.
11. Uso de un inhibidor de histona desacetilasa
en la fabricación de un medicamento para la prevención de
hipertrofia cardiaca patológica e insuficiencia cardiaca.
12. Uso de la reivindicación 11, en el que dicho
inhibidor de histona desacetilasa se selecciona del grupo
constituido por tricostatina A, trapoxina B, MS
275-27, bis-hidroxamida del ácido
m-carboxicinámico, depudecina, oxamflatina, apicidina,
suberoilanilida del ácido hidroxámico, Scriptaid, piroxamida,
3-(4-aroil-1H-pirrol-2-il)-N-hidroxi-2-propenamida
del ácido
2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico
y FR 901228.
13. Uso de la reivindicación 11, en el que el
medicamento se formula para administración intravenosa.
14. Uso de la reivindicación 11, en el que el
medicamento se formula para administración oral, transdérmica, por
liberación sostenida, en supositorio o sublingual.
15. Uso de la reivindicación 11, en el que el
medicamento se formula para su administración a un paciente que
exhibe uno o más de hipertensión incontrolada de larga duración,
enfermedad valvular no corregida, angina crónica y/o infarto de
miocardio reciente.
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