ES2236415T3 - Inhibicion de la histona desacetilasa para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca. - Google Patents

Abstract

Uso de un inhibidor de histona desacetilasa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hipertrofia cardiaca patológica e insuficiencia cardiaca.

Description

Inhibición de la histona desacetilasa para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca.

Antecedentes de la invención

El gobierno posee derechos sobre la presente invención de acuerdo con el número de subvención NIH RO1 HL61544 de los National Institutes of Health. La presente invención reivindica el beneficio de la prioridad sobre los documentos de nº. de serie provisional U.S. 60/325.311, presentado el 27 de septiembre de 2001 y 60/334.041, presentado el 31 de octubre de 2001.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de inhibidores de HDAC para tratar hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiaca.

2. Descripción de la técnica relacionada

La hipertrofia cardiaca en respuesta a una carga de trabajo aumentada impuesta al corazón es un mecanismo adaptativo fundamental. Es un proceso especializado que refleja un aumento cuantitativo del tamaño y masa celulares (en lugar del número de células) como resultado de cualquiera o una combinación de estímulos neurales, endocrinos o mecánicos. La hipertensión, otro factor implicado en la hipertrofia cardiaca, es un precursor frecuente de insuficiencia cardiaca congestiva. Cuando aparece insuficiencia cardiaca, el ventrículo izquierdo habitualmente se hipertrofia y se dilata, y se reducen los índices de función sistólica, tales como la fracción de eyección. Claramente, la respuesta hipertrófica cardiaca es un síndrome complejo y la elucidación de las rutas que conducen a la hipertrofia cardiaca será beneficiosa en el tratamiento de enfermedades cardiacas resultantes de diversos estímulos.

Una familia de factores de transcripción, la familia del factor 2 potenciador de miocito (MEF2), está implicada en la hipertrofia cardiaca. Por ejemplo, una variedad de estímulos puede elevar el nivel de calcio intracelular, dando como resultado una cascada de sistemas de señalización o rutas intracelulares, incluyendo calcineurina, CAM quinasas, PKC y MAP quinasas. Todas estas señales activan el MEF2 y dan como resultado hipertrofia cardiaca. Sin embargo, no se comprende aún completamente cómo los diversos sistemas de señalización ejercen sus efectos sobre el MEF2 y modulan su señalización hipertrófica. Es conocido que ciertas proteínas histona desacetilasas, HDAC 4, HDAC 5, HDAC 7, HDAC 9 y HDAC 10, están implicadas en la modulación de la actividad MEF2.

Se han clonado once HDAC diferentes de organismos vertebrados. Todas comparten homología en la región catalítica. Las histona acetilasas y desacetilasas desempeñan un papel importante en el control de la expresión génica. El equilibrio entre actividades de histona acetilasas, habitualmente denominadas acetiltransferasas (HAT) y desacetilasas (HDAC), determina el nivel de acetilación de histona. En consecuencia, las histonas acetiladas causan la relajación de la cromatina y la activación de la transcripción génica, mientras que la cromatina desacetilada es generalmente transcripcionalmente inactiva. En un informe previo, el laboratorio de los inventores demostró que HDAC 4 y 5 dimerizan con MEF2 y reprimen la actividad transcripcional de MEF2 y, además, que esta interacción requiere la presencia de la terminación N de las proteínas HDAC 4 y 5. McKinsey et al. (2000 a, b).

En un contexto distinto, recientes investigaciones han destacado también el importante papel de las HDAC en la biología del cáncer. De hecho, se está ensayando en diversos inhibidores de HDAC su capacidad de inducir la diferenciación y/o apoptosis celular en células cancerosas. Marks et al. (2000). Dichos inhibidores incluyen suberoilanilida de ácido hidroxámico (SAHA) (Butler et al., 2000; Marks et al., 2001); bis-hidroxamida del ácido m-carboxicinámico (Coffey et al., 2001) y piroxamida (Butler et al., 2001). Estos estudios se han resumido en la indicación de que "los HPC basados en ácido hidroxámico, particularmente SAHA y piroxamida, son inhibidores potentes de HDAC in vitro e in vivo, e inducen la detención del crecimiento, la diferenciación o la muerte celular apoptótica de células transformadas ... [y por tanto] son compuestos importantes entre la familia de los HPC basados en ácido hidroxámico y están actualmente en ensayos clínicos de fase I". Marks et al. (2000). Hasta la fecha, no se han reseñado informes sobre los efectos de los inhibidores de HDAC sobre la hipertrofia de células musculares y la respuesta al estrés.

Sumario de la invención

Por tanto, según la presente invención, se proporciona el uso de inhibidores de histona desacetilasa para la preparación de un medicamento para tratar hipertrofia cardiaca patológica e insuficiencia cardiaca, que comprende (a) identificar un paciente que tiene hipertrofia cardiaca; y (b) administrar al paciente un inhibidor de histona desacetilasa. Administrar puede comprender administración intravenosa, oral, transdérmica, por liberación sostenida, en supositorio o sublingual. El tratamiento puede comprender además administrar un segundo régimen terapéutico tal como un betabloqueante, un ióntropo, diurético, ACE-I, antagonista de AII o bloqueante de Ca^{++}. El segundo régimen terapéutico puede administrarse al mismo tiempo que el inhibidor de histona desacetilasa, o antes o después que el inhibidor de histona desacetilasa. El tratamiento puede mejorar uno o más síntomas de insuficiencia cardiaca tales como proporcionar una capacidad de ejercicio aumentada, un volumen de eyección de sangre, presión diastólica ventricular izquierda terminal, presión capilar pulmonar de enclavamiento, rendimiento cardiaco, índice cardiaco, presiones arteriales pulmonares, dimensiones sistólica y diastólica ventricular izquierda terminal, tensión de pared ventricular izquierda y derecha, tensión de pared y grosor de pared, morbilidad y mortalidad aumentados relacionados con la enfermedad.

En aún otra realización, se proporciona el uso de inhibidores de histona desacetilasa para la preparación de un medicamento para prevenir hipertrofia cardiaca patológica e insuficiencia cardiaca, que comprende: (a) identificar un paciente con riesgo de desarrollar hipertrofia cardiaca; y (b) administrar al paciente un inhibidor de histona desacetilasa. La administración puede comprender administración intravenosa, oral, transdérmica, por liberación sostenida, en supositorio o sublingual. El paciente con riesgo puede exhibir una o más de hipertensión incontrolada de larga duración, enfermedad valvular no corregida, angina crónica y/o infarto de miocardio reciente.

Según las realizaciones precedentes, el inhibidor de histona desacetilasa puede ser cualquier molécula que efectúe una reducción de la actividad de una histona desacetilasa. Esto incluye proteínas, péptidos, moléculas de ADN (incluyendo ADN sin sentido), moléculas de ARN (incluyendo ARNi y sin sentido) y moléculas pequeñas. Las moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitación, tricostatina A, (TSA), trapoxina B, MS 275-27, bis-hidroxamida del ácido m-carboxicinámico, depudecina, oxamflatina, apicidina, suberoilanilida del ácido hidroxámico, Scriptaid, piroxamida, 3-(4-aroil-1H-pirrol-2-il)-N-hidroxi-2-propenamida del ácido 2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico y FR 901228. Adicionalmente, las siguientes referencias describen inhibidores de histona desacetilasa que pueden seleccionarse para uso en la presente invención: documentos AU 9.013.101, AU 9.013.201, AU 9.013.401, AU 6.794.700, EP 1.233.958, EP 1.208.086, EP 1.174.438, EP 1.173.562, EP 1.170.008, EP 1.123.111, JP 2001/348340, U.S. 2002/103192, U.S. 2002/65282, U.S. 2002/61860, WO 02/51842, WO 02/50285, WO 02/46144, WO 02/46129, WO 02/30879, WO 02/26703, WO 02/26696, WO 01/70675, WO 01/42437, WO 01/38322, WO 01/18045, WO 01/14581, Furumai et al., (2002), Hinnebusch et al. (2002), Mai et al. (2002), Vigushin et al. (2002), Gottlicher et al., (2001), Jung (2001), Komatsu et al. (2001); Su et al. (2000).

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentada en la presente memoria.

Fig. 1A-C. La TSA altera la represión génica inducida por agonista. Se trataron miocitos cardiacos cultivados con PE (20 \mumol/l) o IL-1 (1 ng/ml) durante 48 h. Se añadió TSA (30 nmol/l) 30 min antes del tratamiento con PE o IL-1. Se ensayó la expresión de ARNm específico de miocito (SERCA2a (Fig. 1A), \alphaMyHC (Fig. 1B), \betaMyHc (Fig. 1C)) en 5 \mug de ARN total mediante el ensayo de protección de ARNasa. Los datos medios son de 4 cultivos, y se presentan como % del control después de normalización con la señal GAPDH.

Fig. 2A-D. La sobreexpresión de HDAC reprime promotores específicos de músculo. Se transfectaron miocitos cultivados durante 72 h con vectores de expresión (2 \mug por \sim3 x 10^{5} células) de HDAC 1, 4, 5 marcado con Flag (o su vector de cadena principal) y marcadores CAT (5 \mug) para genes SERCA (Fig. 2A), \alphaMyHC (Fig. 2B), \betaMyHC (Fig. 2C y 2D), más fosfatasa alcalina secretada impulsada por SV40 (SEAP, 1 \mug, Clontech). Se utilizó TSA a 30 nmol/l, y se añadió justo después de la transfección. Se añadió PE 22 (20 \mumol/l) 24 h después, y se realizaron ensayos de CAT después de 48 horas adicionales. Los datos medios son de n= 3 cultivos diferentes, y se presentan como % de pCMV después de normalización de la actividad SEAP en el medio. Se confirmó la sobreexpresión de HDAC por transferencia Western de Flag.

Fig. 3A-D. Los inhibidores de HDAC bloquean la activación del informador ANF mediante fenilefrina sin citotoxicidad. Se cotransfectaron cardiomiocitos de rata neonatal con un total de 1 \mug de fragmento promotor ANF de 3 kB y plásmidos CMV-Lac Z. (Fig. 3A) El promotor ANF es mínimamente activo en cardiomiocitos no estimulados. La adición de inhibidores de HDAC no induce la actividad promotora ANF, pero el cotratamiento de cardiomiocitos con fenilefrina y un inhibidor de HDAC (TSA (85 nM), NaBut (5 mM) o toxina HC (5 ng/ml)) prevenía la activación del promotor ANF mediante fenilefrina (100 \muM). (Fig. 3B) Expresión de lac Z mediante el promotor constitutivo CMV. El tratamiento con inhibidores de HDAC aumentó la actividad CMV con y sin cotratamiento con fenilefrina. (Fig. 3C y 3D) Las gráficas muestran que las medidas de actividad adenilato quinasa permanecen constantes en el medio después de X horas de cultivar cardiomiocitos en ausencia o presencia de los estimulantes hipertróficos FBS, PE o ET-1.

Fig. 4A-C. Los inhibidores de HDAC previenen la expresión de ANF endógeno inducida normalmente por agonistas hipertróficos. (Fig 4A) La gráfica muestra la suma de diversos experimentos de transferencia puntual (n= 4). Como en los experimentos de transfección, la fenilefrina (100 \muM) induce la expresión de ANF más de tres veces. El tratamiento con inhibidores de HDAC (TSA 85 nM, butirato de sodio 5 mM, toxina HC 5 ng/ml) bloquea la acumulación del mensaje ANF. (Fig. 4B y C) Las gráficas muestran una reducción de la detección quimioluminiscente de ANF en el medio de cultivo con concentraciones crecientes de los inhibidores de HDAC TSA (Fig. 4B) y butirato de sodio (Fig. 4C) cuando se cocultivan con los estimulantes hipertróficos FBS, PE o ET-1.

Fig. 5A-B. El tratamiento de cardiomiocitos con inhibidores de HDAC bloquea el programa génico fetal asociado a hipertrofia cardiomiocítica. (Fig. 5A) La gráfica muestra los cambios en número de veces de la expresión de \alphaSK-actina por fenilefrina y la falta de activación génica en muestras tratadas con TSA. (Fig. 5B) La gráfica muestra los cambios en número de veces de la expresión de ARN de \alphaMyHC y \betaMyHC. El tratamiento con fenilefrina induce la activación de la expresión de \betaMyHC (gen fetal) en cardiomiocitos; mientras que la fenilefrina sola no activa el gen \alphaMyHC, la isoforma adulta. El tratamiento con TSA previno la activación de \betaMyHC, pero estimuló la expresión de \alphaMyHC. Las gráficas representan tres o más experimentos independientes.

Fig. 6. Los efectos del tratamiento con TSA sobre la reorganización de los sarcómeros y la síntesis de proteína. Las gráficas de las medidas de proteína ribosómica S6 en cardiomiocitos muestran que la fenilefrina y el suero aumentan la síntesis de proteína en cardiomiocitos. El tratamiento de cardiomiocitos con TSA no altera este aumento después de 6 horas (gráficos a la izquierda). Los gráficos a la derecha muestran el contenido de proteína ribosómica S6 en cardiomiocitos después de 24 horas de cotratamiento con PE y concentraciones crecientes de TSA, o con suero y concentraciones crecientes de TSA.

Fig. 7A-B. La TSA induce la activación de genes que están implicados en la diferenciación de cardiomiocitos. (Fig. 7A) Se activaron tres genes por la fenilefrina y se desactivaron por la TSA. (Fig. 7B) Se inactivaron cuatro genes por la fenilefrina y se activaron por la TSA (resultados de un chip de fenilefrina, dos chips de fenilefrina/TSA y un chip de TSA).

Descripción de las realizaciones ilustrativas

La insuficiencia cardiaca es una de las causas principales de morbilidad y mortalidad en el mundo. Sólo en los EE.UU., las estimaciones indican que 3 millones de personas viven actualmente con cardiomiopatía y otras 400.000 se diagnostican cada año. La cardiomiopatía dilatada (DCM), también designada como "cardiomiopatía congestiva", es la forma más común de cardiomiopatía y tiene una prevalencia estimada de casi 40 por 100.000 individuos (Durand et al, 1995). Aunque existen otras causas de DCM, la cardiomiopatía dilatada familiar se ha indicado como representativa de aproximadamente un 20% de la DCM "idiopática". Aproximadamente la mitad de los casos de DCM son idiopáticos, estando asociado el resto a procesos patológicos conocidos. Por ejemplo, ciertos fármacos utilizados en la quimioterapia del cáncer (por ejemplo, doxorubicina y daunorubicina) pueden dar como resultado una grave lesión miocárdica. Además, muchos pacientes con DCM son alcohólicos crónicos. Afortunadamente para estos pacientes, la progresión de la disfunción miocárdica puede detenerse o invertirse si se reduce o se detiene el consumo de alcohol al principio del transcurso de la enfermedad. La cardiomiopatía periparto es otra forma idiopática de DMC, así como la enfermedad asociada a secuelas infecciosas. En suma, las cardiomiopatías, incluyendo DMC, son problemas de salud pública significativos.

Ya que la cardiomiopatía misma no produce típicamente ningún síntoma hasta que el daño cardiaco es suficientemente grave para producir insuficiencia cardiaca, los síntomas de cardiomiopatía son los asociados a insuficiencia cardiaca. Estos síntomas incluyen falta de aliento, fatiga con el ejercicio, incapacidad de tumbarse sin faltar el aliento (ortopnea), dispnea nocturna paroxísmica, dimensiones cardiacas ensanchadas y/o hinchamiento de la parte inferior de las piernas. Los pacientes presentan también a menudo presión sanguínea aumentada, sonidos extracardiacos, murmullos cardiacos, embolias pulmonares y sistémicas, dolor de pecho, congestión pulmonar y palpitaciones. Además, la DCM causa fracciones de eyección reducida (concretamente una medida tanto de la función sistólica intrínseca como de la remodelación). La enfermedad se caracteriza adicionalmente por dilatación ventricular y función sistólica gravemente alterada debido a la contractilidad miocárdica disminuida, lo que da como resultado insuficiencia cardiaca dilatada en muchos pacientes. Los corazones afectados experimentan también remodelación celular/cameral como resultado de la disfunción miocitíca/miocárdica, que contribuye al "fenotipo DCM". A medida que progresa la enfermedad, los síntomas progresan también. Los pacientes con cardiomiopatía dilatada tienen también una incidencia aumentada en gran medida de arritmias con riesgo para la vida, incluyendo taquicardia ventricular y fibrilación ventricular. En estos pacientes, un episodio de síncope (desmayo) se considera como precursor de muerte repentina.

El diagnóstico de cardiomiopatía dilatada depende típicamente de la demostración de cámaras cardiacas agrandadas, particularmente ventrículos agrandados. El agrandamiento es observable habitualmente con rayos X pectorales, pero se evalúa más exactamente utilizando ecocardiogramas. La DCM es a menudo difícil de distinguir de miocarditis aguda, enfermedad cardiaca valvular, enfermedad arterial coronaria y enfermedad cardiaca hipertensiva. Una vez se ha realizado el diagnóstico de cardiomiopatía dilatada, se hacen todo tipo de esfuerzos por identificar y tratar las causas potencialmente reversibles y prevenir daño cardiaco adicional. Por ejemplo, la enfermedad arterial coronaria y la enfermedad cardiaca valvular deben descartarse. Hay que dirigirse a anemia, taquicardias anormales, deficiencias nutricionales, alcoholismo, enfermedad tiroidea y/u otros problemas y controlarlos.

Durante los intentos de identificar y estabilizar la causa subyacente de la cardiomiopatía, se instituye generalmente un tratamiento para minimizar los síntomas y optimizar la eficacia del corazón defectuoso. La medicación sigue siendo lo más importante del tratamiento, aunque no hay tratamientos específicos para cardiomiopatía dilatada distintos de los utilizados en los casos de insuficiencia cardiaca en general. La cirugía de transplante es una opción. Es más, la cardiomiopatía dilatada se ha indicado como la causa más común de transplante cardiaco en los EE.UU.

El tratamiento no farmacológico se utiliza principalmente como coadyuvante del tratamiento farmacológico. Un medio de tratamiento no farmacológico implica reducir el sodio en la dieta. Además, el tratamiento no farmacológico abarca también la eliminación de ciertos fármacos desencadenantes, incluyendo agentes inotrópicos negativos (por ejemplo ciertos bloqueantes de canal de calcio y fármacos antiarrítmicos como disopiramida), cardiotoxinas (por ejemplo anfetaminas) y expansores del volumen plasmático (por ejemplo agentes antiinflamatorios no esteroideos y glucocorticoides).

El tratamiento con agentes farmacológicos representa el mecanismo primario para reducir o eliminar las manifestaciones de insuficiencia cardiaca. Los diuréticos constituyen la primera línea de tratamiento para insuficiencia cardiaca leve a moderada. Desgraciadamente, muchos de los diuréticos utilizados habitualmente (por ejemplo las tiazidas) tienen numerosos efectos adversos. Por ejemplo, ciertos diuréticos pueden aumentar el colesterol y triglicéridos séricos. Además, los diuréticos son generalmente ineficaces para pacientes que padecen insuficiencia cardiaca grave.

Si los diuréticos son ineficaces, pueden utilizarse agentes vasodilatadores; los inhibidores de enzima conversora de angiotensina (ACE) (por ejemplo enalopil y lisinopril) no sólo proporcionan alivio sintomático, sino que se ha reseñado también que reducen la mortalidad (Young et al., 1989). De nuevo, sin embargo, los inhibidores de ACE están asociados a efectos adversos que dan como resultado que estén contraindicados en pacientes con ciertos estados patológicos (por ejemplo estenosis arterial renal).

De forma similar, la terapia con agente inotrópico (es decir, un fármaco que mejora el rendimiento cardiaco aumentando la fuerza de la contracción del músculo miocárdico) puede estar también indicada si los diuréticos no dan como resultado un alivio adecuado. El agente inotrópico más habitualmente utilizado por pacientes ambulatorios es digital. Sin embargo, está asociado a una serie de reacciones adversas, incluyendo problemas gastrointestinales y disfunción del sistema nervioso central.

Por tanto, los agentes farmacológicos utilizados habitualmente tienen graves inconvenientes en poblaciones particulares de pacientes. La disponibilidad de nuevos agentes seguros y eficaces sería indudablemente beneficiosa para pacientes que no pueden utilizar las modalidades farmacológicas actualmente disponibles o que no reciben un alivio adecuado por estas modalidades. El pronóstico para pacientes con DCM es variable, y depende del grado de disfunción ventricular, ocurriendo la mayoría de muertes al cabo de cinco años del diagnóstico.

I. La presente invención

Los inventores han mostrado anteriormente que el MEF2 se activa por la fosforilación por MAP quinasa de tres sitios conservados en su dominio de activación carboxi-terminal (véase Katoh, et al., 1998). La señalización de CaMK activa también el MEF2 al fosforilar las HDAC de clase II, las cuales se expresan a altos niveles en corazón adulto, en el que pueden reprimir la actividad MEF2. Tras la fosforilación, estas HDAC se unen a 14-3-3, y se disocian de MEF2, con translocación resultante al núcleo y activación de la transcripción dependiente de MEF2. Los mutantes de HDAC de clase II que no pueden fosforilarse no pueden separarse de MEF2 y bloquean irreversiblemente la expresión de genes diana MEF2.

El documento WO 01/14581 da a conocer que las enzimas HDAC desempeñan un papel inhibitorio importante en la hipertrofia cardiaca. Aumentar la actividad enzimática de HDAC se describe como curativo para la hipertrofia cardiaca.

Se ha mostrado también que un adenovirus que codifica un mutante no fosforilable de HDAC 5 es capaz de prevenir la hipertrofia cardiomiocítica in vitro en respuesta a diversas rutas de señalización (véase, Lu et al., 2000). Estos hallazgos sugieren que la fosforilación de estos sitios conservados en HDAC de clase II es una etapa esencial para iniciar la hipertrofia cardiaca. Basándose en este hallazgo, podría esperarse que la inhibición de la actividad HDAC por TSA daría como resultado la inducción de hipertrofia cardiaca debido a la depresión de los genes sensibles hipertróficos. Por el contrario, los presentes inventores encontraron en cambio que la TSA realmente previene la hipertrofia cardiaca. Estos hallazgos inesperados sugieren que son necesarias al menos algunas HDAC para hipertrofia, y que la inhibición de la actividad catalítica de HDAC puede prevenir la activación de genes hipertróficos.

¿Cómo pueden explicarse estos resultados aparentemente conflictivos?. Un modelo argumenta que las HDAC de clase I y II pueden controlar distintos conjuntos de genes en los cardiomiocitos. Según este modelo, las HDAC de clase II interaccionan con y reprimen la actividad de factores de transcripción tales como MEF2, que son necesarios para la hipertrofia, lo que explicaría porqué mutantes no fosforilables de HDAC de clase II bloquean la hipertrofia. En contraposición, se propone que las HDAC de clase I, HDAC 1 y HDAC 3 particularmente, suprimen la expresión de genes antihipertróficos. Por tanto, la exposición de cardiomiocitos a TSA daría como resultado la desrepresión de estos genes antihipertróficos y un bloqueo de la hipertrofia. Este modelo predice también que la actividad de dichos genes antihipertróficos sería dominante frente a la actividad de las HDAC de clase II, puesto que ellos también se reprimen por TSA, lo que se esperaría que desreprimiera el programa hipertrófico.

En cualquier caso, e independientemente de la base molecular precisa, la presente invención muestra que, sorprendentemente, los inhibidores de HDAC son beneficiosos en el tratamiento de hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiaca.

II. Histona desacetilasa

Los nucleosomas, el esqueleto principal del plegamiento de cromatina, son estructuras macromoleculares dinámicas que influyen en las conformaciones de solución de cromatina (Workman y Kingston, 1998). El núcleo de nucleosoma está compuesto por las proteínas histonas H2A, HB, H3 y H4. La acetilación de histona causa que los nucleosomas y organizaciones nucleosómicas se comporten con propiedades biofísicas alteradas. El equilibrio entre actividades histona acetiltransferasas (HAT) y desacetilasas (HDAC) determina el nivel de acetilación de histona. Las histonas acetiladas causan la relajación de la cromatina y la activación de la transcripción génica, mientras que la cromatina desacetilada es generalmente transcripcionalmente inactiva.

Se han clonado once HDAC diferentes de organismos vertebrados. Las tres primeras HDAC humanas identificadas fueron HDAC 1, HDAC 2 y HDAC 3 (denominadas HDAC humanas de clase I), y la HDAC 8 (Van den Wyngaert et al., 2000) se ha añadido a esta lista. Recientemente, se han clonado e identificado (Grozinger et al., 1999; Zhou et al. 2001; Tong et al., 2002) las HDAC humanas de clase II HDAC 4, HDAC 5, HDAC 6, HDAC 7, HDAC 9 y HDAC 10 (Kao et al. 2000). Adicionalmente, se ha identificado la HDAC 11, pero no se ha clasificado todavía como de clase I o clase II (Gao et al., 2002). Todas comparten homología en la región catalítica. Las HDAC 4, 5, 7, 9 y 10, sin embargo, tienen una extensión amino-terminal única no encontrada en otras HDAC. Esta región amino-terminal contiene el dominio de unión a MEF2. Se ha mostrado que las HDAC 4, 5 y 7 están implicadas en la regulación de la expresión génica cardiaca y, en realizaciones particulares, en la represión de la actividad transcripcional de MEF2. El mecanismo exacto mediante el que las HDAC de clase II reprimen la actividad MEF2 no se comprende totalmente. Es una posibilidad que la unión de HDAC a MEF2 inhiba la actividad transcripcional de MEF2, competitivamente o bien desestabilizando la conformación nativa transcripcionalmente activa de MEF2. También es posible que las HDAC de clase II requieran dimerización con MEF2 para localizar o posicionar la HDAC en la proximidad de histonas para que proceda la desacetilación.

III. Inhibidores de desacetilasa

Se han identificado una variedad de inhibidores de histona desacetilasa. Los usos propuestos varían ampliamente, pero se enfocan principalmente en la terapia del cáncer. Saunders et al. (1999), Jung et al. (1997), Jung et al. (1999), Vigushin et al. (1999), Kim et al. (1999), Kitazomo et al. (2001), Vigusin et al. (2001), Hoffmann et al. (2001), Kramer et al. (2001), Massa et al. (2001), Komatsu et al. (2001), Han et al. (2001). Dicha terapia es el objeto de un ensayo clínico en fase I patrocinado por los NIH para tumores sólidos y linfoma no de Hodgkin. Las HDAC aumentan también la transcripción de transgenes, constituyendo así un posible coadyuvante para la terapia génica. Yamano et al. (2000), Su et al. (2000).

Las HDAC pueden inhibirse mediante una serie de mecanismos diferentes, proteínas, péptidos y ácidos nucleicos (incluyendo moléculas sin sentido y de ARNi). Los procedimientos son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica de clonación, transferencia y expresión de constructos genéticos, que incluyen vectores virales y no virales y liposomas. Los vectores virales incluyen adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, virus Vaccinia y herpesvirus.

Se contemplan también inhibidores de molécula pequeña. Quizás el inhibidor de molécula pequeña más ampliamente conocido de la función de HDAC sea la tricostatina A, un ácido hidroxámico Se ha mostrado que induce la hiperacetilación y causa la reversión de células transformadas con ras a morfología normal (Taunton et al., 1996) e induce la inmunosupresión en un modelo de ratón (Takahashi et al., 1996). Está comercialmente disponible en BIOMOL Research Labs, Inc., Plymouth Meeting, PA.

Las siguientes referencias describen todas inhibidores de HDAC que pueden encontrar uso en la presente invención: documentos AU 9.103.101, AU 9.013.201, AU 9.013.401, AU 6.794.700, EP 1.233.958, EP 1.208.086, EP 1.174.438, EP 1.173.562, EP 1.170.008, EP 1.123.111, JP 2001/348340, US 2002/103192, US 2002/65282, US 2002/61860, WO 02/51842, WO 02/50285, WO 02/46144, WO 02/46129, WO 02/30879, WO 02/26703, WO 02/26696, WO 01/70675, WO 01/42437, WO 01/38322, WO 01/18045, WO 01/14581, Furumai et al. (2002), Hinnebusch et al. (2002), Mai et al. (2002), Vigushin et al. (2002), Gottlicher et al. (2001), Jung (2001), Komatsu (2001), Su et al. (2000).

Se muestran ejemplos de algunos inhibidores específicos de HDAC en la Tabla 1.

TABLA 1

Inhibidor	Tipo de compuesto	Organismo
Trapoxina B	Derivado de porfirina	H. ambiens
MS-27-275	Derivado de benzamida
Scriptaid	Ácido hidroxámico
FR901228	Ciclopéptido	C. violaceum
		(nº 968)
Depudecina	Metabolito fúngico	A. brassiciola
Oxamflatina	Sulfonamida aromática
Piroxamida (suberoil-3-aminopiridinamida del ácido
hidroxámico)	Ácido hidroxámico
Ácido 2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico (AEO)	Cetona
3-(4-Aroil-1H-pirrol-2-il)-N-hidroxi-2-propenamida	Propenamida
Suberoilanilida del ácido hidroxámico	Ácido hidroxámico
Bis-hidroxiamida de ácido m-carboxicinámico	Ácido hidroxámico

TABLA 1 (continuación)

Inhibidor	Tipo de compuesto	Organismo
Apicidina^{1}	Ciclopéptido	Fusarium spp.
CHAP1 (tricostatina A + trapoxina B)	Derivados hidroxámico/de porfirina
^{1}ciclo(N-O-metil-L-triptofanil-L-isoleucinil-D-pipecolinil-L-2-amino-8- oxodecanoílo)

IV. Procedimientos de tratamiento de hipertrofia cardiaca A. Regímenes terapéuticos

En una realización de la presente invención, se proporciona el uso de inhibidores de HDAC para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hipertrofia cardiaca. Con los fines de la presente solicitud, el tratamiento comprende reducir uno o más de los síntomas de hipertrofia cardiaca, tales como capacidad de ejercicio reducida, volumen de eyección de sangre reducido, presión diastólica ventricular izquierda terminal aumentada, presión capilar pulmonar de enclavamiento aumentada, rendimiento cardiaco e índice cardiaco reducido, presiones arteriales pulmonares aumentadas, dimensiones sistólica y diastólica ventricular izquierda terminal aumentadas y tensión de pared del ventrículo izquierdo, tensión de pared y grosor de pared aumentadas, e igual para el ventrículo derecho. Además, el uso de inhibidores de HDAC puede prevenir que aparezca hipertrofia cardiaca y sus síntomas asociados.

Los regímenes de tratamiento variarán dependiendo de la situación clínica. Sin embargo, el mantenimiento a largo plazo parece ser apropiado en la mayoría de las circunstancias. Puede ser también deseable tratar la hipertrofia con inhibidores de HDAC intermitentemente, tal como en una breve ventana durante la progresión de la enfermedad. Actualmente, el ensayo indica que la dosificación óptima para un inhibidor de HDAC será la dosis máxima antes de que aparezca toxicidad significativa.

B. Terapia combinada

En otra realización, se prevé el uso de la inhibición de HDAC en combinación con otras modalidades terapéuticas. Por tanto, además de las terapias descritas anteriormente, pueden proporcionarse también al paciente más terapias cardiacas farmacéuticas "estándar". Los ejemplos de terapias estándar incluyen, sin limitación, los denominados "betabloqueantes", antihipertensivos, cardiotónicos, antitrombóticos, vasodilatadores, antagonistas hormonales, ióntropos, diuréticos, antagonistas de endotelina, bloqueantes de canal de calcio, inhibidores de fosfodiesterasas, inhibidores de ACE, antagonistas de angiotensina de tipo 2 y bloqueantes/inhibidores de citoquina.

Las combinaciones pueden conseguirse poniendo en contacto células cardiacas con una sola composición o formulación farmacológica que incluye ambos agentes, o poniendo en contacto la célula con dos composiciones o formulaciones distintas al mismo tiempo, incluyendo una composición el constructo de expresión e incluyendo la otra el agente. Como alternativa, la terapia de inhibidor de HDAC puede preceder o seguir a la administración del otro agente en intervalos de minutos a semanas. En realizaciones en las que el otro agente y el constructo de expresión se aplican separadamente a la célula, se aseguraría generalmente que no pase un periodo significativo de tiempo entre el momento de cada suministro, de tal modo que el agente y el constructo de expresión sigan siendo capaces de ejercer ventajosamente un efecto combinado sobre la célula. En tales casos, se contempla que se pondría típicamente en contacto la célula con ambas modalidades a aproximadamente 12-24 horas entre sí y, más preferiblemente, a aproximadamente 6-12 horas entre sí, siendo el más preferido un tiempo de retardo de sólo aproximadamente 12 horas. En algunas situaciones, puede ser deseable extender el periodo de tiempo para tratamiento significativamente, sin embargo, cuando transcurren varios días (2, 3, 4, 5, 6 ó 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 7, ó 8) entre las administraciones respectivas.

Es también concebible que se desee más de una administración de un inhibidor de HDAC, o el otro agente. A este respecto, pueden emplearse diversas combinaciones. A modo de ilustración, cuando el inhibidor de HDAC es "A" y el otro agente es "B", son ejemplares las siguientes permutaciones basadas en 3 y 4 administraciones:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A BB/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/BA B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B.

Se contemplan igualmente otras combinaciones.

C. Formulaciones de fármaco y vías para administración a pacientes

Cuando se contemplan aplicaciones clínicas, se prepararán composiciones farmacéuticas en una forma apropiada para la aplicación pretendida. Generalmente, esto abarcará preparar composiciones que están esencialmente exentas de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser nocivas para seres humanos o animales.

Generalmente, se deseará emplear sales y tampones apropiados para volver estables los vectores de suministro y permitir la captación por células diana. Se emplearán también tampones cuando se introducen células recombinante en un paciente. Las composiciones acuosas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz del vector o células, disuelta o dispersada en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable" designa entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras indeseadas cuando se administran a un animal o un ser humano. Como se utiliza en la presente memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye disolventes, tampones, soluciones, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares aceptables para uso en la formulación de productos farmacéuticos, tales como productos farmacéuticos adecuados para administración a seres humanos. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que algún medio o agente convencional sea incompatible con los ingredientes activos de la presente invención, está contemplado su uso en composiciones terapéuticas. Pueden incorporarse también ingredientes activos suplementarios a las composiciones, a condición de que no inactiven los vectores o células de las composiciones.

Las composiciones activas de la presente invención pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones según la presente invención puede ser mediante cualquier vía común a condición de que el tejido diana esté accesible por esa vía. Esto incluye oral, nasal o bucal. Como alternativa, la administración puede ser inyección intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Dichas composiciones se administrarían normalmente en forma de composiciones farmacéuticamente aceptables, como se describe anteriormente.

Los compuestos activos pueden administrarse también por vía parenteral o intraperitoneal. A modo de ilustración, las soluciones de compuestos activos en forma de base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones pueden prepararse también en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen generalmente un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen, por ejemplo, soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Generalmente, estas preparaciones son estériles y fluidas en la medida en que exista una fácil inyectabilidad. Las preparaciones deben ser estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento y deben conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. Los disolventes o medios de dispersión apropiados pueden contener, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede realizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse mediante el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando los compuestos activos en una cantidad apropiada a un disolvente, junto con cualquier otro ingrediente (por ejemplo como se enumeran anteriormente) según se desee, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados a un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes deseados, por ejemplo, como se enumeran anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación incluyen técnicas de secado a vacío y liofilización que proporcionan un polvo del (de los) ingrediente(s) activo(s) más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución anteriormente esterilizada por filtración del mismo.

Para administración oral, pueden incorporarse generalmente excipientes a los polipéptidos de la presente invención y utilizarse en forma de colutorios y dentífricos no ingeribles. Puede prepararse un colutorio incorporando el ingrediente activo en la cantidad necesaria a un disolvente apropiado, tal como una solución de borato de sodio (solución de Dobell). Como alternativa, el ingrediente activo puede incorporarse a un lavado antiséptico que contiene borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio. El ingrediente activo puede dispersarse también en dentífricos, incluyendo: geles, pastas, polvos y suspensiones. El ingrediente activo puede añadirse en una cantidad terapéuticamente eficaz a una pasta dentífrica que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes y humectantes.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse generalmente en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) derivadas de ácidos inorgánicos (por ejemplo ácido clorhídrico o fosfórico), o de ácidos orgánicos (por ejemplo acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares). Las sales formadas con los grupos carboxilo libres de la proteína pueden derivar también de bases inorgánicas (por ejemplo hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico) o de bases orgánicas (por ejemplo isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares).

Tras la formulación, las soluciones se administran preferiblemente de manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones pueden administrarse fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares. Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, generalmente la solución se tampona adecuadamente y el diluyente líquido se hace primero isotónico, por ejemplo, con suficiente solución salina o glucosa. Dichas soluciones acuosas pueden utilizarse, por ejemplo, para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Preferiblemente, se emplean medios acuosos estériles como se conoce por los expertos en la técnica, particularmente a la vista de la presente descripción. A modo de ilustración, puede disolverse una dosis individual en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15ª edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Aparecerá necesariamente cierta variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración humana, las preparaciones deben satisfacer los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por los estándares de la "FDA Office of Biologicals".

V. Definiciones

Como se utiliza en la presente memoria, el término "insuficiencia cardiaca" se utiliza ampliamente para indicar cualquier afección que reduce la capacidad del corazón de bombear sangre. Como resultado, se desarrollan congestión y edema en los tejidos. Lo más frecuentemente, la insuficiencia cardiaca está causada por una contractilidad reducida del miocardio como resultado de un flujo de sangre coronaria reducido; sin embargo, muchos otros factores pueden dar como resultado insuficiencia cardiaca, incluyendo daño en las válvulas cardiacas, deficiencia vitamínica y enfermedad muscular cardiaca primaria. Aunque los mecanismos fisiológicos precisos de la insuficiencia cardiaca no se comprenden enteramente, se cree que la insuficiencia cardiaca implica trastornos de varias propiedades autónomas cardiacas, incluyendo respuestas simpáticas, parasimpáticas y barorreceptoras. La expresión "manifestaciones de insuficiencia cardiaca" se utiliza ampliamente para abarcar todas las secuelas asociadas a insuficiencia cardiaca, tales como falta de aliento, edema crateriforme, hígado ensanchado ablandado, venas del cuello hinchadas, estertores pulmonares y similares, incluyendo los hallazgos de laboratorio asociados a insuficiencia cardiaca.

El término "tratamiento" o equivalentes gramaticales abarca la mejora y/o la reversión de los síntomas de insuficiencia cardiaca (concretamente la capacidad del corazón de bombear sangre). La "mejora de la función fisiológica" del corazón puede evaluarse utilizando cualquiera de las medidas descritas en la presente memoria (por ejemplo, medida de la fracción de eyección, acortamiento fraccional, dimensión interna ventricular, ritmo cardiaco, etc.), así como cualquier efecto sobre la supervivencia del animal. En el uso de modelos animales, se compara la respuesta de animales transgénicos tratados y animales transgénicos no tratados utilizando cualquiera de los ensayos descritos en la presente memoria (además, pueden incluirse animales transgénicos tratados y no tratados como controles). Un compuesto que causa una mejora en cualquier parámetro asociado a insuficiencia cardiaca utilizado en los procedimientos de examen de la presente invención puede identificarse así como un compuesto terapéutico.

El término "cardiomiopatía dilatada" designa un tipo de insuficiencia cardiaca caracterizado por la presencia de un ventrículo izquierdo dilatado simétricamente con mala función contráctil sistólica y, además, implica frecuentemente al ventrículo derecho.

El término "compuesto" designa cualquier entidad química, farmacéutica, fármaco y similar que pueda utilizarse para tratar o prevenir una enfermedad, malestar, afección, o trastorno de la función corporal. Los compuestos comprenden tanto compuestos terapéuticos conocidos como potenciales. Puede determinarse que un compuesto es terapéutico mediante examen utilizando los procedimientos de examen de la presente invención. Un "compuesto terapéutico conocido" designa un compuesto terapéutico que ha mostrado (por ejemplo mediante ensayos animales o experiencia anterior con administración a seres humanos) que es eficaz en dicho tratamiento. En otras palabras, un compuesto terapéutico conocido no está limitado a un compuesto eficaz en el tratamiento de insuficiencia cardiaca.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "agonista" designa moléculas o compuestos que imitan la acción de un compuesto "nativo" o "natural". Los agonistas pueden ser homólogos de estos compuestos naturales respecto a la conformación, carga u otras características. Por tanto, los agonistas pueden reconocerse mediante receptores expresados en superficies celulares. Este reconocimiento puede dar como resultado cambios fisiológicos y/o bioquímicos en la célula, de tal modo que la célula reacciona ante la presencia del agonista de la misma manera que si estuviera presente el compuesto natural. Los agonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o cualquier otra molécula que interaccione con una molécula, receptor y/o ruta de interés.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "hipertrofia cardiaca" designa el proceso en el que los miocitos cardiacos adultos responden al estrés mediante un crecimiento hipertrófico. Dicho crecimiento se caracteriza por aumentos del tamaño celular sin división celular, ensamblaje de sarcómeros adicionales en la célula para maximizar la generación de fuerza y una activación del programa génico cardiaco fetal. La hipertrofia cardiaca está a menudo asociada a un riesgo aumentado de morbilidad y mortalidad, y por tanto los estudios dirigidos a la comprensión de los mecanismos moleculares de la hipertrofia cardiaca podrían tener un impacto significativo sobre la salud humana.

Como se utilizan en la presente memoria, los términos "antagonista" e "inhibidor" designan moléculas o compuestos que inhiben la acción de un factor celular que puede estar implicado en hipertrofia cardiaca. Los antagonistas pueden ser homólogos o no de estos compuestos naturales con respecto a conformación, carga u otras características. Por tanto, los antagonistas pueden reconocerse mediante los mismos o diferentes receptores que son reconocidos por un agonista. Los antagonistas pueden tener efectos alostéricos los cuales previenen la acción de un agonista. Como alternativa, los antagonistas pueden prevenir la función del agonista. En contraposición con los agonistas, los compuestos antagonísticos no dan como resultado cambios patológicos y/o bioquímicos en la célula, de modo que la célula reacciona en presencia del antagonista de la misma manera que si el factor celular estuviera presente. Los antagonistas e inhibidores pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o cualquier otra molécula que se une o interaccione con un receptor, molécula y/o ruta de interés.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "modular" designa un cambio o una alteración en la actividad biológica. La modulación puede ser un aumento o reducción de la actividad proteica, un cambio en las características de unión o cualquier otro cambio en las propiedades biológicas, funcionales o inmunológicas asociadas a la actividad de una proteína u otra estructura de interés. El término "modulador" designa cualquier molécula o compuesto que es capaz de cambiar o alterar la actividad biológica como se describe anteriormente.

El término "antagonista de receptor \beta-adrenérgico" designa un compuesto o entidad química que es capaz de bloquear, parcial o completamente, el tipo beta (\beta) de adrenoreceptores (concretamente, receptores del sistema adrenérgico que responden a catecolaminas, especialmente norepinefrina). Algunos antagonistas de receptor \beta-adrenérgico exhiben un grado de especificidad por un subtipo de receptor (generalmente \beta1); dichos antagonistas se denominan "antagonistas de receptor adrenérgico específicos de \beta1" y "antagonistas de receptor adrenérgico específicos de \beta2". El término "antagonista de receptor \beta-adrenérgico" designa compuestos químicos que son antagonistas selectivos y no selectivos. Los ejemplos de antagonistas de receptor \beta-adrenérgico incluyen, pero sin limitación, acebutolol, atenolol, butoxamina, carteolol, esmolol, labetolol, metoprolol, nadolol, penbutolol, propanolol y timolol. El uso de derivados de antagonistas de receptor \beta-adrenérgico conocidos está abarcado por los procedimientos de la presente invención. Es más, cualquiera compuesto que se comporte funcionalmente como un antagonista de receptor \beta-adrenérgico está abarcado por los procedimientos de la presente invención.

Los términos "inhibidor de enzima conversora de angiotensina" o "inhibidor de ACE" designan un compuesto o entidad química que es capaz de inhibir, parcial o completamente, la enzima implicada en la conversión de la relativamente inactiva angiotensina I en la activa angiotensina II en el sistema renina-angiotensina. Además, los inhibidores de ACE inhiben simultáneamente la degradación de bradiquinina, lo que probablemente potencia significativamente el efecto antihipertensivo de los inhibidores de ACE. Los ejemplos de inhibidores de ACE incluyen, pero sin limitación, benazepril, captopril, enalopril, fosinopril, lisinopril, quiapril y ramipril. El uso de derivados de inhibidores de ACE conocidos está abarcado por los procedimientos de la presente invención. Es más, cualquier compuesto que se comporte funcionalmente como un inhibidor de ACE está abarcado por los procedimientos de la presente
invención.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "genotipo" designa la composición genética real de un organismo, mientras que "fenotipo" designa los rasgos físicos presentados por un individuo. Además, el "fenotipo" es el resultado de la expresión selectiva del genoma (concretamente, es una expresión del historial celular y su respuesta al entorno extracelular). Es más, el genoma humano contiene una estimación de 30.000-35.000 genes. En cada tipo celular, sólo se expresa una pequeña fracción (concretamente 10-15%) de esos genes.

VII. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar adicionalmente diversos aspectos de la invención. Debe apreciarse por los expertos en la técnica que las técnicas dadas a conocer en los ejemplos siguientes representan técnicas y/o composiciones descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y por tanto puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica.

Ejemplo 1 Materiales y procedimientos

Cultivo celular. Se sembraron miocitos ventriculares de ratas de un día de edad a baja densidad en MEM con 5% de suero de ternero, y se estudiaron en MEM exento de suero. Se trataron los cultivos con PE (nº. P6126, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), IL-1 (nº. 501-RL, R&D Systems, Minneapolis, MN), TSA (nº. GR-309, BIOMOL Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA) o sus vehículos (ácido ascórbico para PE; albúmina de suero bovino para IL-1; dimetilsulfóxido para TSA).

Detección de residuos de lisina acetilados. Se sometió el extracto celular total a análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos de Cell Signaling Technology (Beverly, MA) (anticuerpo de lisina acetilada: nº. 9441, anticuerpo de histona H3 acetilada en la lisina 9: nº. 9671, anticuerpo de histona H3 acetilada en la lisina 23: nº. 9674, anticuerpo de histona H3: nº. 9712). Se examinó la localización nuclear de la histona H3 acetilada mediante inmunotinción utilizando los mismos anticuerpos.

Cuantificación de la hipertrofia de miocitos y expresión de ARNm específico de miocitos. Se cuantificó el crecimiento de miocitos cultivados mediante el contenido de proteína radiomarcada después de incubación continua con ^{14}C-fenilalanina. Para la evaluación del programa génico miocítico, se extrajo el ARN total de células con TRIZol (GIBCO, Carlsbad, California) y se utilizó en un ensayo de protección de ARNasa con sondas de SERCA, \alpha/\beta-MyHC, ANP, BNP y \alpha-actina cardiaca. Todas las muestras incluían también gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno para la carga de ARN.

Transfección. Se transfectaron miocitos utilizando coprecipitación con fosfato de calcio con vectores de expresión marcados con Flag dirigidos por el promotor de citomegalovirus para HDAC 1, 4, 5 y plásmidos informadores que portan los promotores de rata para SERCA (3500 pb), \alphaMyHC (2900 pb) o \betaMyHC (3300 pb) que activan la expresión del gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Se evaluó la expresión informadora después de 48 horas como se describió anteriormente, con corrección de la eficacia de transfección con SEAP (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Se confirmó la sobreexpresión de HDAC mediante análisis de transferencia Western utilizando anticuerpo M2 anti-Flag (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO).

Resultados

La TSA aumenta la acetilación de proteína en miocitos cardiacos. Los experimentos iniciales se dirigieron a confirmar que la TSA era capaz de inhibir la actividad HDAC en miocitos cardiacos, razonando que esto debería dar como resultado un aumento global de la acetilación de proteína. El grado de acetilación se determinó utilizando anticuerpos específicos de residuos de lisina acetilados. Los inventores mostraron tanto mediante análisis de transferencia Western como mediante análisis de inmunofluorescencia celular que la exposición a TSA durante 24 horas aumentaba eficazmente los residuos de lisina acetilados en una serie de proteínas, y específicamente en aquellas de histona H3.

La TSA potencia el crecimiento inducido por agonista, pero invierte la represión del gen asociado a la hipertrofia. Aunque la TSA por sí misma no tuvo efecto sobre el crecimiento de miocitos, los inventores encontraron que se potenciaban las respuestas hipertróficas individuales tanto ante PE como IL-1. Ambos estímulos hipertróficos desactivaron la expresión de SERCA (Fig. 1A) y \alphaMyHC (Fig. 1B) y la exposición combinada a ambos agonistas dio como resultado una represión adicional. En contraposición, la TSA aumentó la expresión basal tanto de ARNm de SERCA2a como de \alphaMyHC. El pretratamiento con TSA dio también como resultado una inversión sustancial de la represión de la expresión de SERCA por ambos estímulos hipertróficos. Notablemente, aunque la TSA dio como resultado una inversión casi completa del efecto de PE sobre la expresión de \alphaMyHC, este efecto fue menos prominente en el caso de células tratadas con IL-1 (o cotratadas). Los inventores mostraron anteriormente que el cotratamiento de miocitos cardiacos tanto con PE como con IL-1 suprimía la inducción habitual por PE de la expresión de \alphaMyHC en casi un 50%. Es intrigante que aunque la TSA no tuvo efecto sobre la expresión basal ni la inducción por PE de este gen, aumentó la expresión de \alphaMyHC en presencia de IL-1 sola e invirtió el efecto de IL-1 en células cotratadas con PE/IL-1. Se observó también una inversión similar con el gen sACT (Wang y Long, datos no publicados). Notablemente, la TSA no afectó a la expresión génica de la \alpha-actina cardiaca, ANP ni BNP bajo ninguna condición de tratamiento hipertrófico (datos no mostrados).

Sobreexpresión de actividades promotoras reprimidas por HDAC de genes específicos de miocito. De acuerdo con los estudios de expresión de ARNm para estos genes diana, la TSA aumentó también las actividades promotoras basales de ambos genes SERC2 (Fig. 2A) y \alphaMyHC (Fig. 2B), pero no la de \betaMyHC (Fig. 2C). Además, la contransfección de estos constructos con vectores de expresión de HDAC 1 ó 4 redujo también las actividades promotoras de ambos genes SERCA (Fig. 2A) y \alphaMyHC (Fig. 2D). En contraposición, sin embargo, la HDAC5 no consiguió inhibir las actividades promotoras de ningún gen a pesar de niveles de expresión similares a los de otras isoformas (datos no mostrados). Notablemente, los tres constructos de HDAC fueron capaces de atenuar el aumento inducido por PE de actividad promotora de \alphaMyHC (Fig. 2D).

Ejemplo 2 Materiales y procedimientos

Aislamiento de cardiomiocitos. Se recogieron corazones de ratas hembra Sprague-Dawley preñadas de 15 días (Harlan, Houston, TX). Después de triturar en solución salina tamponada con fosfato, se aislaron los cardiomiocitos de las fracciones de digestión sucesiva con solución al 0,1% (p/v) de pancreatina (Sigma, St. Louis, MO). Se recogieron las fracciones, se resuspendieron en medio de siembra, se reunieron y después se sembraron durante 2 horas para separar los fibroblastos de la población de cardiomiocitos. Se recogieron las células suspendidas y se sembraron en discos de 6 pocillos a 1 x 10^{6} células/pocillo para experimentos de transfección e inmunofluorescencia, y a 2 x 10^{6} células en discos de 10 cm para análisis de ARN.

Ensayo de transcripción. 24 horas después de la siembra, se transfectaron células con un total de 1 \mug/ml durante 5 horas utilizando reactivo Lipofectamine Plus (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se incubaron las células transfectadas durante 24 horas y después se trataron durante 24 horas adicionales. Se lisaron las células y se ensayó en sus lisados la luminiscencia con el sistema de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI) utilizando un luminómetro Lucysoft 2 (Rosys Anthos, New Castle, DE).

Quimioluminiscencia. Se sembraron cardiomiocitos neonatales en placas de 96 pocillos y se trataron durante 72 horas. Se lavaron las células dos veces con 1 x PBS, se fijaron en 4% de paraformaldehído/1 x PBS, y se permeabilizaron con Triton-X100 al 0,1%. Después de bloquear, se incubaron las células durante 1 h con anticuerpo monoclonal anti-ANF 10 \mug/ml (Biodesign). Se lavaron dos veces los pocillos con 1% de BSA/1 x PBS y después se incubaron durante 1 h con IgG-Fc-HRP de cabra anti-ratón (Jackson Labs, localización) a 1:1000 en 1 x PBS/1% de BSA. Se lavaron las células dos veces con 1% de BSA/1 x PBS, dos veces con 1 x PBS y después se transfirieron en seco. Se añadió luminol (Pierce, Rockford, IL) y se detectó la quimioluminiscencia en un lector de placa Fusion (Perkin Elmer/Packard).

Análisis de transferencia puntual. Se aisló el ARN total de cardiomiocitos no tratados, tratados con fenilefrina, tratados con TSA o cotratados con fenilefrina y TSA. Se transfirió 1 \mug de ARN a nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA) y se hibridó a 50ºC durante 14 h con oligonucleótidos marcados terminales. (ANF, 5'-aatgtgaccaagctgcgt
gacacaccacaagggcttaggatcttttgcgatctgctcaag-3', SEC Nº ID 1; actina \alphaSK 5'-tggagcaaaacagaatggctggctttaatgctt
caagttttccatttcctttccacaggg-3', SEC Nº ID 2; \alphaMyHC, 5'-cgaacgtttatgtttattgtggattggccacagcgagggtctgctggagagg-3', SEC Nº ID 3, \betaMyHC, 5'- gcttat tctgcttccacctaaagggctgttgcaaa ggctccaggtctgagggcttc-3', SEC Nº ID 4, GAPDH, 5'-ggaacatgtagaccatgtag ttgaggtcaatgaag-3', SEC Nº ID 5). Se lavaron las transferencias dos veces con solución de 2 x SSC/0,5% de SDS y se expusieron a película (Kodak, Rochester, NY) o phosphoimager (Amersham Bioscience, Sunnyvale, CA). Se midió la intensidad de la hibridación de las sondas utilizando ImageQuant© (Amersham Bioscience, Sunnyvale, CA).

Inmunotinción. Se recubrieron cubreobjetos de vidrio con laminina (Invitrogen, Carlsbad, CA) solubilizando la laminina en 1 x PBS (40 \mug/ml), sumergiendo los cubreobjetos en la solución y dejándolos secar al aire. Se trataron las células durante 24 horas, se lavaron, se fijaron durante 10 min con formaldehído al 3,7%, se lavaron con 1 x PBS y se permeabilizaron con 1 x PBS que contenía 3% de BSA y 0,1% de NP-40 (Sigma, St. Louis, MO). Los anticuerpos primarios estaban en 1 x PBS que contenía 3% de BSA y 0,1% de NP-40 durante 30 min, después se lavaron tres veces con 1 x PBS. Se incubaron los anticuerpos secundarios con FITC o TRITC (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) (1:200) en la misma solución tampón que los anticuerpos primarios, después se lavaron con 1 x PBS, se cubrieron y se visualizaron posteriormente. Se capturaron las imágenes utilizando una cámara digital (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japón).

Síntesis de proteína. Se incubaron cardiomiocitos con leucina tritiada (1,0 \muCi/ml; 172 Ci/mmol de actividad específica) (ICN Biochemicals, Inc., Irvine, CA) en medio RPMI tratado (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 6 horas de incubación, se lavaron dos veces las células con 1 x PBS, después se incubaron en TCA al 10% en hielo durante 30 min. Después, se lavaron las células dos veces con TCA al 5%, una vez con agua, y después se lisaron en NaOH 0,25. Se midieron los lisados en un sexto de volumen de fluido de centelleo mediante un contador de centelleo (Beckman, Fullerton, CA).

Protocolo de S6 ribosomal. Después de bloquear, se incubaron las células en 1% de BSA/1 x PBS que contenía anti-proteína S6 50 \mug/ml (Cell Signaling, localización) durante 1 h. Después de lavar, se incubaron las células con IgG-HRP (Jackson Labs, localización) a una dilución 1:400. Se lavaron después las células dos veces con 1% de BSA/1 x PBS, después se transfirieron en seco. Se añadió luminol (Pierce, Rockford, IL) y se detectó la quimioluminiscencia en un lector Fusion (Perkin-Elmer/Packard).

Chip génico y análisis. Se aisló ARN utilizando trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) a partir de cardiomiocitos neonatales de rata no tratados, tratados con fenilefrina, tratados con TSA y cotratados con fenilefrina/TSA. Se prepararon los ARN y se hibridaron con chips U34A (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) según los protocolos de Affymetrix. Se detectó la intensidad de hibridación, se determinaron los cambios en la expresión génica y se analizaron mediante Micro Array Suite 5.0 (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA).

Resultados

Debido a que las histona desacetilasas (HDAC) regulan la expresión génica, los inventores analizaron si la inhibición de HDAC alteraría la expresión de genes asociados a hipertrofia cardiaca. El factor natriurético auricular (ANF) es uno de dichos genes, y su expresión aumenta en presencia de agonistas hipertróficos. Para determinar si la inhibición de HDAC afecta a la activación del gen ANF, se realizaron experimentos de transfección con el promotor ANF y se trataron cardiomiocitos transfectados con fenilefrina y varios inhibidores de HDAC. El tratamiento de cardiomiocitos con tricostatina (TSA), butirato de sodio (NaBut) o toxina HC (HC) no activó el promotor ANF. Los inhibidores de HDAC, sin embargo, bloquearon completamente la activación del promotor mediante tratamiento con fenilefrina (Fig. 3A). Este efecto fue específico, debido a que los cardiomiocitos tratados con cada inhibidor de HDAC solo o junto con fenilefrina aumentaron la actividad transcripcional del informador CMB-Lac Z (Fig. 3B), indicando que la acción de estos agentes farmacológicos era específica del control transcripcional de ANF y no de la inhibición transcripcional general.

Los inventores examinaron después si dosis crecientes de TSA y butirato de sodio eran citotóxicas para cardiomiocitos cultivados. Para determinar la mortalidad celular, se ensayó la liberación de adenilato quinasa de cardiomiocitos en el medio de cultivo. Este ensayo es una medida conocida de la integridad de la membrana celular: las membranas se vuelven más permeables en células moribundas causando que las células liberen adenilato quinasa. Aumentar las dosis de TSA (hasta 100 nM) y butirato de sodio (hasta 25 nM) hizo poco por aumentar la adenilato ciclasa en el medio de cultivo, indicando una ausencia de muerte celular aumentada por TSA y butirato de sodio (Fig. 3C y 3D). En los experimentos de un solo punto temporal, se utilizaron TSA 85 nM o butirato de sodio 5 mM, de modo que estos resultados indican que la inactivación de la transcripción de ANF es un efecto directo de la inhibición de HDAC y no una consecuencia indirecta de la citotoxicidad por los inhibidores de HDAC.

Para determinar si la expresión génica endógena es paralela a los resultados de transfección, los inventores observaron los niveles de ARN endógeno de ANF de cardiomiocitos en diversas condiciones de tratamiento. El análisis de transferencia puntual de ARN de cardiomiocitos tratados con fenilefrina mostró un aumento de aproximadamente 3 veces en la expresión de ANF en respuesta al tratamiento con fenilefrina; sin embargo, el cotratamiento de células tratadas con fenilefrina con los diferentes inhibidores de HDAC (TSA, NaBut o toxina HC) previno la respuesta de ANF inducida por fenilefrina (Fig. 4A), de acuerdo con los resultados de transfección citados anteriormente.

Los datos anteriores han mostrado que una baja dosis de TSA puede inducir la expresión de ANF mediante la acetilación del locus de ANF y mediante la inactivación del represor de la transcripción NRSE. Para averiguar si hay un efecto dependiente de la dosis de los inhibidores de HDAC, los inventores examinaron la expresión de ANF después de tratar cardiomiocitos primarios con concentraciones crecientes de TSA (Fig. 4B) y butirato de sodio (Fig. 4C) en ausencia y presencia de los estimulantes hipertróficos suero (FBS), fenilefrina (PE) o endotelina-1 (ET-1). A dosis muy bajas (0,2 nM) de butirato de sodio (Fig. 4C), los inventores observaron un aumento de casi dos veces en la expresión de ANF. Había sólo un aumento marginal con TSA (Fig. 4B). Sin embargo, los inhibidores de HDAC a todas las demás concentraciones no indujeron la producción de ANF, y con concentraciones crecientes, contrarrestaron la inducción de la expresión de ANF observada normalmente después de tratar cardiomiocitos cultivados con los estimulantes de crecimiento FBS, PE y ET-1 (Fig. 4B y C). Las concentraciones mínimas que inhibían la respuesta hipertrófica de cada estimulante de crecimiento fueron TSA 40 nM y butirato de sodio 5 mM, que imitaban la reducción de tres a cuatro veces en la transcripción de ANF observada en la transfección y los experimentos de transferencia puntual. Estas dosis estaban muy por debajo del umbral de citotoxicidad.

La hipertrofia cardiaca está asociada a la reprogramación de genes fetales además de ANF. Los inventores deseaban determinar si otros miembros de la cascada génica fetal estaban afectados por el tratamiento con TSA. El análisis cuantitativo del cambio en veces de la expresión de \alpha-sk y \betaMyHC, además de ANF, mostró que la inhibición de HDAC daba como resultado la supresión de otros genes activados por el estimulante hipertrófico fenilefrina (Fig. 5A y B). Adicionalmente, además de desactivar la isoforma de cadena de miosina fetal, isoforma (\betaMyHC), el tratamiento con TSA de miocitos cardiacos indujo la expresión de \alphaMyHC, la isoforma de cadena pesada de miosina adulta normalmente reducida en cardiomiocitos hipertróficos (Fig. 5B). Estos datos tomados conjuntamente indican que la inhibición de HDAC suprime la reprogramación transcripcional de la cascada génica asociada a la hipertrofia cardiomiocítica.

La tinción de proteína ANF mostró que los cardiomiocitos tratados con fenilefrina o suero inducían una acumulación perinuclear de proteína ANF en comparación con células no estimuladas (datos no mostrados). Los cardiomiocitos tratados con TSA carecían de acumulación de proteína ANF, y la adición de TSA a cardiomiocitos tratados con fenilefrina o con suero redujo drásticamente la acumulación de proteína ANF. La tinción inmunocitoquímica de \alpha-actinina mostró que la inhibición de HDAC antagonizaba la reorganización del sarcómero, otro fenómeno asociado a la hipertrofia cardiomiocítica. Los cardiomiocitos no estimulados mantenían una forma amorfa sin organización estructural aparente del sarcómero (\alpha-actinina). Los agonistas hipertróficos fenilefrina, suero y ET-1 estimulaban potencialmente la organización del sarcómero como parte de una estructura citoesquelética altamente ordenada. De forma interesante, la TSA afectó a la morfología cardiomiocítica. Aunque las células tratadas con TSA no cambiaron de tamaño, tendían a adquirir una apariencia "estrellada" al crecer extensiones estrechas desde el cuerpo principal de la célula. Sin embargo, carecían de la organización del sarcómero. El efecto del tratamiento con TSA fue más drástico en presencia de estimulantes del crecimiento, porque afectó a la morfología hipertrófica inducida normalmente por fenilefrina, suero o ET-1. Los cardiomiocitos tratados con TSA carecían de sarcómeros totalmente organizados.

Los inventores determinaron después si la TSA antagonizaba el aumento de síntesis de proteína asociado normalmente a la respuesta hipertrófica ensayando los cambios en la síntesis de proteína y midiendo la acumulación de contenido de proteína de la subunidad ribosómica S6. La fenilefrina potenció la síntesis de proteína en los miocitos cardiacos por un factor de 2 después de 6 horas de estimulación; sin embargo, el cocultivo de fenilefrina con los inhibidores de HDAC TSA y butirato de sodio tuvo poco efecto sobre la estimulación de la síntesis de proteína inducida normalmente por fenilefrina (Fig. 6). Sin embargo, 24 horas después del cotratamiento, los inhibidores de HDAC antagonizaron la síntesis de proteína inducida normalmente por PE o suero de manera dependiente de la dosis (Fig. 6). Esto sugiere que la prevención de la organización del sarcómero por la inhibición de HDAC es un efecto específico de la regulación de la transcripción.

Trabajos anteriores han mostrado que el tratamiento con TSA de levadura da como resultado un cambio en la expresión génica en sólo un subconjunto de genes. Si esto es cierto para los cardiomiocitos, entonces es posible que un número limitado de genes sea responsable de la supresión del fenotipo hipertrófico. Para identificar estos genes, los inventores ensayaron la expresión de aproximadamente 8.000 genes mediante matriz de chip génico. El análisis gráfico posterior de los ensayos de expresión entre los cambios génicos en las células tratadas con fenilefrina y fenilefrina/TSA revelaron que la mayoría de los genes se agrupaba linealmente. La mayoría de los transcriptos permanecía relativamente sin cambios (menos de un cambio de 3 veces en la expresión génica) entre el chip hibridado con ARN de células tratadas con fenilefrina y el chip hibridado con ARN de células tratadas con fenilefrina/TSA. Esto sugiere que el número relativo de genes responsables de la supresión del crecimiento de cardiomiocito inducido por fenilefrina mediante tratamiento con TSA es bajo.

A partir del número reducido de genes cuyos niveles de expresión se alteraron por fenilefrina, TSA o su combinación, los inventores identificaron siete genes que tenían una diferencia consistente de dos o más veces entre los grupos de tratamiento con fenilefrina y tratados con TSA: fenilefrina/TSA y TSA. Se activaron tres genes por el tratamiento con fenilefrina y se desactivaron por TSA: citocromo oxidasa subunidad VIII, proteína de complejo T de ratón y proteína 3 de unión a factor de crecimiento de insulina (Fig. 7A).Los 4 genes desactivados por fenilefrina y activados por TSA fueron proteína grande asociada al microtúbulo tau, ubiquitina hidrolasa carboxil-terminal, glicoproteína de superficie celular de Thy-1 y antígeno MyHC de clase I (Fig. 7B). El análisis Northern confirmó los resultados de expresión de la matriz de chip génico (datos no mostrados).

XI. Referencias

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Claims (15)

1. Uso de un inhibidor de histona desacetilasa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hipertrofia cardiaca patológica e insuficiencia cardiaca.

2. Uso de la reivindicación 1, en el que dicho inhibidor de histona desacetilasa se selecciona del grupo constituido por tricostatina A, trapoxina B, MS 275-27, bis-hidroxamida del ácido m-carboxicinámico, depudecina, oxamflatina, apicidina, suberoilanilida del ácido hidroxámico, Scriptaid, piroxamida, 3-(4-aroil-1H-pirrol-2-il)-N-hidroxi-2-propenamida del ácido 2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico y FR 901228.

3. Uso de la reivindicación 1, en el que el medicamento se formula para administración intravenosa.

4. Uso de la reivindicación 1, en el que el medicamento se formula para administración oral, transdérmica, por liberación sostenida, en supositorio o sublingual.

5. Uso de la reivindicación 1, en el que el medicamento se formula para su administración junto con un segundo fármaco terapéutico.

6. Uso de la reivindicación 5, en el que dicho segundo fármaco terapéutico se selecciona del grupo constituido por un betabloqueante, un ióntropo, un diurético, un ACE-I o antagonista de AII y un bloqueante de Ca^{++}.

7. Uso de la reivindicación 5, en el que dicho segundo fármaco terapéutico se formula para su administración en el mismo momento que dicho medicamento inhibidor de histona desacetilasa.

8. Uso de la reivindicación 5, en el que dicho segundo fármaco terapéutico se formula para su administración antes o después de la administración de dicho medicamento inhibidor de histona desacetilasa.

9. Uso de la reivindicación 1, en el que el tratamiento de hipertrofia cardiaca patológica comprende la mejora de uno o más síntomas de hipertrofia cardiaca.

10. Uso de la reivindicación 9, en el que dichos uno o más síntomas de hipertrofia cardiaca se selecciona(n) de una capacidad de ejercicio aumentada, un volumen incrementado de eyección de sangre, presión diastólica ventricular izquierda terminal, presión capilar pulmonar de enclavamiento, rendimiento cardiaco, índice cardiaco, presiones arteriales pulmonares, dimensiones sistólica y diastólica ventricular izquierda terminal, tensión de pared ventricular izquierda y derecha o tensión de pared, morbilidad y mortalidad relacionados con la enfermedad.

11. Uso de un inhibidor de histona desacetilasa en la fabricación de un medicamento para la prevención de hipertrofia cardiaca patológica e insuficiencia cardiaca.

12. Uso de la reivindicación 11, en el que dicho inhibidor de histona desacetilasa se selecciona del grupo constituido por tricostatina A, trapoxina B, MS 275-27, bis-hidroxamida del ácido m-carboxicinámico, depudecina, oxamflatina, apicidina, suberoilanilida del ácido hidroxámico, Scriptaid, piroxamida, 3-(4-aroil-1H-pirrol-2-il)-N-hidroxi-2-propenamida del ácido 2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico y FR 901228.

13. Uso de la reivindicación 11, en el que el medicamento se formula para administración intravenosa.

14. Uso de la reivindicación 11, en el que el medicamento se formula para administración oral, transdérmica, por liberación sostenida, en supositorio o sublingual.

15. Uso de la reivindicación 11, en el que el medicamento se formula para su administración a un paciente que exhibe uno o más de hipertensión incontrolada de larga duración, enfermedad valvular no corregida, angina crónica y/o infarto de miocardio reciente.