DE602005005449T2

DE602005005449T2 - Adjuvante zusammensetzungen

Info

Publication number: DE602005005449T2
Application number: DE602005005449T
Authority: DE
Inventors: Robert James Ystrad-Meurig Nash; Alison Ann Ystrad-Meurig Watson; Emma Louisa Peterborough EVINSON
Original assignee: Summit Corp PLC
Current assignee: Summit Therapeutics Ltd
Priority date: 2004-01-21
Filing date: 2005-01-21
Publication date: 2009-08-27
Anticipated expiration: 2025-01-22
Also published as: DE602005005449D1; US20090047306A1; EP1711174B1; EP1711174A1; AU2005205968B2; ATE389397T1; AU2005205968C1; CA2553986A1; GB0401239D0; AU2005205968B8; WO2005070415A1; AU2005205968A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Adjuvantien und im Speziellen auf Alaun-basierende Adjuvantien und darauf basierende Impfungen.
Hintergrund zu der Erfindung
Immunität:
Wenn das Immunsystem durch ein fremdes Antigen herausgefordert wird, antwortet es durch Auslösen einer schützenden Antwort. Diese Antwort ist durch die abgestimmte Antwort sowohl der angeborenen wie auch der erworbenen Immunsysteme charakterisiert. Diese Systeme, die einst für getrennt und unabhängig gehalten wurden, werden nun als zwei ineinandergreifende Teile erkannt, die, wenn sie kombiniert sind, zwei für beide Seiten ausschließliche Erfordernisse erfüllen: Geschwindigkeit (beigesteuert durch das angeborene System) und Spezifizität (beigesteuert durch das erworbene System).
Das angeborene Immunsystem dient als Verteidigungslinie gegen eindringende Pathogene, und hält das Pathogen in Schach bis die erworbenen Antworten entwickelt sind. Dies wird innerhalb von Minuten nach der Infektion in einer Antigen-unabhängigen Art ausgelöst, wobei zu weitreichend konservierten Mustern bei den Pathogenen geantwortet wird (obwohl dies nicht nichtspezifisch ist und zwischen eigenen und (Fremd) Pathogenen unterscheiden kann). Entscheidender Weise erzeugt es auch das entzündliche und mitanregende Milieu (manchmal als das Gefahrsignal bezeichnet), das das erworbene Immunsystem zu den zellulären oder humoralen Antworten, die am Besten zur Bekämpfung des infektiösen Agens geeignet sind (wird nachstehend ausführlicher diskutiert) verstärkt und steuert (oder es polarisiert).
Die erworbene Immunantwort wird über Tage oder Wochen wirksam und stellt letztendlich die genaue antigene Spezifität zur Verfügung, die für die vollständige Eliminierung des Pathogens und das Erzeugen eines immunologischen Gedächtnisses benötigt werden. Dies wird im Prinzip durch T und B-Zellen vermittelt, die einer Keimbahn-Gen-Neuordnung unterzogen wurden und die durch eine herausreichende Spezifität und ein Langzeitgedächtnis gekennzeichnet sind. Dies erfordert jedoch auch die Rekrutierung von Elementen des angeborenen Immunsystems, einschließlich sachgerechter Phagozyten (Makrophagen, Neutrophile etc.) und Granulozyten (Basophile, Eosinophile etc.), die Bakterien und sogar relativ große protozoische Parasiten verschlingen. Sobald sich eine adaptive Immunantwort entwickelt hat, führt ein nachfolgendes Aussetzen zu dem Pathogen zu seiner raschen Eliminierung (gewöhnlich bevor Symptome der Infektion augenscheinlich werden), da die hochspezifizierten Gedächtniszellen gebildet wurden, die bei nochmaligen Aussetzen zu ihrem bekannten Antigen schnell aktiviert werden.
Gegenseitige Abhängigkeit der angeborenen und erworbenen Antworten
Es wird nun angenommen, dass die frühesten Ereignisse, die der Inversion eines Pathogens folgen, durch zelluläre Komponenten des angeborenen Immunsystems ausgeführt werden. Die Antwort wird ausgelöst, wenn die ansässigen Gewebemakrophagen und dentritischen Zellen (DCs) ein Pathogen entdecken und durch Signale, die durch die Interaktion zwischen Muster-erkennenden Rezeptoren (PRRs) und den pathogen-zugehörigen molekularen Mustern (PAMPs), die großen Gruppen von Mikroorganismen gemeinsam sind, aktiviert werden. Die aktivierten Makrophagen und DCs werden stimuliert verschiedene Zytokine (einschließlich der Chemokine IL-8, MIP-1α und MIP-1β, die die „Gefahrsignale" darstellen und einen Einstrom von NK-Zellen, Makrophagen, unreifenden dentritischen Zellen in die Gewebe auslösen, auszuschütten.
Die aktivierten DCs wandern dann mit einem Antigen beladen zu den Lymphknoten. Sobald sie dort sind aktivieren sie Immunzellen der erworbenen Antwort (in erster Linie naive B- und T-Zellen) durch das Handeln als Antigen-präsentierende Zellen (APCs). Die aktivierten Zellen wandern dann zu den Stellen der Infektion (geleitet durch „Gefahrsignale") und verstärken, sobald sie dort sind, weiter die Antwort der rekrutierenden Zellen des angeborenen Immunsystems (einschließlich Eosinophile, Basophile, Monozyten, NK-Zellen und Granulozyten). Dieses zelluläre Handeln wird durch ein großes Aufgebot an Zytokinen (speziell derjenigen der chemokinen Untergruppe) instrumentiert und beeinhaltet Immunzellen vieler unterschiedlicher Typen und Gewebequellen (für einen Überblick siehe Luster (2002), Current Opionion in Immunology, 14: 129–135).
Polarisierung der erworbenen Immunantwort
Die erworbene Immunantwort wird im Wesentlichen über zwei unabhängige Glieder ausgeführt: zell-vermittelte (Typ 1) Immunität und Antikörper-vermittelte oder humorale (Typ 2) Immunität.
Typ 1-Immunität beinhaltet die Aktivierung von T-Lymphozyten, die entweder auf infizierte Zellen, die ein fremdes Antigen tragen, einwirken oder andere Zellen stimulieren auf die infizierten Zellen einzuwirken. Dieser Zweig des Immunsystems begrenzt daher wirksam und tötet Zellen, die cancerös oder mit Pathogenen (im Besonderen Viren) infiziert sind. Die Typ 2- Immuniät beinhaltet die Generierung von Antikörpern zu fremden Antigenen durch B-Lymphozyten. Dieser antikörper-vermittelte Zweig des Immunsystems attackiert und neutralisiert wirksam extrazelluläre fremde Antigene.
Beide Zweige des Immunsytems sind bei der Bekämpfung einer Krankheit wichtig und es wird zunehmend erkannt, dass der Typ der Immunantwort genauso wichtig ist, wie seine Intensität oder seine Dauer. Über dies kann die Balance der Typ 1/Typ 2-Antwort (auch bezeichnet als das Th1:Th2-Antwortverhältnis/Balance mit Verweis auf die eindeutigen Zytokinen und Effektorzellenkeimlinge, die in die Regulierung jeder Antwort involviert sind -siehe nachstehend) ebenfalls eine Rolle bei der Bestimmung der Wirksamkeit (und der Auswirkungen) der Immunabwehr spielen, da die die Typ 1 und Typ 2-Antworten nicht notwendigerweise für beide exklusiv sind (in vielen Fällen verlangt eine effektive Immunantwort, dass beide parallel auftreten).
In vielen Fällen wird die Immunantwort gleich nach dem Kontakt mit einem Antigen verdreht stark in Richtung einer Typ 1- oder Typ 2-Antwort. Der Mechanismus dieser Typ 1/Typ 2 Verdrehung oder Polarisierung wird noch nicht vollkommen verstanden, aber ist bekannt, ein komplexes System von zellvermittelten chemischen Boten (Zytokinen und speziell Chemokinen) zu involvieren, in denen die Typ 1/Typ 2 Polarisierung (oder Balance) zumindest zum Teil, durch das Wesen der anfänglichen PRR-PAMP-Interaktion, bestimmt wird, wenn die DCS und Makrophagen des angeborenen Immunsystems zum ersten Mal und nachfolgend durch das zytokine Milieu, in dem die Antigenprägung naiver T-Helferzellen stattfindet, stimuliert werden.
Zwei Zytokine scheinen besonders frühe Funktionen bei der Bestimmung des Pfades der Immunantwort zu haben. Interleukin- 12 (IL-12), ausgeschüttet von Makrophagen, steuert die Typ 1-Antwort durch Stimulierung der Differenzierung von Th1-Zellen, der Helferzellen, die die Typ 1-Antwort überwachen. Ein anderes Makrophagen-Zytogen, Interleukin-10 (IL-10) verhindert diese Antwort, aber veranlasst statt dessen eine Typ 2-Antwort.
Die Typ 1- und Typ 2-Antworten können u. a. auf der Basis bestimmter phenotypischer Veränderungen, die bei der Vorbereitung und der nachfolgenden Polarisierung naiver Helfer T-Zellen anwesend sind, unterschieden werden. Diese phenotypischen Unterschiede sind, zumindest zum Teil, durch die Natur der Zytokine, die durch die polarisierten T-Helferzellen ausgeschüttet werden, charakterisiert.
Th1-Zellen produzieren sogenannte Th1-Zytokine, die eines oder mehrere TNF, IL-1, IL-2, IFN-gamma, IL-12 und/oder IL-18 einschließen. Die Th1-Zytokine sind in die Aktivierung von Makrophagen involviert und Th1-Zellen instrumentieren Typ 1-Antworten. Im Gegensatz dazu produzieren Th2-Zellen sogenannte Th2-Zytokine, die eines oder mehrere IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 einschließen. Die Th2-Zytokine treiben die Produktion verschiedener Antikörper voran und können die Typ 1-Antwort unterdrücken.
Die Involvierung von Th1- und Th2-Zellen und Zytokinen bei einer Typ 1:Typ 2-Immunantwort-Polarisierung führt zu den Bezeichnungen Th1-Antwort und Th2-Antwort, die verwendet werden, um die Typ1 und bzw. Typ2 Immunantworten zu definieren. Daher werden diese Bezeichnungen hier synonym verwendet.
Impfungen
Impfungen stellen für das Immunsystem eines Wirts Antigene (typischer Weise fremde Antigene oder Neo-Antigene) krankheitsverursachender Agentien dar, um diesen Wirt zu veranlassen, die therapeutischen und/oder prophylaktischen Immunantworten, wie vorstehend beschrieben, aufzunehmen.
Die meisten Impfungen, die heutzutage verwendet werden, stellen sowohl die antigenen Komponenten eines Pathogens (das für die Spezifität benötigt wird) und, beziehungsweise, die PAMPs zur Verfügung, die in der Lage sind, die PRR von angeborenen Immunzellen (die für das Verstärken einer Antwort benötigt werden) zu aktivieren. Solche Impfungen basieren auf getöteten oder abgeschwächten Formen der Mikroben (typischerweise Bakterienzellen, virale Partikel oder Teile davon), die die Krankheit verursachen (oder, im Fall von Krebs Impfungen von den bösartigen Zellen des Tumors) und können außerordentlich wirksame therapeutische und prophylaktische Agentien sein.
Die Anwesenheit nichtessentieller (und manchmal gefährlicher oder unerwünschter) Komponenten in diesen wenig charakterisierten getöteten oder geschwächten Impfungen kann jedoch zu schlechten Nebenwirkungsprofilen führen und hat zu einem negativen behördlichen Klima geführt, das die Entwicklung und Einführung neuer Ganzzell-Impfungen limitiert. Dies hat beträchtliche Anstrengungen angeregt, die Impfungskomponenten zu reinigen und hat die Entwicklung von Untergruppenimpfungen, konjugierten Impfungen und DNA-Impfungen gefördert.
Untergruppenimpfungen basieren auf synthetischen oder isolierten Agentien, die unter Verwendung (bio)chemischen und/oder rekombinanten Techniken (z. B. rekombinanten Peptiden, Protein und/oder Kohlehydratsynthese oder Reinigung) erzeugt wurden. Konjugierte Impfungen involvieren die Verbindung (gewöhnlich durch chemisches Crosslinking) von relativen nicht-immunogenischen (gewöhnlich Kohlehydrat-basierten) Antigenen mit stärker immunogenischen Trägerproteinen. DNA-Impfungen geben das Antigen (die Antigene) in Form von codierender Nukleinsäure ab und beruhen somit auf der endogenen Expression der codierender DNA nach der Verabreichung. Solche Impfungen erfordern normalerweise einen geeigneten Vektor (z. B. ein Plasmid, ein virales oder lipides Bläschen) um die codierende Nukleinsäure zu der geeigneten Stelle des Wirts zu bringen.
Obwohl Untergruppen, konjugierte und DNA-Impfungen grundsätzlich mit guten Nebenwirkungsprofilen gut vertragen werden, besitzen sie im Allgemeinen keine PAMPs, die für die angeborene Immunaktivierung benötigt werden. Daher zeigen sie typischerweise weit weniger Wirkung im Vergleich zu den komplexen Antigenmischungen, die in vielen der bewährten geschwächten/getöteten Impfungen vorhanden sind: die ziemlich einfache Beschaffenheit synthetischer Antigene von niedrigem Molekulargewicht macht sie im Allgemeinen, obgleich ohne die potentiellen schädigenden Konterminanten, selbst nicht sehr immunogen.
Die Entwicklung einer Impfung wird auch durch andere Überlegungen getrieben. Zum Beispiel kann die Wirksamkeit irgendwelcher gegebenen Impfungen auch durch den Zustand des Wirts beeinträchtigt werden. Alte oder immungeschwächte Wirte sind schlechte Antworter zu den meisten Impfungen: in bestimmten immungeschwächten Individuen (z. B. Nierendialyse-Patienten und Alkoholiker) kann das Verhältnis der Nichtantworter an 50% heranreichen. Eine Nicht-Antwort kann auch von einer MHC-Restriktion herrühren: zwischen 5 und 10 der Individuen sind Nicht-Antworter oder Über-Antworter zu der Untergruppen HBsAg Impfung und dies stellt einen Defekt in dieser Wirtpopulation dar, T-Helfer-Epitope zu erkennen.
Jüngste Weltereignisse haben gezeigt, dass Bioterrorismus eine sehr reale Bedrohung ist. Von einer medizinischen Seite werden neue und weitreichend effektive Verteidigungsstrategien benötigt werden, um eine potentielle künstliche Epidemie zu verhindern oder zu behandeln. Die Bedrohung durch eine bewußte Verwendung von biologischen Waffen liefert den Anstoß existierende Bioverteidigungsimpfungen (z. B. Antrax, Smallpox) zu verbessern und neue zu erzeugen (z. B. Pest, Hasenpest).
Daher ist es die Herausforderung der modernen Impfentwicklung Strategien für das wirksame Anvisieren sowohl der angeborenen wie auch der erworbenen Immunantwort genauer einer natürlichen Infektion nachzuahmen und wirksame Antworten zu definierten Antigenen zu erreichen, während die Toxizität vermindert wird. Ein großer Teil des Aufwands in diesem Gebiet wird gegenwärtig auf Adjuvantien gerichtet – Immunantwort-Verstärker, die nun als essentiell für das Realisieren neuer Impfungstypen gesehen werden, die bestehende Impfungen effektiver machen und die diejenigen, die teuer herzustellen sind oder knapp sind, leichter erhältlich machen.
Adjuvantien
Ein Adjuvans ist jede Verbindung oder Zusammensetzung, die Stärke und/oder Dauer einer Immunantwort auf ein fremdes Antigen relativ zu der, die durch Antigen alleine hervorgerufen wird, erhöht. Schlüsselfunktionelle Charakteristika eines Adjuvans schließen daher seine Fähigkeit ein, geeignete Immunantworten zu dem Zielantigen zu verstärken, Langzeitsicherheit bei ausgedehnter Anwendung und Flexibilität bei der Verwendung mit verschiedenen Antigen-Anwendungen/Krankheits-Anwendungen.
Die Geschichte der Adjuvans-Entdeckung kann als eine Mischung von Alchemie und Glück charakterisiert werden, da die Funktionsmechanismen der meisten Adjuvantien nur teilweise verstanden bleiben. Obwohl viele verschiedene Adjuvantien bekannt sind, ist das einzige Adjuvans, das derzeit für die Verwendung beim Menschen mit einem Antigen lizensiert ist, Alaun (eine Bezeichnung, die eine Gruppe von Aluminiumsalzen bezeichnet, die Aluminiumhyrdoxid und Aluminiumphosphat einschließt).
Obwohl der Wirkmechanismus von Alaun nicht vollständig verstanden wird, scheint es, dass sich ein Teil seiner Aktivität sich von dem sogenannten Depot-Effekt herleitet. Kleine Antigene, die in dem Blutstrom injiziert werden, können schnell in der Leber abgebaut werden oder durch die Nieren gefiltert werden. Alaun, und die anderen Adjuvantien, die einen Depoteffekt zeigen (siehe nachstehend), können lösliche Antigene in dem Bereich nahe der Injektionsstelle ausfällen (oder auf andere Weise ihr Verweilzeit erhöhen), wo Makrophagen und dentritische Zellen diese verarbeiten können. Auf diese Weise können sie als Antigen-Zulieferer/Anvisierende Vehikel (und nicht notwendigerweise direkt als Immunstimulanzien per se) fungieren, die eine effektivere Präsentation des Antigens zu dem angeborenen Immunsystem vermitteln.
Eine kürzliche Arbeit hat jedoch gezeigt, dass Alaun auch einen direkten Immun-verstärkenden Effekt über die zytokinvermittelte Kontrolle von Th1/Th2-Antworten besitzt (siehe z. B. Brewer et al. (1999) The Journal of Immunology, 163: 6448–6454).
Was immer seine biologische Basis ist, die Immunstimulierung, die von Alaun gezeigt wird, wird stark in Richtung einer Typ 2-Antwort polarisiert (d. h. Alaun hat effektiv nur Typ 2-Adjuvanseigenschaften). Dies ist eine große Einschränkung, da nun erkannt wird, dass Typ 1 Immunantworten (im Speziellen die Induktion von T-Helferzellen Typ 1 (Th-1) und zytotoxischen T-Lymphozyten) für das Erzeugen schützender Immunität gegen viele infektiöse Agentien essentiell sind. Zum Beispiel erfordern viele virale, bakterielle, protozoische und intrazelluläre Infektionen (einschließlich Krankheiten, die durch intrazelluläre Parasiten und Pathogene vermittelt werden, wie Leishmania und Malaria) eine starke zellvermittelte Immunantwort für den adäquaten Schutz.
Daher ist Alaun ungeeignet für die Verwendung mit vielen modernen Impfungen, die entwickelt wurden, um eine Typ 1-Antwort zu fördern. Es wurde zum Beispiel berichtet, dass Alaun die Wirksamkeit von Keuchhusten und Typhusimpfungen nicht verbessert nur einen leichten Adjuvans-Effekt bei Adenovirus-Impfungen beisteuert. Daher wurde die Anwendung von Alaun in klinischen Impfungen weitgehend auf Situationen beschränkt, wo der Schutz durch Typ 2-Antworten bewirkt wird, im Speziellen bei der Herstellung von neutralisierenden Antikörpern.
Diese Beschränkungen von Alaun, zusammen mit den allgemeineren Anforderungen, die die Entwicklung von Impfperformance, wie sie vorstehend diskutiert wurde, haben Bemühungen vorangetrieben, neue Impf-Adjuvantien mit einer größeren Wirkung und/oder der Fähigkeit die vorbestimmte Balance von Typ 1 (zellulär) und Typ 2 (Antikörper) Antworten zu erleichtern. Obwohl verschiedene Kandidaten in unterschiedlichen Stufen der Entwicklung sind, leiden diese Kandidaten an Problemen, die mit Nebenwirkungen und unerwünschter Sensitivität zu kleinen Strukturänderungen (die während der Formulierung, bei der Lagerung oder in vivo nach der Verabreichung auftreten können und die Toxizität drastisch erhöhen können und/oder die Wirksamkeit vermindern können) verbunden sind. Einiger dieser Adjuvantien werden nachstehend eingehender beschrieben.
Pollock et al. (2003) Immunology 108: 137–143 beschreiben Adjuvans-Systeme, die Alaun und spezielle Zytogene umfassen. Sie zeigen speziell, dass die Adsorbtion von IL-12 (mit oder ohne IL-18) an Alaungele das Th1/Th2-Profil der induzierten Antwort beeinflussen kann. Im Speziellen zeigt Alaungel mit adsorbiertem IL-12 ein ausgeglicheneres Th1:Th2-Profil, wobei das IL-12 dazu fungiert, die Alaun-induzierte Th2-Antwort in Richtung einer Th1-Antwort zu polarisieren. Obwohl es in der Abwesenheit von IL-12 nicht aktiv ist, bewirkt die Verwendung von IL-18 als ein zweites zusätzliches Adjuvans einen synergistischen Effekt, der dem IL-12 erlaubte, die Typ 1-Antwort weiter zu steigern und eine noch ausgeprägtere Th1-Polarisierung zu fördern. Die Autoren bemerken, dass das ausgeglichenere Profil der Alaun-/Zytokin-Adjuvans-Systeme (resultierend von der Zytokin-induzierten Th1-Polarisierung/Steigerung der Alaun-induzierten Th2-Antwort) Anwendungen bei der Verbesserung des Verhaltens von Alaun-basierenden Adjuvantien haben können, aber bemerken, dass die Reaktogenität von IL-12 wahrscheinlich ein Hindernis für die Anwendung dieser Erkenntnis bei menschlichen Impfungen ist.
Die US 5,976,539 beschreibt die mögliche Verwendung von Interleukin-12 (IL-12) als ein Adjuvans und unterstreicht sein Potential als ein Aktivator von Typ 1-Immunität. Sein Potential bei Impfungen gegen Infektionen, die erhöhte Zellvermittelte Immunantworten für einen effektiven Schutz gegen die Infektion durch ein Pathogen erfordern, wird betont. IL-12 ist jedoch teuer herzustellen und zu formulieren und seine Verwendung beim Menschen ist voller Schwierigkeiten, die sich von seiner Reaktorgenizität und pleiotropischen Effekten in vivo herleiten (die Dosierungsprobleme und unerwartete Nebenwirkungen zur Folge haben können).
Die WO 88/09336 beschreibt verschiedene immunologisch aktive Saponinfraktionen, die Adjuvans-Aktivität besitzen (in der Wissenschaft generisch als Saponinadjuvantien bekannt). Die Fraktionen wurden erfolgreich in der Veterinärpraxis verwendet und stammen von der Rinde des südamerikanischen Baums Quillaja sponaria. Es wurde gezeigt, dass im Wesentlichen reine Saponine Adjuvans-Aktivität bei einer viel geringeren Konzentration besitzen als heterogene Saponinzubereitungen und ihre toxischen Effekte nicht zeigen. QS-21 zum Beispiel, auch bekannt als QA21 ist eine HPLC gereinigt Fraktion, die in der US 5,057,540 (als QA21) offenbart ist. QS-21-Saponinadjuvantien stimulieren sowohl Typ 1 als auch Typ 2 Immunantworten und würden in kürzlichen großflächigen klinischen Versuchen von sowohl prophylaktischen als auch therapeutischen Impfungen mit großem Erfolg verwendet.
Die WO 90/14837 beschreibt verschiedene submikrone Öl-in-Wasser-Emulsionen und ihre Verwendung als Adjuvantien. Dieses Dokument beschreibt im Besonderen Adjuvans-Zusammensetzungen, die ein metabolisierbares Öl und ein emulgierendes Agens umfassen, wobei das Öl und emulgierende Agens in der Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion mit Öltropfen vorliegen, die im Wesentlichen alle einen Durchmesser von weniger als 1 μm besitzen, vorliegen. Eine der beschriebenen Emulsionen, ein mikrofluidisiertes Emulsionssystem bestehend aus Polysorbat 80 und Sorbitan-Trioleat sychronisiert MF59, wurde kürzlich für die Verwendung in einer Influenzaimpfung in Italien zugelassen. MF59 stimuliert wie Alaun jedoch eine stark polarisierte Typ 2-Antwort.
Es wurde gezeigt, das bakterielles Lipopolysaccharidendotoxin (LPS) und speziell sein aktiver Teil Lipid A, ein wirksames immunologisches Ajduvans ist. Natives dephosphoriliertes Lipid A (DPL) ist reaktogen und pyrogen; einfache chemische Modifikationen an DPL führen jedoch zu nichttoxischen Präparaten, die die Adjuvansaktivität von DPL beibehalten. Klinische Versuche wurden mit Lipid A, das von Salmonella minnesota R595 gereinigt wurde und durch die Entfernung der Phosphatgruppe vom reduzierenden Ende des Disaccharidrückgrats von DPL durch Säurehydrolyse detoxifiziert wurde, durchgeführt, um Monophosphoryl Lipid A (MPL) herzustellen. Monophosphoryl Lipid A kann weiter durch eine 3-O-Deazylierung mit milder alkalischer Hydrolyse detoxifiziert werden und kann in Liposome, die aus Phospholipiden und Cholesterol zusammengesetzt sind, eingekapselt werden.
Bakterielle DNA, aber nicht Wirbeltier-DNA, besitzt, aufgrund der Anwesenheit von unmethylierten CpG Dinukleotiden, direkte immunstimulierende Wirkungen auf mononukleare Periphärblut-Zellen. Diese sind in einer relativ hohen Frequenz in bakterieller DNA vorhanden, aber in Wirbeltier-DNA unterrepräsentiert. Die US 2003,091,599 beschreibt Olegonukleotid-Adjuvantien, die mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid besitzen und zeigt, dass CpG-DNA ein Th-1 Muster der Zytokinproduktion induziert, das durch IL-12 und IFN-gamma dominiert wird, mit geringer Sekretion von Th2-Zytokinen. CpG aktiviert daher direkt Monozyten, Makrophagen und dentritische Zellen, um eine Vielzahl von Zytokinen abzuscheiden, eingeschlossen hohe Konzentrationen an IL-12. Diese Zytokine stimulieren natürliche Killerzellen (NK-Zellen) Gamma-Interferon abzusondern und auch ihre lytische Aktivität zu erhöhen.
Es wurden auch Studien mit einer Emulsion bestehend, aus Squalen, Pluronic L121 Blockpolymer und Tween 80 in phosphatgepufferter Saline (SAF-m-Adjuvans), sowohl allein als auch in Kombination mit Thrionyl, Muramyl Dipeptid (Termutide^TM; N-Acetylmuramyl-L-Threonyl-D-Isoglutamin; MDP) durchgeführt. Diese Studien zeigten, dass das SAF-m-Adjuvans in Kombination mit Influenza, HSV gD2, und HIV-1 Immunogenen, eine größere Adjuvanswirkung zeigt als Alaun und (in machen Fällen) MF59.
Muramyldipeptid (MDP) stellt die kleinste Einheit des mycrobakteriellen Zellwandkomplexes dar, der die Adjuvansaktivität erzeugt, die mit dem vollständigen Freund's Adjuvant beobachtet wurde (Ellouz et al. (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm.; 59: 1317). Viele synthetische Analoga von MDP wurden erzeugt, die ein breites Spektrum an Adjuvans-Wirksamkeit und Nebenwirkungen zeigen (besprochen in Chedid et al. (1978) Prog. Allergy, 25: 63). Drei Analoga, die speziell als Impf-Adjuvantien nützlich sein können, sind Threonyl-Derivate von MDP, n-butyl-Derivate und lipophile Derivate von Muramyl-Tripeptid. Von diesen Verbindungen wird berichtet, dass sie effektiv sowohl Typ 1 als auch Typ 2-Anworten bei niedrigen Graden an Toxizität stimulieren.
Ein vielversprechendes lipophiles Deriviat von MDP ist N-acteylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-[1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-3-(hdroxyphosphoryloxy)]ethylamide (MTP-PE). Dieses Muramyl-Tripeptid besitzt Phosphorlipidenden, die eine Assoziierung mit dem hydrophoben Teil des Moleküls mit einer Lipidumgebung erlauben, während der Muramyl-Peptid-Teil mit der wässrigen Umgebung assoziiert. Daher kann das MTP-PE selbst als ein emulgierendes Agens wirken, um stabile Öl-in-Wasser Emulsionen zu erzeugen.
Daher besteht ein Bedarf für weitere wirksamen, niedrig toxische Adjuvantien und Adjuvans-Systeme. Es gibt ebenfalls einen Bedarf noch ausgeglichenere Adjuvantien und Adjuvans- Systeme, die beide Glieder des Immunsystems stimulieren und daher die Sicherheit und Effektivität bestehender Impfungen verbessern und für die Verwendung mit den schwachimmunogenischen, synthetischen und Zellbasierten Impfungen, die gerade ausgedehnt verwendet werden, geeignet sind. Es gibt ebenfalls einen Bedarf für verbesserte Adjuvantien und Adjuvanssysteme, die die Wirkungen von Impfungen bei alten oder immungeschwächten Patientenpopulationen verbessern.
Ein Adjuvans oder Adjuvans-System, das niedere Dosierungen effektiver macht, würde, vielmehr, billigere Impfungen in den Fällen erlauben, in denen das Antigen teuer herzustellen ist (wie es oft der Fall bei rekombinanten, DNA- oder Untergruppenimpfungen ist). Dies könnte ebenfalls die Belieferungen in Notfällen ausweiten (wie dies zum Beispiel während einer Epidemie auftreten kann). Solche Dosierungseinsparenden Eigenschaften sind in dem Fall von konjugierten Impfungen von besonderer Bedeutung, wo eine schwierige Chemie oft die Antigen-Dosis-Größe limitiert. Das Einsparen der Dosis ist auch in Umständen wichtig, wo mehrere verschiedene Antigene in einer einzigen Einspritzung zusammen verabreicht werden.
Alkaloide
Die Bezeichnung Alkaloid wird hier im engeren Sinne verwendet, um jede basische, organische, stickstoffhaltige Verbindung zu bezeichnen, die natürlicherweise in einem Organismus vorkommt. Die Bezeichnung Alkaloid wird hier ebenfalls im weiteren Sinne verwendet, um eine breitere Gruppierung von Verbindungen zu bezeichnen, die nicht nur die natürlich vorkommenden Alkaloide einschließen, sondern auch ihre synthetischen oder halbsynthetischen Analoga und Derivate.
Die meisten bekannten Alkaloide sind sekundäre Pflanzenstoffe, die als sekundäre Metaboliten in Pflanzengeweben vorkommen (wo sie eine Rolle bei der Abwehr spielen können), aber einige treten als Sekundärmetabolite in den Geweben von Tieren, Mikroorganismen und Pilzen auf. Es wird zunehmend erkannt, dass die Standardtechniken zum Screenen mikrobiologischer Kulturen für das Detektieren vieler Klassen von Alkaloiden (im Speziellen hochpolare Alkaloide, siehe nachstehend) ungeeignet sind und dass Mikroben (einschließlich Bakterien und Pilze, insbesondere die filamentösen Vertreter) sich als eine wertvolle Quelle von Alkaloiden erweisen werden, sobald die Screening-Techniken technisch ausgereifter werden.
Alkaloide zeigen strukturell eine große Vielfalt. Viele Alkaloide sind kleine Moleküle mit Molekulargewichten unter 250 Dalton. Die Gerüste können von Aminosäuren stammen, obwohl manche von anderen Gruppen stammen (wie Steroide). Andere können als Zuckeranaloga angesehen werden. Es wird wahrscheinlich (siehe Watson et al. (2001) Phytochemistry 56: 265–295) das die wasserlöslichen Fraktionen medizinischer Pflanzen und mikrobieller Kulturen viele interessante neue polare Alkaloide enthalten, einschließlich vieler Kohlehydratanaloga. Solche Analoga schließen eine schnell wachsende Anzahl von polyhydroxylierten Alkaloiden ein.
Die meisten Alkaloide werden strukturell auf der Basis der Konfiguration des N-Heterozyklus klassifiziert. Beispiele einiger wichtiger Alkaloide und ihrer Strukturen werden in Kutchan (1995) The Plan Cell 7: 1059–1070 dargestellt. Watson et al. (2001) Phytochemistry 56: 265–295 haben eine umfassende Bandbreite an polyhydroxylierten Alkaloiden unter anderem als Piperidin, Pyrrolin, Pyrrolidin, Pyrrolizidin, Indolizidin und Nortropan Alkaloide klassifiziert (siehe 1–7 von Watson et al. (2001), deren Offenbarung hier durch Verweis eingeschlossen wird).
Watson et al. (2001) zeigen ebenda auch, dass eine funktionelle Klassifikation von zumindest einigen Alkaloiden auf der Basis ihres Glukosidase-Hemmungsprofils möglich ist: viele polyhydroxilierte Alkaloide sind wirksame und hochselektive Glukosidasehemmer. Diese Alkaloide können die Zahl, Position und Konfiguration von Hydroxylgruppen nachahmen, die in Pyranosyl- oder Furanosylgruppen vorkommen und so die aktive Seite einer erkennenden Glukosidase binden und Sie dadurch hemmen. Diese Gebiet wird in Legler (1990) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 48: 319–384 und in Asano et al. (1995) J. Med. chem. 38: 2349–2356 besprochen.
Es wird seit langem erkannt, dass viele Alkaloide pharmakologisch aktiv sind und Menschen haben Alkaloide (typischerweise in der Form von Pflanzenextrakten) als Gifte, Narkotika, Stimulanzien und Medizin seit tausenden von Jahren verwendet. Die therapeutischen Anwendungen von polyhydroxilierten Alkaloiden wurden umfassend in Watson et al. (2001) besprochen, ebenda: Anwendungen, die Krebstherapie, Immunstimulation, die Behandlung von Diabetes, die Behandlung von Infektionen (im Speziellen viralen Infektionen), die Therapie von Glykosphingolipid Lysosomalen Speicherkrankheiten und die Behandlung von Autoimmunstörungen (wie Arthritis und Sklerose) ein.
Sowohl von natürlichen wie auch synthetischen mono- und bizyklischen stickstoffhaltigen Analoga von Kohlenhydraten ist bekannt, dass sie eine Wirkung als chemotherapeutische Agentien besitzen. Alexin (1) und Australin (2) waren die ersten Alkaloide. die mit einem Kohlestoffsubstituent bei C-3 als vielmehr die gewöhnlicheren C-1-Substituenten, ein Charakteristikum der Necin-Familie der Pyrrolizidine, isoliert wurden.
Alexin (1)
Australin (2)
Die Alexine kommen in allen Spezien des Genus Alexa und auch in der verwandten Spezies Castanospermum australe vor. Stereoisomere von Alexin, einschließlich 1,7a-Diepialexin (3) wurden ebenfalls isoliert (Nash et al. (1990) Phytochemistry (29) 111) und synthetisiert (Choi et al. (1991) Tetrahedion Letters (32) 5517 und Denmark und Cottel (2001) J. Org. chem. (66) 4276–4284).
1,7a-Diepialexin (3)
Aufgrund der berichteten schwachen in vitro antiviralen Eigenschaften eines 7,7a-Diepialexins (nachfolgend als 1,7a-Diepialexin definiert), bestand großes Interesse an der Isolierung natürlicher Produkte und der Synthese von Analoga.
Swainsonin (4) ist als Indolizidin-Alkaloid (und so strukturell unterschiedlich von den Alexinen) ein wirksamer und spezifischer Hemmer von α-Mannosidase und es wird berichtet, dass es eine Wirksamkeit als ein antimetastatisches, tumor- antiproliferatives und immunregulatorisches Agens (siehe z. B. US 5,650,413 , WO 00/37465 , WO 93/09117 ) besitzt.
Swainsonin (4)
Ein anderes Indolizidin-Alkaloid, Castanospermin (5), ist ein wirksamer α-Glukosidasehemmer. Von dieser Verbindung, zusammen mit bestimmten 6-O-Acylderivaten (so wie dasjenige, das als Bucast (6) bekannt ist), wurde berichtetet, dass sie antivirale und anti-metastatische Aktivitäten zeigt.
Castanospermin (5)
Bucast (6)
Die Auswirkung der Variation in der Größe des sechsgliedrigen Rings Swainsonin auf seine Glukosidase-Hemm-Aktivität wurde untersucht: Deriviate (sogenannte „ringverengte Swainsonine") wurden synthetisiert. Von diesen synthetischen Derivaten (1S,2R,7R,7aR)-1,2,7-trihydroxy (7) und das 7S-Epimer (8)) wurde jedoch gezeigt, dass sie viel schwächere hemmende Aktivität im Vergleich zu Swainsonin selbst besitzen ( US 5,075,457 ).
(1S,2R,7R,7aR)-1,2,7-Trihydroxy (7)
7S-Epimer (8)
Eine andere Verbindung 1α,2α,6α,7α,7αβ-1,2,6,7-Tetrahydroxy (9) ist ein Analogum von 1,8-Diepiswainsonin und wird als „geeigneter"-Hemmer von Glukosidaseenzymen in der EP 0 417059 beschrieben.
1α,2α,6α,7α,7αβ 1,2,6,7-tetrahydroxy (9)
Casuarin(1R,2R,3R,6S,7S,7aR)-3-(Hydroxymethyl)-1,2,6,7-Tetrahydroxy (10) ist ein
hochoxigeniertes bizyklisches Alkaloid, dass als ein höher oxigeniertes Analogum des 1,7a-Diepialexin (gezeigt in 3) oder als ein C(3)hydroxymethyl-substituiertes Analogum von 1α,2α,6α,7α,7αβ-1,2,6,7-Tetrahydroxy (gezeigt in 9) bezeichnet werden kann.
Casuarin (10)
Casuarin kann aus verschiedenen botanischen Quellen, einschließlich der Rinde von Casuarina equisetifolia (Casuarinaceae), den Blättern und der Rinde von Eugenia jambolana (Myrtaceae) und Syzygium guineense (Myrtaceae) isoliert werden (siehe z. B. Nash et al. (1994) Tetrahedron Letters (35) 7849–7852). Epimere von Casuarin, und wahrscheinlich Casuarin selbst, können durch Natriumhydrogentellurid-induzierte Zyklisierung von Azidodimesylaten synthetisiert werden (Bell et al. (1997) Tetrahedron Letters (38) 5869–5872).
Von Casuarina equisetifolia Holz, Rinde und Blättern wurde beansprucht, dass sie gegen Diarrhö, Dysenterie und Kolik nützlich sind (Chopra et al. (1956) Glossary of Indian Medicinal Plants, Council of Scientific and Industrial Research (India), New Delhi, S. 55) eine Probe wurde kürzlich in West-Samoa für die Behandlung von Brustkrebs verschrieben. Von einer afrikanischen Pflanze, die Casuarin enthält (identifiziert als Syzygium guineense) wurde berichtet, dass sie bei der Behandlung von Aidspatienten förderlich ist (siehe Wormald et al. (1996) Carbohydrate Letters (2) 169–174).
Das Casuarin-6-α-Glukosid (Casuarin-6-α-D-Glukopyranose, 11) wurde ebenfalls von der Rinde und den Blättern von Eugenia jambolana (Wormald et al. (1996) Carbohydrate Letters (2) 169–174) isoliert.
Casuarin-6-α-D-Glukopyranose (11)
Eugenia jambolana ist ein in Indien für den therapeutischen Wert seiner Samen, Blätter und Frucht gegen Diabetes und bakterielle Infektionen gut bekannter Baum. Von seiner Frucht wurde gezeigt, dass sie Blutzuckerspiegel bei Menschen senkt und von wässrigen Extrakten der Rinde wird beansprucht, dass sie die Glykogenolyse und den Glykogenspeicher in Tieren (siehe Wormald et al. (1996) Carbohydrate Letters (2) 169–174) beinflussen.
Einige Pyrrolidinalkaloide zeigen sich als ziemlich weit verbreitete Sekundärmetabolite: zum Beispiel 2R,5R-dihydroxymethyl-3R,4R-dihydroxypyrrolidin (DMDP) (12) und 1,4-Dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol(D-AB1) (13) wurden sowohl von Pflanzen aus gemäßigten Zonen wie auch tropischen Pflanzen aus ziemlich unverwandten Familien isoliert und DMDP wird auch durch eine Spezies des filamentösen Bakteriums Steptomyces hergestellt.
DMDP (12)
D-AB1 (13)
Von DMDP wurde gezeigt, dass es nematozide Aktivität: Die WO 92/09202 beschreibt die Verwendung der Verbindung bei dem Kontrollieren von Krankheiten, die durch parasitische Nematoden sowohl in Pflanzen als auch Säugetieren verursacht werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert, zumindest zum Teil, auf der überraschenden Entdeckung, dass bestimmte Alkaloide eine Th1 (Typ 1)-Immunantwort stimulieren können, wenn sie mit einem Antigen zusammen verabreicht werden. Wenn sie zusammen mit einem Typ 2 (Th2) Adjuvans, wie Alaun oder MF59 zusammen verabreicht werden, können die Alkaloide der Erfindung die Typ 2-Immunantwort von Th2 zu Th1 polarisieren, verdrehen oder verlagern und so effektiv die Alaun/MF59-induzierte Th2-Antwort mit einer Th1-Antwort verstärken, um ein ausgeglichenes Adjuvans-Aktivitäts-Profil zu erzeugen.
Demnach wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Verwendung wie sie in den Ansprüchen definiert ist, zur Verfügung gestellt.
Die Adjuvanszusammensetzung umfasst des Weiteren bevorzugt ein zusätzliches Adjuvans oder mehrere zusätzliche Adjuvantien. In solchen Ausführungsformen stellt die Zusammensetzung der Erfindung ein Adjuvanssystem dar, wie es hier definiert wird.
Das zusätzliche Adjuvans in dem Adjuvanssystem der Erfindung kann ein Th1, Th2 oder ein ausgeglichenes Adjuvans umfassen, oder, sofern zwei oder mehr zusätzlich Adjuvantien eingesetzt werden, Mischungen von Th1, Th2 oder ausgeglichenen Adjuvantien.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das zusätzliche Adjuvans ein Typ 2-Adjuvans, z. B. Alaun oder MF59. Durch Variieren der relativen Mengen an Alkaloid und Typ 2-Adjuvans können ausgeglichene Adjuvans mit einem festen Th1:Th2 Verhältnis, die aus einer breiten Skala ausgewählt werden, hergestellt werden.
Die am meisten bevorzugten Adjuvanssysteme umfassen das Alkaloid der Erfindung und Alaun als zusätzliches Adjuvans. In solchen Ausführungsformen kann das Alaun als das einzige zusätzliche Adjuvans vorhanden sein, so dass das Adjuvanssystem aus (oder im Wesentlichen) dem Th1-aktivierenden Alkaloid und Alaun besteht. Derartige Adjuvans können als ausgeglichene Adjuvantien fungieren, da die Alaun-induzierte Typ 2-Immunantwort durch eine Typ 1-Antwort, die durch das Alkaloid der Erfindung beigesteuert wird, verstärkt werden kann. Zudem kann die Th1:Th2-Balance, die durch derartige Zusammensetzungen hergestellt wird, durch Variieren der relativen Mengen an Alkaloid und Alaun vorbestimmt werden (und können tatsächlich vernünftig gemäß der Natur des endgültigen Impfungsziels vorselektiert werden). Auf diese Weise können, ausgeglichen mit Adjuvantien, mit einem vorselektierten Th1:Th2-Verhältnis überall in dem {Typ 1 <–> Typ 2} Kontinuum hergestellt werden.
Das Alkaloid und das zusätzliche Adjuvans (z. B. Alaun) können physisch verbunden sein: z. B. kann das Alkaloid physisch auf einem Alaungel adsorbiert sein. Alternativ können das zusätzliche Adjuvans und das Alkaloid physisch getrennt sein und bloß zusammen verabreicht werden (wie hier definiert).
Jede geeignete Form von Alaun kann gemäß der Erfindung verwendet werden. Geeignete Formen schließen Aluminiumsalze, z. B. Aluminiumhydroxid, Alumuniumphosphat oder Mischungen von Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat ein. Besonders bevorzugt ist, dass Aluminiumhydroxid, das kommerziell als Alhydrogel^TM erhältlich ist.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann des Weiteren einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff umfassen. Geeignete Hilfsstoffe werden in größerem Detail nachstehend beschrieben (in der Sektion mit dem Titel „Formulierung").
Jedes geeignete zusätzliche Adjuvans oder eine Kombination davon kann verwendet werden. Besonders bevorzugt sind synergistische Kombinationen von einem oder mehreren zusätzlichen Adjuvans in denen die Th1/Th2-Stimulierung und/oder Polarisierung größer ist als die Summe derjeniger, die durch das Alkaloid und das individuelle Adjuvans (die individuellen Adjuvantien) alleine erzeugt werden. Ebenfalls bevorzugt ist ein zusätzliches Adjuvans (Adjuvantien), die, wenn sie mit dem Alkaloid in einem Adjuvanssystem vorhanden sind, funktionell die Th1-Aktivität des Alkaloids vervollständigen, um die Alkaloid-induzierte Typ 1-Antwort mit einer gegen-ausgleichenden Typ 2-Antwort zu verstärken. Für einige Anwendungen ist es jedoch wünschenswert die Immunantwort soweit wie möglich in die Th1- Richtung zu verdrehen oder zu polarisieren und die Auswahl von Typ 1 zusätzlichem Adjuvans (zusätzlichen Adjuvantien) kann in solchen Fällen angezeigt sein. Solche stark polarisierenden Typ 1-Adjuvanssysteme können besonders bei therapeutischen Impfungen Anwendung finden und speziell bei Anwendungen, bei denen eine starke CTL-Antwort benötigt wird (wie dies z. B. bei der Behandlung von Krebs und Krankheiten, die durch bestimmte intrazelluläre Pathogene ausgelöst werden, der Fall ist).
Geeignet für die Verwendung als zusätzliches Adjuvans gemäß der Erfindung sind Zytokine (zum Beispiel Th1-Zytokine, z. B. IL-12, IL-18 und/oder IFN-gamma). Andere geeignete zusätzliche Adjuvantien sind diejenigen, die als Carrier und/oder Depotbildende Agentien fungieren (wie Lipidvesikel oder Liposome, verschiedene Gele oder Emulsionen, z. B. die Seppic ISA-Serie von Montanid Adjuvantien und Provax^TM, wobei das Letzte eine Öl-in Wasser-Emulsion ist, die ein stabilisierendes Detergens und Mizellen-formendes Agens enthält). Noch andere schließen virusartige Partikel, Virosome und ISCOM^®-Matrizen und Partikel ein. ISCOM-Partikel bieten sowohl Adjuvans als auch Antigen-liefernde Eigenschaften. Die Partikel umfassen Saponine, Chloesterol und Phospholipide. Partikel ohne ein eingebautes oder assoziiertes Antigen werden ISCHOMATRIX^® genannt. Wenn Antigene in den Partikel eingebaut sind oder mit der vorgeformten ISCHOMATRIX^® assoziiert sind, wird dies ein ISCOM^® genannt.
Andere geeignete zusätzliche Adjuvans für die Verwendung gemäß der Erfindung schließen Saponine (im Speziellen QS-21), Submikron Öl-in Wasser-Emulsionen (speziell MF59) und CpGs ein.
Noch andere geeignete zusätzliche Adjuvantien für eine Verwendung gemäß der Erfindung schließen Lipid A-Derivate (zum Beispiel poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene (PCPP)-Derivate von Lipopolysacchariden, wie Monophosphoryl Lipid (MPL)) ein. SB-AS2 (SmithKline Beecham Adjuvanssystem #2, eine Öl-in-Wasser Emulsion enthaltend MPL und QS21) kann ebenfalls verwendet werden, wie auch SB-AS4 (SmithKline Beecham Adjuvanssystem #4, das Alaun und MPL enthält).
Andere geeignete Adjuvantien für eine Verwendung gemäß der Erfindung schließen MDPs (zum Beispiel jedes der vielen synthetischen Analoga, die in Chedid et al. (1978) Prog. Allergy, 25: 63 besprochen werden, einschließlich Threonylderivaten von MDP, n-Butylderivaten und lipophilen Derivaten von Muramyltripeptid (zum Beispiel N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-[1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-3(hydroxyphosphoryloxy)]ethylamid (MTP-PE) ein. Ein Adjuvanssystem, das eine Kombination einer Emulsion und eines MDP umfasst, zum Beispiel die Synthex^TM-Adjuvans-Emulsion (SAF-m, eine Emulsion bestehend aus Squalin, Pluronic L121 Blockpolymer und Tween 80 in Phosphat gepufferte Saline) kann besonders bevorzugt sein.
Andere geeignete Agentien zur Verwendung als zusätzliche Adjuvantien schließen lebende Antigen-präsentierende Zellen (APCs) ein. Besonders bevorzugt sind dentritische Zellen (DCs), die bevorzugt autolog und mit einem Antigen vorbeladen sind.
Alternativ oder zusätzlich, werden Immuneffektorzellen verwendet, um eine Typ 1-Antwort hervorzurufen, einschließlich zytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs). Derartige CTLs sind wieder bevorzugt autolog und durch das Aussetzen zu DCs (und/oder anderen APCs) oder durch in vitro Targeting/Priming-Techniken (einschließlich die in vitro-Manipulation isolierter CTLs durch rekombinante DNA-Techniken) bereits auf ihr Ziel ausgerichtet.
Das zusätzlichen Adjuvans (die zusätzlichen Adjuvans) können physisch mit dem Alkaloid der Erfindung verbunden sein: zum Beispiel kann das zusätzliche Adjuvans in Beimischung mit dem Alkaloid vorliegen. In Ausführungsformen, wo das zusätzliche Adjuvans Alaun umfasst, ist das Alkaloid (und jedes andere zusätzliche Adjuvans (alle anderen zusätzliche Adjuvantien) bevorzugt auf dem Alaun adsorbiert. Alternativ können das zusätzliche Adjuvans und das Alkaloid physisch getrennt sein und bloß zusammen verabreicht werden (wie hier definiert) wie es weiter nachstehend in der Section mit dem Titel „Posolgie" beschrieben wird.
Hinsichtlich eines anderen Aspekts stellt die Erfindung eine Impfung zur Verfügung, die die Zusammensetzung der Erfindung zusammen mit einem Antigen oder mehreren Antigenen umfasst.
Die Erfindung findet Anwendung bei der Herstellung jeder Impfung aber kann besonders eine Untergruppenimpfung, eine konjugierte Impfung, eine DNA-Impfung, eine rekombinante Impfung oder eine Schleimhautimpfung sein. Die Impfung kann therapeutisch oder prophylaktisch sein.
Jedes geeignete Antigen oder Kombination von Antigenen kann in den Impfungen der Erfindung verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Nukleinsäure(n), die eines oder mehrere Antigen-Proteine codiert (codieren), Protein(e) oder Peptid(e); Glykoprotein(e); Polysaccharid(e) und andere Kohlenhydrate(e); Fusionsprotein(e); Lipid(e);
Glykolipid(e); Peptidnachahmung(en) von Polysacchariden, Kohlehydrat(e) und ein Protein(e) in Beimischung; Kohlehydrat-Proteinkonjugat(e); Zellen oder Extrakte davon, tote oder geschwächte Zellen oder Extrakte davon; Tumorzellen oder Extrakte davon; virale Partikel (z. B. abgeschwächte virale Partikel oder virale Komponenten) und Allergen(e).
Das Antigen kann ein bakterielles, ein virales, ein Pilz-, ein protozoisches oder ein Prion-Antigen umfassen. Andere geeignete Antigene schließen Neoantigene, tumorassoziierte Antigene und Eigen-Antigene ein.
Das Antigen, das in den Impfungen der Erfindung verwendet wird, kann dosissparend sein, da der Adjuvanseffekt des Alkaloids (der Alkaloide) der Erfindung einen ausreichend immunstimulierenden Effekt ausgehend von relativ geringen Mengen an Antigenen erlaubt.
Die Impfung kann über jeden geeigneten Weg, wie es im größeren Detail in der Section mit dem Titel „Posologie" (nachstehend) erklärt wird, verabreicht werden. Die Impfung kann daher oral, topisch, epicutan, intramuskuluär, intradermal, subkutan, intranasal, intravaginal, sublingual oder über Inhalation verabreicht werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Die folgenden Bezeichnungen haben (zusätzlich zu jeglichen breiteren oder engeren) die Bedeutungen, die diese Bezeichnungen im Stand der Technik genießen, wo sie hier verwendet werden und solange es nicht speziell anderweitig angezeigt ist, die folgenden Bedeutungen:
Die Bezeichnung Alaun, wie sie hier verwendet wird, ist dafür gedacht, jede Aluminiumverbindung abzudecken, einschließlich Aluminiumsalzen, zum Beispiel Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Mischungen davon). Aluminiumhydroxid für die Verwendung als ein Adjuvans ist kommerziell erhältlich als Alhydrogel^TM.
Die Bezeichnung Typ 1-Adjuvans oder Th1-Adjuvans ist, wie sie hier verwendet wird, ist dafür gedacht, ein Adjuvans zu definieren, das eine Th1 (Typ 1)-Antwort stimuliert (oder eine Antwort mit einer relativ schwachen TH2 (Typ 2) Antwort., die polarisiert ist oder in Richtung einer Typ 1-Antwort gedreht ist. Solche Adjuvantien schließen CPG Adjuvantien (wie hier definiert) MDP Adjuvantien (wie hier definiert) ISCOMS, einige Zytokine (einschließlich IL-12) und Lipid A Derivate (einschließlich MPL) ein.
Die Bezeichnung Typ 2-Adjuvans oder Th2-Adjuvans, wie er hier verwendet wird, ist dafür gedacht, ein Adjuvans zu definieren, das eine Th2 (Typ 2)-Antwort stimuliert (oder eine Antwort die polarisiert ist oder in Richtung einer Typ 2-Anwort gedreht ist, mit einer relativ schwachen Th1 (Typ 1)-Antwort). Derartige Adjuvantien schließen Alaun- und Submikron Öl-in Wasser Emulsion-Adjuvantien (wie hier definiert, einschließlich MF59) ein.
Die Bezeichnung ausgeglichenes Adjuvans, wie sie hier verwendet, ist dafür gedacht, ein Adjuvans zu definieren, das sowohl eine Th1 (Typ 1)-Antwort als auch eine Th2 (Typ 2)-Antwort stimuliert. Derartige Adjuvantien schließen Saponin-Adjuvantien (wie hier definiert, einschließlich QS-21 und bestimmte experimentielle Adjuvans-Systeme (wie das Alaun IL-12 Adjuvans-System, das in Pollock et al. (2003) infra) beschrieben wird.
Die Bezeichnung Adjuvanssystem, wie sie hier verwendet wird, ist dafür gedacht, eine Adjuvans-Zusammensetzung zu definieren, die zwei oder mehrere unterschiedliche Adjuvantien umfasst. Beispielhafte Adjuvans-Systeme schließen SB-AS2 (SmithKline Beecham Adjuvans- System #2, eine Öl-in Wasser Emulsion enthaltend MPL und QS21) und SB-AS4 (SmithKline Beecham Adjuvans-System #4, das Alaun und MPL enthält) ein.
Die Bezeichnung Th1-aktivierende Alkaloide, wie sie hier verwendet wird, ist dafür gedacht, ein Alkaloid (wie hier vorstehend definiert) zu definieren, dass eine Typ 1 Immunantwort auf Antigen stimulieren kann, wenn es dort in einer ausreichenden Dosierung zusammen verabreicht wird. Th1-aktivierende Alkaloide können daher als Typ 1-Adjuvantien agieren. Bevorzugte Th1-aktivierende Alkaloide sind Alkaloide, die, wenn sie mit einem Antigen und Alaun zusammen verabreicht werden, die Balance der Th2 Alaun-induzierten Immunantwort von Th2 in Richtung Th1 drehen (oder polarisieren) (und auf dieser Weise ein ausgeglichenes Adjuvans-Aktivitäts-Profil erzeugen). Besonders bevorzugt sind Th1-aktivierende Alkaloide, die, wenn sie mit Alaun und einem Antigen zusammen verabreicht werden, die Immunantworten derart polarisieren, dass die Alaun-induzierte Th2-Antwort mit einer Th1-Antwort verstärkt wird.
Die Bezeichnungen Saponin oder Saponin-Adjuvans, (wie sie hier verwendet werden, sind dafür gedacht, eine Familie von glykosidischen triterpenoiden Verbindungen zu definieren, die in wässrigen Lösungen Schaum erzeugen und eine Immun-Adjuvans-Aktivität besitzen. Die Bezeichnung ist ebenfalls dafür gedacht, natürliche und pharmazeutisch akzeptable Salze und pharmazeutisch akzeptable Derivate sowie auch biologisch aktive Fragmente davon, abzudecken.
Die Bezeichnung CpG oder CpG-Adjuvans, wie sie hier verwendet wird, ist dafür gedacht, eine Familie von Nukleinsäuren (z. B. Olegonukleotiden) zu definieren, die mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid aufweisen, und die Immunadjuvansaktivität besitzen.
Die Bezeichnung Submikron Öl-in-Wasser Emulsion oder Submikron Öl-in Wasser-Emulsion-Adjuvans, wie sie hier verwendet wird, ist dafür gedacht, eine Klasse ein von Emulsionen abzudecken, die ein metabolisierbares Öl und ein emulgierendes Agens umfassen, wobei das Öl und das emulgierende Agens in Form einer Öl-in-Wasser Emulsion vorhanden sind, die Öltropfen besitzt, die im Wesentlichen alle einen Durchmesser von weniger als einem Mikron aufweisen und die Immun-Adjuvans-Aktivität besitzen.
Die Bezeichnung MDP oder MDP-Adjuvans, wie sie hier verwendet wird, ist dafür gedacht Derivate von Muramyldipeptid zu definieren, die geeignet für die Verwendung als Adjuvans sind. Ein exemplarisches MDP-Adjuvans N-acetylmuarmyl-L-Alanyl-D-Isoglutaminyl-L-Alanin-2-[1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-3(Hydroxyphosphoryloxy)]Ethylamid (MTP-PE). Dieses Muramyltripeptid weist Phosphorlipidenden auf, die eine Assoziierung des hydrophoben Teils des Moleküls mit einer Lipidumgebung erlauben, während der Muramylpeptidteil mit der wässrigen Umgebung assoziiert.
Die Bezeichnung therapeutische Impfung, wie sie hier verwendet wird, ist dafür gedacht, eine Unterklasse von Impfungen zu definieren, die therapeutische (und nicht nur prophylaktische) Eigenschaften besitzen. Derartige Impfungen können zusätzlich zum therapeutischen Potential prophylaktische Aktivität aufweisen. Sie finden Anwendung bei der Behandlung von bestehenden Krankheiten, Infektionen oder Zuständen. Sie wurden zunehmend wichtig als Agentien für die Behandlung von Krebs, Aids und Malaria.
Die Bezeichnung „zusammen verabreicht", wie sie hier verwendet wird, wie sie im Zusammenhang mit der Verabreichung der verschiedenen Komponenten der Zusammensetzungen, Impfungen etc. der Erfindung verwendet wird, ist dafür gedacht, die sequentielle, gleichzeitige oder getrennte Verabreichung der bezeichneten Komponenten abzudecken. Gleichzeitige Verabreichung umfasst daher den Fall, bei dem die bezeichneten Komponenten vor der Verabreichung physisch gemixt sind. Sequentielle Verabreichung umfasst die Umstände, bei denen die bezeichneten Komponenten mit einem Grad an zeitlicher Trennung (typischerweise von einigen Minuten bis zu einigen Stunden, obwohl bei manchen Ausführungsformen die Verabreichung der zusammen verabreichten Komponenten durch einen Zeitraum von einem oder mehreren Tagen getrennt sein kann) verabreicht werden.
Die Bezeichnung Neoantigen wird hier verwendet, um jede neue exprimierte Antigen-Determinante zu definieren. Neoantigene können, als neu exprimierte Determinanten (speziell auf der Oberfläche von transformierten oder infizierten Zellen) aufgrund einer Konfirmationsänderung in einem Protein entstehen, als das Ergebnis einer komplexen Formation von einem oder mehreren Molekülen oder als das Ergebnis einer Spaltung eines Moleküls mit einer resultierenden Darstellung neuer antigener Determinanten. Die Bezeichnung Neoantigen, wie sie hier verwendet wird, umfasst daher Antigene, die aufgrund einer Infektion exprimiert wurden (z. B. viraler Infektion, Protozone Infektion oder bakterieller Infektion) in Prionvermittelten Krankheiten (z. B. BSE und CJD), einer „on-cell" Transformation (Krebs), wobei im letzten Fall das Neoantigen als Tumor-assoziiertes Antigen bezeichnet werden kann.
Die Bezeichnung Tumor-assoziiertes Antigen wird hier verwendet, um ein Antigen zu definieren, das in transformierten (bösartigen oder tumorösen) Zellen vorhanden ist und welches in normalen Zellen des Typs von denen der Tumor stammt, abwesend ist (oder in geringeren Mengen oder in einem unterschiedlichen zellulären Bereich vorhanden ist). Onkogene Viren können ebenfalls die Expression von Tumorantigenen veranlassen, die oft durch den Virus induzierte Wirtproteine sind.
Die Bezeichnungen polar und nichtpolar sind als relative Bezeichnungen zu verstehen, die bei der Charakterisierung von Flüssigkeiten verwendet werden können, um den Grad zu dem sie ein elektrische Dipolelement besitzen und so Hydrophilität (polar) oder Hydrophobizität (nichtpolar) zeigen, anzuzeigen. Derartige Flüssigkeiten können verwendet werden, um polare bzw. nichtpolare sekundäre Pflanzenstoffe zu extrahieren, und die Bezeichnungen polar und nichtpolar, wie sie hier auf Alkaloide, sekundäre Pflanzenstoffe oder jegliche andere Gruppen angewendet werden, sind dem entsprechen zu interpretieren.
Die Bezeichnung isoliert wie sie auf die Alkaloide der Erfindung angewendet wird, wird hier verwendet, um anzuzeigen, dass das Alkaloid, in einem physischen Milieu existiert, das unterschiedlich zu einem ist, das in der Natur vorkommt. Das isolierte Material kann, zum Beispiel im Wesentlichen isoliert (zum Beispiel gereinigt) sein, im Hinblick auf das komplexe zelluläre Milieu in dem es natürlicherweise vorkommt. Wenn das isolierte Material gereinigt ist, ist der absolute Grad an Reinheit nicht kritisch und Fachleuten können leicht die geeigneten Grade an Reinheit bestimmen, gemäß der Verwendung zu der das Material vorgesehen ist. Bevorzugt sind jedoch Reinheitsgrade von 90% Gew.-%/Gew.-% 99% Gew.-%/Gew.-% oder höher. Unter manchen Umständen bildet das isolierte Alkaloid einen Teil einer Zusammensetzung (z. B. ein mehr oder weniger rohes Extrakt, das viele andere Substanzen enthält) oder eines Puffersystems, das zum Beispiel andere Komponenten enthalten kann. In anderen Umständen kann das isolierte Alkaloid zu wesentlicher Homogenität, z. B. wie sie spektrofotometrisch, durch NMR oder durch Chromatografie (zum Beispiel GC-MS) bestimmt wird, gereinigt werden.
Die Bezeichnungen Derivat und pharmazeutisch verträgliches Derivat wie sie auf die Alkaloide der Erfindung angewendet werden, definieren Alkaloide, die durch chemische Derivatisierung der Eltern-Alkaloide der Erfindung erzielt werden (oder erzielbar sind). Die pharmazeutisch verträglichen Derivate sind geeignet für die Verabreichung oder die Verwendung in Kontakt mit den menschlichen Geweben ohne übermäßige Toxizität, Irritation oder allgergische Irritationen (d. h. mit einem vernünftigen Nutzen-/Risikoverhältnis). Bevorzugte Derivate sind diejenigen, die durch Alkylierung, Esterifizierung oder Azylierung der Eltern-Alkaloide der Erfindung erzielt werden (oder erzielbar sind). Die Derivate können per se immunstimulatorisch sein oder können bis sie in vivo verarbeitet werden, inaktiv sein. Im letzteren Fall fungieren die Derivate der Erfindung als Pro-Pharmaka. Besonders bevorzugte Pro-Pharmaka sind Esterderivate, die an einem oder mehreren der freien Hydroxyle esterifiziert sind und die durch Hydrolyse in vivo aktiviert werden. Die pharmazeutisch verträglichen Derivate der Erfindung behalten einen Teil oder die gesamte der immunstimulierenden Aktivität des Elternalkaloids. In manchen Fällen wird die immunstimulierende Aktivität durch Deriviatisierung erhöht. Derivatisierung kann ebenfalls andere biologische Aktivitäten des Alkaloids verstärken, zum Beispiel die Bioverfügbarkeit und/oder die Glukosidasehemmaktivität und/oder das Glukosidasehemmprofil. Derivatisierung kann zum Beispiel die Glukosidasehemmungs-Wirksamkeit und/oder- spezifität erhöhen.
Die Bezeichnung pharmazeutisch verträgliches Salz wie sie auf die Alkaloide der Erfindung angewandt wird, definiert jegliches nichttoxische Additionssalz einer organischen oder anorganischen Säure der freie Baseverbindungen, die für die Verwendung in Kontakt mit den Geweben von Menschen oder niederen Tieren ohne übermäßige Toxizität, Irritation, allergische Reaktion geeignet sind und die entsprechend ein angemessenes Nutzen-/Risikoverhältnis besitzen. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Salze sind im Stand der Technik gut bekannt. Beispiele sind die Salze von anorganischen Säuren (zum Beispiel Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefel- und Phosphorsäuren), organischen Carboxylsäuren (zum Beispiel Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Succinsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure und Mandelsäure) und organischen Sulfonsäuren (zum Beispiel Methansulfonsäure und p-Toluensulfonsäure). Das Alkaloid der Erfindung kann ebenfalls durch Reaktion mit einem Alkalimetallhalogenid, zum Beispiel Natriumchlorid, Natriumjodid oder Lithiumjodid in Salze umgewandelt werden. Die Alkaloide der Erfindung werden bevorzugt durch Reaktion mit einer stöchiometrischen Menge an Natriumchlorid in Anwesenheit eines Lösungsmittels wie Aceton in ihre Salze umgewandelt.
Diese Salze und die freie Basenverbindungen können entweder in hydrierter oder im Wesentlichen wasserfreier Form vorliegen. Kristalline Formen der Verbindungen der Erfindung werden ebenfalls in Erwägung gezogen und im Allgemeinen sind die Säureadditionssalze der Alkaloide der Erfindung kristalline Materialien, die in Wasser und verschiedenen hydrophilen organischen Lösungsmitteln löslich sind und die im Vergleich zu ihren freie Basenformen höhere Schmelzpunkte und eine erhöhte Löslichkeit zeigen.
Die vorliegende Erfindung zieht die Verwendung aller optischer Isomere, razemischer Formen und Diastereomeren der Alkaloide der Erfindung in Erwägung. Die Fachleute werden anerkennen, dass, aufgrund der asymmetrisch substituierten Kohlenstoffatome, die in den Alkaloiden der Erfindung vorhanden sind, die Alkaloide der Erfindung in optisch aktiven und razemischen Formen bestehen können und synthetisiert und/oder isoliert werden können. Verweise auf die Alkaloide der vorliegenden Erfindung umfassen daher die Alkaloide als eine Mischung von Diastereomeren, wie individuelle Diastereomere, als eine Mischung von Enantiomeren sowie in der Form von individuellen Enantiomeren.
Die vorliegende Erfindung beabsichtigt daher, alle optischen Isomere der Alkaloide der Erfindung und razemischen Formen davon und, sofern nicht anderweitig angezeigt (zum Beispiel durch die Verwendung von Strich-Keil-Strukturformeln), sind die Verbindungen, die hier gezeigt werden, dafür gedacht, alle möglichen optischen Isomere der so gezeigten Verbindungen zu umfassen. In Fällen, wo die stereochemische Form des Alkaloid wichtig für die pharmazeutische Verwendung ist, zieht die Erfindung die Verwendung eines isolierten Eutomers in Erwägung.
Alkaloide für die Verwendung gemäß der Erfindung
Das Alkaloid, das gemäß der Erfindung verwendet wird, stimuliert eine Typ 1-Immunantwort auf ein Antigen. Die Alkaloide zur Verwendung gemäß der Erfindung agieren daher als Typ 1-Adjuvantien. Bevorzugt sind Alkaloide, die, wenn sie zusammen mit einem Antigen und Alaun verabreicht werden, die Balance der Th2-Alaun induzierten Immunantwort von Th2 in Richtung Th1 bewegen (oder polarisieren), und dadurch ein ausgeglichenes Adjuvans-Aktivitäts-Profil erzeugen. Besonders bevorzugt sind Alkaloide, die, wenn sie zusammen mit Alaun und einem Antigen verabreicht werden, die Immunantwort derart polarisieren, dass die Alaun-induzierte Th2-Antwort durch eine Th1-Anwort verstärkt wird.
Derartige Alkaloide werden hier als Th1-aktivierende Alkaloide bezeichnet und das Th1-aktivierende Alkaloid, das in den Ansprüchen definiert ist, wird gemäß der Erfindung verwendet.
Th1-aktivierende Alkaloide können leicht durch Screening-Assays identifiziert werden, die dafür ausgebildet sind, die Th1-Induktion in vitro zu ermitteln. Die Fachleute werden über viele geeignete Assays unterrichtet sein, so wie diese, die hier und in Pollock et al. (2003) Immunology 108: 137–143 beschrieben werden, das hier durch Bezugnahme aufgenommen wird (siehe speziell den Abschnitt mit dem Titel „material and methods" auf Seite 138). Andere geeignete Assays können durch Fachleute, die leicht in der Lage sein werden, geeignete Bedingungen für solche Essays zu erkennen, einschließlich inter alia das Wesen und die Anzahl der Immunzellen, die relativen Konzentrationen von Alkaloid und Zellen, die Dauer und Stimulierung mit Alkaloid und die Verfahren, die verwendet werden, um die Induktion von einem Zytokin oder mehreren Zytokinen zu bestimmen, leicht ausgewählt und entwickelt werden.
In vielen Ausführungsformen der Erfindung ist das Alkaloid isoliert. In einigen Ausführungsformen wird jedoch die Verwendung eines isolierten Alkaloids nicht verlangt und rohe Extrakte genügen.
Die Alkaloide müssen nicht natürlich vorkommen und können synthetische Analoga oder Derivate von natürlich vorkommenden Gegenstücken sein. Solche Analoga oder Derivate sind bevorzugt pharmazeutisch verträgliche Analoga, Salze, Isomere oder Derivate, wie hier definiert. Bevorzugte Alkaloide sind jedoch sekundäre Pflanzenstoffe oder Derivate oder synthetische Analoga davon. Solche sekundären Pflanzenstoffe können von natürlichen Quellen isoliert oder in vitro synthetisiert werden.
Bevorzugt sind Alkaloide mit einem geringen Molekulargewicht, da diese wünschenswerte pharmakinetische Merkmale zeigen. Das Alkaloid kann daher ein Molekulargewicht von 100 bis 400 Dalton, bevorzugt 150 bis 300 Dalton und am bevorzugtesten 200 bis 250 Dalton besitzen.
Das Alkaloid besitzt die Formel:
wobei R aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, gerade oder verzweigtes, unsubstituiertes oder substituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes Acyl-, Alkyl- (z. B. Zykloalkyl), Alkenyl-, Alkynyl- und Arylgruppen oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Acylderivat ausgewählt wird.
Besonders bevorzugt sind Alkaloide mit der Formel:
wobei R aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, gerade oder verzweigtes, unsubstituiertes oder substituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes Acyl-, Alkyl- (z. B. Zykloalkyl), Alkenyl-, Alkynyl- und Arylgruppen oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Derivat davon umfasst.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Alkaloid 1R,2R,3R,6S,7S,7aR)-3-(hydroxymethyl)-1,2,6,7-tetrahydroxypyrrolizidin (Casuarin), wobei R Wasserstoff ist und das Alkaloid die Formel:
besitzt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Derivat davon.
Das Alkaloid kann ebenfalls ein Casuarin-Glykosid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Derivat davon sein. In solchen Ausführungsformen ist das Alkaloid bevorzugt ein Casuarin-6-α-D-Glykosid mit der Formel:
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Derivat davon.
Andere geeignete Alkaloide für die Verwendung gemäß der Erfindung werden ausgewählt aus:

(a) 3,7-diepi-Casuarin;
(b) 7-epi-Casuarin;
(c) 3,6,7-triepi-Casuarin;
(d) 6,7-diepi-Casuarin;
(e) 3-epi-Casuarin;
(f) 3,7-diepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid;
(g) 7-epi-Casuarin-6-α-D-Glukosid;
(h) 3,6,7-trepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid;
(i) 6,7-diepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid; und
(j) 3-epi-Casuarin-6-α-D-Glukosid;

Besonders bevorzugt sind daher die Diastereomere von Casuarin, ausgewählt aus 3,7-diepi-Casuarin (14), 7-epi-Casuarin (15), 3,6,7-triepi-Casuarin (16), 6,7-diepi-Casuarin (17) und 3-epi-Casuarin (18), sowie pharmazeutisch verträgliche Salze oder Derivate davon.
3,7-Diepi-Casuarin (14)
7-Epi-Casuarin (15)
3,6,7-Triepi-Casuarin (16)
6,7-Diepi-Casuarin (17)
3-Epi-Casuarin (18)
Andere bevorzugte Diastereomere werden von 3,7-diepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid (19), 7-epi-Casuarin-6-α-D-Glukosid (0), 3,6,7-triepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid (21), 6,7-diepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid (22) und 3-epi-Casuarin-6-α-D-Glukosid (23) ausgewählt, sowie pharmazeutisch verträglichen Salzen und Derivaten davon
3,7-Diepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid (19)
7-Epi-Casuarin-6-α-D-Glukosid (20)
3,6,7-Triepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid (21)
6,7-Diepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid (22)
3-Epi-Casuarin-6-α-D-Glukosid (23)
Weitere bevorzugte Diastereomere schließen 7a-Epimere, ausgewählt aus 3,7,7a-triepi-Casuarin, 7,7a-diepi-Casuarin, 3,6,7,7a-tetraepi-Casuarin, 6,7,7a-triepi-Casuarin und 3,7a-diepi-Casuarin, sowie pharmazeutisch verträgliche Salze und Derivate davon, ein.
Besonders bevorzugt sind Alkaloide ausgewählt aus der nachstehenden Tabelle:
Biologische Aktivitäten der Alkaloide der Erfindung
Die Alkaloide der Erfindung stimulieren eine Typ 1-Immunantwort auf ein Antigen. Die Alkaloide der Erfindung können daher als Typ 1-Adjuvantien fungieren. Sie können daher in Verbindung mit verschiedenen zusätzlichen Adjuvantien eingesetzt sein, um die Balance der Immunantwort in Richtung eines Typ 1-Profils zu verlagern oder die Immunantwort zu polarisieren. Die Alkaloide der Erfindung können daher in Verbindung mit einem Typ 2-Adjuvans (wie Alaun) verwendet werden, um die Immunantwort von Th2 in Richtung von Th1 zu verlagern, um so ein ausgeglichenes Adjuvans-Aktivitäts-Profil herzustellen. Die Alkaloide können daher die Immunantwort derart polarisieren, dass eine Alaun-induzierte Th2-Anwort durch eine Th1-Anwort verstärkt wird.
Die Typ 1-Immunantwort, die von den Alkaloiden der Erfindung gezeigt wird, kann eine dominante Typ 1-Anwort sein. Eine dominante Typ 1-Anwort, ist eine Antwort, die eine parallele Typ 2-Anwort (zum Beispiel eine, die endogen entstanden ist, oder durch eine gemeinsame Verabreichung eines zusätzlichen Typ 2 oder ausgeglichenen Adjuvans stimuliert wurde) mit einer Typ 1-Komponente verstärken kann. Eine dominante Typ 1-Antwort erlaubt die Produktion ausgeglichener Adjuvanssysteme durch gemeinsame Verabreichung des Alkaloids der Erfindung mit einem oder mehreren Adjuvantien, die Typ 2-Aktivität besitzen, wie sie hier beschrieben werden. Besonders bevorzugt sind Alkaloide, die eine dominante Typ 1-Anwort zeigen, so dass bei gemeinsamer Verabreichung mit Alaun, die Alaun-induzierte Th2-Antwort durch eine Alkaloid-induzierte Typ 1-Antwort verstärkt wird.
Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die polarisierende Adjuvans-Aktivität der Alkaloide der Erfindung von der Stimulierung der Expression eines oder mehrerer Th1-Zytokine und/oder der Supression eines oder mehrerer Th2-Zytokine in vivo stammt. Die Alkaloide der Erfindung können daher die Expression von einem oder mehreren Th1-Zytokinen in vivo stimulieren. Bevorzugt sind Alkaloide, die IL-12 und/oder IL-2 in vivo oder in vitro (zum Beispiel in Lymphozyten oder dentritischen Zellen) stimulieren. Besonders bevorzugt sind Th1-aktivierende Alkaloide, die die Produktion von IL-2 in dentritischen Zellen in vitro stimulieren.
IL-2 ist ein Th1-Zytokin, das in die Vermittlung von Typ 1-Antworten involviert ist. Es scheint, dass es nicht nur in die T-Zellaktivierung, sondern auch in die Aktivierung von inter alia NK-Zellen involviert ist, um so die angeborene und die erworbene Immunität zu regulieren und zu verbinden. Die Alkaloid-induzierte Expression von IL-2 in dentritischen Zellen kann daher direkt eine Th1-Antwort verstärken und so das Th1:Th2-Antwort-Verhältnis erhöhen. Die Alkaloid-induzierte Expression von IL-2 kann auch indirekt, durch Stimulierung der Aktivität von endogenen dentritischen Zellen, die dann Antworten von anderen Klassen von Lymphozyten (CTL, B, NK und NK-Zellen) auslösen, eine Th1-Antwort verstärken (und so dass Th1:Th2-Antwortverhältnis erhöhen) und das T-Zell-Gedächtnis auslösen (ein kritisches Ziel der Impfung).
IL-12 ist der primäre Vermittler der Typ 1-Immunität (der Th1-Antwort). Es induziert NK-Zellen IFN-γ als Teil der angeborenen Immunantwort zu produzieren und veranlasst die Expansion CD4 Th1-Zellen und zytotoxischer CD8-Zellen, die IFN- als Teil der angeborenen Immunantwort zu produzieren und veranlasst die Expansion CD4 Th1-Zellen und zytotoxischer CD8-Zellen, die IFN-γ produzieren. Es verstärkt daher die T-Zellinvasion von Tumoren sowie die Empfänglichkeit von Tumorzellen für die T-Zellinvasion. Eine Alkaloid-induzierte Expression von IL-12 in Lymphozyten (z. B. in dentritischen Zellen und/oder Makrophagen) kann daher direkt eine Th1-Antwort verstärken und so Th1:Th2-Antwortverhältnis erhöhen.
Die Alkaloide der Erfindung können ebenfalls die Expression von einem oder mehreren Th2-Zytokinen (zum Beispiel IL-5) unterdrücken und so das Th1:Th2-Antwortverhältnis erhöhen.
Die Alkaloide der Erfindung können ebenfalls Glukosidasehemmer sein. Besonders bevorzugt sind Alkaloide, die eine Spezifizität der Glukosidasehemmung zeigen, zum Beispiel Glukosidase I lieber als Mannosidase. Solche bevorzugten Alkaloide können daher in ihrem Glukosidase-Hemm-Profil zu Swainsonin und seinen Analoga ziemlich unterschiedlich sein, da die letzteren wirksamere und spezifische Hemmer von Mannosidase sind. Jede derartige Glukosidasehemmung kann in die Vermittlung der Stimulierung der Typ 1-Antwort involviert sein oder kann rein zufällig zu der polarisierenden Adjuvansaktivität sein. Ohne jedoch an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass eine derartige Aktivität als ein Index oder Marker der Typ 1-Adjuvansaktivität bei den Th1-aktivierenden Alkaloiden der Erfindung dienen kann.
Ziele von Impfungen
Die Impfungen der Erfindung können bei der Behandlung oder Prophylaxe eines weiten Bereichs an Krankheiten und Erkrankungen, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden.

• Virale Ziele schließen Krankheiten und Erkrankungen ein, in denen irgendwelche der folgenden Viren (oder Virenklassen) einbezogen sind: Retroviren, (z. B. die menschlichen Immundeffizienzviren, einschließlich HIV-1); Picornaviren (z. B. Polioviren, Hepatitis A Virus, Enteroviren, menschliche Coxackle Viren, Rhinoviren, Echoviren); Calciviren (z. B. Stämme, die Gastroenteritis verursachen); Togaviren (z. B. Equine Enzephalitisviren, Rubellaviren ); Flaviviren (z. B. Dengi-Viren, Enzephalitisviren, Gelbfieberviren); Coronoviren (z. B. Coronaviren); Rhabdoviren (z. B. vesikuläre Stomatitisviren, Tollwutviren); Filoviren (z. B. Ebolaviren); Paramyxoviren (z. B. Parainfluenzaviren, Mumpsvirus, Masernvirus, respiratorischer Syncytialvirus; Orthomyxoviren (z. B. Influenzaviren); Bungaviren (z. B: Hantaanviren, Bungaviren, Phleboviren und Nairoviren); Arenaviren (hämorrhagische Fieberviren); Reoviren (z. B. Reoviren, Orbiviren und Rotaviren); Birnaviren; Hepadnaviren (Hepatitis B Virus); Parvoviren (Parvoviren), Papovaviren (Papillomaviren, Polyomaviren); Adenoviren (die meisten Adenoviren); Herpesviren (herpes simplex virus (HSV) 1 und 2, Varicellazostervirus, Cytomegalovirus (CMV), Herpesvirus; Poxviren (Variolaviren, Vacciniaviren, Poxviren) und Iridoviren (z. B. Afrikanisches Schweinfiebervirus); und unklassifizierte Viren (z. B. die etiologischen Agentien spongiformer Enzephalopathien, das Agens von Deltahepatitis (das für einen defekten Satellit des Hepatitis B Virus gehalten wird), der HCV-Virus (der nicht A-, nicht B-Hepatitis verursacht); Norwalk und verwandte Viren und Astroviren). Von den vorstehenden sind besonders bevorzugt HIV, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Tollwutvirus, Poliovirus, Influenzavirus, Meningitisvirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Röteln, Keuchhusten, Enzephalitisvirus, Pappilomavirus, Gelbfiebervirus, respiratorisches Syncytialvirus, Parovvirus, Chikungunyavirus, haemorraghische Fieberviren und Herpesviren, besonders Varicella, Zytomegalovirus und Epstein-Barr-Virus. In derartigen Ausführungsformen ist das Antigen (die Antigene), das für die Verwendung in der Impfung ausgewählt ist (sind) von den Antigenen hergeleitet, die in dem natürlich vorkommenden Virus vorhanden sind (oder dort durch Infektion exprimiert/induziert sind) oder mit Bezug dazu gestaltet sind.
• Bakterielle Ziele schließen sowohl Gram-negative als auch Gram-positive Bakterien ein. Beispiele von Bakterien, die eine Zielscheibe der Impfungen der Erfindung sein können, schließen ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Heliobacter pylori, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacterium spp.. (z. B. M. tuberculosis, M. leprae, M. avium, M. interacellulare, M. kansaii und M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus), Streptococcus agalactica (Gruppe B Streptococcus), Streptococcus viridians, Streptococcous faecalis, Streptococcus bovis und jedes der anaerobischen Spezies der Gattung Streptococcus, Streptococcus pneumoniae, Campylobacter spp., Entereococcus spp., Haemophilus influenza, Bacillus antrhacis, Corynebacterium spp. (einschließlich C. diphteriae). Erysipeloxthrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aeroenes, Klebsiella spp. (einschließlich K. pneumoniae), Pasturella multocida, Bacteriodes spp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus monilijormis, Treponema palladium, Treponema pertenue, Leptospira spp., Rickettsia spp. und Actinomyces spp. (einschließlich A israeli). In derartigen Ausführungsformen stammt das Antigen (die Antigene), das/die für die Verwendung in der Impfung ausgewählt wird (werden), von dejenigen Antigenen, die in dem natürlich vorkommenden Bakterium vorhanden sind (oder dort durch Infektion exprimiert/induziert sind oder wird unter Bezugnahme darauf entwickelt).
• Fungale Ziele schließen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidiodes immitis, Blastomyces dermatidis, Chlamydia trachomatis und Candida albicans ein. In derartigen Ausführungsformen stammt das Antigen (die Antigene), das (die) für die Verwendung in der Impfung ausgewählt wird (werden), von den Antigenen, die in dem natürlich vorkommenden Pilz vorhanden sind, oder dort während der Infektion exprimiert/induziert werden (oder dort unter Bezugnahme darauf ausgebildet werden).
• Protozoische Ziele schließen Plasmodium spp. (einschließlich Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale und Plasmodium vivax) Toxoplasma spp. (einschließlich T. gondii und T. cruzii) und Leishmania spp. ein.
• Krebsarten und prolieferative Erkrankungen schließen Festgewebe-Krebsarten und diejenigen der Blut- und Lymphatischen Systeme (einschließlich Hodgkin's Krankheit, Leukämien, Lymphomane, multiplen Myelome und Waldenström's Krankheit), Melanome (einschließlich Melanome des Auges), Adenome, Sarkome, Karzinome von Festgeweben, Melanome, Krebsarten der Lunge, der Schilddrüse, der Speicheldrüse, des Beines, der Zunge, der Lippe, des Gallengangs, des Beckens, des Mittelfelds der Harnröhre, Kaposi Sarkom (z. B. wenn es mit Aids verbunden ist); Hautkrebsarten (einschließlich malignantes Melanom), Krebsarten des Verdauungstrakts (einschließlich Kopf- und Nackenkrebsarten, Speiseröhrenkrebs, Magenkrebs, Krebs der Bauspeicheldrüse, Leberkrebs, Dickdarm- und Rektumkrebs, Analkrebs), Krebsarten der Genital- und Harnsysteme (einschließlich Nierenkrebs, Blasenkrebs, Hodenkrebs, Prostatakrebs), Krebsarten bei Frauen (einschließlich Brustkrebs, Gebärmutterhals-Uteruskrebs, Eierstockkrebs, gynäkologische Krebsarten und Chorionkarzinome) sowie im Gehirn, Knochenkarzinoid, Nasen-Rachenraum, Bauchfell, Schilddrüsen, Weichgewebetumoren und Krebsarten eines unbekannten Primärorts. In derartigen Ausführungsformen sind das Antigen (die Antigene), das (die) für die Verwendung in der Impfung ausgewählt wird (werden), das bekannte Neoantigen (die bekannten Neoantigene) oder ein tumorverbundenes Antigen (tumorverbundene Antigene), die in den malignanten Zellen und/oder Geweben vorhanden sind.
• Allergische Erkrankungen schließen atopische Allergie, allergischen Schnupfen, allergische Bindehautentzündung, atopische Dermatitidis, Hyperiosinophilie, Reizdarmsyndrom, Allergen-induzierte Migräne, bakterielle Allergie, bronchiale Allergie (Asthma), Kontaktallergie (Dermatitis), verzögerte Allergie, Pollenallergie (Heufieber), Medikamentenallergie, Stichallergie, Bissallergie, Gastrointestinale oder Lebensmittelallergie (einschließlich derjenigen, mit entzündlichen Darmkrankheiten verbunden sind, einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Chron) und physische Allergie. Physische Allergien schließen Kälteallergie (kalte Nesselsucht oder ein Angioödem) ein, Hitzeallergie (cholinergische Nesselsucht) und Lichtempfindlichkeit. In solchen Ausführungsformen entstammt das Antigen (die Antigene), das (die) für die Verwendung in der Impfung ausgewählt wird (werden), von denjenigen Antigenen, die den verwandten Allergenen, einschließlich Pollen, Insektengiften, Tierhautschuppenstaub, Pilzsporen und Medikamenten (z. B. Penicillin) und Proteinen, die zu den folgenden Gattungen spezifisch sind: Canis, Dermatophagoidis, Felis, Ambrosia, Lolium, Cryptomeria, Alder, Alnus; Betula, Quercus, Festuca und Bromus vorhanden sind (oder sind in Bezug zu diesen gestaltet).
• Andere Ziele schließen vielzellige Parasiten oder Pathogene wie Eingeweidewürmer (z. B. Schistosoma spp.) ein.

Es kann daher gesehen werden, dass die Zusammensetzungen und Impfungen der Erfindung Anwendung in der Behandlung oder Prophylaxe verschiedener Infektionen einschließlich bakterieller, viraler, fungaler, protozoischer und vielzelliger Infektionen finden kann. Die Impfungen können zum Beispiel bei der Behandlung oder Prophylaxe einer Infektion mit dem respiratorischen synzytischen Virus (RSV), Epstein-Barr, Hepatitis B Virus (HBV), Hepatitis C Virus (HCV), Herpes simplex Typ 1 und 2, Herpes genitalis, Herpes keratitis, Herpes enzephalitis, Herpes zoster, menschliches Immundefizitvirus (HIV), Influenza A Virus, Hantann Virus (haemorrhagisches Fieber), menschliches Papillomavirus (HPV), Tuberkulose, Lepra und Masern verwendet werden. Besonders bevorzugt ist die Behandlung oder Prophylaxe von Infektionen, bei denen das Pathogen einen intrazellulären Bereich befällt oder die Expression von Neoantigenen durch Wirtzellen, einschließlich HIV/AIDS, Leishmania, Influenza, Tuberkulose und Malaria verursacht.
Im Allgemeinen wird sich das Ziel der Impfungen der Erfindung in der Natur des Antigens (der Antigene), die für die Verwendung in der Impfformulierung ausgewählt wurden, widerspiegeln, und die Fachleute werden in der Lage sein, das vielversprechendste (die vielversprechendsten) Antigen(e) von den verursachenden Agentien (wie vorstehend aufgelistet) auszuwählen, zu entwickeln oder herzuleiten.
Tiermedizinische Anwendungen
Die Erfindung findet nicht nur in dem Gebiet menschlicher Therapie und Prophylaxe Anwendung, sondern auch in der Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionen in jeglichem nicht-menschlichen Tier. Derartige tiermedizinische Anwendungen werden nachstehend in größerem Detail beschrieben:

• Domestizierte Tiere. Die Entwicklung von Impfungen für die prophylaktische oder therapeutische Verwendung bei domestizierten Tieren ist von großer Wichtigkeit, nicht nur weil der Markt für solche Impfungen zur Verwendung mit domestizierten Haustieren ziemlich groß ist, sondern auch, weil die große Nähe von Tier und Mensch in solchen Situationen zu einem erhöhten Risiko von dem Übergang des Pathogens vom Menschen zum Tier führt. Derartiges „Spezies-Überspringen" war verantwortlich für die Evolution vieler wichtiger Humanpathogene, einschließlich Masern, HIV, SARS und Dengi-Fieber. Das Influenza A Virus sprang von Vögeln auf Menschen, um 1918, 1957 und 1968 verheerende Pandemien auszulösen. Die Erfindung findet daher Anwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von domestizierten Tieren. Domestizierte Tiere schließen Haustiere (wie Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Gerbile, Hamster, Affen, Frettchen, Fische, Schweine, Papageien und andere Vögel) ein, sowie Arbeitstiere wie Pferde, Hunde, Esel und Ziegen.
• Vieh: Infektion von Vieh und Viehbestand kann schwere ökonomische Schäden hervorrufen, wie durch die kürzlichen Ausbrüche von Maul- und Klauenseuche im Vereinten Königreich gezeigt wurde. Impfungen für die Verwendung bei Vieh und Viehbestand (einschließlich Kühen, Pferden, Eseln, Schweinen, Schafen und Ziegen) sind daher außerordentlich wichtig.
• Vögel: Moderne landwirtschaftliche Methoden halten Vögel in großer Zahl in sehr großer Nähe und unter geschlossenen Bedingungen. Solche Bedingungen fördern die schnelle Ausbreitung einer infektiösen Krankheit und die Kontrolle einer Infektion bei Vögeln ist ein großes Anliegen. Küken sind noch dazu besonders anfällig für eine Infektion. Besonders bevorzugt ist die Behandlung von Vögeln, ausgewählt aus Huhn, Taube, Truthahn, Ente, Gans, Fasan und Wachtel.
• Fische und andere aquatische Tiere. Die hohe Dichte von aquatischen Tieren in Bruttanks, Fischfarmen oder anderen Typen von Marine- oder Frischwasser-Landwirtschaftsanlagen setzt die Aquakulturindustrie einem besonderen Risiko für Infektionen und Verseuchung aus. Virale, bakterielle und parasitische Krankheiten stellen ein ernsthaftes Problem für die aquakulturelle Industrie dar. Die Erfindung findet daher Anwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Fischen und anderen aquatischen Tieren, einschließlich Fischen und Schalentieren (einschließlich Muscheln, Hummer, Shrimps, Krabbe und Austern). Besonders bevorzugt ist die Behandlung oder Prophylaxe von Knochen- oder Knorpelfischen, einschließlich Salmoniden, Karpfen, Seewolf, Anemonenfisch, Dorade und Zackenbarsch. Besonders bevorzugt ist die Behandlung von Forelle, Lachs und Saibling.

Formulierung
Die Zusammensetzungen und Impfungen der Erfindung umfassen das Alkaloid der Erfindung wahlweise zusammen mit einem oder mehreren zusätzlichen Adjuvantien und/oder einem pharmazeutisch verträglichen Stoff.
Das Alkaloid der Erfindung kann jegliche Form annehmen. Es kann synthetisch, gereinigt, oder aus natürlichen Quellen isoliert sein (z. B. von Casuarina equisetifolia oder Eugenia jambolana) unter Verwendung von Techniken wie sie in der Wissenschaft beschrieben werden (auf die nachstehend Bezug genommen wird). Das Alkaloid der Erfindung kann gereinigt werden, wenn es aus einer natürlichen Quelle isoliert wird.
In den Ausführungsformen, wo das Alkaloid der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff formuliert wird, kann jeder geeignete Hilfsstoff verwendet werden, einschließlich zum Beispiel inerte Verdünnungsmittel, auflösende Agentien, bindende Agentien, befeuchtende Agentien, süßende Agentien, geschmacksgebende Agentien, färbende Agentien und Konservierungsstoffe. Geeignete inerte Verdünnungsmittel schließen Natrium- und Kalziumcarbonat, Natrium- und Kalziumphosphat und Laktose ein, während Maisstärke und Alginsäure geeignete auflösende Agentien sind. Bindende Agentien können Stärke und Gelatine einschließen, während das befeuchtendende Agens, falls es vorhanden ist, generell ein Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talk sein wird.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können jede geeignete Form annehmen und schließen Tabletten, Elixiere, Kapseln, Lösungen, Suspensionen, Puder, Granulate und Aerosole ein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann die Form eines Baukasten von Teilen annehmen, wobei der Baukasten die Zusammensetzung der Erfindung zusammen mit Instruktionen für die Verwendung und/oder eine Vielzahl von unterschiedlichen Komponenten in Einheitsdosis-Form umfassen kann.
Tabletten für die orale Verwendung können das Alkaloid der Erfindung entweder allein oder zusammen mit anderen Pflanzenmaterial, das mit der botanischen Quelle (den botanischen Quellen) verbunden ist, einschließen. Die Tabletten können das Alkaloid der Erfindung gemischt mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, sowie inerte Verdünnungsmittel, auflösende Agentien, bindende Agentien, befeuchtende Agentien, süßende Agentien, geschmacksgebende Agentien, färbende Agentien und Konservierungsstoffe enthalten. Geeignete inerte Verdünnungsstoffe schließen Natrium- und Kalziumcarbonat, Natrium- und Kalziumphosphat und Laktose ein, während Maisstärke und Alginsäure geeignete auflösende Agentien sind. Bindende Agentien können Stärke und Gelatine einschließen, während das befeuchtende Agens, falls es vorhanden ist, generell Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talk sein wird. Falls gewünscht, können die Tablette mit einem Material wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat gecoatet sein, um die Absorbtion im Gastrointestinaltrakt zu verzögern.
Kapseln für die orale Verwendung schließen harte Gelatinekapseln ein, in denen das Alkaloid der Erfindung mit einem festen Verdünnungsmittel gemischt ist und weiche Gelatinekapseln, in denen der aktive Inhaltsstoff mit Wasser oder einem Öl, wie Erdnussöl, flüssigem Paraffin oder Olivenöl, gemischt ist.
Formulierungen für die rektalen Verabreichung können als Zäpfchen mit einem geeigneten Träger, umfassend, zum Beispiel Kakaobutter oder Salicylat, dargeboten werden.
Formulierungen, die vaginale Verabreichung geeignet sind, können in Form von Pessarien, Tampons, Cremes, Gelen, Pasten, Schäumen oder Sprühformulierungen dargeboten werden, die zusätzlich zu dem aktiven Inhaltsstoff derartige Träger enthalten, wie sie im Stand der Technik als zweckdienlich bekannt sind.
Für eine intramuskuläre, intraperitonale, subkutane oder intravenöse Verwendung werden die Verbindungen der Erfindung im Allgemeinen in sterilen wässrigen Lösungen oder Suspensionen bereitgestellt werden, die zu einem geeigneten pH und Isotonizität gepuffert sind.
Geeignete wässrige Vehikel schließen Ringer's Lösung und isotonische Natriumchlorid ein. Wässrige Suspensionen, gemäß der Erfindung können suspendierende Agentien, wie Zellulosederivate, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon und Tragantgummi und ein nassmachendes Agens wie Lecithin einschließen. Geeignete Konservierungsmittel für die wässrigen Suspensionen schließen Ethyl und n-Propyl p-Hydroxybenzoat ein.
Die Verbindungen der Erfindung können ebenfalls als Liposomformulierungen dargeboten werden.
Für die orale Verabreichung kann das Alkaloid der Erfindung in festen oder flüssigen Zubereitungen, wie Kapseln, Pillen, Tabletten, Pastillen, Lutschtabletten, Ausschmelzungen, Puder, Granulaen, Lösungen, Suspensionen, Dispersionen oder Emulsionen (wobei die Lösungen, Suspensionen, Dispersionen oder Emulsionen wässrig oder nichtwässrig sein können) formuliert sein. Die festen Einheitsdosis-Formen können eine Kapsel enthalten, die vom gewöhnlichen Hart- oder Weichschalen-Gelatine-Typ ist, zum Beispiel, Tenside, Befeuchter und inerte Füllstoffe, wie Laktose, Saccharose, Kalziumphosphat und Maisstärke.
In einer anderen Ausführungsform sind die Alkaloide der Erfindung mit gewöhnlichen Tablettenträgern, wie Laktose, Saccharose und Maisstärke in Kombination mit Bindemitteln wie Akazie, Maisstärke oder Gelatine, auflösenden Agentien, die dazu dienen bei dem Aufbrechen und Auflösen der Tablette, das der Verabreichung folgt, wie Kartoffelstärke, Alginsäure, Maisstärke und Guaran zu helfen und den Fluss der Tablettengranulierungen zu verbessern und das Anhaften von Tablettenmaterial auf den Tablettenpressformen und -stempeln zu verhindern, zum Beispiel Talk, Stearinsäure oder Magnesium, Kalzium oder Zinkstearat, Farbstoffen, färbenden Agentien und geschmacksgebenden Agentien, die dafür da sind die ästhetischen Qualitäten der Tabletten zu erhöhen und sie für den Patienten annehmbarer zu machen, tablettiert.
Geeignete Hilfsstoffe für die Verwendung in oralen Flüssig-Dosier-Formen schließen Verdünnungsmittel, wie Wasser und Alkohole, zum Beispiel, Ethanol, Benzylalkohol und die Poylethylenalkohole entweder mit oder ohne der Zugabe eines pharmazeutisch verträglichen Tensids, suspendierenden Agens oder emulgierenden Agens, ein.
Die Alkaloide der Erfindung können ebenfalls parenteral, das heißt subkutan, intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal verabreicht werden.
In derartigen Ausführungsformen wird das Alkaloid in Form von injizierbaren Dosen in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel zusammen mit einem pharmazeutischen Träger (der eine sterile Flüssigkeit oder Mischung von Flüssigkeiten sein kann), dargereicht. Geeignete Flüssigkeiten schließen Wasser, Saline, wässrige Dextrose und verwandte Zuckerlösungen, einen Alkohol (wie Ethanol, Isopropanol, oder Hexadecylalkohol), Glykole (wie Propylenglykol oder Polyethylenglycol), Glyzerolketale (wie 2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol), Ether (wie Poly(Ethylen-Glycol)400), ein Öl, eine Fettsäure, einen Fettsäureester oder Glyzerid, oder ein azetyliertes Fettsäureglyzerid mit oder ohne der Zugabe eines pharmazeutisch verträglichen Tensids (wie Seife oder einem Reinigungsmittel), ein suspendierendes Agens (wie Pektin, Carbomere, Methylzellulose, Hydroxypropyl-Methylzellulose oder Carboxymethylzellulose) oder ein emulgierendes Agens und andere pharmazeutische Adjuvantien ein. Geeignete öle, die in den parenteralen Formulierungen dieser Erfindung verwendet werden können, sind diejenigen von mineralischen, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, zum Beispiel Erdnussöl, Sojaöl, Sesamöl, Baumwollsaatöl, Maisöl, Olivenöl, Vaseline und Mineralöl.
Geeignete Fettsäuren schließen Ölsäure, Stearinsäure und Isostearinsäure ein. Geeignete Fettsäureester sind, zum Beispiel, Ethyloleat und Isopropylmyristat.
Geeignete Seifen schließen fettiges Alkalimetall, Ammonium und Triethanolamin-Salze und geeignete Reinigungsmittel, einschließlich kationischer Reinigungsmittel, zum Beispiel Dimethyl-Dialkyl-Ammonium-Halogenid, Alkyl-Pyridinium-Halogenid und Alkyl-Amin-Acetate; anionische Reinigungsmittel, zum Beispiel Alkyl, Aryl und Olefinsulfonate, Alkyl, Olefin, Ether und Monoglyzerid-Sulfate und Sulfosuccinate; nichtionische Reinigungsmittel, zum Beispiel Fettaminoxide, Fettsäure-Alkanolamide und Polyoxyethylen Polypropylencopolymere; und amphoterische Reinigungsmittel, zum Beispiel Alkyl-beta-Aminopropionat und 2-Alkylimidazolin quartere Ammoniumsalze sowie Mischungen ein.
Die parenteralen Zusammensetzungen dieser Erfindung werden typischerweise von ungefähr 0,5 bis ungefähr 25 Gew.-% des Alkaloids der Erfindung in Lösung enthalten. Konservierungsstoffe und Puffer können ebenfalls verwendet werden. Um eine Irritation an der Stelle der Injektion zu minimieren oder zu eliminieren, können derartige Zusammensetzungen ein nichtionisches Tensid enthalten, dass eine hydrophil/lipophil Balance (HLB) von ungefähr 12 bis ungefähr 17 besitzt. Die Quantität des Tensids in derartigen Formulierungen reicht von ungefähr 5 bis ungefähr 15 Gew.-%. Das Tensid kann eine einzelne Komponente mit dem vorstehenden HLB sein oder kann eine Mischung von zwei oder mehr Komponenten mit dem gewünschten HLB sein. Veranschaulichende Tenside, die in parenteralen Formulierungen verwendet werden, sind die Klasse der Polyethylen-Sorbitan-Fettsäure-Ester, zum Beispiel Sorbitan-Monooleat und die hochmolekulargewichtigen Addukte von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Base, geformt durch die Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglykol.
Die Alkaloide der Erfindung können ebenfalls topisch verabreicht werden, und wenn dies geschah, kann der Träger geeigneter Weise eine Lösung, eine Salbe oder eine Gelbase umfassen. Die Base kann zum Beispiel eines oder mehrere der folgenden umfassen: Vaseline, Lanolin, Polyethylenglykole, Bienenwachs, Mineralöl, Verdünnungsmittel, wie Wasser und Alkohol und Emulgatoren und Stabilisatoren. Topische Formulierungen können eine Konzentration des Alkaloids von ungefähr 0,1 bis ungefähr 10 Gew.-%/Vol.-% (Gewicht pro Einheit Volumen) enthalten.
Wenn sie verbunden verwendet werden, können die Alkaloide der Erfindung zur Verwendung mit einem anderen Arzneimittel oder mehreren anderen Arzneimitteln formuliert werden. Speziell können die Alkaloide der Erfindung in Kombination mit Anti-Tumoragentien, Anti-mikrobiellen Agentien, Anti-Rheumatika, Anti-proliferativen Agentien und/oder anderen immunstimulierenden Agentien verwendet werden. Die Alkaloide der Erfindung können zum Beispiel mit anti-viralen und/oder anti-proliferativen Agentien, wie Zytokinen, einschließlich Interleukin 2 und Interleukin 12, Interferonen und Induktoren davon, Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und/oder transformierenden Wachstumsfaktor (TGF) sowie myelosuppressive Agentien und/oder chemotherapeutische Agentien (sowie Doxorubizin, 5-Fluorourazil, Zyklophosphamid und Methotrexat), Isoniazid (z. B. bei der Prävention oder Behandlung von peripheraler Neurophatie) und mit Analgetika (z. B. NSAIDs) für die Prävention und Behandlung von gastroduodenalen Geschwüren, verwendet werden.
Eine verbundene Verwendung kann sich daher in einer speziellen Einheitsdosis widerspiegeln, die entwickelt wurde, um mit einem anderen Medikament (anderen Medikamenten), oder in Formulierungen, in denen das Alkaloid mit einem oder mehreren Anti-Tumoragentien gemischt ist, anti-mikrobiellen Agentien und/oder Anti-Rheumatika (oder anders physikalisch mit dem anderen Medikament (den anderen Medikamenten)) in einer einzelnen Einheitsdosis verbunden), verträglich zu sein (oder zusammen zu wirken). Verbundene Verwendungen können sich ebenfalls in der Zusammensetzung der pharmazeutischen Baukastens der Erfindung widerspiegeln, in denen das Alkaloid der Erfindung mit den Anti-Tumoragentien, anti-mikrobiellen Agentien und/oder Anti-Rheumatika zusammen gepackt ist (z. B. als Teil von Array-Einheitsdosen). Eine verbundene Verwendung kann sich ebenfalls in der Information und/oder Instruktionen bezogen auf die gemeinsame Verabreichung des Alkaloids mit Anti-Tumoragentien, anti-mikrobiellen Agentien und/oder Anti-Rheumatika widerspiegeln.
Posologie
Die Menge das Alkaloids, die verabreicht wird, kann, je nach der speziellen Einheitsdosis, die verabreicht wird, Dauer der Behandlung, dem Alter, Gewicht, Art der verbundenen Behandlung (falls vorhanden), und Geschlecht des behandelten Patienten, der Natur und dem Ausmaß der behandelten Erkrankung, und der Natur des Antigents, Alkaloids und jeglichen zusätzlichen Adjuvans (jeglicher zusätzlicher Adjuvantien), die verabreicht werden, weitreichend variieren.
Wie vorstehend erklärt wurde, kann die Menge an Alkaloid, das in den Impfungen der Erfindung eingesetzt wird (im Speziellen die relative Menge, die verwendet wird, wenn es einem zusätzlichen Adjuvans (zusätzlichen Adjuvantien) vorhanden ist, kann gemäß der gewünschten Balance der Th1:Th2-Antwort ausgewählt werden: die Th1:Th2-Balance kann gemäß der Natur des endgültigen Impfungsziels durch Titration der Th1-Antwort, die durch das Alkaloid der Erfindung beigesteuert wird, gegen die Th1- und/oder Th2-Antwort, die durch das zusätzliche Adjuvans (die zusätzlichen Adjuvantien) beigesteuert wird (werden), vernünftig vorselektiert werden. Auf diese Weise können ausgeglichene Adjuvantien mit einem vorselektierten Th1:Th2-Verhältnis die irgendwo in ein weites Spektrum von {Typ 1 <–> Typ 2} Aktivitäten fallen, hergestellt werden.
Die Alkaloide der Erfindung können zudem in Verbindung mit anderen Agentien, die bei der Behandlung von Krankheiten, Erkrankungen oder Infektionen, wo eine Immunstimulierung angezeigt ist (wie vorstehend beschrieben) angesehen werden, verwendet werden und in derartigen Ausführungsformen kann die Dosis dem entsprechend angepasst werden.
Die Alkaloide der vorliegenden Erfindung können durch orale oder parenterale Wege verabreicht werden, einschließlich intravenös, intramuskulär, intraperentoneal, subkutan, transdermal, über die Schleimhaut, über die Luft (aerosol), rektal, vaginal und über eine topische (einschließlich bukkal und sublingual) Verabreichung verabreicht werden. Bevorzugte Wege der Verabreichung der Impfungen der Erfindung sind subkutane oder transdermale Wege.
Die Impfungen werden bevorzugt in Einheitsdosen zubereitet und verabreicht. Flüssige Einheitsdosen sind Fläschchen oder Ampullen für die Injektion oder eine andere parenterale Verabreichung. Feste Einheitsdosen sind Tabletten, Kapseln und Zäpfchen. Für die Behandlung eines Patienten können, abhängig von der Aktivität der Verbindung, Art der Verabreichung, Zweck der Immunisierung (d. h. prophylaktische oder therapeutische), Natur- und Schwere der Erkrankung, Alter und Körpergewicht des Patienten, unterschiedliche Dosen notwendig sein. Die Verabreichung einer vorgegebenen Dosis kann sowohl durch eine einzelne Verabreichung in Form einer individuellen Einheitsdosis oder anders durch verschiedene kleinere Einheitsdosen ausgeführt werden. Eine Mehrzahl der Verabreichung von Dosen getrennt bei spezifischen Intervallen von Wochen oder Monaten dient gewöhnlich der Verstärkung der Antigen-spezifischen Antworten.
Die Alkaloide der Erfindung können gleichzeitig, getrennt oder sequentiell mit der Verabreichung der anderen Impfungskomponenten (einschließlich jeglicher zusätzlicher Adjuvantien, wie Alaun) verabreicht werden.
Daher können in einigen Ausführungsformen die Alkaloide der Erfindung in Mischung mit einer anderen Impfungskomponente (anderen Impfungskomponenten) oder anderweitig zusammen gepackten (z. B. als Teil von Array-Einheitsdosen) mit den anderen Impfungskomponenten, mit dem es als Adjuvans verwendet werden soll, vorhanden sein. In nochmals anderen Ausführungsformen spiegelt sich die Verwendung der Alkaloide der Erfindung als Adjuvans einfach in dem Gehalt der Information und/oder den Instruktionen wieder, die mit den Impfungskomponenten zusammengepackt sind und sich auf den Impfungsablauf, die Impfungsformulierung und/oder Posologie beziehen.
Wo ein zusätzliches Adjuvans verwendet wird, kann das Alkaloid der Erfindung zusammen verabreicht werden (wie hier definiert), d. h. simultan oder sequentiell. Wenn die Adjuvantien simultan verabreicht werden, können sie in der gleichen Formulierung oder in getrennten Formulierungen verabreicht werden, und, im letzteren Fall, an derselben oder an getrennten Stellen, sie sollen aber zur gleichen Zeit verabreicht werden. Die Adjuvans können sequentiell verabreicht werden, wenn die Verabreichung von den mindestens zwei Adjuvans temporär getrennt ist. Die zeitliche Trennung zwischen der Verabreichung der zwei Adjuvans kann eine Sache von Minuten sein oder es kann länger sein. Die zeitliche Trennung ist weniger als 14 Tage und bevorzugter weniger als 7 Tage und am Bevorzugtesten weniger als 1 Tag. Die zeitliche Trennung kann ebenfalls mit einen Adjuvans zuerst und einem bei der Verstärkung, oder einem zuerst und der Kombination bei der Verstärkung, oder der Kombination von einem zuerst und einem bei der Verstärkung erfolgen.
Erläuterung
Die Erfindung wird nun in Bezug zu speziellen Beispielen beschrieben werden. Diese sind bloß beispielhaft und nur für veranschaulichende Zwecke gedacht: sie sind nicht dafür gedacht, in irgendeiner Weise den Umfang des beanspruchten Monopols oder der beschriebenen Erfindung zu beschränken.
Diese Beispiele stellen die beste Weise, die gegenwärtig für das Ausführen der Erfindung in Betracht gezogen wird, dar.
Beispiel 1: Effekt von 3,7-diepi-Casuarin (14) auf Alaun-induzierte Th1/Th2-Antworten
Adjuvans-Zubereitung
Alhydrogel (Alaun; erworben von Superfos BioSector a/s Vedbaek, Dänemark) wurde mit einer vorbestimmten Menge an hochgereinigtem Ovalbumin (OVA; Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ) mit oder ohne 3,7-diepi-Casuarin gemischt.
Mäuse und Animpfungen
Alle Mäuse (BALG/c) wurden subkutan an in den Fußballen mit 100 μg OVA in 50 μl Phosphat-gepufferter Saline (PBS), die mit Alaun gemischt war und entweder und PBS (Kontrolle) oder 3,7-diepi-Casuran (50 mg in PBS) immunisiert. Das Verstärken der Animpfungen wurde in der gleichen Art zwei Wochen später in den kontralateralen Fußballen durchgeführt.
Bestimmung von Plasma-Antikörper-Titern
Blutproben (Schwanzblut) wurden 3 Wochen nach der primären Animpfung entnommen.
Enzym-Verbundene Immunosorbent Assays (ELISA) wurden wie in Brewer et al. (1999) Jmmunol 163: 6448–54 beschrieben durchgeführt, um OVA-spezifische lgG1 und lgG2a im Plasma zu detektieren. Ergebnisse wurde als Endpunktverdünnungen ausgedrückt, wobei der Endpunkt als die endgültige Plasmaverdünnung bestimmt wird, die eine höhere Absorbanz als eine Negativ-Kontroll-Plasmaprobe erzielt, die in dem Assay eingeschlossen ist.
Isolierung von Milzzellen und Kultur von Milzzellen
Die Mäusemilz wurde aseptisch entfernt und in einer sterilen Petri Schale plaziert, die 5 ml an Gesamtmedium (RPMI, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin und 10% fötales Kalbsserum) enthält. Zellsuspensionen wurden durch Verwenden des Endes einer Syringe und Vermahlen der Milz durch ein Drahtsieb hergestellt. Die Zellsuspension wurde dann bei 1000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Um die Erythozyten zu entfernen, wurde das Zellpellet in Boyle's solution (Tris 0,17 M & Ammonium Chloride 0,16 M) resuspendiert und wieder für 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde dann in einem Medium weitere zwei Male gewaschen und dann in 3 ml Medium wiederaufgenommen. Eine Zellzählung wurde dann ausgeführt. Stimulationsessays wurden dann in dreifacher Ausfertigung in U-bodenen 96-Well-Platten (Corning Costar, NY) mit OVA (bei 5 μg/ml, 100 μg/ml und 500 μg/ml) durchgeführt.
Zytokin Assays
Murines Interferon-γ (IFN-γ) wurde unter Verwendung von verbundenen Antikörpern durch ELISA analysiert gemäß den Instruktionen der Herstellers analysiert.
Ergebnisse
Wie in Brewer et al (1999) J Immunol 163: 6448–54 beschrieben, produzierte die Animpfung von BALG/c-Mäusen mit hochgereinigten Ovalbumin, das in Alaun zubereitet wurde, hohe Titer von Antigen-spezifischen lgG1 (1a) und vernachlässigbaren Mengen an lgG2a (1b), einem Phenotyp, typisch für eine polarisierte Th2-Antwort. Die Anwesenheit von 3,7-diepi-Casuarin in Mischung mit dem Alaun/OVA (MNLP24) führte zu einer angekündigten Drehung in Richtung einer Th1-Antwort mit einem signifikanten Anstieg an lgG2a.
Wenn Milzzellen mit Antigen in vitro restimuliert wurden, wurde ein signifikant größere Menge an IFN-γ in Zellen hergestellt, die von Mäusen stammen, die mit Alaun/OVA in Mischung mit 3,7-diepi-Casuarin (MNLP 24) angeimpft wurden, hergestellt, verglichen mit denjenigen, die mit Alaun-OVA alleine (Kontrolle) (2) angeimpft wurden.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Th2-Profil von Alaun (das eine große Hürde bezogen auf seine umfassende Verwendung in modernen Impfungen war) mit einer Th1-Komponente durch gemeinsame Verabreichung des Th1-aktivierenden Alkaloids 3,7-dieepi-Casuarin verstärkt werden kann. Dies eröffnet die Möglichkeit die Th1:Th1-Balance der Alaun-induzierten Immunantwort durch eine vernünftige Anwendung von Th1-aktivierenden Alkaoloiden (so wie 3,7-dieepi-Casuarin) maßzuschneidern.
Vergleichsbeispiel 2: Effekt von exogenem rIL-12 auf Alaun-induzierte Th1/Th2-Antworten
Das Experiment, wie es in Beispiel 1 (vorstehend) beschrieben wurde, wurde wiederholt, aber mit dem Ersatz von 3,7-dieepi-Casuarin mit 1 μg von rIL-12 (R&D Systems, Oxford, UK). Ausführliche Antwort Assays von IFN-γ wurden auf Lymphknoten-Kulturen eher als Milzzellen (wie beschrieben in Pollock et al. (2003) Immunology 108: 137–143) durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten, dass rIL-12 einen zu 3,7-dieepi-Casuarin vergleichbaren Effekt auf die Alaun-induzierte Th1/Th2-Antwort hat, und eine ähnliche Th1-verstärkte Th2-Antwort erzeugt (siehe 1 und 2, Pollock et al. (2003) Immunology 108: 137–143).
Beispiel 3: Adjuvans-Aktivität von 3,7-dieepi-Casuarin (MNLP 24) mit einer optimalen Dosis an Influenza-Impfung
Experimentelles Design
Drei Gruppen von 6 weiblichen Balb/c Mäusen wurden intramuskulär (i. m.) mit einer Mischung der Influenza-Impfung zusammen mit 3,7-dieepi-Casuarin an den Tagen 0 und 14 geimpft. Jede Gruppe erhielt eine unterschiedliche Dosis von 3,7-dieepi-Casuarin. Gruppe B erhielt niedrige Dosis, Gruppe C eine mittlere Dosis und Gruppe D eine hohe Dosis (20, 50, bzw. 100 μg). Eine vierte Kontrollgruppe (Gruppe A) erhielt nur die Influenza-Impfung. Immunmodulatorische Aktivität wurde durch die Bestimmung von Influenza-spezifischen Antikörper-Antworten, die im Serum am Tag 28 erhalten wurden, bewertet.
Materialien und Methoden
Mäuse: 34 weibliche, SPF-Züchtung, BALG/c Mäuse wurden von einer Kolonie erhalten, die unter SPF-Bedingungen bei Charles River Deutschland, Sulzfeld, Germany, gehalten wird. 24 Tiere wurden zu den verschiedenen Gruppen durch Computerrandomisierung verteilt. Die Mäuse wurden während der ganzen Studienzeit in Typ 2 Makrolon-Käfigen im gleichen Raum bei einer Temperatur von 20,7 bis 24, 6°C und 30 bis 70% Feuchtigkeit gehalten. Der Tierraum mit mindestens 10 Luftaustauschungen pro Stunde gelüftet. Die Beleuchtung war künstlich durch fluoreszierende Röhren, zeitschalterkontrolliert bei einer Sequenz von 12 Stunden Licht, 12 Stunden Dunkelheit (Licht „an" von 7:00 früh bis 07:00 Uhr abends). Futter und Wasser wurden ad libidum bereitgestellt.
Wasser für die Injektion wurde durch NPBI (die Niederlande) bereitgestellt, Batch Nummer 03G0472, Ablaufdatum Juni 2006, CBS-Nummer 42650, gelagert bei Raumtemperatur.
Die Influenzaimpfung (Solvay Pharmaceuticals B. V., Weesp, die Niederlande) ist eine einwertige Untergruppenimpfung, die Haemaglutinin (HA) des A/Panama-Stamms enthält. Die Konzentration der Lösung betrug 430 μg HA/ml, Batch Nummer HPR34, gelagert bei 2–10°C.
Eine Stammlösung von 3,7-dieepi-Casuarin (5,8 mg) wurde in 2,0 ml Wasser für die Injektion gelöst (Konzentration 100 μg/35 μl) und 250 μl-Anteile wurden hergestellt und gelagert.
Kontrollgruppe A erhielt nur Influenzaimpfung (105 μl Influenza-Impfungs-Stammlösung, gemischt mit 245 μl Wasser für die Injektion). Gruppe B erhielt 49 μl von der 3,7-dieepi-Casuarin Stammlösung gemischt mit 105 μl Influenza-Impfungs-Stammlösung und 196 μl Wasser für die Injektion. Gruppe C erhielt 122,5 μl von der 3,7-dieepi-Casuarin-Stammlösung gemischt mit 105 μl Influenzaimpfungsstammlösung und 122,5 μl Wasser für die Injektion. Gruppe D erhielt 245 μl von der 3,7-dieepi-Casuarin-Stammlösung gemischt mit 105 μl Influenza-Impfungs-Stammlösung.
Alle Lösungen wurden genau vor der Verwendung frisch zubereitet.
Kontrollgruppe A erhielt zwei i. m.-Injektionen in den Oberschenkel des linken und rechten Hinterbeins (25 μl pro Ballen) mit Impfung und 3,7-dieepi-Casuarin.
Bestimmung von Influenzaimpfungsspezifischen lgG, lgG1 und lgG2a
lgG, lgG1 (Th2-vermittelt) und lgG2a (Th1-vermittelt)-Antikörper gegen Impfungsantigen wurden in Serumproben bestimmt, die bei den Tagen 0 und 28 unter Verwendung von Sandwich ELISA erhalten wurden. Flache Bodenplatten (NUNC Immuno Plate, Roskilde, Dänemark) wurden mit 100 μl (5 μg Protein/ml) gecoated, in Carbonatpuffer (pH 9,6) aufgelöst. Nach dreimaligem Waschen (0,5% Tween 20 Lösung), wurden die Platten durch Zugabe von 100 μl/well PBS, enthaltend 1% bovines Serum-Albumin und 0.02% Tween 20 (PBS/Tween 0,02%/BSA 1%) gestoppt. Nach 1 h Stunde Inkubation bei 37°C wurden die Platten gewaschen und serielle Verdünnungen von Testserum (PBS/Tween 0,02%/BSA 1%) wurden in zweifacher Ausfertigung inkubiert (1 h, 37°C). Startverdünnungen waren 1:400. Nach einem zweiten Waschschritt, wurde HRP-konjugierter Antikörper hinzugeben (30 min, 37°C); Ratten-Anti-Maus lgG, lgG1 oder lgG2a (Zymed) aufgelöst in PBS/BSA/Tween (1:1000). Nach dem Waschschritt von TMB-Substratlösung (3,3',5,5'-tetramethyl-Benzidin) zugegeben (20 min, RT), die Reaktion wurde daraufhin mit 2 N H₂SO₄ gestoppt. Die optische Dichte (OD) wurde bei 450 nm unter Verwendung eines Biorad-Microplate-Readers 3550 (Bio Rad Laborstories, Richmond, CA) gemessen. Die Konzentrationen von Influenza-spezifischem lgG, lgG1 und lgG2a in Serum wurden, basierend auf einer Standardkurve, die mit einer Referenz (konzentrierten) Serum-Probe, die eine willkürliche Anzahl an Einheiten spezifischer Antikörper per Milliliter (AU/ml) enthält, erhalten wurde, berechnet. Das Referenzserum wurde durch Mischen gleicher Volumina jeder individuellen Serumprobe hergestellt, die am Tag 28 von Gruppe A erhalten wurde und die auf jede individuelle ELISA-Platte (Anfangsverdünnung 1:50, seriell 11 mal verdünnt) integriert wurde.
Die statistische Evaluierung der Daten wurde durch die Analyse der (Co)-Varianz durchgeführt, gefolgt von Dunnet's multiplen Vergleichstests. Im Fall der Inhomogenität der Varianz wurden die Daten log-transformiert (im Fall von statistischer Analyse auf spezifische lfG1-Daten). Wahrscheinlichkeitswerte von p < 0,05 wurden als signifikant angesehen.
Ergebnisse
Eine gute Influenza-Impfungs-spezifische-lgG total und lgG1 Antikörper-Antwort wurde in allen Gruppen beobachtet. Die beobachtete lgG2a-Antikörper-Antwort war in allen Testgruppen viel weniger ausgeprägt. Zwei Werte von einem der Kontrolltiere wurden bei dem 99%-Vertrauensintervall aus Ausreißer identifiziert und demnach ausgeschlossen.
Statistisch signifikante Unterschiede wurden zwischen der Kontrollgruppe A und allen Behandlungsgruppen B–C beobachtet (siehe 3) in der die Influenza-Impfungsspezifische lgGtot, lgG1, und lgG2a Serum-Antikörper-Antworten in mit Influenza alleine oder in Kombination mit 20, 50 oder 100 μg 3,7-diepi-Casuarin geimpften Tieren (bezeichnet „MNL" auf der X-Achse) gemessen durch ELISA – die Balken stellen Gruppenmittelwerte ± SD. * P < 0,05, ** P < 0,01 gegen die Kontrollgruppe, die mit Influenzaimpfung alleine beimpft wurde). Keine Dosisantwort wurde beobachtet. Eine statistisch signifikante vermehrte spezifische lgG1-Antwort wurde in den Gruppen beobachtet, die mit 20 (P < 0,01), 50 (P < 0,05) und, bzw. 100 μg 3,7-diepi-Casuarin (P < 0,01), behandelt wurden.
Im Vergleich zu der Kontrollgruppe A wurde eine statistisch signifikant erhöhte lgGtotal Antwort in den Gruppen, die mit 20 (P < 0,05) oder, bzw., 100 μg 3,7-diepi-Casuarin (P < 0,01) behandelt wurden, beobachtet. Keine Unterschiede wurden hinsichtlich lgG2a-spezifischen Antworten beobachtet.
Die Ergebnisse zeigten, dass 3,7-diepi-Casuarin Adjuvans-Aktivität sogar in Impfungsformulierungen zeigt, die eine optimale Dosis an Influenza-Antigen enthalten: eine klare spezifische lgGtotal und lgG1-Antwort (Th2-vermittelt) wurde beobachtet. Der statistisch signifikante Anstieg an spezifischem lgGtotal und lgG1, der in den Behandlungsgruppen B–D beobachtet wurde, zeigt klar die Adjuvans-Aktivität von 3,7-diepi-Casuarin. Kein Verdrehen der Th1/Th2-Antwort von Th2 in Richtung von Th1 wurde bei den hohen Influenza-Antigen-Dosen, die studiert wurden, beobachtet: von derartig optimalen Dosen würde erwartet, die Immunomodulation auf dem Level von Th1:Th2-Antwort-Verhältnis zu verdecken.
Beispiel 4: Synthese von 3,7-diepi-Casuarin (10)
Allgemein Experimentelles
Alle Reaktionen wurden unter einer Atmosphäre von Argon bei Raumtemperatur durchgeführt, unter Verwendung wasserfreier Lösungsmittel solange nichts anderes angegeben wird. Wasserfreie Lösungsmittel wurden von Fluka Chemicals bezogen und wurden wie geliefert, verwendet. Schichtchromatografie (Tlc) wurde auf Aluminium-Platten, die mit Merck 60 F₂₅₄ Silicagel vorgecoated waren, durchgeführt und wurden unter ultraviolettem Licht und durch Färben unter Verwendung von 6%-iger Phosphomolybdänsäure in Ethanol visualisiert. Silicagel-Chromatografie wurde unter Verwendung von Sorbsil C60 40/60 Silicagel unter einer positiven Atmosphäre durchgeführt. Amberlite IR-120, stark saures Ionenaustauscherharz wurde durch Tränken des Harzes in 2 M hydrochloriger Säure für mindestens zwei Stunden, gefolgt durch Auswaschen mit destilliertem Wasser bis das Eluans pH5 erreichte, hergestellt. Dowex 50WX8-100 wurde durch Tränken des Harzes mit 2 M hydrochloriger Säure für mindestens zwei Stunden hergestellt, gefolgt von Auswaschen mit destiliertem Wasser bis es neutral war. Infrarotspektren wurden auf einem Perkin-Elmer 1750 IR Fourier-TransformSpectrophotometer unter Verwendung von dünnen Filmen auf Natriumchloridplatten aufgezeichnet. Nur charakteristische Peaks wurden aufgezeichnet. Optische Rotationen wurden auf einem Perkin-Elmer 241 Polarimeter mit einer Pfadlänge von 1 dm gemessen. Konzentration wurden in g/100 ml angegeben. Nukleare magnetische Resonanzspektren wurden auf einem Bruker DQX 400 Spectrometer in dem festgelegten deuterierten Lösungsmittel aufgezeichnet. Alle Spektren wurden bei Raumtemperatur aufgezeichnet. Chemische Drehungen (δ) werden in ppm angegeben und sind relativ zu den verbleibenden Lösungsmitteln als Standard. Protonenspektren (δ_H) wurden bei 400 MHz aufgezeichnet und Carbonspektren (δ_C) bei 100 MHz aufgezeichnet.
2,3:5,6:7,8-Tri-O-Isopropyliden-D-erythro-L-talo-octono-1,4-Lacton (Qc)
5,6:7,8-Di-O-isopropyliden-D-erythro-L-galacto-octono-1,4-Lacton (Qb)
Natriumzyanid (7,02 g, 142 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung von D-glycero-D-gulo-Heptose (Qa, 21 g, 100 mmol) in Wasser (300 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 48 Stunden gerührt, bei Rückfluss für 48 Stunden erhitzt und durch eine Säule enthaltend Amberlite IR-120 (ein stark saures Ionenaustauschharz, 300 ml) geleitet. Das Eluens wurde unter reduziertem Druck konzentriert und der Rückstand im Vakuum für 24 Stunden getrocknet. Der resultierende Schaum wurde mit Aceton (500 ml) und Schwefelsäure (5,4 ml) in der Anwesenheit von wasserfreiem Kupfersulfat (10 g, 62 mmol) bei Raumtemperatur für 48 Stunden behandelt. T. l. c.-Analyse wies auf das Vorhandensein von zwei Hauptprodukten (Ethyl Acetat:Zyklohexan, 1:1; R_f 0,72, 0,18) hin. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat wurde mit Natriumbikarbonat (50 g) für 24 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Feste Reste wurden durch Filtration entfernt und Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Der resultierende rohe gelbe Sirup wurde durch Silicagel-Chromatografie gereinigt, bereitstellend:
2,3:5,6:7,8-tri-O-Isopropylidene-D-erythro-L-talo-octono-1,4-Lakton Qc als farbloser Sirup (R_f, 0,72; 7,672 g; 21%) und
5,6:7,8-di-O-Isopropyliden-D-erythro-L-galacto-octono-1,4-Lakton Qb als ein klares Öl (R_f 0,18; 8,105 g; 25%)
2,3:5,6:7,8-tri-O-Isopropyliden-D-erythro-L-talo-octono-1,4-Lakton Qc: δ_H (CDCl₃) 1,29, 1,33, 1,35, 1,38, 1,42, 1,48 (6 × s, 18H, 3 × (CH₃)₂), 3,93-3,99 (m, 2H, H-8_a, H-7), 4,03-4,07 (m, 2H, H-5, H-6), 4,15 (dd, 1H, J_8a,8b 8,7 J_8b7 6,1, H-8b), 4,75 4,78 (m, 3H, H-2, H-3, H-4) δ_c (CDCl₃) 25,23, 25,51, 26,00, 26,71, 26,73, 27,16 (3 × C(CH₃)₂), 67,93, 74,93, 76,33, 76,69, 78,65, 79,40, 80,06, 109,95, 110,72, 113, 19, 174,27;
ν_max(film) 1793. 5,6:7,8-di-O-isoprpyliden-D-erythro-L-galacto-octono-1,4-Laktone Qb: δ_H(d₆-Azeton) 1,28, 1,32, 1,34, 1,35 (4 s, 12H, 2 × C(CH₃)₂), 3,92 (1H, m, H-8_a), 3,98 (m, 1H, H-7) 4,14 (m, 2H, H-5, H-8_b), 4,23-4,25 (m, 2H, H-4, H-6), 4,35-4,40 (m, 2H, H-2, H-3); δ_c (d₆-Aceton) 25,31. 25,87, 26,72, 27,31, 68,06, 75,15, 75,23, 77,51, 78,05, 78,41, 79,01, 110,06, 110, 31, 174,25; v_max (film) 1793, 3541.
2,3:5,6-Di-O-Isopropyliden-D-eryhtro-L-talo-octono-1,4-Lakton Qd
Eine Lösung von 2,3:5,6;6:7,8-tri-O-Isopropyliden-D-erythro-L-talo-octono-1,4-Lakton (Qc; 3,8 g, 10,6 mmol) wurde mit Essigsäure:Wasser (2:3, 100 ml) bei 50°C für 2 h behandelt. T. l. c.-Analyse (Ethylacetat:Zyklohexan, 1:1) zeigte das Verschwinden des Ausgangsmaterials (R_f 0,72) und das Vorhandensein einer polareren Verbindung (R_f, 0,15) an. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde Silicagel-Chromatografie (Ethylacetate:Zyklohexan, 1:1 bis 3:1) gereinigt, ergebend 2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-D-erythro-L-talo-octono-1,4-Lakton Qd als ein klares Öl (3,23 g, 94%): δ_H (CD₃OD) 1,28, 1,38, 1,43 (3 × s, 12H, 2 × C(CH₃)₂), 3,59 (dd, 1H, J_8a,7 5,40 J_8a,8b 11,41, H-8_a), 3,66-3,69 (m, 1H, H-7), 3,74 (dd 1H, J_8b,7 2,90 Hz, H-8_b) 4,01 (app t, 1H J_6,7 7,62 Hz, H-6) 4,24 (dd, 1H, J_5,6 8,17 Hz J_5,4 0,89 Hz, H-5) 4,79-4,81 (m, 2H, H-3, H-4), 4,89-4,91 (m, 1H, H-2); δ_c (CD₃OD) 24,62, 25,42, 26,05, 26,49, 63,86, 73,81, 75,40, 75,91, 79,18, 79,90, 80,78, 110,53, 113,09, 175,76; v_max (film) 1791, 3478; [α]_D –35,7 (c 1, CHCl₃).
8-O-tert-Butyl-Dimethyl-Silyl-2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-D-erythro-L-talo-octono-1,4-Lakton- Qe
Zu einer Lösung von 2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-D-erythro-L-talo-octono-1,4-Lakton (Qd, 3,18 g, 10 mmol) in N,N-Dimethylformamid (40 ml) wurde tert-Butyl-Dimethyl-Siliylchlorid (1,808 g, 12 mmol) und Imidazol (1,361 g, 20 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt, nach denen die t. l. c -Analyse (Ethlyacetat:Zyklohexan, 1:1) kein Ausgangsmaterial (R_f 0,15) und die Bildung eines Hauptprodukts (R_f 0,63) zeigte. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde zwischen Ethylacetat und Lauge aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und das Lösungsmittel entfernt. Das resultierende blasse Öl wurde durch Silicagel-Chromatografie (Ethyl Acetat:Zyklohexan, 0:1 bis 1:2) gereinigt, um 8-O-tert-Butyldimethylsilyl-2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-D-erythro-L-talo-octono-1,4-Lakton Qe als klares Öl (3,612 g, 85%): δ_H (CDCl₃) 0,04 (br s, 6H, 2 × CH₃), 0,86 (s, 9H, C(CH₃)₃) 1,23, 1,30, 1,32, 1,41 (4 × s, 12H, 2 × C(CH₃)₂), 3,63-3,67 (m, 2H, H-8_a, H-7), 3,76 (br d 1H, H-8_b) 3,96 (app t, J_6,7 8,21 J_6,5 7,98, H-6) 4,08 (br d, 1H, H-5) 4,72 (br s, 2H, H-2, H-3), 4,78 (br s, 1H, H-4); δ_c (CDCl₃) –5,52, –5,45, 18,25, 25,51, 25,80, 25,93, 26,68, 27,18, 63,95, 72,97, 74,88, 74,93, 78,71, 79,63, 79,87, 110,34, 113,00, 174,42; v_max (film) 1794, 3570; [α]_D –20,1 (c 1, CHCl₃) zu ergeben.
7-Azido-8-O-tert-Butyldimethylsilyl-7-deoxy-2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-L-threo-L-talo-octono-1,4-Lakton Qf
Eine Lösung von 8-O-tert-Butyldimethylsilyl-2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-D-erythro-L-talo-octono-1,4-Lakton (Qe, 3,5 g, 8,2 mmol) in einer Pyridin:Dichloro-Methan-Mischung (1:4, 25 ml) wurde auf –30°C gekühlt. Trifluoro-Methan-Sulfo-Anhydrid (3,5 g, 2,09 ml, 12,4 mmol) wurde portionsweise zugegeben und die Mischung wurde für 2 h gerührt. T. l. c.-Analyse (Ethyl Acetat:Zyklohexan, 1:3) zeigte das Verschwinden des Ausgangsmaterials (R_f 0,38) und die Anwesenheit eines weniger polaren Produkts (R_f 0,48) an. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und der Rest wurde zwischen Ethyl Acetat und 0,5 M Salzsäure aufgeteilt. Die organische Schicht wurde mit Lauge gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Der resultierende rohe blasse orangene Rest wurde mit Natriumazid (807 mg, 12,4 mmol) in N,N-Dimethylformamid (25 ml) für 16 Stunden behandelt. T. l. c.-Analyse (Ethyl Acetat:Zyklohexan, 1:4) zeigte das Verschwinden des Zwischenprodukts-Triflat (R_f 0,42) und das Vorhandensein von einer polareren Verbindung (R_f 0,40). Das Reaktions-Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest wurde zwischen Ethyl Acetat und Lauge aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde mit Ethyl Acetat extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und im Vakuum konzentriert. Der resultierende rohe Rest wurde durch Silicagel-Chromatografie (Ethyl Acetat:Zyklohexan, 0:1 bis 1:4) gereinigt, bereitstellend 7-azido-8-O-tert-Butyl-Dimethyl-Silyl-7-deoxy-2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-L-threo-L-talo-octono-1,4-Lakton Qf als ein farbloses Öl (3,026 g, 81%): δ_H (CDCl₃) 0,11 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 0,91 (s, 9H, C(CH₃)₃) 1,30, 1,38, 1,41, 1,47 (4 × s, 12H, 2 × C(CH₃)₂), 3,41-3,45 (m, 1H, H-7), 3,87 (dd 1H, J_8a,7 5,37 Hz J_8a,8b 10,81 Hz, H-8_a) 3,92 (dd, 1H, J_8b,7 7,32 Hz, H-8_a) 4,19-4,24 (m, 2H, H-5, H-6) 4,61 (br s, 1H, H-4), 4,75-4,79 (m, 2H, H-2, H-3); δ_c (CDCl₃) –5,59, –5,56, 18,14, 25,54, 25,73, 26,09, 26,71, 26,98, 61,61, 63,19, 67,94, 74,84, 74,94, 75,47,78,36, 78,66, 119,90, 113,37, 174,02; v_max (film) 1796, 2111 [α]_D +36,7 (c 1, CHCl₃).
7-Azido-8-O-tert-Butyldimethylsilyl-7-deoxy-2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-L-threo-L-talo-octitol Qg
7-Azido-8-O-tert-Butyl-Dimethyl-Silyl-7-deoxy-2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-L-threo-L-talo-octono-1,4-Lakton (Qf, 3,00 g, 6,6 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (40 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Lithiumborohydrid 216 mg, 9,9 mmol) wurde zugegeben und die Mischung wurde bei 0°C auf Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. T. l. c.-Analyse (Ethyl Acetat:Zyklohexan, 1:1) zeigte das Verschwinden des Ausgansmaterials (R_f 0,76) und das Vorhandensein einer polareren Verbindung (R_f 0,45) an. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Ammoniumchlorid (sat. aq.) beendet und zwischen Ethyl Acetat und Lauge aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde mit Ethyl Acetat (2 ×) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und das Lösungsmittel entfernt. Der resultierende rohe Rest wurde durch Silicagel-Chromatografie (Ethyl Acetat:Zyklohexan, 1:3 bis 1:1) gereinigt, liefernd 7-azido-8-O-tert-Butyldimethylsilyl-7-deoxy-2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-L-threo-L-talo-Octitol Qg als ein farbloser Sirup (2,476 g, 82%): δ_H (CDCl₃) 0,10 (s, 6H, 2 × CH₃), 0,91 (s, 9H, C(CH₃)₃) 1,36, 1,41, 1,42, 1,48 (4 × s, 12H, 2 × C(CH₃)₂), 3,43-3,47 (m, 1H, H-7), 3,66 (br d 1H, H-4) 3,79-3,92 (m, 4H, H-1, H-1_a, H-8, H-8_a) 4,10-4,14 (m, 2H, H-2, H-3) 4,30-4,38 (m, 2H, H-5, H-6); δ_c (CDCl₃) –5,61, –5,51, 18,14, 25,18, 25,71, 26,87, 27,07, 27,86, 60,65, 62,39, 63,66, 67,62, 75,90, 76,91, 77,18, 77,49, 108,63, 110,16; v_max (film) 2109, 3536; [α]_D +46,6 (c 1, CHCl₃).
7-Azido-8-O-tert-Butyl-Dimethyl-Silyl-7-deoxy-2,3:5,6-di-O-Methan-Sulphonyl-Isopropyliden-1,4-di-O-L-threo-L-talo-octitol Qh
7-Azido-8-O-tert-Butyl-Dimethyl-Silyl-7-deoxy-2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-L-threo-L-talo-octitol (Qg, 2,4 g, 5,3 mmol) wurde in Pyridin (20 ml) gelöst und zu einer Lösung von 4-Dimethylamino Pyridin (64 mg, 0,53 mmol) und Methan-Sulfonyl-Chlorid (4,814 g, 3,253 ml, 42 mmol) in Pyridin (20 ml) gegeben und für 2 h gerührt. T. l. c.-Analyse (Ethyl Acetat:Zyklohexan, 1:2, doppeltes Auswaschen) offenbarte das Verschwinden des Ausgangsmaterials (R_f 0,33) und die Anwesenheit eines hydrophoberen Produkts (R_f 0,43). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde zwischen Ethyl Acetat und Lauge aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde mit Ethyl Acetat extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Der resultierende rohe Rest wurde durch Silicagel-Chromatografie (Ethyl Acetat:Zyklohexan, 1:2) gereinigt, ergebend 7-Azido-8-O-tert-Butyl-Dimethyl-Silyl-7-deoxy-2,3:5,6-di-O-Isopropyliden-1,4-di-O-Methanesulfonyl-L-threo-L-talo-octitol Qh als ein farbloses Öl (2,973 g, 92%): δ_H (CDCl₃) 0,11, 0,12 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 0,91 (s, 9H, C(CH₃)₃), 1,41, 1,44, 1,46, 1,56 (4 × s, 12H, 2 × C(CH₃)₂), 3,08 (s, 3H, SO₂CH₃) 3,21 (s, 3H, SO₂CH₃), 3,49 (ddd, 1H, J_7,6 2,82 J_7,8 5,46 Hz, J_7,8a 7,94 Hz, H-7) 3,87-3,97 (m, 2H, H-8, H-8_a), 4,19 (dd, 1H, J_8,5 2,30 Hz, H-6) 4,24-4,31 (m, 2H, H-1, H-5) 4,36 (dd, 1H, J_3,4 2,96 Hz, J_3,2 6,62 Hz, H-3), 4,49-4,53 (m, 1H, H-2), 4,69 (dd, 1H, J_1a,2 2,39 Hz, J_1a,1 10,83 Hz, H-1_a) 5,11 (app t, 1H, H-4); δ_c (CDCl₃) –5,56, 18,18, 25,76, 26,24, 26,78, 26,89, 27,56, 37,75, 39,02, 60,90, 63,57, 70,44, 76,07, 76,46, 77,18, 77,32, 109,01, 110,86; v_max (film) 2113; [α]_D –16,2 (c 1, CHCl₃).
7-Azido-7-deoxy-1,4-di-O-Methansulfonyl-L-threo-L-talo-octitol Qi
7-Azido-8-O- tert-Butyl-Dimethyl-Silyl-7-deoxy-2,3:5,6-di-O-Isopropylideri-1,4-di-O-Methan-Sulfonyl-L-threo-L-talo-octitol (Qh, 2,90 g, 4,7 mmol) wurde mit einer Trifluoressigsäure:Wassermischung (1:1 40 ml) für 3 h behandelt. T. l. c.-Analyse (Ethyl Acetat) zeigte das Verschwinden des Ausgangsmaterials (R_f 0,9) und die Anwesenheit eines polareren Produkts (R_f 0,12). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde mit Toluen zusammen verdampft und unter Vakuum getrocknet. Reinigung durch Silicagel-Chromatografie (Ethyl Acetat:Zyklohexan, 1:1 bis 1:0) ergab 7-azido-7-deoxy-1,4-di-O-Methansulfonyl-L-threo-L-talo-octitol Qi als farbloses Öl (1,677 g, 85%): δ_H(CD₃OD) 3,12 (s, 3H, SO₂CH₃), 3,21 (s, 3H, SO₂CH₃), 3,61-3,71 (m, 2H, H-7, H-8), 3,78-3,82 (m, 2H, H-6, H-8_a) 3,98-4,05 (m, 2H, H-2, H-3), 4,11-4,13 (m, 1H, H-5) 4,34 (dd, 1H, J_1,2 4,87 Hz, J_1,1a 10,44 Hz, H-1) 4,45 (dd, 1H, J_1a,2 1,87 Hz, H-1_a) 5,00 (dd, 1H, J_4,3 1,91 Hz, J_4,5 6,15 Hz, H-4); δ_c(CD₃OD) 36,17, 38,11, 61,84, 66,62, 69,09, 70,33, 70,45, 71,08, 72,55, 86,41; v_max (film) 2113; [α]_D –9,1 (c 1, H₂O).
(1R,2R,3S,6S,7R,7aR)-3-(Hydroxymethyl)-1,2,6,7-Tetrahydroxypyrrolizidine Qj
[3,7-diepi-Casuarin]
7-Azido-7-deoxy-1,4-di-O-Methansulfonyl-L-threo-L-talo-octitol (Qj, 1,6 g, 3,78 mmol) wurde in Wasser (30 ml) gelöst und mit 10%-tigem Palladium auf Kohlenstoff (400 mg) unter einer Wasserstoffatmosphäre für 16 h behandelt. T. l. c.-Analyse (Ethyl Acetat:Methanol, 9:1) zeigte das Verschwinden des Ausgangsmaterials (R_f 0,75) und die Anwesenheit eines polareren Produkts (R_f 0,05) an. Palladium wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde mit Natriumacetat (930 mg, 11,34 mmol) bei 60°C für 16 Stunden behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das rohe braune Öl wurde durch Ionenaustauscher-Chromatografie gereinigt (Dowex 50WX8-100, eluierend mit 2 M Ammoniumhydroxid) gereinigt, um (1R,2R,3S,6S,7R,7aR)-3-(Hydroxymethyl)-1,2,6,7-Tetrahydroxpyrrolizidin [3,7-diepi-Casuarin] Qj als ein braunes Glas (671 mg, 87%): δ_H (D₂O) 2,81-2,92 (m, 2H, H-5, H-5_a), 3,16 (dd, 1H, J_3,2 5,91 Hz, J_3,8 10,74 Hz, H-3), 3,30 (app t, 1H, J 3,78 Hz, H-7_a) 3,76 (dd, 1H, J_8,8a 6,35 Hz, H-8), 3,87 (dd, 1H, H-8_a) 4,01 (d, 1H, J_2,1 3,55 Hz, H-2), 4,04-4,12 (m, 2H, H-6, H-7), 4,29 (app t, 1H, H-1); δ_c(D₂O) 49,32, 57,29, 63,78, 70,41, 72,59, 72,65, 74,47, 78,25; [α]_D –21,1 (c 0,5, H₂O) hervorzubringen.
Äquivalente
Die vorstehende Beschreibung beschreibt derzeit bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Es wird erwartet, dass den Fachleuten bei der Betrachtung dieser Beschreibung in der Praxis zahlreiche Modifikationen und Variationen davon einfallen. Von diesen Modifikationen und Variationen wird angenommen, dass sie von den hier angefügten Ansprüchen umfasst werden.

Claims

Verwendung eines Antigens oder mehrerer Antigene und einer Adjuvanszusammensetzung, umfassend ein Th1-aktivierendes Alkaloid für die Herstellung eines Impfstoffs für den Einsatz zur Immunisierung, um eine Immunantwort vom Typ 2 in Richtung Typ 1 gegen das Antigen/die Antigene zu polarisieren, wobei das Alkaloid die Formel
aufweist, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe, welche Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes, unsubstituiertes oder substituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes Acyl, Alkyl, zum Beispiel Zykloalkyl-, Alkenyl-, Alkynyl- und Arylgruppen, oder ein pharmazeutische akzeptables Salz oder Acylderivat davon umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Th1-aktivierende Alkaloid die Expression von IL-12 in vitro in Lymphozyten und/oder dentritischen Zellen stimuliert.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Adjuvanszusammensetzung des Weiteren ein zusätzliches Adjuvans umfasst, zum Beispiel ein zusätzliches Adjuvans, ausgewählt aus: (a) einem Typ-2-Adjuvans, zum Beispiel Alaun und/oder MF59, und/oder (b) einem Zytokin, (c) einem Depot-bildenden Agens, (d) einem Saponin, (e) einer submikronen Öl-in-Wasser Emulsion, (f) einem CpG, (g) einem Lipid-A-Derivat, (h) einem MDP, (i) einem ISCOM^®; (j) einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC), zum Beispiel einer dentritischen Zelle, (k) einem zytokinischen T-Lymphozyten (CTL) und (l) einer synergistischen Kombination der oben Erwähnten.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Immunisierung die Verabreichung eines Impfstoffs umfasst, ausgewählt aus: (a) einem Subunit-Impfstoff, (b) einem Konjugat-Impfstoff, (c) einem DNA-Impfstoff, (d) einem rekombinanten Impfstoff, (e) einem mukosalen Impfstoff, (f) einem therapeutischen Impfstoff, (g) einem prophylaktischen Impfstoff.
Verwendung nacheinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das eine oder die mehreren Antigen(e) ausgewählt ist/sind aus: (a) Nukleinsäure(n), welche für ein oder mehrere antigene(s) Protein(e) kodieren, (b) Protein(e) oder Peptid(e), (c) Glykoprotein(e), (d) Polysaccharid (3) zum Beispiel Kohlenhydrat(e), (e) Fusionsprotein(e), (f) Lipid(e), (g) Glykolipid(e), (h) Peptidmimetikum-(-mimetika) von Polysacchariden; (i) Kohlenhydrat(e) und Protein(e) als Zusatz, (j) Kohlenhydrat-Protein-Konjugat(e), (k) Zellen oder Extrakte davon, (l) tote oder abgeschwächte Zellen oder Extrakte davon, (m) Tumorzellen oder Extrakte davon, (n) virale Partikel, zum Beispiel abgeschwächte virale Partikel oder virale Bestandteile, (o) Allergen(e), (p) Mischungen aus (a) bis (o).
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das eine oder die mehreren Antigen(e) ein bakterielles Antigen, ein virales Antigen, ein Pilzantigen, ein Protozoenantigen, ein Prioantigen, ein Neoantigen, ein Tumor-assoziiertes Antigen oder ein Selbst-Antigen umfasst/umfassen.
Verwendung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei das eine oder die mehreren Antigen(e) dosissparend ist/sind.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Impfung oral, mukosal, topisch, epikutan, intramuskulär, intradermal, subkutan, intranasal, intravaginal, sublingual oder mittels Inhalation durchgeführt wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Th-1 aktivierende Alkaloid ist aus: (a) 3,7-diepi-Casuarin, (b) 7-epi-Casuarin, (c) 3,6,7-triepi-Casuarin, (d) 6,7,-dieepi-Casuarin, (e) 3-epi-Casuarin, (f) 3,7-diepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid, (g) 7-epi-Casuarin-6-α-d-Glukosid, (h) 3,6,7-triepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid, (i) 6,7-diepi-Casuarin-6-α-D-Glukosid und (j) 3-epi-Casuarin-6-D-Glukosid oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz oder Acylderivat davon.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Th-1 aktivierenden alkaloid um 3,7-diepi-Casuarin mit der Formel
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Acylderivat davon handelt.