CN109310773A

CN109310773A - 含有tlr激动剂的配制品和使用方法

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Publication number: CN109310773A
Application number: CN201780035091.4A
Authority: CN
Inventors: C·B·福克斯
Original assignee: Infectious Disease Research Institute Inc
Current assignee: Access To Advanced Health Institute
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2037-05-11
Also published as: EP3458475B1; JP7195148B2; JP2019519504A; CN109310773B; MX2018014086A; ES2929054T3; KR102392974B1; RU2018139999A; BR112018073690A2; BR112018073690B1; IL299285A; IL263028B2; EP4112638A1; HUE059605T2; KR20190008545A; DK3458475T3; AU2017268144B2; CA3023968A1; IL263028B1; EP3458475A1

Abstract

提供了包括吸附到明矾上的具有辅助脂质的TLR7/8激动剂或TLR4激动剂的佐剂的稳定水性配制品。还提供了使用所述配制品来刺激免疫应答的组合物和方法。

Description

含有TLR激动剂的配制品和使用方法

相关技术的说明

自20世纪早期Glenny的开创性工作以来(1)，铝盐已经变成人类疫苗中最广泛使用的佐剂，产生关于各种疫苗抗原的安全性和适用性的无可比拟的历史。铝盐通常包括具有大表面面积和高电荷密度的半结晶纳米颗粒和微米颗粒。当疫苗抗原被最佳地吸附到铝盐颗粒的表面上时，所述半结晶纳米颗粒和微米颗粒可以像佐剂那样最有效(2)。铝盐在推进对疫苗抗原的抗体应答方面有效，但是存在较小的指示：所述铝盐实质上增加对疫苗抗原的细胞免疫。诱导有效细胞免疫对研发针对包含结核病、HIV和疟疾的若干疾病的有效疫苗来说可能是必需的。因此，将额外的免疫刺激剂吸附到铝盐上也应当是疫苗配制品研发的首要考虑。因此，佐剂的临床应用的进步发生在2009年当US FDA批准的葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline)的针对人类的人乳头瘤病毒疫苗在2009年使用时；含有AS04，一种由吸附到羟基氧化铝上的Toll样受体4(TLR4)配体单磷酰脂质A组成的佐剂系统(3)。除了TLR4激动剂之外，临床前和临床研究中的其它模式识别受体(PRR)配体可以受益于到铝盐的吸附作用(4)。如TLR4配体等一些PRR配体由于物理化学结构兼容性而吸附到一些铝盐上。因此，羟基氧化铝由于磷酸酯配体交换和/或静电相互作用而吸附这种分子(2)。然而，关注的其它PRR配体，如TLR7/8激动剂咪唑喹啉不含有将促进吸附到羟基氧化铝的结构化部分。

本文引用的所有参考，包含专利申请和专利公开物通过引用以其全文并入本文，就像每个单独参考特别地且单独地被指示为通过引用合并。

发明内容

本公开提供一种TLR水性配制品，其包括：(a)TLR激动剂；以及(b)辅助脂质。在某些实施例中，所述TLR激动剂包括TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂或TLR9激动剂。在某些实施例中，所述水性配制品进一步包括铝盐。

本公开提供一种TLR7/8水性配制品，其包括：(a)TLR7/8激动剂；以及(b)辅助脂质。在某些实施例中，所述水性配制品是具有400nm或更小的粒度的稳定纳米悬浮液。

本公开提供一种组合物，其包括：(a)TLR7/8激动剂；(b)辅助脂质；以及(c)铝盐。在某些实施例中，所述TLR7/8激动剂吸附到所述铝盐上。在某些实施例中，所述TLR7/8激动剂以所述铝盐的25％吸附到所述铝盐上。在某些实施例中，所述铝盐选自由以下组成的群组：氢氧化铝、三水合铝、羟基氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝、羟基磷酸铝硫酸盐和硫酸铝钾。在某些实施例中，所述铝盐包括在某些实施例中，所述铝盐包括在某些实施例中，所述TLR7/8激动剂包括3M-052。在某些实施例中，所述辅助脂质是磷脂或季铵盐脂质。在某些实施例中，所述辅助脂质包括C_10-20烷基链。在某些实施例中，所述辅助脂质选自DOPC、DSPG、DSTAP和聚山梨醇酯80。在某些实施例中，所述辅助脂质选自DSPG和DSTAP。在某些实施例中，所述组合物包括3M-052、和DSPG。在某些实施例中，所述组合物包括3M-052、和DSTAP。在某些实施例中，所述组合物进一步包括抗原。在某些实施例中，所述抗原选自结核病相关抗原、流感相关抗原、红血球凝聚素相关抗原、癌症相关抗原、病毒相关抗原和阿米巴病相关抗原。在某些实施例中，所述结核病相关抗原选自由ID93、ID91和BCG组成的群组。在某些实施例中，所述流感相关抗原选自由H5N1、甲型流感、乙型流感和丙型流感组成的群组。在某些实施例中，所述阿米巴病相关抗原是LecA。在某些实施例中，所述病毒抗原选自由乙型肝炎和丙型肝炎组成的群组。在某些实施例中，所述组合物是稳定的。在某些实施例中，所述组合物稳定至少约六个月。在某些实施例中，所述组合物稳定至少约一年。在某些实施例中，所述组合物在2℃到8℃下稳定至少六个月。在某些实施例中，所述组合物在2℃到8℃下稳定至少一年。

本公开提供一种TLR4水性配制品，其包括：(a)TLR4激动剂；以及(b)辅助脂质，其为DPTAP。在某些实施例中，所述水性配制品是具有400nm或更小的粒度的稳定纳米悬浮液。

本公开提供一种组合物，其包括：(a)TLR4激动剂；(b)辅助脂质，其为DPTAP；以及(c)铝盐，其为在某些实施例中，所述TLR4激动剂吸附到所述铝盐上。在某些实施例中，所述TLR7/8激动剂以所述铝盐的25％吸附到所述铝盐上。在某些实施例中，所述TLR4激动剂吸附到所述磷酸铝上。在某些实施例中，所述TLR4激动剂包括3D-单磷酰脂质A(MPL)。在某些实施例中，所述TLR4激动剂包括GLA。在某些实施例中，所述TLR4激动剂包括具有式(IV)的合成GLA：

或其药学上可接受的盐，其中：

L₁、L₂、L₃、L₄、L₅和L₆相同或不同且独立地是-O-、-NH-或-(CH₂)-；

L₇、L₈、L₉和L₁₀相同或不同且独立地是不存在或-C(＝O)-；

Y₁是酸官能团；

Y₂和Y₃相同或不同且独立地是-OH、-SH或酸官能团；

Y₄是-OH或-SH；

R₁、R₃、R₅和R₆相同或不同且独立地是C_8-13烷基；并且

R₂和R₄相同或不同且独立地是C_6-11烷基。

在某些实施例中，所述TLR4激动剂包括具有式(V)的合成GLA：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；并且R²和R⁴是C₁₂-C₂₀烷基。

在某些实施例中，所述TLR4激动剂包括具有以下式的合成GLA：

或其药学上可接受的盐。

在某些实施例中，所述组合物进一步包括抗原。在某些实施例中，所述抗原选自结核病相关抗原、流感相关抗原、红血球凝聚素相关抗原、癌症相关抗原、病毒相关抗原和阿米巴病相关抗原。在某些实施例中，所述结核病相关抗原选自由ID93、ID91和BCG组成的群组。在某些实施例中，所述流感相关抗原选自由H5N1、甲型流感、乙型流感和丙型流感组成的群组。在某些实施例中，所述阿米巴病相关抗原是LecA。在某些实施例中，所述病毒相关抗原选自由乙型肝炎和丙型肝炎组成的群组。在某些实施例中，所述组合物是稳定的。在某些实施例中，所述组合物稳定至少约六个月。在某些实施例中，所述组合物稳定至少约一年。在某些实施例中，所述组合物在2℃到8℃下稳定至少六个月。在某些实施例中，所述组合物在2℃到8℃下稳定至少一年。

本公开提供一种药物组合物，其包括本文所公开的配制品或组合物。在某些实施例中，所述药物组合物是稳定的。在某些实施例中，所述药物组合物进一步包括抗原。在某些实施例中，所述抗原选自结核病相关抗原、流感相关抗原、红血球凝聚素相关抗原、癌症相关抗原、病毒相关抗原和阿米巴病相关抗原。在某些实施例中，所述结核病相关抗原选自由ID93、ID91和BCG组成的群组。在某些实施例中，所述流感相关抗原选自由H5N1、甲型流感、乙型流感和丙型流感组成的群组。在某些实施例中，所述阿米巴病相关抗原是LecA。在某些实施例中，所述病毒相关抗原选自由乙型肝炎和丙型肝炎组成的群组。在某些实施例中，所述药物组合物的所述组合物是稳定的。在某些实施例中，所述组合物稳定至少约六个月。在某些实施例中，所述组合物稳定至少约一年。在某些实施例中，所述组合物在2℃到8℃下稳定至少六个月。在某些实施例中，所述组合物在2℃到8℃下稳定至少一年。

本公开提供一种刺激受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所公开的配制品或组合物，并且由此刺激所述受试者的免疫应答。在某些实施例中，所述免疫应答是非特异性免疫应答。在某些实施例中，所述免疫应答是抗原特异性免疫应答。在某些实施例中，所述免疫应答涉及B细胞的活化、T细胞的活化、抗体的产生或细胞因子的释放。在某些实施例中，所述组合物用于单一疗法。在某些实施例中，所述组合物用于治疗过敏、成瘾、癌症或自身免疫。在某些实施例中，所述组合物用于疫苗。在某些实施例中，所述组合物的施用途径为口服、静脉内、皮内、经皮、鼻、皮下或肛门。在某些实施例中，该受试者是人。在某些实施例中，所述受试者是非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述非人类哺乳动物是狗、牛或马。

本公开提供一种用于制备包括TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和辅助脂质的水性配制品的方法，其中包括所述TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和所述辅助脂质的所述组合物包括在1nm到约450nm范围内的颗粒；其中所述方法包括：(a)将TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和辅助脂质混合到溶剂中以形成溶液；(b)从步骤(a)的所述溶液中去除所述溶剂以形成薄膜组合物；以及(c)再水化来自步骤(c)的所述薄膜组合物以形成再水化的组合物；以及(d)使所述再水化的组合物经受高能量源以形成纳米悬浮液组合物。在某些实施例中，所述高能量源由微流化器、挤出机、超声发生器、silverson混合器或均化器产生。在某些实施例中，所述方法进一步包括将抗原与所述纳米悬浮液组合物混合。在某些实施例中，所述方法进一步包括将铝盐与所述纳米悬浮液组合物混合。在某些实施例中，所述方法进一步包括将铝盐和抗原与所述纳米悬浮液组合物混合。

参照以下详细说明和附图，本发明的这些和其它方面将是显而易见的。另外，更加详细地描述本发明的某些方面的各种参考文献在本文中列出并且因此通过引用以其全文并入。

附图说明

图1示出了3M-052和各种磷脂的结构。

图2A到图2D示出了3M-052的水性悬浮液的物理性质和到铝盐的吸附作用。图2A示出了制造时3M-052水性悬浮液的粒度和多分散性指数(示出的是来自同一样品的三个测量结果的平均值+/-s.d.)。图2B示出了所选3M-052悬浮液在2周内的粒度稳定性(示出的是来自同一样品的三个测量结果的平均值+/-s.d.)。图2C示出了所选3M-052悬浮液的ζ电势(示出的是来自同一样品的针对ζ电势的九个测量结果的平均值+/-s.d.)。图2D示出了通过监测含有铝盐的样品相比于不含铝盐的样品的离心上清液中3M-052的浓度评估的3M-052的水性悬浮液到或的吸附作用。样品以2000xg被离心2到3分钟。误差条表示来自使用单独批次的3M-052的两个单独实验的标准偏差，其中来自每个实验的每个样品都一式两份地执行。

图3A到图3B示出了单独的或在羟基氧化铝存在的情况下的3M-052-AF的粒度特性。图3A示出了基于强度的光散射粒度分布。图3B示出了基于体积的光散射粒度分布。

图4示出了如由上清液的紫外吸光度测量的3M-052-AF到的吸附等温线。误差条表示来自使用单独批次的3M-052的两个单独实验的标准偏差，其中来自每个实验的每个样品都一式两份地执行。

图5A到图5B示出了明矾和3M052诱导协同抗原特异性免疫原性。通过肌肉注射单独的或辅助有3M-052-AF(0.5μg)、或结合到的3M-052-AF(0.5μg)的ID93(0.5μg)，间隔三周，对C57BL/6小鼠进行三次免疫。在图5A中，在第一次免疫后三周，通过ELISA确定ID93特异性IgG1、IgG2c和总IgG(IgGT)血清端点滴度。N＝4-5小鼠/组。在图5B中，在最终免疫后四周，在布雷菲德菌素A(Brefeldin A)存在的情况下用培养基或ID93重新刺激脾细胞八小时，并且通过从ID93特异性应答中减去培养基应答来确定产生CD4T细胞的细胞因子的频率。数据表示具有每组4到5个动物且具有相似结果的两个实验。示出了平均值+/-s.e.m.。*p<0.05vs.ID93，#p<0.05vs.ID93+3M-052-AF，p<0.05vs.ID93+3M-052-明矾。

图6A到图6D示出了3M-052剂量滴定。通过肌肉注射单独的或辅助有3M-052-AF(0.1、0.5、1或10μg)、或结合到的3M-052-AF(0.1、0.5、1或10μg)的ID93(0.5μg)，间隔三周，对C57BL/6小鼠进行三次免疫。在图6A和图6B中，在第一次免疫后三周，通过ELISA确定ID93特异性IgG1、IgG2c和总IgG血清端点滴度。N＝5小鼠/组。在图6C和图6D中，在最终免疫后一周，在布雷菲德菌素A存在的情况下用培养基或ID93重新刺激脾细胞八小时，并且通过从ID93特异性应答中减去培养基应答来确定产生CD4T细胞的细胞因子的频率。数据表示具有每组5个动物且具有相似结果的两个实验。示出了平均值+/-s.e.m.。

图7A到图7B示出了TLR7用于TH1诱导3M-052的佐剂活性。通过肌肉注射辅助有结合到的3M-052-AF(1μg)或结合到的GLA-AF(5μg)的ID93(0.5μg)，间隔三周，对野生型C57BL/6或B6.129S1-TLR7^tm1Flv(TLR7^-/-)小鼠进行两次免疫。在图7A中，在第一次免疫后三周，确定ID93特异性IgG1和IgG2c血清抗体滴度。图7B示出了在第二次免疫后一周用ID93对脾细胞进行离体刺激之后量化的ID93特异性CD4T细胞。N＝5小鼠/组。数据表示具有每组5个动物且具有相似结果的两个实验。条带指示平均值+/-s.e.m.。*p<0.05。

图8A到图8D示出了用3M-052-Alhydrogel配制的HIV gp120抗原相比于用3M-052-AdjuPhos、单独的3M-052或单独的任何类型的明矾配制的HIV gp120抗原诱导增强的抗体和TH1型细胞应答。通过肌肉注射单独的或辅助有3M-052-AF(1μg)、或的HIV gp120抗原(10pg)，间隔三周，对C57BL/6小鼠进行三次免疫。图8A示出了实验方案。图8B示出了在第一次免疫后三周，通过ELISA确定的HIV gp120抗原特异性IgG1、IgG2c和总IgG(IgG)血清端点滴度的结果。N＝5小鼠/组，条带指示平均值+s.d.。在图8C中，在第二次免疫后一周，用HIV gp120抗原重新刺激脾细胞，并且通过流式细胞术确定产生CD4T细胞的细胞因子的频率。N＝5小鼠/组，条带指示平均值+s.d.。在图8D中，在第二次和第三次免疫后三周，通过ELISPOT测量HIV gp120抗原特异性骨髓抗体分泌细胞。N＝5小鼠/组，条带指示平均值+s.e.m.。*p<0.05vs.HIV gp120抗原，#p<0.05vs.3M-052-AF，p<0.05vs.对应明矾(或)，p<0.05vs.

图9A到图9D示出了3M-052和明矾协同以增加免疫时的先天应答。用3M-052-AF(1μg)、或对野生型C57BL/6小鼠进行肌内免疫。十八小时之后，收获引流腹股沟淋巴结并且分别对其以下各项进行分析：CD11b+Ly6C+炎性单核细胞的流入量(图9A)；共刺激分子CD86在B细胞、炎性单核细胞或DC上的表达(图9B)；CD69在淋巴细胞上的表达(图9C)；以及IFN-γ或IL-1β通过NK细胞和中性粒细胞的表达(图9D)。N＝5小鼠/组。数据表示具有每组5个动物且具有相似结果的两个实验。条带指示平均值+s.e.m.。*p<0.05vs.空，#p<0.05vs.3M-052，p<0.05vs.对应明矾(或)，p<0.05vs.

图10示出了6个月内的3M-052-DSPG纳米悬浮液粒度和尺寸多分散性(示出了n＝6批，平均值+/-s.d.)。

图11A到图11C示出了用3M-052-Alhydrogel配制的HIV gp120抗原诱导增强的阴道和TH1型细胞应答。通过肌肉注射单独的或辅助有3M-052-AF(1μg)、或的HIVgp120抗原(10μg)，间隔三周，对C57BL/6小鼠进行三次免疫。图11A示出了实验方案。在图11B中，在第三次免疫后三周，通过ELISA确定的HIV gp120抗原特异性IgG1、IgG2c和总IgG阴道灌洗端点滴度。N＝9-10小鼠/组，条带指示平均值+s.d.。在图11C中，在每次免疫后一周，用HIV gp120抗原重新刺激脾细胞，并且通过流式细胞术确定产生CD4T细胞的细胞因子的频率。N＝5小鼠/组，条带指示平均值+s.e.m.。*p<0.05vs.HIV gp120抗原，#p<0.05vs.3M-052-AF，p<0.05vs.对应明矾(或)，p<0.05vs.

具体实施方式

本公开涉及包括TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和辅助脂质的组合物，其中所述组合物适合于在水性溶液中与铝盐结合。本公开提供包括TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和辅助脂质的水性配制品。本公开还提供包括吸附到铝盐上的具有辅助脂质的TLR7/8激动剂或TLR4激动剂的佐剂的稳定水性组合物。

将TLR配体吸附到铝盐上还导致更局部地递送并且促进增强的佐剂活性。然而，某些TLR激动剂的结构不能实现到明矾的有效吸附。本公开涉及包括促进通过辅助脂质吸附到铝盐的TLR激动剂的脂质基组合物的组合物。

本公开提供通过具有辅助脂质的TLR激动剂的配制品来增强TLR激动剂与明矾和/或抗原的生理化学结构兼容性以产生稳定水性配制品。通过输入能量(例如，超声处理或微流化)促进制备稳定水性配制品或纳米悬浮液，可以通过所述能量输入将TLR激动剂和辅助脂质的颗粒大小设定为约450nm或更小。水性配制品或纳米悬浮液在约2℃到8℃下在至少约1周、2周、4周、3个月、6个月、9个月或1年内是稳定的。水性配制品或纳米悬浮液是TLR激动剂和辅助脂质的组合物，其中所述组合物是TLR激动剂和辅助脂质的在预定时间段内稳定的分散体，如本文所描述的。

还提供了本文描述的包括水性配制品的组合物(如疫苗组合物、药物组合物)。在一些实施例中，组合物用于刺激受试者的免疫应答。在一些实施例中，本文描述的组合物还包括一种或多种抗原。

在本说明书中，除非另外说明，否则术语“约”和“基本上由…组成”是指所指示的范围、值或结构的±20％。应当理解的是，如本文所使用的术语“一(a)”和“一个(an)”是指所列举的组件的“一个或多个”。替代方案(例如，“或”)的使用应当被理解为指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文所使用的，术语“包含”、“具有”和“包括”被同义地使用，其中术语及其变体旨在被解释为非限制性的。

除非另外说明，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语具有它们领域认可的含义。

“烷基”指含有1到20个碳原子并且在某些优选实施例中含有11到20个碳原子的直链或支链、非环状或环状、不饱和或饱和的脂族烃基。代表性饱和直链烷基包含甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等，包含十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；而饱和支链烷基包含异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环状烷基包含环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环状烷基包含环戊烯基和环己烯基等。环状烷基在本文还被称为“碳环(homocycles)”或“同素环(homocyclic rings)”。不饱和烷基包含在相邻碳原子之间的至少一个双键或者三键(分别被称为“烯基”或者“炔基”)。代表性直链和支链烯基包含乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等；而代表性直链和支链炔基包含乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。

“卤代(Halo)”或“卤素(halogen)”是指氟代、氯代、溴代和碘代。

“羟基(Hydroxy)”或“氢氧基(hydroxyl)”是指基团-OH。

“烷氧基”是指基团-O-烷基基团，其中烷基是如以本文所定义的。例如，烷氧基包含甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正丁氧基等。

“酰氨基”是指基团–NR²⁰C(O)R²¹，其中R²⁰和R²¹独立地选自氢、烷基和芳基。

“酸官能团”是指能够在水性培养基中给予质子的官能团(即-Lowry酸)。在给予质子之后，酸官能团变成带负电荷的种类(即酸官能团的共轭碱)。酸官能团的实例包含但不限于：-OP(＝O)(OH)₂(磷酸根)、-OS(＝O)(OH)₂(硫酸根)、-OS(OH)₂(亚硫酸根)、-C(＝O)OH(羧酸根)、-OC(＝O)CH(NH₂)CH₂C(＝O)OH(天冬氨酸根)、-OC(＝O)CH₂CH₂C(＝O)OH(琥珀酸根)以及-OC(＝O)CH₂OP(＝O)(OH)₂(羧甲基磷酸根)。

组合物

本公开提供包括TLR激动剂和辅助脂质的水性配制品。在某些实施例中，将包括TLR激动剂和辅助脂质的水性配制品或纳米悬浮液与铝盐混合。在一些实施例中，本文描述的组合物还可以包括一种或多种试剂或抗原。

本公开提供包括(1)TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和(2)辅助脂质的水性配制品。在某些实施例中，使包括TLR7/8激动剂和辅助脂质的组合物经受高能量源以产生水性配制品或纳米悬浮液组合物。在某些实施例中，使包括TLR激动剂和辅助脂质的组合物经受高能量源以产生水性配制品或纳米悬浮液组合物。在某些实施例中，水性配制品或纳米悬浮液组合物包括大小范围在约1nm到450nm，如小于约400nm或小于约200nm范围内的颗粒。

在某些实施例中，将包括TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和辅助脂质的水性配制品或纳米悬浮液与铝盐混合。本公开提供一种组合物，其包括：(1)TLR7/8激动剂；(2)辅助脂质；以及(3)铝盐。本公开提供一种组合物，其包括：(1)TLR4激动剂；(2)辅助脂质；以及(3)铝盐。

在一些实施例中，本文描述的组合物还可以包括一种或多种试剂或抗原。本公开提供包括(1)TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和(2)辅助脂质的水性配制品，所述水性配制品进一步包括一种或多种试剂或抗原。本公开提供包括以下各项的水性组合物：(1)TLR7/8激动剂或TLR4激动剂；(2)辅助脂质；以及(3)铝盐，所述水性组合物进一步包括一种或多种试剂或抗原。本公开提供包括以下各项的水性组合物：(1)TLR7/8激动剂；(2)辅助脂质；以及(3)铝盐，所述水性组合物进一步包括一种或多种试剂或抗原。本公开提供包括以下各项的水性组合物：(1)TLR4激动剂；(2)辅助脂质；以及(3)铝盐，所述水性组合物进一步包括一种或多种试剂或抗原。

下文提供了水性组合物的组分的描述。

TLR激动剂

在一些实施例中，本文描述的TLR激动剂是疏水性的或相对疏水性的，并且当在来自高能量源的输入存在或不存在的情况下与水混合时，在不存在辅助脂质的情况下，所述TLR激动剂基本上不形成本公开的稳定水性纳米悬浮液。在一些实施例中，本公开的TLR激动剂含有非极性部分，如碳氢化合物链。在一些实施例中，本公开的TLR激动剂可溶于有机溶剂中，但是难溶于或不溶于水，并且趋向于在不存在本公开的辅助脂质的情况下排列成水性溶液中的聚集体。在Mary Luckey，剑桥大学出版社，纽约，2014年的膜结构生物学：生物化学与生物物理基础(Membrane Structural Biology:With Biochemical andBiophysical Foundations)中描述了TLR激动剂的物理化学性质，所述文献通过引用以其全部并入本文。

如本文所使用的，“不溶于水”是指当化合物与水混合时，例如当在例如处于或处于约25℃与50℃之间的室温下与水混合时，不溶解的化合物。如本文所使用的，“水中低溶解度”是指例如当在如处于或处于约25℃与50℃之间的室温下与水混合时，具有小于或约30mg/mL的水中溶解度的化合物。如本文所使用的，“难溶于水”可以用于指不溶于水或具有低水溶解度的化合物，例如非极性化合物。

TLR7/8激动剂

本文提供了可以用于本文描述组合物的TLR7/8激动剂。如本文所使用的，“TLR7/8激动剂”是指通过其与TLR7、TLR8或两者相互作用而影响其生物活性的激动剂。这种生物活性包含但不限于诱导TLR7和/或TLR8介导的信号转导以加强通过先天免疫系统的免疫应答。在一些实施例中，TLR是咪唑喹啉胺衍生物(参见，例如美国专利号4,689,338(Gerster))，但是还已知其它化合物类别(参见，例如美国专利号5,446,153(Lindstrom等人)；美国专利号6,194,425(Gerster等人)；和美国专利号6,110,929(Gerster等人)；以及国际公开号WO2005/079195(Hays等人))。

在某些实施例中，TLR7/8激动剂是具有以下化学式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹⁰选自由氢和C_1-6烷基组成的群组；R^11b是任选地由选自由卤代、羟基、C_1-6烷氧基和酰胺基组成的群组的一个或多个群组取代的C_1-6烷基。

在式(I)的一些实施例中，R¹⁰是氢。在一些实施例中，R¹⁰是C_1-6烷基。在一些实施例中，R¹⁰是甲基、乙基、正丙基或正丁基。在一些实施例中，R¹⁰是正丁基。

在式(I)的一些实施例中，R^11b是由酰胺基取代的C_2-4烷基。在一些实施例中，R^11b是–(CH₂)₄-酰胺基。在一些实施例中，R^11b是-(CH₂)₄-NH-C(O)-C_1-25烷基。在一些实施例中，R^11b是-(CH₂)₄-NH-C(O)-C_15-25烷基。在一些实施例中，R^11b是-(CH₂)₄-NH-C(O)-C_15-20烷基。在一些实施例中，R^11b是-(CH₂)₄-NH-C(O)-C₁₇烷基。

在某些实施例中，TLR7/8激动剂是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐：

在某些优选实施例中，用于本文的组合物的TLR7/8激动剂包括如美国专利号9,242,980中描述的N-(4-{[4-氨基-2-丁基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1-yl]oxy}丁基)硬脂酸酰胺)，3M-052。

TLR4激动剂

在某些优选实施例中，用于本文的组合物的TLR4激动剂包括吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)，如美国专利公开号US2007/021017、US2009/045033、US2010/037466和US 2010/0310602中描述的那些，所述专利的内容通过引用以其全部并入本文。

例如，在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(II)的结构的合成GLA佐剂：

或其药学上可接受的盐，其中：

Y₁是酸官能团；

Y₂和Y₃相同或不同且独立地是-OH、-SH或酸官能团；

Y₄是-OH或-SH；

R₁、R₃、R₅和R₆相同或不同且独立地是C_8-13烷基；并且

R₂和R₄相同或不同且独立地是C_6-11烷基。

在合成GLA结构的一些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₀烷基；并且R²和R⁴是C₈烷基。在某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₉烷基。

例如，在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(III)的结构或其药学上可接受的盐的合成GLA佐剂：

在以上GLA结构的某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；并且R²和R⁴是C₁₂-C₂₀烷基。在另一个特定实施例中，GLA具有上述式，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₁₃烷基。在另一个特定实施例中，GLA具有上述式，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₀烷基；并且R²和R⁴是C₈烷基。

在另一个特定实施例中，GLA具有上述式，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；并且R²和R⁴是C₉-C₂₀烷基。在某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₉烷基。

在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(IV)的结构或其药学上可接受的盐的合成GLA佐剂：

在以上GLA结构的某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁-C₂₀烷基；并且R²和R⁴是C₉-C₂₀烷基。在某些实施例中，R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₉烷基。

在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(V)的结构的合成GLA佐剂：

在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下式(VI)的结构或其药学上可接受的盐的合成GLA佐剂：

在某些实施例中，TLR4激动剂是具有以下结构或其药学上可接受的盐的合成GLA佐剂：

在另一个实施例中，将减毒的脂质A衍生物(ALD)并入本文描述的组合物中。ALD是已经被改变或构造使得分子显示脂质A的更小或不同的不良反应的脂质A类分子。这些不良反应包含如在鸡胚50％致死剂量测定(CELD₅₀)中评估的致热原性、局部Shwarzman反应性和毒性。根据本公开有用的ALD包含单磷酰脂质A(MLA或MPL)和3-脱酰单磷酰脂质A(3D-MLA或3D-MPL)。MLA(MPL)和3D-MLA(3D-MPL)已知并且不需要在本文中进行详细描述。参见例如1984年3月13日发布并转让给Ribi免疫化学制剂研究公司(Ribi ImmunoChem Research,Inc.)的美国专利号4,436,727，所述专利公开单磷酰脂质A及其制造。Myers等人的也转让给里比免疫化学制剂研究公司的美国专利号4,912,094和再审查证书B1美国专利号4,912,094体现3-脱酰单磷酰脂质A及其制造方法。还参见例如GB 2220211和WO 92/116556。从GB2220211(Ribi)处已知3-脱氧酰化单磷酰脂质A。在化学方面，其是3-脱氧酰化单磷酰脂质A与4、5或6个酰化链的混合物并且由Ribi免疫化学蒙大那公司(Ribi Immunochem Montana)制造。国际专利申请号WO 92/116556中公开了3-脱氧酰化单磷酰脂质A的某种形式。关于MLA和3D-MLA的这些专利中的每一个的公开内容通过引用并入本文。

在以上TLR4激动剂化合物中，可以根据分子中的官能团确定总电荷。例如，磷酸基可以是带负电荷的或中性的，取决于磷酸基的电离状态。

在本文提供的实施例中的任何实施例中，TLR4激动剂是具有式(III)的结构或其药学上可接受的盐的合成GLA佐剂，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₁₃烷基。

辅助脂质

本文提供了可以用于本文描述组合物的辅助脂质。

在某些实施例中，所述辅助脂质是磷脂或季铵盐脂质。在某些实施例中，辅助脂质是作为磷脂酰胆碱或磷酸甘油脂的磷脂。在某些实施例中，辅助脂质包括以下部分中的任何部分：

其中X^-是碱金属抗衡离子，并且Y⁺是卤化物抗衡离子。

在某些实施例中，辅助脂质包括C_10-20烷基链。在某些实施例中，所述辅助脂质包括C_12-18烷基链。

在某些实施例中，辅助脂质是阴离子型。在某些实施例中，辅助脂质是阳离子型。在某些实施例中，辅助脂质是整体不带电荷的。在某些实施例中，辅助脂质是两性离子。

在某些实施例中，以下示出了合适的辅助脂质。

在某些实施例中，辅助脂质选自DLPG、DMPG、DPPG、DSPG、DOPG、DSTAP和DPTAP。在某些实施例中，辅助脂质选自DLPG、DMPG、DPPG、DSPG和DOPG。在某些实施例中，辅助脂质选自DSTAP和DPTAP。

在某些实施例中，辅助脂质是DSPG。在某些实施例中，辅助脂质是DSTAP。在某些实施例中，辅助脂质是DPTAP。

在某些实施例中，所述辅助脂质选自DSPG和DSTAP。在某些实施例中，所述辅助脂质选自DSPG和DSTAP。在某些实施例中，辅助脂质是DSPG。在某些实施例中，辅助脂质是DSTAP。

在某些实施例中，辅助脂质选自DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC和POPC。在某些实施例中，辅助脂质选自DLPC、DSPC和DOPC。

在某些实施例中，辅助脂质选自DPPC和DPTAP。在某些实施例中，辅助脂质是DPPC。在某些实施例中，辅助脂质是DPTAP。

在某些实施例中，辅助脂质选自DOPC、DSPG、DSTAP和聚山梨醇酯80。

在本文描述的实施例中的任何实施例中，辅助脂质可以是DLPE。

在本文描述的实施例中的任何实施例中，辅助脂质可以是DMTAP。

在本文描述的实施例中的任何实施例中，辅助脂质可以是DTAP。

铝盐

如上所述，本文描述的组合物可以包括铝盐，所述铝盐在本文中可以被称为明矾。合适的铝盐包含氢氧化铝、三水合铝、羟基氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝、羟基磷酸铝硫酸盐和硫酸铝钾。铝盐还可以由以下式提及：Al(OH)₃、AlH₃O₃、AlH₆O₃、AlO(OH)、Al(OH)(PO₄)和KAl(SO₄)₂。被用作共同佐剂的铝盐是有利的，因为它们具有良好的安全记录、增加抗体应答、使抗原稳定并且对于大规模生产来说相对简单。(Edelman，2002年，分子生物技术(Mol.Biotechnol.)，21:129-148；Edelman,R.，1980年，传染疾病综述(Rev.Infect.Dis.)，2:370-383)。

在某些实施例中，铝盐是氢氧化铝或羟基氧化铝。具有总体正电荷并且可以容易地吸附带负电荷的部分。也可以被称为Amphojel；氢氧化铝凝胶；水合氧化铝；三氢氧化铝；或Alugelibye。

在某些实施例中，铝盐是磷酸铝。具有总体负电荷并且可以容易地吸附带正电荷的部分。

TLR激动剂和辅助脂质的水性配制品

如上所述，本公开提供包括(1)TLR激动剂和(2)辅助脂质的水性配制品。本公开提供包括(1)TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和(2)辅助脂质的水性配制品。

在某些实施例中，本公开提供包括(1)TLR7/8激动剂和(2)辅助脂质的水性配制品。在某些实施例中，水性配制品包括TLR7/8激动剂和辅助脂质，所述辅助脂质选自由DOPC、DSPG、DSTAP和聚山梨醇酯80组成的群组。在某些实施例中，水性配制品包括TLR7/8激动剂和辅助脂质，所述辅助脂质选自由DSPG和DSTAP组成的群组。

在某些实施例中，本公开提供包括(1)TLR4激动剂和(2)辅助脂质的水性配制品。在某些实施例中，本公开提供包括(1)TLR4激动剂和(2)作为DPTAP的辅助脂质的水性配制品。

在某些实施例中，使包括TLR激动剂和辅助脂质的组合物经受高能量源以产生水性配制品或纳米悬浮液组合物。在某些实施例中，使包括TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和辅助脂质的组合物经受高能量源以产生水性配制品或纳米悬浮液组合物。在某些实施例中，水性配制品包括TLR激动剂和辅助脂质的大小范围在约1nm到450nm，如小于约400nm或小于约200nm范围内的纳米悬浮液颗粒。

大小

在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小范围为约50nm到75nm。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小范围为约50nm到100nm。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小范围为约50nm到150nm。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小范围为约50nm到200nm。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小范围为约20nm到100nm。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小范围为约20nm到50nm。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小范围为约10nm到200nm。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小范围为约10nm到100nm。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小范围为约10nm到50nm。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小为约1nm、约5nm、约10nm、约15nm、约20nm、约25nm、约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm、约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约105nm、约110nm、约115nm、约120nm、约125nm、约130nm、约135nm、约140nm、约145nm、约150nm、约155nm、约160nm、约165nm、约170nm、约175nm、约180nm、约185nm、约190nm、约195nm或约200nm。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小为不大于约1nm、不大于约5nm、不大于约10nm、不大于约15nm、不大于约20nm、不大于约25nm、不大于约30nm、不大于约35nm、不大于约40nm、不大于约45nm、不大于约50nm、不大于约55nm、不大于约60nm、不大于约65nm、不大于约70nm、不大于约75nm、不大于约80nm、不大于约85nm、不大于约90nm、不大于约95nm、不大于约100nm、不大于约105nm、不大于约110nm、不大于约115nm、不大于约120nm、不大于约125nm、不大于约130nm、不大于约135nm、不大于约140nm、不大于约145nm、不大于约150nm、不大于约155nm、不大于约160nm、不大于约165nm、不大于约170nm、不大于约175nm、不大于约180nm、不大于约185nm、不大于约190nm、不大于约195nm或不大于约199nm。

在一些实施例中，TLR激动剂和辅助脂质的纳米悬浮液颗粒的大小为不大于约200nm、不大于约205nm、不大于约10nm、不大于约215nm、不大于约220nm、不大于约225nm、不大于约230nm、不大于约235nm、不大于约240nm、不大于约245nm、不大于约250nm、不大于约255nm、不大于约260nm、不大于约265nm、不大于约270nm、不大于约275nm、不大于约280nm、不大于约285nm、不大于约90nm、不大于约295nm、不大于约300nm、不大于约305nm、不大于约310nm、不大于约315nm、不大于约320nm、不大于约325nm、不大于约130nm、不大于约335nm、不大于约140nm、不大于约145nm、不大于约150nm、不大于约355nm、不大于约360nm、不大于约365nm、不大于约370nm、不大于约375nm、不大于约380nm、不大于约385nm、不大于约390nm、不大于约395nm或不大于约399nm、不大于约400nm；不大于约405nm、不大于约410nm、不大于约415nm、不大于约420nm、不大于约425nm、不大于约430nm、不大于约435nm、不大于约440nm、不大于约440nm、不大于约445nm或不大于约450nm。

在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒能够通过至少0.45微米的过滤器过滤。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒能够通过至少0.45微米或更小孔径的过滤器过滤。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒能够通过0.45微米的过滤器过滤。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒能够通过0.20微米的过滤器过滤。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒能够通过0.22微米的过滤器过滤。

稳定性

在本文提供的一些实施例中，包括TLR激动剂(例如，TLR7/8激动剂或TLR4激动剂)和辅助脂质的水性纳米悬浮液颗粒的1nm到450nm大小是稳定的，因为保持纳米悬浮液颗粒的大小小于450nm，并且因为当在本公开的辅助脂质不存在的情况下相比于TLR激动剂时，颗粒展现出减少的聚集或没有聚集。

在一些实施例中，“稳定的”是指包括纳米悬浮液颗粒的配制品或组合物，所述纳米悬浮液颗粒显示出几乎没有聚集或减少的聚集，或者展示出相比于初始粒度，配制品的平均粒度或多分散性随时间几乎没有总体增加。

纳米悬浮液颗粒的稳定性可以通过本领域技术人员熟悉的技术测量。在一些实施例中，在视觉上观察稳定性。视觉检查可以包含检查微粒、絮状物或聚集物。在一些实施例中，稳定性由纳米悬浮液颗粒的大小确定。例如，大小可以通过本领域已知的技术评估，包含但不限于，X射线和激光衍射、动态光散射(DLS)、CryoEM或Malvern Zetasize。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小是指Z平均直径。在一些实施例中，稳定性由纳米悬浮液颗粒穿过具有粒度的过滤器，例如通过0.20微米、0.22微米或0.45微米的过滤器的能力评估。在一些实施例中，稳定性由pH确定。在一些实施例中，稳定性由例如使用动态光散射(DLS)技术进行的多分散性指数(PdI)的测量确定。

在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒的Z平均直径在测定的时间段内增加小于50％、小于40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于12％、小于10％、小于7％、小于5％、小于3％、小于1％。

在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒在0℃到8℃，如2℃到8℃下是稳定的。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒在0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃下在至少1分钟内、至少5分钟内、至少10分钟内、至少15分钟内、至少20分钟内、至少25分钟内、至少30分钟内、至少35分钟内、至少40分钟内、至少45分钟内、至少50分钟内、至少55分钟内、至少1小时内、至少2小时内、至少6小时内、至少12小时内、至少18小时内、至少24小时内、至少48小时内、至少72小时内、至少1周内、至少2周内、至少3周内、至少1个月内、至少2个月内、至少3个月内、至少4个月内、至少5个月内、至少6个月内、至少7个月内、至少8个月内、至少9个月内、至少10个月内、至少11个月内、至少1年内、至少2年内或至少5年内是稳定的。

在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒在20℃到30℃下是稳定的。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒在25℃下在至少1分钟内、至少5分钟内、至少10分钟内、至少15分钟内、至少20分钟内、至少25分钟内、至少30分钟内、至少35分钟内、至少40分钟内、至少45分钟内、至少50分钟内、至少55分钟内、至少1小时内、至少2小时内、至少6小时内、至少12小时内、至少18小时内、至少24小时内、至少48小时内、至少72小时内、至少1周内、至少2周内、至少3周内、至少1个月内、至少2个月内、至少3个月内、至少4个月内、至少5个月内、至少6个月内、至少7个月内、至少8个月内、至少9个月内、至少10个月内、至少11个月内、至少1年内、至少2年内或至少5年内是稳定的。

在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒在35℃到40℃下是稳定的。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒在35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃下在至少1分钟内、至少5分钟内、至少10分钟内、至少15分钟内、至少20分钟内、至少25分钟内、至少30分钟内、至少35分钟内、至少40分钟内、至少45分钟内、至少50分钟内、至少55分钟内、至少1小时内、至少2小时内、至少6小时内、至少12小时内、至少18小时内、至少24小时内、至少48小时内、至少72小时内、至少1周内、至少2周内、至少3周内、至少1个月内、至少2个月内、至少3个月内、至少4个月内、至少5个月内、至少6个月内、至少7个月内、至少8个月内、至少9个月内、至少10个月内、至少11个月内、至少1年内、至少2年内或至少5年内是稳定的。

在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒在57℃到62℃下是稳定的。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒在57℃、58℃、59℃、60℃、61℃或62℃下在至少1分钟内、至少5分钟内、至少10分钟内、至少15分钟内、至少20分钟内、至少25分钟内、至少30分钟内、至少35分钟内、至少40分钟内、至少45分钟内、至少50分钟内、至少55分钟内、至少1小时内、至少2小时内、至少6小时内、至少12小时内、至少18小时内、至少24小时内、至少48小时内、至少72小时内、至少1周内、至少2周内、至少3周内、至少1个月内是稳定的。

在一个示例性实施例中，纳米悬浮液颗粒在2℃到8℃下在至少2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或一年内是稳定的。

在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒在1到4次冷冻融化之后是稳定的。在一些实施例中，纳米悬浮液颗粒在1次、2次、3次或4次冷冻融化之后是稳定的。

TLR激动剂、辅助脂质和铝盐的组合

如上所述，提供了包括吸附到铝盐上的具有辅助脂质的TLR激动剂的佐剂的稳定水性配制品。本公开提供包括吸附到铝盐上的具有辅助脂质的TLR7/8激动剂或TLR4激动剂的佐剂的稳定水性配制品。

在某些实施例中，本公开提供包括以下各项的水性组合物：(1)TLR7/8激动剂；(2)辅助脂质；以及(3)铝盐。在某些实施例中，水性配制品包括以下各项：(1)TLR 7/8激动剂；(2)选自由DOPC、DSPG、DSTAP和聚山梨醇酯80组成的群组的辅助脂质；以及(3)铝盐。在某些实施例中，水性配制品包括以下各项：(1)TLR 7/8激动剂；(2)选自由DSPG和DSTAP组成的群组的辅助脂质；以及(3)铝盐。

在某些实施例中，本公开提供包括以下各项的水性组合物：(1)TLR4激动剂；(2)辅助脂质；以及(3)铝盐。在某些实施例中，本公开提供包括以下各项的水性组合物：(1)TLR4激动剂；(2)作为DPTAP的辅助脂质；以及(3)铝盐。在某些实施例中，本公开提供包括以下各项的水性组合物：(1)TLR4激动剂；(2)辅助脂质；和(3)作为磷酸铝的铝盐(例如，)。在某些实施例中，本公开提供包括以下各项的水性组合物：(1)TLR4激动剂；(2)作为DPTAP的辅助脂质；和(3)作为磷酸铝的铝盐(例如，)。

涉及对组分中的每一种的选择的因素包含但不限于组分的电荷以及可交换配体的存在。在适当地选择组分的情况下，TLR激动剂和辅助脂质适合于吸附到铝盐上。在某些实施例中，在体外条件下发生吸附。

结合或吸附是指通常由于特异性或非特异性结合或相互作用而展现出相互吸引或结合能力的分子或其部分之间的相互作用，包含但不限于生物化学、生理学和/或化学相互作用。在某些实施例中，到铝盐的结合可以通过紫外光谱法、SDS-PAGE或离心分离研究来确定。

在一些实施例中，存在于组合物中的具有辅助脂质的TLR激动剂的至少25％、至少40％、至少50％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％与明矾颗粒缔合。实例1中展示了一种确定关联百分比的示例性方法。

吸附到铝盐上通常可以但不限于通过以下机制发生：静电相互作用和配体交换。静电相互作用使用在某种溶液条件下组分上相反电荷的存在。配体交换使用组分中的一种组分中的磷酸基来与另一种组分的羟基进行交换。对于配体交换，使用组分中可接近的磷酸基和羟基。为了制备与包括TLR激动剂、辅助脂质和铝盐的佐剂组合物结合的具有抗原的疫苗组合物，考虑抗原上的电荷以及抗原上的磷酸基和羟基的存在。

配体交换

在关于配体交换机制的某些实施例中，抗原与包括TLR激动剂、辅助脂质和铝盐的佐剂组合物之间可能存在配体交换。

在某些实施例中，佐剂组合物的组分(例如，TLR激动剂、辅助脂质和铝盐)之间可能存在配体交换。如上所述，佐剂组合物中的某些组分包括磷酸基，而其它某些组分包括羟基，因此能够进行配体交换。例如，某些TLR4激动剂包括磷酸基。而且，某些辅助脂质包括磷酸基。而且，包括磷酸基。羟基存在于以下组分中：抗原、TLR激动剂、辅助脂质和

静电相互作用

在关于静电相互作用机制的某些实施例中，在约生理学pH下，疫苗组合物基本上不带电荷。

如果疫苗组合物的抗原带电荷，则佐剂组合物的组分(例如，TLR激动剂、辅助脂质和铝盐)可以被选择用于中和抗原的电荷以提供基本上不带电荷的疫苗组合物。如果疫苗组合物的抗原基本上不带电荷，则佐剂组合物的组分(例如，TLR激动剂、辅助脂质和铝盐)可以被选择用于使抗原保持基本上不带电荷以提供基本上不带电荷的疫苗组合物。如上所述，佐剂组合物中的组分中的每一种组分可以被表征为带负电荷、带正电荷或不带电荷。

在某些实施例中，配制品组合物包括TLR激动剂、辅助脂质和铝盐，其中使用来自下表的特征选择所述组分。

在某些实施例中，配制品组合物包括TLR激动剂、辅助脂质和铝盐，其中所述组分选自下表。

制备组合物的方法

本公开提供用于制备包括TLR激动剂(例如，TLR7/8激动剂或TLR4激动剂)和辅助脂质的水性配制品的方法；其中，所述方法包括：

(a)将TLR激动剂(例如，TLR7/8激动剂或TLR4激动剂)和辅助脂质混合到溶剂中以形成溶液；

(b)从步骤(a)的所述溶液中去除所述溶剂以形成薄膜组合物；以及

(c)再水化来自步骤(c)的所述薄膜组合物以形成再水化的组合物；以及

(d)使所述再水化的组合物经受高能量源以形成纳米悬浮液组合物。

在一些实施例中，溶剂具有低沸点。适合于所述方法的溶剂包含但不限于氯仿、二氯甲烷、甲醇和水。在某些实施方式中，溶剂是氯仿。在某些实施例中，溶剂包括氯仿、甲醇和水。

在某些实施例中，将TLR7/8激动剂或TLR4激动剂与辅助脂质混合可以采用TLR7/8激动剂或TLR4激动剂与辅助脂质约1:2的比例。

在步骤(a)中混合组分可以在室温下或在轻微加热下进行。轻微加热可以加热到30℃、35℃或40℃。

在方法的步骤(b)中，在轻微加热或减小的压力下去除溶剂。在一些实施例中，在减小的压力下去除溶剂。减小的压力是低于大气压的压力。

在步骤(c)中，再水化薄膜组合物。用于再水化的合适的溶剂是水。在某些实施例中，水是超纯水。

在步骤(d)中，使再水化的组合物经受高能量源以形成纳米悬浮液组合物。在某些实施例中，搅拌再水化的组合物。搅拌的方法是超声处理。超声处理可以发生持续高达若干小时。在某些实施例中，继续搅拌直到组合物是透明的。在某些实施例中，继续搅拌直到组合物基本上没有可见颗粒。在一些实施例中，如由紫外光谱、浊度计或动态光散射的读数证明的，溶液是透明的。

在步骤(d)中，再水化的组合物可以被加工或研磨。使用本领域已知的包含超声处理、silverson混合和微流化的标准技术进行加工或研磨。

在一些实施例中，高能量源提供至少2,000PSI、至少3,000、5,000PSI、至少10,000PSI、至少15,000PSI、至少20,000PSI、至少25,000PSI、至少30,000PSI、至少33,000PSI、至少40,000PSI、至少45,000PSI或至少50,000PSI。在一些实施例中，高能量源提供约5,000到50,000；5,000到10,000；5,000到15,000；5,000到20,000；5,000到25,000；5,000到30,000；5,000到35,000；5,000到40,000；5,000到45,000；或5,000到50000PSI。在一些实施例中，高能量源提供约45,000到50,000；40,000到50,000；35,000到50,000；30,000到50,000；25,000到50,000；20,000到50,000；15,000到50,000；10,000到50,000；或5,000到50,000PSI。在一些实施例中，高能量源提供约25,000到35,000；25,000到30,000；或30,000到35,000PSI。在一些实施例中，高能量源提供约30,000PSI。

在一些实施例中，高能量源是高剪切源。

在一些实施例中，高能量源是微流化器。微流化用于描述组合物暴露于高剪切力的过程。在一些实施例中，通过被称为的仪器或装置加工组合物。

在一些实施例中，高能量源是挤出机。

在一些实施例中，高能量源是超声发生器。

在一些实施例中，高能量源是均化器。

在一些实施例中，使组合物经受至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、15次、20次、25次、30次、50次或100次高剪切力。在一些实施例中，使组合物经受1次到5次、6次到10次、11次到15次、16次到20次、21次到30次、31次到40次、41次到50次、51次到60次、61次到70次、71次到80次、81次到90次或91次到100次高剪切力。在一些实施例中，使组合物经受3次、6次或10次高剪切力。

在某些实施例中，纳米悬浮液颗粒的大小范围为约1nm到450nm，如小于约400nm或小于约200nm。

如本文所描述的，水性配制品可以进一步与铝盐混合。

如本文所描述的，水性配制品可以进一步与抗原混合。

如本文所描述的，水性配制品可以进一步与铝盐和抗原混合。

本公开提供由上述方法中任一种方法制成的产品。

本公开提供由以下方法制成的纳米悬浮液组合物：

本公开提供由上述步骤(a)到步骤(d)制成的纳米悬浮液组合物，所述步骤进一步包括将纳米悬浮液组合物与铝盐混合；将纳米悬浮液组合物与抗原混合；或者将纳米悬浮液组合物与铝盐和抗原混合。

试剂

本文提供的水性配制品可以进一步包括一种或多种试剂，其中所述试剂可以是多肽、多核苷酸、抗原、佐剂、诊断剂、治疗剂、生物体、基因组或病毒。在一些实施例中，水性配制品包括两种或更多种试剂。在一些实施例中，试剂与水性配制品缔合。在一些实施例中，试剂通过配体交换和/或通过静电(基于电荷的)相互作用与水性配制品缔合。

多肽

在一些实施例中，试剂是多肽。在一些实施例中，多肽是全长蛋白或其片段。在一些实施例中，多肽是肽。在一些实施例中，多肽是融合蛋白。在一些特定实施例中，融合蛋白在向个体施用时能够诱发免疫应答。在一些实施例中，多肽是抗原，如以下进一步描述的。

抗原

在一个实施例中，试剂包括抗原。

在一些实施例中，多肽抗原涉及或衍生自过敏、癌症或感染性疾病。

在一些实施例中，本文描述的组合物用于疫苗接种目的，并且被提供为疫苗配制品(疫苗组合物)。

抗原可以是任何靶表位、分子(包含生物分子)、分子络合物(包含含有生物分子的分子络合物)、亚细胞组装体、期望针对其诱发或增强受试者的免疫应答性的细胞或组织。经常，术语抗原将指关注的多肽抗原。然而，如本文所使用的，抗原还可以指编码关注的多肽抗原的重组构建体(例如，表达构建体)。在某些实施例中，抗原可以是或可以衍生自以下各项或者可以与其发生免疫交叉反应：感染性病原体和/或表位、生物分子、与感染、癌症、自身免疫性疾病、过敏、哮喘或刺激抗原特异性免疫应答将是期望的或有益的任何其它病况相关联的细胞或组织。

某些实施例设想衍生自至少一种感染性病原体的抗原，所述至少一种感染性病原体如细菌、病毒或真菌，包含：放线菌，如结核分枝杆菌或麻风分枝杆菌或另一种分支杆菌；细菌，如沙门氏菌、奈瑟氏球菌、包柔氏螺旋体、衣原体或博代氏杆菌的成员；病毒，如单纯性疱疹病毒、人体免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、肝炎病毒、EB病毒、呼吸道合胞体病毒、人乳头状瘤病毒(HPV)和巨细胞病毒；HIV，如HIV-1或HIV-2；真菌，如曲霉菌、芽生菌、球孢子菌和肺孢子菌或酵母菌，包含念珠菌属，如白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌；寄生虫，如原生动物，例如疟原虫属，包含恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫；或另一种寄生虫，如以下一种或多种：棘阿米巴、溶组织内阿米巴、管圆线虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、日本血吸虫、隐孢子虫、钩虫、溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴、迪斯帕内阿米巴、哈氏内阿米巴、波氏内阿米巴、班氏线虫、贾第虫和利什曼虫。在特定实施例中，抗原可以形成涉及结核病、流感、阿米巴病、HIV、肝炎或利什曼病的抗原或与其有关。

在一些实施例中，抗原是阿米巴病相关抗原。在一些实施例中，抗原是阿米巴病引起的抗原。在一些实施例中，抗原来自阿米巴病引起的生物体。在一些实施例中，抗原来自溶组织内阿米巴。在一个实施例中，抗原包括LecA。在一个实施例中，抗原是LecA。

在一些实施例中，抗原是流感相关抗原。在一些实施例中，抗原是流感引起的抗原。在一些实施例中，抗原来自流感引起的病毒。在一个实施例中，抗原包括H5N1。在一个实施例中，抗原包括H5N1。

例如，在某些实施例中，抗原衍生自包柔氏螺旋体属，抗原可以包含核酸、病原体衍生抗原或抗原制剂、重组产生的蛋白质或肽、以及嵌合融合蛋白。一个这种抗原是OspA。OspA可以是借助于其在宿主细胞中的生物合成的呈脂化形式的完全成熟蛋白质(Lipo-OspA)或者可以可替代地是非脂化衍生物。这种非脂化衍生物包含具有流感病毒的非结构蛋白的第一81个N-末端氨基酸(NS1)的非脂化NS1-OspA融合蛋白和完整OspA蛋白质，并且另一个MDP-OspA是非脂化形式的携带3个附加N-末端氨基酸的OspA。

在某些实施例中，抗原衍生自病毒如衍生自HIV-1(如tat、nef、gp120或gp160)、人类疱疹病毒如gD、或其衍生物、或即刻早期蛋白如来自HSV1或HSV2的ICP27、巨细胞病毒(尤其人类)(如gB或其衍生物)、轮状病毒(包含减毒活病毒)、EB病毒(如gp350或其衍生物)、水痘带状疱疹病毒(如gpl、II和IE63)、或衍生自肝炎病毒如乙型肝炎病毒(例如，乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒、或衍生自其它病原病毒如副粘病毒：呼吸道合胞体病毒(如F和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头状瘤病毒(例如，HPV6、11、16、18等)、黄病毒(例如，黄热病毒、登革病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒)、或流感病毒(全活病毒或灭活病毒)、裂解流感病毒、鸡蛋中生长的细胞或MDCK细胞、或完整流感病毒(如由Gluck，《疫苗(Vaccine)》，1992,10,915-920中所描述的)、或其纯化或重组蛋白如HA、NP、NA或M蛋白、或其组合)。

在某些其它实施例中，抗原衍生自一种或多种细菌病原体，如奈瑟氏球菌属，包含淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌(例如，荚膜多糖及其缀合物、转铁结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PilC、黏附素)；酿脓链球菌(例如，M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸)、无乳链球菌、变形链球菌：杜克嗜血杆菌；莫拉菌属，包含卡他莫拉菌，其也被称为粘膜炎布兰汉球菌(例如，高分子量和低分子量黏附素和侵袭素)；博德特氏菌属，包含百日咳博德特氏菌(例如，百日咳杆菌粘附素、百日咳毒素或其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌；分支杆菌属，包含肺结核分支杆菌(例如，ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌；军团菌属，包含嗜肺军团菌；埃希氏杆菌属，包含肠毒性大肠杆菌(例如，定居因子、不耐热肠毒素或其衍生物、耐热性肠毒素或其衍生物)、肠出血性大肠肝菌、肠致病性大肠杆菌(例如，志贺样毒素或其衍生物)；弧菌属，包含霍乱弧菌(例如，霍乱毒素或其衍生物)；志贺菌属，包含索氏志贺菌、痢疾志贺菌、弗氏志贺菌；耶尔森菌属，包含小肠结肠炎耶尔森菌(例如，Yop蛋白)、鼠疫耶尔森菌、假结核病耶尔森菌；弯曲菌属，包含空肠弯曲菌(例如，毒素、黏附素和侵袭素)和大肠弯曲菌；沙门氏菌属，包含伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌；李斯特菌属，包含产单核细胞李斯特菌；螺杆菌属，包含幽门螺杆菌(例如，尿素酶、过氧化氢酶、空泡毒素)；假单胞菌属，包含铜绿假单胞菌；葡萄球菌属，包含金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；肠球菌属，包含粪肠球菌、屎肠球菌；梭菌属，包含破伤风梭菌(例如，破伤风毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(例如，肉毒毒素及其衍生物)、艰难梭菌(例如，梭菌毒素A或B及其衍生物)；芽孢杆菌属，包含炭疽芽孢杆菌(例如，肉毒杆菌毒素及其衍生物)；棒状杆菌属，包含白喉棒状杆菌(例如，白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋体属，包含伯氏疏螺旋体(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、伽氏疏螺旋体(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、埃氏疏螺旋体(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、安德森疏螺旋体(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫姆斯疏螺旋体；埃立克体属，包含马埃立克体和人粒细胞埃立克体病的药剂；立克次氏体，包含立氏立克次体；衣原体属，包含沙眼衣原体(例如，MOMP、肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(例如，MOMP、肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体；钩端螺旋体属，包含肾脏钩端螺旋体；密螺旋体属，包含苍白密螺旋体(例如，罕见外膜蛋白)、齿垢密螺旋体、痢疾密螺旋体；或其它细菌病原体。

在某些其它实施例中，抗原衍生自一种或多种寄生虫(例如参见John,D.T.和Petri,W.A.、Markell和Voge的《(医学寄生虫学(Medical Parasitology)》-第9版，2006年，WB Saunders，费城；Bowman,D.D.，《兽医寄生虫学(Georgis'Parasitology forVeterinarians)》-第8版，2002年，WB Saunders，费城)，如疟原虫属，包含恶性疟原虫；弓形虫属，包含刚地弓形虫(例如，SAG2、SAG3、Tg34)；内阿米巴属，包含溶组织内阿米巴；巴贝虫属，包含果氏巴贝虫；锥体虫属，包含冈比亚布氏锥虫；贾第虫属，包含兰伯氏贾第虫；利什曼虫属，包含硕大利什曼原虫；肺囊虫属，包含卡氏肺囊虫；毛滴虫属，包含阴道毛滴虫；或者衍生自能够感染哺乳动物的蠕虫，如：(i)线虫感染(包含但不限于蠕形住肠线虫、人蛔虫、毛首鞭形线虫、美洲板口线虫、十二指肠钩虫、班氏吴策线虫、马来丝虫、盘尾丝虫、麦地那龙线虫、旋毛虫和粪类圆线虫)；(ii)吸虫感染(包含但不限于曼氏裂体吸虫、埃及裂体吸虫、日本裂体吸虫、湄公血吸虫、华支睾吸虫、并殖吸虫属、肝片吸虫、大拟片吸虫、大片吸虫)；以及(iii)绦虫感染(包含但不限于牛带绦虫和猪带绦虫)。在某些实施例中，抗原衍生自血吸虫属、曼氏裂体吸虫、埃及裂体吸虫和/或日本裂体吸虫，或者衍生自酵母菌如念珠菌属，包含白色念珠菌；隐球菌属，包含新型隐球菌。

其它特异性抗原衍生自结核分枝杆菌，例如Th Ral2、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)。针对结核分枝杆菌的蛋白质还包含融合蛋白及其变体，其中结核分枝杆菌的至少两个、三个或四个或更多个多肽融合到更大蛋白质中。某些融合包含Ra12-TbH9-Ra35、Erdl4-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erdl4-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO 99151748)。可以使用的其它抗原包含US 2010/0129391和WO 2008/124647中描述的抗原、抗原组合和融合蛋白。在一个示例性实施例中，融合蛋白是ID93。在一个示例性实施例中，融合蛋白是ID91。

其它特异性抗原衍生自衣原体并且包含例如高分子量蛋白质(HWMP)(WO 99/17741)、ORF3(EP 366 412)和假定膜蛋白质(Pmp)。其它衣原体抗原可以选自WO 99128475中描述的组。某些抗原可以衍生自链球菌属，包含肺炎链球菌(例如，荚膜多糖及其缀合物、PsaA、PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白)和蛋白质抗原肺炎球菌溶血素(《生物化学与生物物理学学报(Biochem Biophys Acta)，1989,67,1007；Rubins等人，《微生物发病机理(Microbial Pathogenesis)，25,337-342)及其突变体去毒衍生物(WO 90/06951；WO99/03884)。其它细菌疫苗包括衍生自嗜血杆菌属的抗原，所述嗜血杆菌属包含B型流感嗜血杆菌(例如，PRP及其缀合物)、不可分型的流感嗜血杆菌例如OMP26、高分子量黏附素、P5、P6、D蛋白和D脂蛋白、以及丝束蛋白和衍生自肽(美国专利号5,843,464)的丝束蛋白或其多拷贝变体或融合蛋白。

其它特异性抗原衍生自B型肝炎。B型肝炎表面抗原的衍生物是本领域众所周知的并且尤其包含欧洲专利申请EP-A414 374；EP-A-0304 578和EP 198474中阐述、描述的那些PreS1、Pars2S抗原。在一方面，抗原是HIV-1gp120，尤其当在CHO细胞中表达时。在另外的实施例中，抗原是gD2t。

在其它实施例中，抗原衍生自人乳头状瘤病毒(HPV)，所述HPV被认为负责生殖器疣(HPV 6或HPV 11以及其它)，并且HPV病毒负责宫颈癌(HPV16、HPV18以及其它)。特定抗原包含L1颗粒或衣壳体、以及包括选自HPV 6和HPV 11蛋白E6、E7、L1和L2的一种或多种抗原的融合蛋白。某些形式的融合蛋白包含如WO 96/26277中公开的L2E7和GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)中公开的蛋白D(1/3)-E7。附加的可能抗原包含HPV 16或18抗原。例如，L1或L2抗原单体、或L1或L2抗原作为病毒样颗粒(VLP)一起呈现，或者单独的L1蛋白单独呈现在VLP或衣壳体结构中。这种抗原、病毒样颗粒和衣壳体是本身已知的。参见例如WO 94/00152、WO 94/20137、WO 94/05792和WO93/02184。

在其它实施例中，抗原是融合蛋白。融合蛋白可以单独包含或作为融合蛋白如例如E7、E2或F5；具体实施例包含包括L1E7融合蛋白(WO 96/11272)的VLP。特定HPV 16抗原包括早期蛋白E6或F7，其与蛋白D载剂融合以形成来自HPV 16的蛋白D-E6或E7融合物或其组合；或E6或E7与L2的组合(WO 96/26277)。可替代地，HPV 16或18早期蛋白E6和E7可以呈现为单个分子，例如蛋白D-E6/E7融合物。组合物可以任选地包含例如呈蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白的形式的来自HPV 18的E6和E7蛋白中的任一者或两者。组合物另外可以包括来自其它HPV菌株的抗原，例如来自菌株HPV 31或33。

抗原还可以衍生自引起疟疾的寄生虫。例如，来自恶性疟原虫的抗原包含RTS,S和TRAP。RTS是杂合蛋白，所述杂合蛋白包括恶性疟原虫的环子孢子(CS)蛋白的基本上所有C-末端部分，所述C-末端部分通过B型肝炎表面抗原的preS2部分的四个氨基酸与B型肝炎病毒的表面(S)抗原连接。公开为WO93/10152的要求英国专利申请号9124390.7的优先权的国际专利申请号PCT/EP92/02591中公开了其完整结构。当在酵母菌中表达时，RTS作为脂蛋白颗粒被产生，并且当与来自HBV的S抗原共表达时，其产生混合的颗粒，被称为RTS,S。

被公开为WO 90/01496的国际专利申请号PCT/GB 89/00895中描述了TRAP抗原。本发明的实施例是疟疾疫苗，其中抗原性制备包括RTS,S和TRAP抗原的组合。可能候选为多级疟疾疫苗的组分的其它疟原虫抗原是恶性疟原虫MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、钳合蛋白、PfEMPl、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27125、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230和疟原虫属中的其类似物。

在一个实施例中，抗原衍生自癌症细胞，如可以用于对癌症的免疫治疗。例如，抗原可以是肿瘤排斥抗原，如针对前列腺、乳房、结肠直肠、肺、胰腺、肾或黑色素瘤癌症的那些肿瘤排斥抗原。示例性癌症或癌细胞衍生的抗原包含MAGE 1、3和MAGE 4或其它MAGE抗原，如WO99/40188中公开的那些抗原、PRAME、BAGE、Lage(也被称为NY Eos 1)、SAGE和HAGE(WO 99/53061)或GAGE(Robbins and Kawakami，1996，《免疫学前沿观点(CurrentOpinions in Immunology)》，第8版，第628到636页；Van den Eynde等人，《国际临床和实验室研究杂志(International Journal of Clinical&Laboratory Research)(1997年和1998年)；Correale等人(1997)，《美国国家癌研究所杂志(Journal of the NationalCancer Institute)》，第89版，第293页。癌症抗原的这些非限制性实例表达于广泛范围的肿瘤类型中，如黑色素瘤、肺癌、恶性毒瘤和膀胱癌。参见例如美国专利号6,544,518。

其它肿瘤特异性抗原包含但不限于：用于治疗许多癌症的肿瘤特异性或肿瘤相关神经节苷脂，如GM2和GM3或其针对载剂蛋白的缀合物；或自身肽激素，如全长促性腺激素释放激素(GnRH，WO 95/20600)、10个氨基酸长的短肽。在另一个实施例中，使用了前列腺抗原，如前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、PSCA(例如，《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》，95(4)1735-1740 1998)、PSMA，或在一个实施例中被称为前列腺的抗原(例如，Nelson等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》(1999)96:3114-3119；Ferguson等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，1999，96,3114-3119；WO 98/12302；美国专利号5,955,306；WO 98/2,0117；美国专利号5,840,871和5,786,148；WO 00/04149。其它前列腺特异性抗原是从WO98/137418和WO/004149中已知的。另一个是STEAP(PNAS 96 14523 145287-12 1999)。

用于本发明的上下文中的其它肿瘤相关抗原包含：Plu-1(《生物化学杂志(J BiolChem.)》274(22)15633-15645,1999)，HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon等人，《生物测定(Bioessays)》199,21:61-70，美国专利号5,654,140)和Criptin(美国专利号5,981,215)。此外，尤其与癌症疗法的疫苗相关的抗原还包括酪氨酸酶和生存素。

在某些实施例中，本公开的组合物将特别适用于治疗老年人和/或免疫抑制患者，包含进行肾透析的受试者、进行化学治疗和/或放射治疗的受试者、移植受者等等。此类个体对疫苗通常展现出减少的免疫应答，并且因此，使用本公开的组合物可以增强在这些受试者中实现的免疫应答。

在其它实施例中，本发明的组合物中使用的药剂包含与呼吸性疾病相关联的抗原，如因细菌感染(例如，肺炎球菌感染)引起或加剧的那些呼吸性疾病，以用于预防和治疗如慢性阻塞性肺病(COPD)等病状。COPD在生理学上由患有慢性支气管炎和/或肺气肿的患者的不可逆或部分可逆气道阻塞的存在来定义(《美国呼吸与重症护理医学杂志(Am JRespir Crit Care Med.)》，1995年11月；152(5Pt 2):S77-121)。COPD的加重通常由细菌(例如，肺炎球菌)感染(《临床微生物综述(Clin Microbiol Rev.)》，2001年4月；14(2):336-63)引起。

多核苷酸

在一些实施例中，试剂是多核苷酸。多核苷酸包含但不限于DNA、RNA、适体和寡核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸是DNA。在一些实施例中，多核苷酸是RNA。在一些实施例中，DNA或RNA是单链或双链的。在一些实施例中，多核苷酸是非编码RNA。在一些实施例中，多核苷酸是编码RNA。在一些实施例中，所述RNA选自由复制子RNA、mRNA、tRNA、siRNA、shRNA和微小RNA组成的组。

在一些实施例中，多核苷酸对多肽进行编码。在一些实施例中，多核苷酸对多肽进行编码，所述多肽是抗原或包括抗原。在一些实施例中，由多核苷酸编码的多肽是融合蛋白。在一些实施例中，由多核苷酸编码的多肽是LecA。在一些实施例中，由多核苷酸编码的多肽是H5N1。在一些实施例中，由多核苷酸编码的多肽是TD93。

在一些实施例中，多核苷酸是复制子。在一些实施例中，复制子是能够在其自身的控制下极大地复制的质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或病毒。在一些实施例中，复制子是RNA或DNA。在一些实施例中，复制子是单链或双链的。在一些实施例中，复制子衍生自RNA病毒。

佐剂

在一些实施例中，除了TLR激动剂之外，本文提供的组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述佐剂选自由以下组成的组：AS-2、单磷酰脂质A、3-脱O-酰化单磷酰脂质A、IFA、QS21、CWS、TOM、AGP、含CpG寡核苷酸、Toll样受体(TLR)激动剂、Leif、皂苷、皂苷模拟物、生物和合成脂质A、咪喹莫特、加喹莫特(gardiquimod)、瑞喹莫德、聚I:C、鞭毛蛋白、GLA、SLA、STING、以及其组合。

生物体

在一些实施例中，本文提供的组合物包括生物体。例如，溶组织内阿米巴、流感引起的病毒或引起结核病(TB)的细菌结核分枝杆菌。当前，使用活菌的疫苗接种是用于诱导针对结核病的保护性免疫的最有效方法。用于此目的的最常见的分支杆菌是卡介苗(BCG)、牛结核分支杆菌的减毒株。因此，在一些实施例中，组合物包括分支杆菌。

在一些实施例中，药剂是病毒或病毒基因组。因此，在这些实施例中，组合物包括病毒或病毒基因组。

TLR激动剂

如本文所描述的，本公开的某些实施例设想组合物和免疫学佐剂组合物，其包含药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种Toll样受体激动剂(TLR激动剂)。Toll样受体(TLR)包含先天免疫系统的细胞表面跨膜受体，所述细胞表面跨膜受体将早期识别能力赋予如可能存在于大量感染性病原体中或上的多种保守微生物分子结构的宿主细胞，(例如，Armant等人，2002年，《基因组生物学(Genome Biol.)》3(8):综述3011.1-3011.6；Fearon等人，1996年，《科学(Science)》272:50；Medzhitov等人，1997年，《免疫学新观点(Curr.Opin.Immunol)》9:4；Luster，2002年，《免疫学新观点(Curr.Opin.Immunol)》14:129；Lien等人，2003年，《自然免疫学《Nat.Immunol.)》4:1162；Medzhitov，2001年，《免疫学自然评论(Nat.Rev.Immunol.)》1:135；Takeda等人，2003年，《免疫学年度评论(Ann RevImmunol.)》21:335；Takeda等人，2005年，《国际免疫杂志(Int.Immunol.)》17:1；Kaisho等人，2004年，《微生物与感染(Microbes Infect.)》6:1388；Datta等人，2003年，《免疫学杂志(J.Immunol.)》170:4102)。

诱导TLR介导的信号转导以加强通过先天免疫系统发起免疫应答受接合细胞表面TLR的TLR激动剂的影响。例如，脂多糖(LPS)可以是通过TLR2或TLR4的TLR激动剂(Tsan等人，2004年，《白细胞生物学杂志(J.Leuk.Biol.)》76:514；Tsan等人，2004年，《美国生理学-细胞生理学杂志(Am.J.Physiol Cell Phsiol.)》286:C739；Lin等人，2005年，《休克(Shock)》24:206；聚(肌苷-胞苷)(聚:C)可以是通过TLR3的TLR激动剂(Salem等人，2006年，《疫苗(Vaccine)》24:5119)；肽聚糖可以是TLR2和/或TLR6激动剂(Soboll等人，2006年，《繁殖生物学(Biol.Reprod.)》75:131；Nakao等人，2005年，《免疫学杂志(J.Immunol.)》174:1566)；来自明尼苏达州圣保罗的3M Pharmaceuticals的分子量为318Da的3M003(4-氨基-2-(甲基丙烯酸)-α,α-二甲基-6,7,8,9-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇水合物，其还是相关组分3M001和3M002的来源；Gorden等人，2005年，《免疫学杂志(J.Immunol.)》174:1259)可以是TLR7激动剂(Johansen，2005年，《临床实验过敏症(Clin.Exp.Allerg.)》35:1591和/或TLR8激动剂(Johansen，2005年)；鞭毛蛋白可以是TLR5激动剂(Feuillet等人，2006年，《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》103:12487)；并且C型肝炎可以用作通过TLR7和/或TLR9的TLR激动剂(Lee等人，2006年，《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》103:1828；Horsmans等人，2005年，《肝脏病学(Hepatol.)》42:724)。其它TLR激动剂是已知的(例如，Schirmbeck等人，2003年，《免疫学杂志(J.Immunol.)》171:5198)并且可以根据当前描述的某些实施例使用。

在各种实施例中，所述TLR激动剂可以是TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂、TLR9激动剂或其组合。

重组表达构建体

根据本文中公开的某些实施例，本文中描述的组合物可以含有至少一种重组表达构建体，所述重组表达构建体包括启动子，所述启动子与对抗原进行编码的核酸序列可操作地连接。在某些另外的实施例中，重组表达构建体存在于病毒载体中，如腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒或逆转录病毒载体。用于制作和使用这种表达构建体和载体的组合物和方法是本领域已知的，如表达如本文中提供的多肽，例如根据Ausubel等人，(编辑)，《当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology)》，2006，John Wiley&Sons，纽约。通常可以在例如美国专利号6,844,192；7,037,712；7,052,904；7,001,770；6,106,824；5,693,531；6,613,892；6,875,610；7,067,310；6,218,186；6,783,981；7,052,904；6,783,981；6,734,172；6,713,068；5,795,577和6,770,445以及其它地方找到重组表达构建体的非限制性实例，其中可以适于表达如本文中提供的多肽抗原的教导用于某些当前公开的实施例中。

免疫应答

本公开因此提供了用于更改(例如，以统计学上显著的方式例如相对于如对于本领域技术人员将熟悉的适当对照物增加或减少)能够产生免疫应答的宿主的免疫应答的组合物。如本领域普通技术人员将知道的，免疫应答可以是宿主的免疫状态的任何主动变更，所述主动变更可以包含参与宿主免疫状态的维护和/或调节的一个或多个组织、器官、细胞或分子的结构或功能的任何变更。通常，免疫应答可以通过各种熟知的参数中的任何参数检测到，包含但不限于以下的体内或体外确定：可溶免疫球蛋白或抗体；如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等可溶介体以及其它可溶小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介体；如通过免疫系统的细胞的更改的功能或结构性质确定的细胞活化状态变化，例如细胞增殖、更改的能动性、如特异性基因表达或细胞溶解行为等特异化活动的诱导；免疫系统的细胞的细胞分化，包含更改的表面抗原表达谱或细胞凋亡(程序性细胞死亡)的发生；或可以检测到免疫应答的任何其它标准。

免疫应答通常可以例如被宿主免疫系统的细胞和组织看作自身结构与非自身结构之间在分子或细胞等级的区别，但是本公开不应如此限制。例如，免疫应答还可以包含由自身分子、细胞或组织的免疫识别产生的免疫系统级变化，如可能伴随任何数量的正常状况，如免疫系统组分的典型调节，或者如可能存在于病理状况中，如在自动免疫和退行性疾病中观察到的不适当的自动免疫应答。作为另一个实例，除了通过上调特定免疫系统活性(如抗体和/或细胞因子产生或激活细胞介导的免疫)来诱导之外，免疫应答还可以包含可能是所选抗原的结果、抗原施用的途径、特异性耐受性诱导或其它因素的抑制、衰减或对可检测免疫的任何其它下调。

可以通过本领域普通技术人员将容易熟悉的多个熟知的免疫学测定中的任何测定来建立对由本公开的组合物诱导的免疫应答的确定。此类测定包含但不限于以下的体内或体外确定：可溶抗体；如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等可溶介体以及其它可溶小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介体；如通过免疫系统的细胞的更改的功能或结构性质确定的细胞活化状态变化，例如细胞增殖、更改的能动性、如特异性基因表达或细胞溶解行为等特异化活动的诱导；免疫系统的细胞的细胞分化，包含更改的表面抗原表达谱或细胞凋亡(程序性细胞死亡)的发生。用于执行这些和类似测定的过程是广泛已知的并且可以见于例如Lefkovits(《免疫学方法手册：综合技术资料(Immunology MethodsManual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques)》，1998；还参见《免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)；还参见例如Weir，《实验免疫学手册(Handbookof Experimental Immunology)》，1986，布莱克威尔科学出版社(Blackwell Scientific)，波士顿(Boston)，马萨诸塞州(MA)；Mishell和Shigii(编辑)《细胞免疫学选定方法(Selected Methods in Cellular Immunology)》，1979，费里曼出版社(FreemanPublishing)，旧金山(San Francisco)，加利福尼亚州(CA)；Green和Reed，1998，《科学(Science)》，281:1309以及其中引用的参考文献)。

可以通过各种已知技术来完成对抗原反应性T细胞的增殖的检测。例如，可以通过测量DNA合成速率来检测T细胞增殖，并且可以通过控制候选抗原反应性T细胞所暴露的刺激物(如例如，呈现细胞的、特异性期望抗原或对照抗原脉冲的抗原)来确定抗原特异性。已经受刺激发生增殖的T细胞展现出增加的DNA合成速率。用于测量DNA合成速率的典型式是例如通过用氚化胸腺嘧啶来脉冲标记T细胞的培养物，所述氚化胸腺嘧啶是并入新合成的DNA中的核苷前体。可以使用液体闪烁分光光度计来确定合并的氚化胸腺嘧啶的量。用于检测T细胞增殖的其它方式包含测量白介素-2(IL-2)产量、Ca2+流量或上染率的增加，如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-联苯-四唑。可替代地，可以测量淋巴因子(如干扰素-γ)的合成，或者可以量化可以对特定抗原进行应答的T细胞的相对数量。

可以例如通过测定使用如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、平衡渗析法或者包含蛋白质印迹法的固相免疫印迹法等体外方法用根据本公开的疫苗治疗的宿主的样本(例如，含免疫球蛋白样本，如血清、血浆和血液)来实现对抗原特异性抗体产生的检测。在优选实施例中，ELISA测定可以进一步包含用对抗原具有特异性的固相单克隆抗体来对靶抗原进行抗原捕获固定例如以增强测定的灵敏度。还可以例如使用可从商业来源(例如，Sigma公司，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO)；还参见《R&D Systems公司2006年目录(R&D Systems 2006Catalog)》，R&D Systems公司，明尼阿波里斯市(Minneapolis)，明尼苏达州(MN))容易获得的方法、设备和试剂、通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来容易地确定对可溶介体(例如，细胞因子、趋化因子、淋巴因子、前列腺素)的精化。

可以使用本领域所熟知的常规测定来监测任何数量的其它免疫学参数。这些常规测定可以包含例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定、第二抗体体外应答、使用已经建立的标志物抗原系统对各种外周血或淋巴单核细胞亚群的流式免疫细胞荧光分析、免疫组织化学或其它相关测定。这些和其它测定可以见于例如Rose等人(编辑)，《临床实验室免疫学手册(Manual of Clinical Laboratory Immunolog)第5版》，1997，美国微生物学学会(American Society of Microbiology)，华盛顿特区(Washington,DC)。

因此，设想的是，本文所提供的疫苗和佐剂组合物将能够引发或增强宿主的选自以下的至少一个免疫应答：Th1型T淋巴细胞应答、Th2型T淋巴细胞应答、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答、抗体应答、细胞因子应答、淋巴因子应答、趋化因子应答以及炎症应答。在某些实施例中，免疫应答可以包括以下中的至少一种：产生一个或多个细胞因子，其中细胞因子选自干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；产生一个或多个白介素，其中白介素选自IL-1、1L-2、1L-3、1L-4、1L-6、1L-8、1L-10、IL-12、ID-13、IL-16、IL-18和IL-23；产生一个或多个趋化因子，其中趋化因子选自MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL4和CCL5；以及选自记忆T细胞、记忆B细胞、效应子T细胞应答、细胞毒性T细胞应答和效应子B细胞应答的淋巴细胞应答。参见例如WO94/00153；WO 95/17209；WO 96/02555；U.S.6,692,752；U.S.7,084,256；U.S.6,977,073；U.S.6,749,856；U.S.6,733,763；U.S.6,797,276；U.S.6,752,995；U.S.6,057,427；U.S.6,472,515；U.S.6,309,847；U.S.6,969,704；U.S.6,120,769；U.S.5,993,800；U.S.5,595,888；Smith等人，1987，《生物化学杂志(J Biol Chem.)》262:6951；Kriegler等人，1988，《细胞(Cell)》53:45 53；Beutler等人，1986，《自然(Nature)》320:584；U.S.6,991,791；U.S.6,654,462；U.S.6,375,944。

药物组合物

本文中提供了包括本文中描述的组合物的药用组合物(包含个组合物)。在一些实施例中，组合物进一步包括药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。在一些实施例中，药物组合物是疫苗组合物。可以向受试者施用本文中描述的组合物以刺激受试者的免疫应答(包含非特异性应答和抗原特异性应答)。在一些实施例中，受试者是哺乳动物(例如，包含农场动物(牛、猪、山羊、马等)的动物和宠物(猫、狗等)或人类)。在一个实施例中，所述受试者是人。在另一个实施例中，所述受试者是非人类哺乳动物。在另一个实施例中，所述非人类哺乳动物是狗、牛或马。在一些实施例中，受试者是恒温动物。

药物组合物通常包括本文中描述的组合物并且可以进一步包括如本文中提供的选自与药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂组合的抗原、附加TLR激动剂或重组表达构建体的一种或多种组分。

因此，在某些方面，本公开涉及TLR7/8激动剂或TLR4激动剂“单一疗法”，其中如本文所描述的，TLR7/8激动剂或TLR4激动剂被配制在组合物中，所述组合物基本上缺乏其它抗原并且施用给受试者以刺激免疫应答例如非特异性免疫应答或抗原特异性免疫应答，以便诊断、治疗或预防疾病或其它病症，如生物体感染。在其它方面，本公开涉及组合物中的TLR7/8激动剂或TLR4激动剂，所述组合物基本上缺乏其它抗原并且施用给受试者以刺激免疫应答例如非特异性免疫应答或抗原特异性免疫应答，以便治疗或预防疾病或其它病症，如生物体感染。在一个实施例中，例如，本公开的组合物和方法用于刺激受试者的免疫应答。在另一个实施例中，GLA采用喷雾形式，任选地提供在试剂盒中。

在某些其它实施例中，药物组合物是疫苗组合物，所述疫苗组合物包括本文中描述的组合物和抗原，并且可以进一步包括如本文中提供的与药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂组合且选自其它TLR激动剂等和/或重组表达构建体的一种或多种组分。说明性载剂在所用的剂量和浓度下将对接受者无毒。

说明性载剂在所用的剂量和浓度下将对接受者无毒。对于包括TLR7/8激动剂或TLR4激动剂加抗原的疫苗，将按约0.01μg/kg体重到约100μg/kg体重施用，通常通过皮内、皮下、肌肉内或静脉内途径或通过其它途径施用。

优选的剂量为约1μg/kg到约1mg/kg，其中5μg/kg到约200μg/kg是特别优选的。对于本领域技术人员显而易见的是，施用的数量和频率将取决于主体的应答。治疗使用的“药学上可接受的载剂”是制药领域众所周知的并且描述于例如《雷明顿药物科学(Remingtons Pharmaceutical Sciences)》，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑，1985)。例如，可以使用生理pH下的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂。例如，苯甲酸钠、山梨酸以及邻羟基苯甲酸的酯类可以作为防腐剂而被添加。以1449进行皮内注射。此外，可以皮内注射使用抗氧化剂和悬浮剂。

“药学上可接受的盐”是指本发明实施例的衍生自这种化合物和有机酸或无机酸(酸加成盐)或有机碱或无机碱(碱加成盐)的组合的化合物的盐。本发明实施例的组合物可以以游离碱或游离盐的形式使用，其中这两种形式被认为在本发明实施例的范围内。

药物组合物可以呈允许组合物施用给患者的任何形式。例如，组合物可以呈固体、液体或气体(气溶胶)的形式。典型的施用途径包含但不限于口服、局部、肠胃外(例如，舌下或经颊)、舌下、直肠、阴道和鼻内(例如，作为喷雾)。如本文中使用的术语肠胃外包含：离子电渗注射(例如，美国7,033,598；7,018,345；6,970,739)、超声促渗注射(例如，美国4,780,212；4,767,402；4,948,587；5,618,275；5,656,016；5,722,397；6,322,532；6,018,678)、热注射(例如，美国5,885,211；6,685,699)、被动经皮注射(例如，美国3,598,122；3,598,123；4,286,592；4,314,557；4,379,454；4,568,343；5,464,387；英国专利说明书号2232892；美国6,871,477；6,974,588；6,676,961)、微针注射(例如，美国6,908,453；5,457,041；5,591,139；6,033,928)和射流注射施用以及还有皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内、海绵窦内、鞘内、道内、尿道内注射或输注技术。在具体实施例中，如本文中描述的组合物(包含疫苗和药物组合物)通过选自离子电渗法、微空化、超声促渗法或微针的技术皮内施用。

药物组合物可以被配制成允许其中含有的有效成分在将组合物施用给患者时是生物可利用的。将施用给患者的组合物采用一个或多个剂量的形式，其中例如，片剂可以是单个剂量单位，并且本公开的呈气溶胶形式的一种或多种化合物的容器可以容纳多个剂量单位。

对于口服施用，赋形剂和/或粘合剂可以存在。实例是蔗糖、高岭土、淀粉糊精、海藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素。着色剂和/或调味剂可以存在。可以采用涂层壳。

组合物可以呈液体的形式，例如酏剂、糖浆剂、溶液、乳剂或悬浮液。作为两个实例，液体可以用于口服施用或用于通过注射递送。当旨在用于口服施用时，优选组合物含有甜味剂、防腐剂、染料/色素和增味剂中的一种或多种。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。

如本文中使用的不论呈溶液形式、悬浮液形式还是呈其它类似形式的液体药物组合物可以包含以下载剂或赋形剂中的一种或多种：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、优选地生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、固定油如角鲨烯、角鲨烯、矿物油、失水甘露糖醇单油酸酯、胆固醇和/或可以用作溶剂或悬浮媒体的合成单甘油酯或二甘油酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如醋酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐以及用于张度调节的药剂如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。

在另一个实施例中，本公开的组合物以可以雾化的方式配制。

还可能期望在疫苗或药物组合物中包含其它组分，如递送媒剂，包含但不限于铝盐、油包水乳剂、可生物降解油媒剂、水包油乳剂、可生物降解微胶囊和脂质体。上文还描述了用于这种媒剂中的附加免疫刺激性物质(协佐剂)的实例并且其可以包含N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-异谷酰胺(MDP)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ干扰素和IL-12。

虽然本领域普通技术人员已知的任何适合的载剂可以用于本公开的药物组合物中，但是载剂的类型可以根据施用模式以及是否期望持续释放而变化。对于肠胃外施用如皮下注射，载剂优选地包括水、盐水、乙醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于口服施用，可以采用上述载剂或固体载剂中的任一种，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。可生物降解微球(例如，聚乳酸乳交酯)还可以用作本发明实施例的药物组合物的载剂。例如美国专利号4,897,268和5,075,109中公开了适合的可生物降解微球。在这方面，优选的是微球大于约25微米。

药物组合物还可以含有稀释剂如缓冲剂、抗氧化剂如抗坏血酸、低分子量(小于约10个残基)多肽、蛋白质、氨基酸、包含葡萄糖、蔗糖或糊精的碳水化合物、螯合剂如EDTA、谷胱甘肽、以及其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是适当的示例性稀释剂。优选地，产物可以使用作为稀释剂的适当的赋形剂溶液(例如，蔗糖)配制为冻干物。

如上文所描述的，在某些实施例中，本公开包含能够递送对期望抗原进行编码的核酸分子的组合物。这种组合物包含重组病毒载体(例如，逆转录酶病毒(参见WO 90/07936、WO 91/02805、WO 93/25234、WO 93/25698和WO94/03622)、腺病毒(参见Berkner，《生物技术(Biotechniques)》6:616-627,1988；Li等人，《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》4:403-409,1993；Vincent等人，《自然遗传学(Nat.Genet.)》5:130-134,1993；以及Kolls等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.USA)》91:215-219,1994)，痘病毒(参见美国专利号4,769,330；美国专利号5,017,487；和WO 89/01973))、与多聚阳离子分子络合的重组表达构建体核酸分子(参见WO 93/03709)、和与脂质体缔合的核酸(参见Wang等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.USA)》84:7851,1987)。在某些实施例中，DNA可以与杀伤的或失活的腺病毒连接(参见Curiel等人，《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》3:147-154,1992；Cotton等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.USA)》89:6094,1992)。其它适合的组合物包含DNA配体(参见Wu等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》264:16985-16987,1989)和脂质DNA组合(参见Feigner等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》84:7413-7417,1989)。

除了直接的体内过程之外，可以使用其中将细胞从宿主中去除、修饰并放置在相同或另一个宿主动物中的离体过程。将显而易见的是，人们可以在离体上下文中利用上文所指出的任何组合物将抗原编码的核酸分子引入到组织细胞中。病毒、物理和化学摄取方法的方案是本领域熟知的。

因此，本发明实施例可用于增强或引发宿主、患者或细胞培养物中的免疫应答。如本文所使用的，术语“患者”是指任何温血动物，优选地人。患者可能受感染性疾病、如乳腺癌等癌症或自身免疫性疾病折磨或者可以是正常的(即，无可检测疾病和/或感染)。“细胞培养物”是含有免疫系统的免疫活性细胞或分离细胞(包含但不限于T细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞和树突细胞)的任何制品。此类细胞可以通过本领域技术人员所熟知的各种技术中的任何技术进行分离(例如，聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度离心)。细胞可能(但不需要)从受癌症折磨的患者中分离，并且可以在治疗之后重新引入到患者中。

在某些实施例中，旨在用于肠胃外施用或口服施用的液体组合物应该含有使得将获得适合的剂量的疫苗组合物的量。通常，这个量是组合物中至少0.01wt％的抗原。当旨在用于口服施用时，这个量可以在组合物重量的0.1％与约70％之间变化。口服组合物可以含有介于约4％与约50％之间的抗原。优选组合物和制剂被制备成使得肠胃外剂量单位含有按重量计约0.01％与1％之间的活性组合物。

药物组合物可以旨在用于局部施用，在这种情况下，载剂可以适当地包括溶液、乳剂、乳膏或凝胶基质。例如，基质可以包括以下中的一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水和乙醇、以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的药物组合物中。如果旨在经皮使用，则所述组合物可以包含经皮贴片或电离子透入装置。局部配制品可以含有的抗原(例如，GLA抗原疫苗组合物)或GLA(例如，免疫佐剂组合物；GLA可从亚拉巴马州阿拉巴斯特的Avanti Polar Lipids,Inc.获得；例如，产品号699800)的浓度为约0.1％w/v到约10％w/v(每单位体积重量)。

所述组合物可以旨在以例如栓剂的形式直肠施用，所述栓剂将在直肠中融化并且释放药物。用于直肠施用的组合物可以含有油脂性基剂作为适当的无刺激性赋形剂。这种基剂包含但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。在本公开的方法中，疫苗组合物/佐剂可以通过使用一种或多种插入物、一种或多种珠粒、一种或多种定时释放配制品、一种或多种贴片或一种或多种速释配制品。

在某些实施例中，还设想了包括本文所描述的疫苗组合物和/或免疫佐剂组合物，所述组合物可以设置在一个或多个容器中。在一个实施例中，疫苗组合物和/或免疫佐剂的所有组分一起存在于单个容器中，但是实施例不旨在如此限制并且还设想了其中例如免疫佐剂组合物与抗原组分分离且不接触的两个或更多个容器。通过非限制性理论的方式，据信，在一些情况下，有益的是，可以执行仅施用免疫佐剂组合物，而在其它情况下，有益的是，此类施用可以与抗原的施用在时间上和/或空间上(例如，在不同的解剖部位)分开，而在再其它情况下，有益的是，实施向受试者施用如本文所描述的并且含有抗原和佐剂组合物两者以及任选地本文所描述的其它组分的疫苗组合物。

根据此类试剂盒实施例的容器可以是任何适合的容器、器皿、小瓶、安瓿、管、杯、箱、瓶、烧瓶、广口瓶、碟、单孔或多孔设备的孔、储器、罐等等、或者本文所公开的组合物可以放置、储存和/或运输并进入其中以去除内含物的其它装置。典型地，此类容器可以由兼容有预期用途并且可以容易地实现对所容纳的内含物的恢复的材料制成。这种容器的优选实例包含玻璃和/或塑料密封或可再密封的管和安瓿，包含具有橡胶隔膜或其它密封装置的那些，所述橡胶隔膜或其它密封装置与使用针和注射器取出内容物相容。这种容器可以例如由玻璃或化学相容的塑料或树脂制成，其可以由一种材料制成或可以涂覆有所述材料，所述材料允许从容器中有效回收材料和/或保护材料免受例如降解条件(例如紫外线或极端温度)或不需要的污染物(包含微生物污染物)的引入的影响。容器优选地是无菌的或可灭菌的，并且由将与任何载剂、赋形剂、溶剂、媒剂等相容的材料制成，如可以用于悬浮或溶解本文描述的疫苗组合物和/或免疫佐剂组合物和/或抗原和/或重组表达构建体等。

以下示实例是通过说明的方式而不是通过限制的方式来提供的。

实例

实例1.合成TLR7/8配体到氧化铝的吸附作用用于增强佐剂活性

摘要

近一个世纪，铝盐一直是最广泛使用的疫苗佐剂配制品，并且因此建立了安全性和有效性的历史。然而，对于如结核病或HIV病毒等极具挑战性的疾病目标，铝盐的佐剂活性可能不足以实现保护功效。TLR配体到铝盐的吸附有助于增强佐剂活性，如人乳头瘤病毒疫苗然而，一些如TLR7/8激动剂咪唑喹啉等TLR配体不能有效地吸附到铝盐上。本公开描述通过开发合成TLR7/8配体(例如，3M-052)的基于脂质的纳米悬浮液来解决挑战的配制品方法，所述配体通过所使用的辅助脂质的结构特性来促进到铝盐的吸附。在免疫小鼠中，吸附羟基氧化铝的3M-052配制品增强了针对结核病和HIV的疫苗抗原的抗体和TH1型细胞免疫应答。

本公开提供了当PRR配体首先与纳米悬浮液形式的辅助脂质一起配制时，辅助脂质的结构性质可以促进PRR配体吸附到铝盐而不改变PRR配体化学结构。此外，所述方法的多功能性可以允许相同的PRR配体吸附到不同类型的铝盐，这取决于与其络合的辅助脂质的结构。本公开提供了一种配制品方法，所述方法涉及开发用于调节合成的TLR7/8配体3M-052(5)与铝盐之间的吸附相互作用的纳米悬浮液，以便产生增强对共吸附的重组结核病或HIV疫苗抗原的抗体和细胞免疫原性的疫苗佐剂配制品。

材料与方法

辅助配制品材料。合成1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)，1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)，1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DLPG)，1,2-二甲亚基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DMPG)，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DPPG)，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)，1,2-二硬脂酰3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)，1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)和吡喃葡萄糖脂质佐剂(GLA，也被称为PHAD)购自Avanti Polar Lipids Inc(阿拉巴斯特，阿拉巴马州)。聚山梨醇酯80购自J.T.Baker(旧金山，加利福尼亚州)。泊洛沙姆188购自Spectrum Chemical(加迪纳，加利福尼亚州)。盐水溶液(0.9％w/v)购自Teknova(霍利斯特，加利福尼亚州)。TLR9CpG对照获自Avecia(Milfrod，马萨诸塞州)。‘85’和购自E.M.Sergeant Pulp&Chemical Co.(克利夫顿，新泽西州)。HIVgp120抗原在Fouts等人(“人类免疫缺陷病毒1型gp120-CD4受体络合物的单链多肽类似物的表达和表征”病毒，第74卷，第24期，2000年12月，11427-11436)中提到。实例中使用的GLA具有式(III)的结构，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基；并且R²和R⁴是C₁₃烷基。

辅助配制品制造。通过将3M-052或GLA与脂质赋形剂以1:2的摩尔比(佐剂：脂质)分散在氯仿或氯仿、甲醇和水的混合物中来制备水性纳米悬浮液。然后使用Genevac EZ-2离心蒸发器(斯通里奇，纽约州)蒸发溶剂。将干燥的膜在超纯水中再水化，然后在约60℃的Crest powersonic CP230D(特伦顿，新泽西州)超声水浴中超声处理达数小时或直至配制品是半透明的，没有可见的颗粒。为配制含有明矾的组合物，将含水纳米悬浮液与或混合。对于免疫原性研究，将重组疫苗抗原(ID93或HIVgp120抗原)与纳米悬浮液、明矾和指定的稀释剂混合在一起。

辅助配制品表征和稳定性。使用马尔文仪器公司(Malvern Instruments)(伍斯特郡，英国)Zetasizer Nano-S或Zetasizer Nano-ZS通过动态光散射(DLS)表征水性纳米悬浮液的粒度。在分析之前，将水性纳米悬浮液在聚苯乙烯比色皿中的水中以1:10或1:100倍稀释，所述分析由三次测量组成，导致散射强度偏差的平均直径值报告为Z-平均。使用Zetasizer Nano-ZS使用一次性毛细管电池测量ζ电位，从在水中1:10稀释制备的每个样品收集九个连续测量值。通常，在将配制品1:20稀释到乙醇:HCl(98:2v:v)中并且与标准曲线比较后，通过322.5nm的紫外吸光度测量3M-052浓度。稀释到有机溶剂中消除了纳米悬浮颗粒的光散射的潜在干扰。然而，对于需要最大灵敏度的3M-052结合等温线，不对样品或标准品进行稀释。替代性地，3M-052浓度由具有带电气溶胶检测的反相HPLC确定。在1:20稀释到乙醇：HCl中后，通过260nm处的紫外吸光度测量TLR9CpG对照浓度。如前所述(6)，使用甲醇:氯仿:水移动梯度，通过反相HPLC用C18柱(Atlantis T3或Agilent XBridge)和带电气溶胶检测(CAD)测量GLA浓度。为了检测未结合的TLR配体，如所示简单地离心含有明矾的配制品，并且通过紫外吸光度或HPLC-CAD测定上清液。根据实验，2,000xg到16,000xg处的离心时间为2分钟到5分钟。在一些实验中(图2D和表4)，为了去除铝盐制备中盐水或缓冲盐对TLR激动剂的沉淀的影响，铝盐首先被离心并且去除上清液并用水代替；在结合研究中采用铝盐之前，重复此过程进行另一个清洗。

CryoTEM成像。将样品保存在由400目铜网格上的多孔碳膜支撑的玻璃化冰中。通过将3μL样品悬浮液滴施加到清洁的网格上，用滤纸吸干并且立即在液体乙烷中进行玻璃化来制备样品。将网格储存在液氮下直至转移到电子显微镜上进行成像。使用FEITecnaiT12电子显微镜进行电子显微镜检查，在配备有FEI Eagle 4k×4k CCD相机的120k eV下操作。使用低温恒温器将玻璃质冰网格转移到电子显微镜中，所述低温恒温器将网格保持在低于-170℃的温度。以多个尺度获取每个网格的图像以评估样本的总体分布。在以较低放大率识别用于成像的潜在合适的目标区域之后，以110,000x(0.10nm/像素)、52,000x(0.21nm/像素)和21,000x(0.50nm/像素)的标称放大率获取高放大率图像。图像以-2μm(110,000x)，-3μm到-2μm(52,000x)和-5μm(21,000x)的标称聚焦以及约的电子剂量获得。

抗原吸附到铝盐上。通过UV-Vis光谱法和用银染色的SDS-PAGE确定3M-052和ID93或HIV gp120抗原与和的结合效率。通过混合盐水稀释剂、抗原、3M-052-AF和/或铝盐制备1mL配制品。为了确定HIV gp120抗原吸附，将30μl样品上清液与10μl 4X还原或非还原LDS样品缓冲液混合，然后将20μl到25μl加入含有15μl SeeBlue2预染标准的10泳道SDS-PAGE凝胶中。为了确定ID93吸附，将45μl样品上清液与15μl 4X还原LDS样品缓冲液混合，然后将25μl加入含有15μl SeeBlue2预染标准的10泳道SDS-PAGE凝胶中。将凝胶在190V下运行55分钟，并且然后置于50:40:10EtOH:CH₃COOH:H₂O的固定溶液中过夜。然后根据西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(圣路易斯，密苏里州)ProteoSilverPlus Silver Stain试剂盒提供的说明对凝胶进行染色。

动物和免疫。C57B1/6和B6.129Sl-TLR7^tm1Flv/J(TLR7^-/-)购自JacksonLaboratories(巴尔港，缅因州)。通过肌肉注射用重组TB疫苗抗原ID93(0.5μg/剂量)或用AdjuPhos、3M-052+AdjuPhos或辅助的HIV gp120抗原(10μg/剂)。最终佐剂剂量为5μg GLA或0.1μg到10μg 3M-052，其中200μg的AdjuPhos或在100μL中。在第一次免疫后三周对小鼠进行加强免疫。将所有小鼠维持在无特定病原体的条件下。所有程序均经IDRI机构动物护理和使用委员会批准。

抗体滴度。通过将眼眶后血液收集到微量血清收集管(VWR International，威彻斯特，宾夕法尼亚州)中，然后离心，在免疫后21天制备小鼠血清(N＝5/组)。然后通过抗体捕获ELISA分析每种血清样品。简而言之，用0.1M碳酸氢盐缓冲液中的2μg/ml免疫抗原涂覆ELISA板(Nunc，罗契斯特，纽约州)，并且用1％BSA-PBS封闭。然后，在PBS/Tween20中连续顺序和随后清洗时，将连续稀释的血清样品、抗小鼠IgG、IgG1或IgG2c-HRP(SouthernBiotech，伯明翰，阿拉巴马州)和ABTS-H2O2(Kirkegaard和Perry Laboratories，盖瑟斯堡，马里兰州)添加到板中。在405nm处分析板(ELX808，Bio-Tek Instruments Inc，威努斯基，佛蒙特州)。使用Prism软件V6(GraphPad)计算终点滴度。替代性地，在用HIV gp120抗原第三次免疫后三周收集阴道灌洗液，并且使用相同的方法分析抗体滴度。

细胞内细胞因子染色。最后一次免疫后一周，脾细胞被分离。使用红细胞裂解缓冲液(Red Blood Cell Lysis Buffer)(eBioscience)裂解红细胞，并且重悬于RPMI 1640和10％FBS中。将细胞以2×10⁶个细胞/孔接种在96孔板中，并且用免疫抗原(10μg/mL)刺激2小时或在37℃下未刺激。添加GolgiPlug(BD Biosciences)并且将细胞在37℃下再孵育8小时。在抗-CD16/32(克隆2.4G2)存在下，清洗细胞并且用荧光染料标记的CD4(克隆GK1.5)、CD44(克隆IM7)和CD8(克隆53-6.7)(BioLegend和eBioscience)的抗体进行表面染色持续20分钟。清洗细胞并且用Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)透化20分钟。用Perm/Wash(BD Biosciences)清洗细胞两次，并且用荧光染料标记的抗体CD154(克隆MR1)、IFN-γ(克隆XMG-1.2)、IL-2(克隆JES6-5H4)、TNF(克隆MP6-XT22)、GM-CSF(克隆MP1-22E9)、IL-5(克隆TRFK5)和IL-17A(克隆TC11-18H10.1)(BioLegend和eBioscience)在室温下进行细胞内染色20分钟。清洗细胞并且重悬于PBS中。在LSRFortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上收集多达10⁶个事件。用FlowJo(TreeStar)分析数据。将细胞门控为单体>淋巴细胞>CD4+CD8->细胞因子阳性或CD44^hi>细胞因子阳性。通过从抗原刺激的细胞中减去未刺激细胞的应答阳性的频率来确定抗原特异性应答频率。

抗体分泌细胞ELISPOT测定。使用ELISPOT测定法定量存在于骨髓中的抗原特异性抗体分泌细胞。在测定开始前一天，将Multiscreen ELISPOT板(Millipore)用1ug抗原/孔涂覆，并且孵育过夜。将封闭的板用清洗缓冲液(PBS+0.5％吐温20)清洗三次，用收集培养基封闭两小时并且清洗3次。免疫后21天在补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基中收集骨髓，使用Guava自动细胞计数器(Millipore)定量并且重悬到1×10⁶个细胞/mL。将细胞连续稀释3倍，添加到板中，并且在37℃下孵育5小时。通过添加1:100稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(Southern Biotech)检测分泌的抗体。根据制造商的说明用AEC过氧化物酶底物试剂盒(Vector Labs)显现斑点。在CTL生物分析仪上对斑点进行定量。

先天免疫应答。在肌内免疫进入腓肠肌后十八小时，收集引流的pop窝淋巴结并且在含有蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific)的PBS中解离。在冰上对细胞进行CD8、CD90.2(克隆53-2.1)、CD19(克隆1D3)、NKL1(克隆PK136)、CD11c(克隆N418)、CD11b(克隆M1/70)、Ly6G(克隆1A8)、Ly6C(HK1.4)、CD69(克隆H1.2F3)和CD86(克隆GL1)的表面染色20分钟。清洗细胞并且用Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)透化20分钟。用Perm/Wash(BDBiosciences)清洗细胞两次，并且在室温下用荧光染料标记的IFN-γ和proIL-1β抗体(克隆NJTEN3)(BioLegend和eBioscience)在细胞内染色20分钟。清洗细胞并且重悬于PBS中。在LSRFortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上收集多达10⁶个事件。用FlowJo(TreeStar)分析数据。将细胞门控为单细胞>细胞>CD19+CD90.2-(B细胞)、CD8+CD90.2+(CD8T细胞)、CD8-CD90.2+(CD4T细胞)、CD8-CD19-NK1.1+(NK细胞)、CD8-CD19-CD11c+(DCs)、CD8-CD19-GD1lb+Ly6C+(炎性单核细胞)或CD19-CD11b+Ly6G+(PMNs)。

统计分析。通过使用Prism版本5或更高版本(GraphPad)的Tukey多重比较校正的双向ANOVA分析抗体和T细胞应答。导致p值<0.05的比较被认为是显著的。图中仅报告了有意义的比较(佐剂组相对于单独抗原；相对于3M-052-AF或3M-052-AdjuPhos相对于或3M-052-AF)。

结果

配制品开发和物理化学表征

通过添加合适的辅助脂质并且输入能量(例如超声处理)以分解脂质络合物(7)的粒度来形成TLR配体的水性纳米悬浮液。为了确定合适的辅助脂质以形成具有3M-052的纳米尺寸颗粒，筛选了一系列磷脂(图1)。基于与TLR4配体(8)的共同作用，首先将这些辅助脂质与3M-052在有机溶剂中以1:2的摩尔比(3M-052:辅助脂质)混合。蒸发溶剂后，将配制品水合并且超声处理以将粒度减小到约<200nm，以实现最终无菌过滤的可能性。通过动态光散射确定几种配制品在制造后表现出可接受的粒度(约<200nm)(图2A)。辅助脂质的性质决定了配制品的粒度和物理稳定性。一些配制品在尺寸上显著增长(DLPC、DOPC、聚山梨醇酯80)指示配制品物理不稳定，而其它配制品在5℃下储存2周后表现出很小的变化(DSPG、DSTAP)(图2B)。

大多数配制品带正电荷(图2C)，正如预期的那样，由于咪唑喹啉如3M-052等化学结构，其具有pKa约7(9)。然而，由于DSPG中磷酸基团的负电荷，DSPG引起阴离子颗粒的形成。由于可能吸附到羟基氧化铝上，对于疫苗佐剂开发特别关注阴离子水性悬浮液。因此，测试了3M-052的稳定水性悬浮液到羟基氧化铝或磷酸铝的吸附。在浓度为100μg/ml 3M-052时，观察到基于DSPG的悬浮液与羟基氧化铝的有效结合，但是没有基于DSTAP的3M-052悬浮液到羟基氧化铝的可检测吸附发生(图2D，估计的LOD-5μg/mL)。相比之下，基于DSTAP的悬浮液高效地吸附在磷酸铝上而不是羟基氧化铝上。因此，通过适当选择辅助脂质，促进了3M-052水性纳米悬浮液到不同类型的铝盐的吸附。具有与DSPG相同或相似的头基但具有不同酰基链长度或饱和度的磷脂还促进了纳米悬浮液的形成和3M-052对羟基氧化铝的吸附(表1)。

表1.酰基链和饱和度对PG基纳米悬浮液尺寸和吸附性能的影响。值表示来自实验的同一样品的三个测量结果的平均值+/-s.d.。

基于DSPG的纳米悬浮液(下文称为3M-052-AF)的后续努力由于其形成吸附于羟基氧化铝的纳米悬浮液的能力而得到关注，所述羟基氧化铝通常是如本公开中采用的用于阴离子重组蛋白抗原的优选的铝盐。3M-052-AF在4℃下在至少6个月内是物理稳定的，平均粒度或粒度多分散性几乎没有显示出变化(图10)。

通过低温透射电子显微镜(cryoTEM)表征的3M-052-AF的形态指示胶束结构的相当均匀的悬浮直径约5nm到15nm，尽管还存在较大的不规则形状的颗粒(数据未示出)。这些尺寸特性可能看起来与上文指示的动态光散射相矛盾，其中Z-平均值通常超过100nm。然而，通过动态光散射报告的基于光散射强度的Z-平均值受小比例的大颗粒的影响，因为如图3A所示，其比较小的颗粒散射更多的光(光散射与颗粒直径的10⁶成比例)。基于强度的尺寸分布到基于体积的尺寸分布的数学转换指示在约-20nm范围内的更多颗粒，尽管甚至基于体积的尺寸分布还被更大的颗粒倾斜，其中比例为10³。然而，3M-052-AF的基于体积的尺寸分布与cryoTEM结果更一致(图3b)。由于3M-052-AF的小粒度，纳米悬浮颗粒在含有羟基氧化铝的低温TEM图像中不明显(数据未示出)。实际上，无论是否存在3M-052-AF，羟基氧化铝颗粒的形态看起来大致相同，值得注意的例外是，与羟基氧化铝对照相比，含有3M-052-AF的样品中结晶聚集体的尺寸看起来更大。

为了确定对3M-052-AF的吸附能力，将各种浓度的纳米悬浮液与羟基氧化铝混合，并且在间歇涡旋下静置约30分钟，然后离心使得铝颗粒沉淀。然后测定上清液中的3M-052以检测未结合的物质(图4)。纳米悬浮液的吸附能力为每mg铝约-0.16mg。在本公开中描述的随后的小鼠免疫原性实验中采用的3M-052的剂量低于此水平。3M-052-AF在上随时间的吸附稳定性通过在5℃下储存16周之前和之后测定未结合的3M-052的样品来评估。尽管在对照的上清液中似乎部分损失了3M-052(可能指示粘附在塑料微量离心管上)，但含有明矾样品的上清液中可检测到的3M-052没有增加，指示在16周内没有解吸(表2)。此外，其它TLR配体的存在似乎不会干扰3M-052到羟基氧化铝的吸附，表明含有多个吸附的PRR配体的基于明矾的配制品是可行的(表2)。

表2.随着时间的推移和在共吸附的TLR配体存在下吸附3M-052-AF的稳定性。3M- 052-AF含有DSPG，而GLA-AF含有DPPG。TLR9 CpG对照是可溶的，并且因此不含有辅助脂质。通过紫外吸光度(3M-052、TLR9 CpG对照)或具有带电气溶胶检测(GLA)的HPLC测定未结合的TLR配体。值代表重复样品的平均值+/-s.d.。

NM：未测量

为了确定3M-052是否通过配体交换或静电机制吸附到羟基氧化铝上，评估了离子强度对吸附的影响，所述吸附中和了静电介导的结合(10)。随着氯化钠浓度的增加，对照样品上清液中3M-052含量降低的趋势可归因于3M-052-AF颗粒在暴露于盐水时迅速增加，即使不存在铝，也会导致纳米悬浮液的沉淀(表3)。然而，增加氯化钠浓度似乎不会降低3M-052-AF与羟基氧化铝的结合。

表3.盐水浓度对3M-052-AF吸附到的影响。将样品以2000xg离心10 秒。值代表重复样品的平均值+/-s.d.。

佐剂生物活性

为了确定3M-052与羟基氧化铝的结合是否改变氧化氧化铝或3M-052-AF的体内佐剂活性，我们用结合有羟基氧化铝的3M-052-AF、羟基氧化铝或3M-052-AF佐剂化的结核疫苗抗原ID93(11)免疫C57BL/6小鼠。第一次免疫后三周，接受的小鼠展现出最高的ID93特异性总IgG以及IgG1和IgG2c亚型的血清滴度，表明3M-052-Alhyrogel与单独的3M-052-AF或相比具有独特的佐剂性质(图5A)。在第三次免疫后一个月，通过用ID93刺激脾细胞并且通过流式细胞术在布雷菲德菌素A存在下测量细胞因子产生来评估CD4T细胞应答。与仅用ID93免疫的小鼠相比，ID93+3M-052-AF和免疫的小鼠均具有更高频率的表达CD154的ID93特异性CD4T细胞。用免疫的小鼠表现出在ID93刺激后产生IFN-γ、TNF、IL-2和GM-CSF的TH1细胞(图5B)。虽然几项随访实验证实了这些发现，但是一些批次的3M-052-AF似乎诱导了与相当的TH1T细胞佐剂活性。这种差异的一个可能的解释涉及磷脂(DSPG)与3M-052的比率。在使用TLR4配体的工作中，显示系统地改变磷脂:TLR4配体比率揭示了物理化学以及体外生物活性测定中的双相应答(12)。因此，如果本公开中采用的磷脂:3M-052比率接近此类拐点，则配制品的制备或物理性质的看似微小变化可以导致其生物活性的变化。

为了确定3M-052-AF与羟基氧化铝的结合是否从根本上改变了其佐剂活性或仅仅改变了其生物利用度，检测了单独的3M-052-AF或在两个log₁₀剂量范围内与羟基氧化铝结合的佐剂活性。使用佐剂ID93首次免疫后三周，与单独的或相同剂量范围的3M-052-AF相比，3M-052-AF的明矾吸附配制品在整个剂量范围内始终引发更高的血清抗体滴度(图6A和图6B)。类似地，显示出用于增强ID93特异性CD4T细胞的钟形剂量应答，其中测试剂量的峰值应答为1μg。这些CD154和IFN-γ应答显着高于以0.1μg、1μg或10μg用羟基氧化铝或3M-052-AF辅助的ID93引发的应答(图6C和图6D)。对于产生TNF和IL-2的CD4T细胞还观察到类似的剂量应答。基于此，可以得出结论，3M-052-AF与羟基氧化铝的结合通过某些方式改变其佐剂活性，而不是简单地在任一方向上改变1log₁₀范围内的生物利用度。

体外3M-052激活人类TLR7和TLR8(5)。为了确定这些先天免疫受体是否是的体内佐剂活性的因子，对接种的野生型(WT)C57BL/6小鼠和缺乏TLR7的小鼠(C57BL/6小鼠表达低功能TLR8)的免疫应答进行了比较。作为对照，用TLR4激动剂佐剂GLA-明矾辅助的ID93免疫C57BL/6和TLR7-/-小鼠。无论佐剂或基因型如何，所有免疫组都产生高滴度的ID93特异性IgG1抗体(图7A)。与单独的相比，和在C57Bl/6小鼠中还引发高滴度的IgG2c。在TLR7-/-小鼠中，用ID93+3M-052-明矾免疫的动物中IgG2c诱导显著降低，而对ID93+GLA-Alhdyrogel的IgG2c应答不受TLR7缺乏的影响，表明TLR7用于识别3M-052，而不是或GLA。ID93+还在WT小鼠中引发稳健的细胞应答，其特征在于CD4T细胞能够产生IFN-γ和TNF，其中产生的IL-5或IL-17A非常少(分别是TH2和TH17免疫标记)。然而，在TLR7-/-小鼠中，仅引发对ID93的轻微CD4T细胞应答，其在幅度上与在WT小鼠中单独用佐剂化的ID93引发的应答没有显著差异(图7B)。用ID93+免疫WT和TLR7-/-小鼠引发类似的TH1应答，指示TLR7-/-小鼠的其CD4T细胞对具有其它含有在明矾上配制的佐剂的TLR激动剂的疫苗的应答没有受损。因此，可以得出结论，类似于体外发现，使用TLR7作为其体内佐剂活性，特别是在引发高频率的TH1CD4T细胞和IgG2c转换的抗体应答中。

为了测试3M-052与不同疫苗抗原的体内佐剂活性以及不同铝盐的作用，用含有3M-052-AF、羟基氧化铝、磷酸铝或3M-052-AF与羟基氧化铝或磷酸铝辅助的HIV gp120抗原(13)免疫C57BL/6小鼠。第一次免疫后三周，用3M-052-羟基氧化铝辅助的HIV gp120抗原引发最高血清IgG和IgG2c抗体应答(图8B)。有趣的是，3M-052-羟基氧化铝还产生最高水平的粘膜IgG2c和分泌抗体的长寿浆细胞(图8D和图11)。此外，含有3M-052和羟基氧化铝的配制品是来自CD4+T细胞的IFNγ和TNF的最有效诱导剂(图8C)，特别是在初次免疫后一周(图11)。总体而言，3M-052-羟基氧化铝在此模型中似乎比3M-052-磷酸铝具有更强的佐剂活性；然而，由于HIV gp120抗原吸附到羟基氧化铝但基本上不吸附到磷酸铝(数据未示出)，因此降低的免疫原性应答可以归因于抗原和/或3M-052对磷酸铝的不太理想的吸附。

对疫苗抗原的稳健适应性免疫应答的诱导使用先天免疫系统的适当激活来提供共刺激和细胞因子环境。因此，分析了通过用3M-052+/-磷酸铝或羟基氧化铝免疫而改变的引流淋巴结中的先天免疫应答。3M-052与羟基氧化铝和较小程度的磷酸铝协同作用，以在免疫注射后18小时引发引流淋巴结中炎性单核细胞(CD11b⁺Ly6C⁺)数量的稳健增加(图9A)。类似地，3M-052和两种明矾配制品增强共刺激分子CD86在包含B细胞、单核细胞和树突细胞的APC上的表达以及CD4T细胞和CD8T细胞以及B细胞的瞬时活化，如CD69表达所指示的(图9B和图C)。3M-052与羟基氧化铝独特地协同增强表达IFN-γ的NK细胞和产生IL-1的中性粒细胞的数量(图9D)，两种分子对于用疫苗佐剂诱导稳健的TH1应答很重要(14)。这种对3M-052与明矾之间协同作用的先天应答可能为稳健生成对疫苗抗原的适应性免疫应答创造了适当的环境。与由3M-052+磷酸铝诱导的较弱应答相比，产生IFN-γ的NK细胞和产生IL-1的嗜中性粒细胞的扩增与3M-052+羟基氧化铝的更强的佐剂活性相关。

讨论

TLR7/8激动剂的适当配制品是一种有吸引力的辅助开发方法，其原因有多种，包含可制造性、诱导有效的TH1应答以及先前在FDA批准的产品中使用。咪唑喹啉靶向TLR7和/或TLR8以生成增强的TH1型先天免疫应答(包含小鼠中的IgG2抗体)的能力已在文献中记载(15-17)。作为合成小分子，咪唑喹啉可以低成本并且高纯度地制造。TLR7配体咪喹莫特是外用乳膏中的活性组分，已经被批准用于治疗皮肤癌和生殖器疣的人类免疫治疗用途。然而，注射的咪唑喹啉作为疫苗佐剂尚未超出早期临床试验。由于其小尺寸，假设如R848等可溶性未配制的咪唑喹啉从注射部位迅速扩散，引起全身免疫活化而不是局部刺激。由于这个原因，如与疫苗抗原的共价缀合或颗粒配制品中的包封等“减缓”咪唑喹啉扩散的策略，在临床前试验中显示出前景(5，18-21)。Smirnov等人描述了一种化学合成方法，所述方法导致向咪唑喹啉结构中添加18-碳链，所述咪唑喹啉结构保持局部佐剂活性，但不具有如R848(5)等非脂化结构的明显的全身应答。这种称为3M-052(图1)的分子因此更适合结合到基于脂质的配制品中，如纳米悬浮液、脂质体或乳液。

Wu等人的工作表明新的TLR7配体与膦酸酯基团的化学合成促进了对羟基氧化铝的吸附，从而改善了瞬时局部佐剂活性，同时减少了全身活化(21)。明矾吸附的TLR7配制品有效地提高了各种疫苗抗原的抗体大小和质量，包含与单独使用明矾或单独使用TLR7配体的抗原相比增强的抗攻击保护作用(21)。相反，本文所描述的配制品方法基本上不使用PRR配体上的膦酸酯基团以促进PRR配体吸附到铝盐，并且因此可以具有更广泛的适用性。从监管的观点来看，促进PRR配体吸附到铝盐的能力可以提供开发优势，因为明矾吸附的PRR配体配制品已经含有在批准的如等疫苗中。基于配方的方法可以避免化学修饰现有激动剂结构的需要，而是依赖于配制品的性质以促进对铝盐的吸附。此外，脂质配制品修饰可以调整PRR配体对特定铝盐的吸附偏好，使得疫苗抗原和PRR配体可以吸附到相同类型的铝盐上。这种赋形剂性质包含酰基链的长度和饱和度以及头基结构/电荷。我们发现后者似乎是纳米悬浮液吸附铝盐的能力的主要决定因素，尽管还应考虑酰基链结构以确保PRR配体与辅助脂质之间稳定的悬浮液形成。

尽管这种基于纳米悬浮液的配制品方法的多功能性，但应注意缓冲/盐选择、铝盐类型、混合顺序、稀释剂和疫苗抗原性质的效果应该被充分表征，以便优化佐剂化的疫苗配制品。例如，不能完全区分3M-052-AF吸附的重要性而不依赖于抗原吸附，因为与羟基氧化铝相比，HIV gp120抗原和3M-052-AF对磷酸铝的吸附不太理想。

辅助脂质方法用于将TLR4配体吸附到羟基氧化铝上。可以使用辅助脂质将另外的不溶的TLR4配体GLA配制成水性悬浮液，然后可以将所述水性悬浮液与羟基氧化铝混合以允许吸附。然而，在GLA的情况下，激动剂本身含有磷酸基团，所述磷酸基团通过配体交换促进吸附。在3M-052的情况下，激动剂不含有磷酸基团，因此由于配体交换引起的吸附可以归因于辅助脂质。尽管在本公开中，ID93+3M-052-明矾似乎比ID93+GLA-明矾诱导更有效的TH1应答。TLR7/8和TLR4的细胞定位和分布显着不同，并且在物种之间变化(17)。例如，TLR8在小鼠中被认为是难治的；因此，如3M-052的激动剂可以在具有功能性TLR8的人类或其它物种中引起改变或增强的应答。这些考虑因素与此处提供的数据相结合，指示基于明矾的TLR7/8佐剂配制品可以为人类的TH1应答提供有效的佐剂配制品。

3M-052和明矾协同增加共同刺激分子CD86在引流LN中的APC上的表达，并且以抗原非依赖性方式瞬时地活化淋巴细胞以保留在引流淋巴结中。通过激活APC并且在相同的引流LN中捕获淋巴细胞，这种协同作用为淋巴细胞引发和扩增创造了最佳环境。有趣的是，当用羟基氧化铝配制3M-052时，我们发现包含用于GLA-SE(14)的佐剂活性的IFN-γ和IL-1β的早期产生的先天应答也是显著的。这可能表明这些参数可能是有效佐剂活性的有用的通用签名。识别此类签名将有助于合理开发新的候选疫苗。

总之，开发了一种将基于脂质的PRR配体配制成水性纳米悬浮液的方法，所述方法可以基于辅助脂质的性质使其吸附到铝盐上。开发新的PRR配体的明矾相容配制品的能力可以更快地转化到临床，因为此类配制品类似于中使用的TLR4配体-明矾组合，并且铝盐是人类疫苗中最广泛采用的一类佐剂，具有公认的安全性和免疫原性记录。

实例2.合成TLR4配体对明矾的吸附

测试了TLR 4配体GLA的稳定水性悬浮液对羟基氧化铝或磷酸铝的吸附，并且结果如表4所示。这些数据指示通过适当选择辅助脂质，TLR4配体的吸附可以适应羟基氧化铝或磷酸铝。

表4：将GLA的水性纳米悬浮液吸附到或上。

参考文献

1.Glenny AT、Pope CG、Waddington H、Wallace U。由钾明矾沉淀的类毒素的抗原值(《细菌病理学期刊(J Pathol Bacteriol.)》，1926；29:31-40)。

2.Hem SL、HogenEsch H.含铝佐剂：性质、配方和用途。在：Singh M，编辑。《疫苗佐剂和递送系统(Vaccine Adjuvants and Delivery Systems)》。新泽西州霍博肯：约翰威立国际出版公司(John Wiley和Sons)；2007，第81到114页。

3.Didierlaurent AM、Morel S、Lockman L、Giannini SL、Bisteau M、Carlsen H、Kielland A、Vosters O、Vanderheyde N、Schiavetti F、Larocque D、Van Mechelen M、Garcon N.AS04，基于铝盐和TLR4激动剂的佐剂系统诱导瞬时局部先天免疫反应，导致增强的适应性免疫。《免疫学期刊(J Immunol.)》，2009；10:6186-97。

4.Mullen GED、Aebig JA、Dobrescu G、Rausch K、Lambert L、Long CA、Miles AP、Saul A。通过CPG 7909增强小鼠对疟疾抗原AMA1的抗体产生需要CpG和抗原的物理结合。《疫苗》2007；25(29):5343-7。

5.Smirnov D、Schmidt JJ、Capecchi JT、Wightman PD。3M-052的疫苗佐剂活性：设计用于局部活动的咪唑喹啉，不需要全身细胞因子诱导。《疫苗》2011；29:5434-42。

6.Misquith A、Fung M,Dowling QM、Guderian JA、Vedvick TS、Fox CB。TLR4激动剂活性的体外评估：配制品效果。Coll Surf B：《生物界面(Biointerfaces)》，2014；113:312-9。

7.Fung HWM、Mikasa TJT、Vergara J、Sivananthan SJ、Guderian JA、Duthie MS、Vedvick TS，优化TLR4纳米悬浮液的制造和组成：物理化学稳定性和疫苗佐剂活性。《纳米生物技术期刊(J Nanobiotechnology)》，2013；11:43。

8.Fox CB。表征TLR4激动剂对Alhydrogel沉淀的影响：激光散射光学轮廓的新应用。《药物科学杂志(J Pharm Sci)》，2012；101:4357-64。

9.Chollet JL、Jozwiakowski MJ、Phares KR、Reiter MJ、Roddy PJ、Schultz HJ、Ta QV、Tomai MA。开发局部活性的咪喹莫特配制品。《药物开发技术(Pharm DevTechnol.)》，1999；4:35-43。

10.Iyer S、Robinett RSR、HogenEsch H、Hem SL。氢氧化铝佐剂吸附乙型肝炎表面抗原的机制。《疫苗》2004年；22(11-12):1475-9。

11.Bertholet S、Ireton GC、Ordway DJ、Windish HP、Pine SO、Kahn M、Phan T、Orme IM、Vedvick TS、Baldwin SL、Coler RN,Reed SG。限定的结核病疫苗候选物增强BCG并且防止多药耐药的结核分枝杆菌。《科学转化医学(Sci Transl Med.)》，2010；2:53ra74。

12.Dowling QM、Sivananthan SJ、Guderian JA、Moutaftsi M、Chesko JD、FoxCB、Vedvick TS、Kramer RM。调制效力：物理化学特性是TLR4-激动剂纳米悬浮活性的决定因素。《药物科学杂志(Journal of Pharmaceutical Sciences)》2014；103(3):879-89。

13.Fouts TR、Tuskan R、Godfrey K、Reitz M、Hone D、Lewis GK、DeVico AL。人免疫缺陷病毒1型gp120-CD4受体络合物的单链多肽类似物的表达和表征。《病毒学期刊(Journal of Virology)》，2000；74(24):11427-36。

14.Desbien AL、Reed SJ、Bailor HR、Cauwelaert ND、Laurance JD、Orr MT、FoxCB、Carter D、Reed SG、Duthie MS。角鲨烯乳液通过炎性半胱天冬酶、IL-18和IFN-γ增强TLR4激动剂GLA的佐剂活性。《欧洲免疫学期刊(European Journal of Immunology)》。2015；45(2):407-17。

15.Vasilakos JP、Tomai MA。使用Toll样受体7/8激动剂作为疫苗佐剂。《疫苗专家评审(Expert Review of Vaccines)》。2013；12(7):809-19。

16.Schwenk R、DeBot M、Porter M、Nikki J、Rein L、Spaccapelo R、Crisanti A、Wightman PD、Ockenhouse CF、Dutta S。针对临床级别<斜体>恶性疟原虫</italic>的IgG2抗体CSP疫苗抗原与小鼠中转基因子孢子攻击的保护相关联。《公共科学图书馆综合(PlosOne)》2014；9(10):11020。

17.Reed SG、Orr MT、Fox CB。佐剂在现代疫苗中的关键作用。《自然医学期刊(NatMed.)》，2013；19:1597-608。

18.Fox C、Sivananthan S、Duthie M、Vergara J、Guderian J、Moon E、CoblentzD、Reed S、Carter D。纳米脂质体递送系统协同触发TLR4和TLR7。《纳米生物技术杂志(Journal of Nanobiotechnology)》2014；12(1):17。

19.Kasturi SP、Skountzou I、Albrecht RA、Koutsonanos D、Hua T、Nakaya HI、Ravindran R、Stewart S、Alam M、Kwissa M、Villinger F、Murthy N、Steel J、Jacob J、Hogan RJ、García-Sastre A、Compans R、Pulendran B。用先天免疫规划抗体反应的量级和持久性。《自然(Nature)》，2011；470:543-7。

20.Wille-Reece U、Wu C-y、Flynn BJ、Kedl RM、Seder RA。用缀合到TLR7/8激动剂的HIV-1Gag蛋白免疫导致生成HIV-1Gag特异性Th1和CD8+T细胞应答。《免疫学期刊(TheJournal of Immunology)》,2005；174(12):7676-83。

21.Wu TY-H、Singh M、Miller AT、De Gregorio E、Doro F、D'Oro U、SkibinskiDAG、Mbow ML、Bufali S、Herman AE、Cortez A、Li Y、Nayak BP、Tritto E、Filippi CM、Otten GR、Brito LA、Monaci E、Li C、Aprea S、Valentini S、S、Laera D、Brunelli B、Caproni E、Malyala P、Panchal RG、Warren TK、Bavari S、O'Hagan DT、CookeMP、Valiante NM。合理设计小分子作为疫苗佐剂。《科学转化医学(Science TranslationalMedicine)》，2014；6(263):263ra160。

本说明书中提及的和/或在申请资料表中列出的所有上述的美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利申请以及非专利公开以其全文通过引用结合在此。

由前文应理解的是，虽然用于说明的目的已经在此描述了本发明的具体实施例，但可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，除了所附权利要求书以外，本发明不受限制。

Claims

1.一种TLR水性配制品，其包括：

(a)TLR激动剂；以及

(b)辅助脂质。

2.根据权利要求1所述的水性配制品，其中所述TLR激动剂包括TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂或TLR9激动剂。

3.根据权利要求1或2所述的水性配制品，其进一步包括铝盐。

4.一种TLR7/8水性配制品，其包括：

(a)TLR7/8激动剂；以及

(b)辅助脂质。

5.根据权利要求4所述的水性配制品，其中所述水性配制品是具有400nm或更小的粒度的稳定纳米悬浮液。

6.一种组合物，其包括：

(a)TLR7/8激动剂；

(b)辅助脂质；以及

(c)铝盐。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述TLR7/8激动剂吸附到所述铝盐上。

8.根据权利要求6或7所述的组合物，其中所述TLR7/8激动剂以所述铝盐的25％吸附到所述铝盐上。

9.根据权利要求6到8中任一项所述的组合物，其中所述铝盐选自由以下组成的群组：氢氧化铝、三水合铝、羟基氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝、羟基磷酸铝硫酸盐和硫酸铝钾。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述铝盐包括

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述铝盐包括

12.根据权利要求4到11中任一项所述的组合物，其中所述TLR7/8激动剂包括3M-052。

13.根据权利要求4到12中任一项所述的组合物，其中所述辅助脂质是磷脂或季铵盐脂质。

14.根据权利要求4到13中任一项所述的组合物，其中所述辅助脂质包括C_10-20烷基链。

15.根据权利要求4到14中任一项所述的组合物，其中所述辅助脂质选自DOPC、DSPG、DSTAP和聚山梨醇酯80。

16.根据权利要求4到14中任一项所述的组合物，其中所述辅助脂质选自DSPG和DSTAP。

17.根据权利要求6所述的组合物，其包括3M-052、和DSPG。

18.根据权利要求6所述的组合物，其包括3M-052、和DSTAP。

19.根据权利要求1到18中任一项所述的组合物，其进一步包括抗原。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述抗原选自结核病相关抗原、流感相关抗原、红血球凝聚素相关抗原、癌症相关抗原、病毒相关抗原和阿米巴病相关抗原。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述结核病相关抗原选自由ID93、ID91和BCG组成的群组。

22.根据权利要求20所述的组合物，其中所述流感相关抗原选自由H5N1、甲型流感、乙型流感和丙型流感组成的群组。

23.根据权利要求20所述的组合物，其中所述阿米巴病相关抗原是LecA。

24.根据权利要求20所述的组合物，其中所述病毒相关抗原选自由乙型肝炎和丙型肝炎组成的群组。

25.根据权利要求4到24中任一项所述的组合物，其中所述组合物是稳定的。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物稳定至少约六个月。

27.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物稳定至少约一年。

28.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物在2℃到8℃下稳定至少六个月。

29.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物在2℃到8℃下稳定至少一年。

30.一种TLR4水性配制品，其包括：

(a)TLR4激动剂；以及

(b)辅助脂质，其为DPTAP。

31.根据权利要求30所述的水性配制品，其中所述水性配制品是具有400nm或更小的粒度的稳定纳米悬浮液。

32.一种组合物，其包括：

(a)TLR4激动剂；

(b)作为DPTAP的辅助脂质；以及

(c)铝盐，其为

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述TLR4激动剂吸附到所述铝盐上。

34.根据权利要求32或33所述的组合物，其中所述TLR7/8激动剂以所述铝盐的25％吸附到所述铝盐上。

35.根据权利要求30到34中任一项所述的组合物，其中所述TLR4激动剂吸附到磷酸铝上。

36.根据权利要求30到35中任一项所述的组合物，其中所述TLR4激动剂包括3D-单磷酰脂质A(MPL)。

37.根据权利要求30到35中任一项所述的组合物，其中所述TLR4激动剂包括GLA。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述TLR4激动剂包括具有式(IV)的合成GLA：

或其药学上可接受的盐，其中：

Y₁是酸官能团；

Y₂和Y₃相同或不同且独立地是-OH、-SH或酸官能团；

Y₄是-OH或-SH；

R₁、R₃、R₅和R₆相同或不同且独立地是C_8-13烷基；并且

R₂和R₄相同或不同且独立地是C_6-11烷基。

39.根据权利要求37所述的组合物，其中所述TLR4激动剂包括具有式(V)的合成GLA：

或其药学上可接受的盐，其中：

40.根据权利要求37所述的组合物，其中所述TLR4激动剂包括具有以下式的合成GLA：

或其药学上可接受的盐。

41.根据权利要求30到40中任一项所述的组合物，其进一步包括抗原。

42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述抗原选自结核病相关抗原、流感相关抗原、红血球凝聚素相关抗原、癌症相关抗原、病毒相关抗原和阿米巴病相关抗原。

43.根据权利要求41所述的组合物，其中所述结核病相关抗原选自由ID93、ID91和BCG组成的群组。

44.根据权利要求41所述的组合物，其中所述流感相关抗原选自由H5N1、甲型流感、乙型流感和丙型流感组成的群组。

45.根据权利要求41所述的组合物，其中所述阿米巴病相关抗原是LecA。

46.根据权利要求41所述的组合物，其中所述病毒相关抗原选自由乙型肝炎和丙型肝炎组成的群组。

47.根据权利要求30到46中任一项所述的组合物，其中所述组合物是稳定的。

48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述组合物稳定至少约六个月。

49.根据权利要求47所述的组合物，其中所述组合物稳定至少约一年。

50.根据权利要求47所述的组合物，其中所述组合物在2℃到8℃下稳定至少六个月。

51.根据权利要求47所述的组合物，其中所述组合物在2℃到8℃下稳定至少一年。

52.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到51中任一项所述的配制品或组合物。

53.根据权利要求52所述的药物组合物，其中所述药物组合物是疫苗。

54.根据权利要求52或53所述的组合物，其进一步包括抗原。

55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述抗原选自结核病相关抗原、流感相关抗原、红血球凝聚素相关抗原、癌症相关抗原、病毒相关抗原和阿米巴病相关抗原。

56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述结核病相关抗原选自由ID93、ID91和BCG组成的群组。

57.根据权利要求55所述的组合物，其中所述流感相关抗原选自由H5N1、甲型流感、乙型流感和丙型流感组成的群组。

58.根据权利要求55所述的组合物，其中所述阿米巴病相关抗原是LecA。

59.根据权利要求55所述的组合物，其中所述病毒相关抗原选自由乙型肝炎和丙型肝炎组成的群组。

60.根据权利要求52到59中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是稳定的。

61.根据权利要求60所述的药物组合物，其中所述组合物稳定至少约六个月。

62.根据权利要求60所述的药物组合物，其中所述组合物稳定至少约一年。

63.根据权利要求60所述的药物组合物，其中所述组合物在2℃到8℃下稳定至少六个月。

64.根据权利要求60所述的药物组合物，其中所述组合物在2℃到8℃下稳定至少一年。

65.一种刺激受试者的免疫应答的方法，其包括向受试者施用根据权利要求1到64中任一项所述的配制品或组合物，并且由此刺激所述受试者的免疫应答。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述免疫应答是非特异性免疫应答。

67.根据权利要求65所述的方法，其中所述免疫应答是抗原特异性免疫应答。

68.根据权利要求65所述的方法，其中所述免疫应答涉及B细胞的活化、T细胞的活化、抗体的产生或细胞因子的释放。

69.根据权利要求65所述的方法，其中所述组合物用于单一疗法。

70.根据权利要求65所述的方法，其中所述组合物用于治疗过敏、成瘾、癌症或自身免疫。

71.根据权利要求65所述的方法，其中所述组合物用于疫苗。

72.根据权利要求65到71中任一项所述的方法，其中所述组合物的施用途径为口服、静脉内、皮内、经皮、经鼻、皮下或肛门。

73.根据权利要求65到72中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

74.根据权利要求65到72中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人类哺乳动物。

75.根据权利要求74中任一项所述的方法，其中所述非人类哺乳动物是狗、牛或马。

76.一种用于制备包括TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和辅助脂质的水性配制品的方法，其中包括所述TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和所述辅助脂质的所述组合物包括在1nm到约450nm范围内的颗粒；其中，所述方法包括：

(a)将TLR7/8激动剂或TLR4激动剂和辅助脂质混合到溶剂中以形成溶液；

(c)再水化来自步骤(c)的所述薄膜组合物以形成再水化的组合物；

以及

77.根据权利要求76所述的方法，其中所述高能量源由微流化器、挤出机、超声发生器、silverson混合器或均化器产生。

78.根据权利要求76所述的方法，其进一步包括将抗原与所述纳米悬浮液组合物混合。

79.根据权利要求76所述的方法，其进一步包括将铝盐与所述纳米悬浮液组合物混合。

80.根据权利要求76所述的方法，其进一步包括将铝盐和抗原与纳米悬浮液组合物混合。