CN114555629A - 糖肽疫苗 - Google Patents

糖肽疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN114555629A
CN114555629A CN202080035050.7A CN202080035050A CN114555629A CN 114555629 A CN114555629 A CN 114555629A CN 202080035050 A CN202080035050 A CN 202080035050A CN 114555629 A CN114555629 A CN 114555629A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
cells
liver
mice
days
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080035050.7A
Other languages
English (en)
Inventor
戴尔·伊恩·戈德弗里
威廉·罗斯·希斯
劳伦·爱丽丝·霍尔兹
伊恩·弗朗西斯·赫尔曼斯
加文·弗兰克·佩因特
里根·詹姆斯·安德森
本杰明·杰森·康普顿
希瓦利·阿什温·古拉布
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dai ErYienGedefuli
Lao LunAilisiHuoerzi
Malkop Biological Exploration Co ltd
Wei LianLuosiXisi
Victoria Link Ltd
Victoria University of Wellington
Original Assignee
Dai ErYienGedefuli
Lao LunAilisiHuoerzi
Malkop Biological Exploration Co ltd
Wei LianLuosiXisi
Victoria Link Ltd
Victoria University of Wellington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dai ErYienGedefuli, Lao LunAilisiHuoerzi, Malkop Biological Exploration Co ltd, Wei LianLuosiXisi, Victoria Link Ltd, Victoria University of Wellington filed Critical Dai ErYienGedefuli
Publication of CN114555629A publication Critical patent/CN114555629A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明一般涉及式I的糖肽缀合物化合物：如本文所述，包含缀合物化合物的组合物以及此类化合物作为疫苗的用途。

Description

糖肽疫苗
1.技术领域
本发明总体上涉及式I的糖脂-肽缀合物以及这些缀合物作为预防或降低受试者中疟疾发病率的疫苗的用途。
2.背景技术
疟疾是一种高度流行的寄生虫病，2016年每年约有2.16亿人感染疟疾，超过445,000人死亡。该疾病每年使严重受影响国家的国内生产总值减少数十亿，并造成受影响儿童的严重身心损害。
该疾病由疟原虫属(Plasmodiumspp.)引起，它通过雌性按蚊(Anophelesmosquitoes)传播。在被感染的蚊子叮咬后，注射到皮肤中的未成熟寄生虫(子孢子)通过血液循环到肝脏，在那里它们感染肝细胞。在人类中超过约一周，或在小鼠中超过两天，子孢子在肝细胞内成熟和复制。然后孢子体作为裂殖子释放到血液中，裂殖子能够感染和破坏红细胞并引起疾病。
疟疾寄生虫和产生的免疫应答的复杂性使得疟疾疫苗的开发非常困难。尽管30年前已经证明用放射减毒子孢子(RAS)进行疫苗接种引起针对疟疾的无菌保护，但迄今为止，目前仅有一种疟疾疫苗批准用于人类。
RTS,S疫苗(Mosquirix)是一种基于重组蛋白的疫苗，于2015年获得批准。虽然在试验中认为Mosquirix是最先进的疫苗候选物，但是它需要四次注射，并且功效相对低。鉴于这种低功效，世界卫生组织正在进行大规模的疫苗试点试验，然后建议将其用于婴儿。
因此，本领域非常需要新的疟疾疫苗。本发明的一个目的是提供用作疟疾疫苗的糖脂-肽缀合物和/或提供使用这种缀合物降低疟疾感染的发病率和/或预防疟疾和/或至少为公众提供有用的选择的方法。
在已经参考专利说明书，其他外部文件或其他信息源的本说明书中，这通常是出于提供讨论本发明的特征的上下文的目的。除非另外具体说明，否则对这些外部文件的引用不应被解释为承认这些文件或这些信息源在任何权限中是现有技术或形成本领域公知常识的一部分。
3.发明内容
在一个方面，本发明涉及式I的化合物：
Figure BDA0003347507440000021
其中
R1是(C17-C25)烷基，
R2是为丙氨酸或瓜氨酸的侧链，
E是选自S或Ox的连接基，
Figure BDA0003347507440000022
G不存在或是选自由以下组成的组的氨基酸序列：FFRK(SEQ ID NO：1)、FKFL(SEQID NO：16)和GFLG(SEQ ID NO：17)；以及
J是肽抗原。
在一个实施方案中，式I的化合物是式V.S.G.J的化合物：
Figure BDA0003347507440000023
其中
R1是(C17-C25)烷基，
R2是为丙氨酸或瓜氨酸的侧链，
G不存在或是选自由以下组成的组的氨基酸序列：FFRK(SEQ ID NO：1)、FKFL(SEQID NO：16)和GFLG(SEQ ID NO：17)；以及
J是肽抗原。
在一个实施方案中，式I的化合物是式V.Ox.G.J的化合物：
Figure BDA0003347507440000031
其中
R1是(C17-C25)烷基，
R2是为丙氨酸或瓜氨酸的侧链，
G不存在或是氨基酸序列FFRK(SEQ ID NO：1)、FKFL(SEQ ID NO：16)或GFLG(SEQID NO：17)，以及
J是肽抗原。
在一个实施方案中，J是由感染受试者肝中至少一种细胞的生物体表达的肽抗原。
在一个实施方案中，所述肽抗原被CD8+T细胞识别并增加响应于感染性生物体的肝组织驻留记忆T(TRM)细胞的数量。
在一个实施方案中，肽抗原是疟原虫属(Plasmodium spp)抗原，优选伯氏疟原虫(P.Berghei)抗原，优选优选伯氏疟原虫ANKA抗原。
在一个实施方案中，R1为(C19–C25)烷基，优选(C21–C25)烷基，更优选(C25)烷基。
在一个实施方案中，G是FFRK(SEQ ID NO：1)。
在一个实施方案中，J选自由以下组成的组：NVYDFNLL(SEQ ID NO：2)(NVYSP)、AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：3)(NVYLP)、NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)(NVFSP)和AAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：5)(NVFLP)、DNQKDIYYITGESINAVS(SEQ ID NO：6)、AAALTSALLNVDNLIQ(SEQ ID NO：7)、STNVFDFNNLS(SEQ ID NO：8)、EIYIFTNI(SEQ ID NO：13)、ILNSGLLAV(SEQ ID NO：18)、TKILNSGLLAVVG(SEQ ID NO：19)和HSLSILNSGLLAVLERD(SEQ ID NO：20)。
在一个实施方案中，式I化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003347507440000041
Figure BDA0003347507440000051
以及
Figure BDA0003347507440000052
在一个方面，本发明涉及包含式I化合物和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
在一个方面，本发明涉及包含式I药学上可接受的载体或赋形剂的疫苗。
在另一个方面，本发明涉及增加受试者中肝TRM细胞的数量的方法，其包括向所述受试者施用式I的化合物。
在另一个方面，本发明涉及在受试者中诱导将减少肝细胞感染的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用式I的化合物。
在另一个方面，本发明涉及免疫接种受试者以抵抗肝感染的方法，其包括向受试者施用式I的化合物。
以上讨论的本发明的不同方面的各种实施方案也在以下本发明的详细描述中阐述，但本发明不限于此。
本发明的其它方面可从以下描述中变得显而易见，所述描述仅作为示例并参考附图给出。
4.附图说明
现在将仅通过示例并参考以下附图来描述本发明，其中：
图1显示在使用Clec9A-靶向抗原初免期间，少数佐剂增强肝TRM细胞产生。
如实施例5所述，在用2μgαClec9a-AAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：5)(含有NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)PbT-I表位)连同以下佐剂之一接种前一天，将50,000个PbT-I.GFP细胞转移到B6小鼠中：
i.75μg的CpG类B(ODN2006)链接到CpG类P(21798)，
ii.50μg聚肌胞苷酸(Poly I:C)，
iii.40μg的RIG-I-配体(5’3p dsRNA)，在in vivo
Figure BDA0003347507440000061
中复合，
iv.75μg TLR7-配体(ssRNA)，在DOTAP中复合
v.75μg的cGAS-配体(dsDNA)，在in vivo
Figure BDA0003347507440000062
中复合
vi.1μg LPS。
28天后从所有小鼠收获肝脏(A)和脾脏(B)，并通过流式细胞术评估记忆T细胞的产生。记忆细胞定义为CD8+GFP+CD44+；从该初始门控中，将三个记忆亚群测定为TRM(CD69+CD62Llow)，效应记忆T细胞(TEM)(CD69-CD62Llow)和中央记忆T细胞(TCM)(CD69-CD62Lhigh)细胞。结果来自2个独立实验，每个实验每组使用至少3只小鼠。显示的数据显示平均值±S.E.M。
图2显示用表达疟疾抗原TRAP的小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染不诱导大量肝TRM细胞。
如实施例5所述，使用Clec9A-TRAP(SALLNVDN-SEQ ID NO：9)和CpG和rAAV-TRAP通过初免和诱捕对C57BL/6小鼠进行静脉内接种，或者用105PFU的表达疟疾TRAP抗原的重组MCMV(MCMV-TRAP)感染它们。接种后36天，回收脾(A)和肝(B)，并通过用H-2Db-SALLNVDN四聚体和细胞表面标记CD8、CD44、CD62L、CD69染色的流式细胞术评估。在CD8+、CD44high细胞上门控后，计数TRAP特异性TRM(CD69+CD62Llow)、TEM(CD69-CD62Llow)和TCM(CD69-CD62Lhigh)细胞的数量。结果来自使用每组4只小鼠的一个实验。显示的数据显示平均值±S.E.M。
图3显示α-GalCer作为初免和诱捕接种中CpG的替代物不产生大量的肝TRM细胞。
如实施例5所述，在用8μgαClec9a-NVY和5nmol的CpG或0.135nmol的α-GalCer接种前一天，将50,000个PbT-I.GFP细胞转移到C57BL/6小鼠中。第二天，用2.5x109拷贝的rAAV-NVY感染所有小鼠。35天后从所有小鼠收获脾(A)和肝(B)，并通过流式细胞术计数PbT-I TRM(CD69+CD62Llow)、TEM(CD69-CD62Llow)和TCM(CD69-CD62Lhigh)细胞的数量。显示的数据来自每组使用5只小鼠的一个实验。
图4显示本发明的缀合物化合物提供小鼠中肝TRM细胞数量的增加。
如实施例6所述，将40,000个Ly5.1+OT-I细胞过继转移到受体C57BL/6小鼠中。1天后，用PR8-OVA、α-GalCer和OVA长肽[αGC+OVALP]或含有OVA长肽的缀合物疫苗[V.S.FFRK.OVALP]处理受体小鼠。在接种后第21和60天从受体小鼠收获肝脏和脾脏，并通过流式细胞术评估记忆T细胞的产生(参见图5)。
图4A在用V.S.FFRK.OVALP接种后第21天肝脏中TRM细胞(CD8+Ly5.1+ CD44+ CD69+CD62Llow)和TEM细胞(CD8+Ly5.1+ CD44+ CD69- CD62Llow)的表型。图4B接种后第21天肝脏中存在的TRM细胞数量。图4C在接种后第21天肝脏中存在的TRM、TEM和TCM(CD8+Ly5.1+ CD44+CD69- CD62Lhigh)细胞的数量。图4D接种后第21天脾中存在的TRM、TEM和TCM细胞数量。图4E接种后第60天肝中存在的TRM细胞数量。图4F在接种后60天肝中存在的TRM、TEM和TCM细胞的数量。图4G接种后第60天脾中存在的TRM、TEM和TCM细胞数量。图4A-G中的结果来自两个独立的实验，在两个实验中总共使用10只小鼠。
图5显示了记忆CD8+T细胞群体的检测。
如实施例7所述，使用FSC-A和SSC-A图谱门控肝和脾淋巴细胞。使用FSC-A对FSC-H从分析中除去双联体，并通过消除对碘化丙啶染色呈阳性的细胞除去死细胞。然后通过在CD45.1或Ly5.1+细胞上门控选择供体CD8+T细胞群体，随后是表达活化/记忆标志物CD44和V2转基因TCR链的细胞。使用抗体针对CD69和CD62L描绘记忆亚群。对于使用PbT-I DC8+ T细胞的实验，使用GFP选择供体细胞。
图6显示具有较长脂肪酸链的缀合化合物扩增并激活脾和肝NKT细胞。
如实施例9所述，C57BL/6小鼠用α-GalCer或偶联疫苗V.S.FFRK.OVALP C26-C0(0.135nmol)静脉内接种以检测NKT细胞的活化水平。注射后3天通过流式细胞术对肝和脾进行分析。根据FSC和SSC图谱门控淋巴细胞，除去双联体，然后通过消除细胞DAPI阳性细胞排除死细胞。CD45R/B220抗体用于排除B细胞。用荧光CD1d/α-GalCer四聚体和CD3抗体检测NKT细胞。通过检测NK1.1和CD69的表达来确定NKT细胞的活化状态，两者在第3天均下调。图表显示了第3天时脾(A)和肝(D)中四聚体+CD3int细胞(NKT细胞)的数量，第3天时脾(B)和肝(E)中NK1.1阳性NKT细胞的百分比，以及第3天时脾(C)和肝(F)中CD69阳性NKT细胞的百分比。来自个体小鼠的数据以及平均值±S.E.M.呈现。
图7显示具有长脂肪酰基链的缀合物化合物对于肝TRM细胞形成和保护免受疟疾是最佳的。
如实施例9所述，在静脉内转移5×104个幼稚CD45.1+ OT-I T细胞后一天，用具有不同脂肪酰基链长度(C26-C0)的OVA缀合物疫苗(0.135nmol)免疫C57BL/6小鼠。(A至C)在免疫后第21天处死小鼠，通过FACS评估脾和肝的记忆CD8+T细胞形成。测定肝(A、B)和脾(C)中CD44+ CD8+记忆OT-I亚群[TCM(CD69- CD62L+)、TEM(CD69- CD62L-)和TRM(CD69+ CD62L-)细胞]的绝对数。使用总共7-8只小鼠/组从2个独立实验收集数据。误差条表示平均值±S.E.M；单因素ANOVA与Tukey's多重比较。(D和E)在免疫后第28天，用200OVA转基因PbA子孢子攻击如(A-C)中所述的免疫小鼠和未接种的小鼠的其余同龄组，并在攻击后至多12天测量寄生虫血症。(D)攻击后第7天的寄生虫血症(％感染的红血球(RBC))。显示平均值±S.E.M。(E)通过攻击后第12天血液阶段寄生虫血症的缺乏确定的无菌保护水平。
使用总共11只小鼠/组从2个独立实验收集数据。使用单因素ANOVA与(D)中的Tukey's多重比较检验和(E)中的Fisher's精确检验比较各组。
图8显示用缀合化合物V.S.FFRK.NVYSP接种保护一部分小鼠免于疟疾。
如实施例10所述，将50,000个PbT-I.GFP细胞转移到受体C57BL/6小鼠中。一天后，用αClec9a-NVY/CpG、单独的α-GalCer(αGC)或含有NVY短肽的缀合物疫苗[V.S.FFRK.NVYSP]处理受体小鼠。在第1天，用αClec9a-NVY/CpG处理的小鼠也用rAAV-NVY处理(P&T)。在接种后第35天从每组小鼠收集器官，并通过流式细胞术评估记忆T细胞的产生。
图8A接种后第35天肝中存在的TRM细胞(CD8+GFP+ CD44+ CD69+ CD62Llow KLRG1-)的数量。图8B用V.S.FFRK.NVYSP接种后35天肝脏中TRM和TEM细胞的表型。图8C和图8D接种后第35天肝(C)和脾(D)中PbT-I TRM、TEM(CD44+ CD69- CD62Llow)和TCM(CD44+ CD69- CD62Lhigh)细胞的数量。
在第42天用200个伯氏疟原虫子孢子攻击剩余小鼠，并且从第6-13天通过流式细胞术测量寄生虫血症。图8E疟疾攻击后第7天红细胞中存在的寄生虫百分比。图8F疟疾攻击后死亡或受到保护的小鼠数量。图8G用抗CXCR3mAb消耗肝TRM细胞取消保护。
结果来自2或3个独立实验，每个实验每组使用至少4只小鼠，未使用过的组除外。显示的数据显示平均值±S.E.M和在一些情况下(A、E)来自个体小鼠的数据。A和E组通过单因素ANOVA与Tukey's多重检验后比较进行比较。使用Fisher’s精确检验比较F组。****p<0.001。
图9显示缀合物化合物V.S.FFRK.NVYSP是有效的初免-加强疫苗。
如实施例8所述，将50,000个PbT-I.GFP细胞转移到受体C57BL/6或CD1d-/-小鼠中。在第0天和第30天用V.S.FFRK.NVYSP处理CD1d-/-小鼠(组1)。C57BL/6小鼠仅在第30天用V.S.FFRK.NVYSP处理(组2)，在第0天和第30天用V.S.FFRK.NVYSP处理(组3)，在第0天用αClec9a-NVY和CpG处理，在第30天用V.S.FFRK.NVYSP处理(组4)，或在第0天用αClec9a-NVY和CpG处理(组5)。在第50-60天从每组的小鼠中收获器官并评估记忆T细胞的产生。图9A，在接种后第50-60天肝PbT-I TRM细胞的数量。图9B和图9C，在接种后第50-60天肝(B)和脾(C)中存在的TRM、TEM和TCM细胞的数量。
在第73天用200个伯氏疟原虫子孢子攻击每组中剩余的小鼠，并在第79、80、81天测量寄生虫血症。连续两天从血液中挑出可见寄生虫的小鼠。用低剂量子孢子攻击存活的小鼠用3000个子孢子再攻击。在高剂量攻击后第5、6、7、8和12天测量寄生虫血症。图9D，在初次疟疾攻击后第7天红细胞中存在的寄生虫的百分比。这是在实验开始后80天。图9E，在200、或200和3000子孢子攻击后死于或被保护的小鼠的数量。
图10显示本文所述的含有肽侧翼残基的缀合物化合物产生大量肝TRM细胞。
如实施例11所述，将50,000个PbT-I.GFP细胞转移到受体C57BL/6小鼠中。一天后，用单独的α-GalCer(αGC)、α-GalCer和NVY长肽(αGC+NVYLP)、短肽(V.S.FFRK.NVYSP)和长肽(V.S.FFRK.NVYLP)缀合疫苗，或缺乏FFRK切割序列的长肽缀合疫苗(V.S.NVYLP)处理受体小鼠。在接种后第21-35天从每组的小鼠收集器官，并通过流式细胞术评估记忆T细胞的产生，如图5所示。在第42天用200个伯氏疟原虫子孢子攻击每组剩余的小鼠，并在第6、7、8和13天通过流式细胞术测量寄生虫血症。连续两天从血液中挑出可见寄生虫的小鼠。图10A，接种后第21-35天肝TRM细胞的数量。图10B和C，在接种后第21-35天肝(B)和脾(C)中存在的TRM、TEM和TCM细胞的数量。图10D，疟疾攻击后第7天红细胞中存在的寄生虫的百分比。图10E，200个子孢子攻击后死亡或受到保护的小鼠的数量。
图11显示缀合物化合物V.S.NVYLP不扩增或激活脾或肝NKT细胞。
如实施例11所述，用α-GalCer或缀合疫苗V.S.FFRK.NYYSP、V.S.FFRK.NVYLP或V.S.NVYLP接种C57BL/6小鼠。图A-B，第3天肝(A)和脾(B)中CD1d四聚体阳性NKT细胞数量。图C-D，第3天肝(D)和脾(E)中NKT细胞上CD69的平均荧光强度。图E-F，在第3天表达NK1.1的肝(E)和脾(F)中NKT细胞的百分比。图G，接种后18小时测量血清ALT。该图显示来自单个小鼠的数据以及平均值±SEM。通过单因素ANOVA与Tukey's多重检验后比较来比较各组。*p<0.05。
图12显示如本文所述使用肟化学连接的缀合物化合物(V.Ox.G.J化合物)引发针对疟原虫的无菌免疫。
如实施例12所述，将50,000个PbT-I.GFP细胞转移到受体C57BL/6小鼠中。一天后，用V.Ox.FFRK.NVYSP或V.S.FFRK.NVYSP缀合物处理受体小鼠。在接种后第21天从每组的小鼠收集器官，并通过流式细胞术评估记忆T细胞的产生，如图5所示。在第35天用200个伯氏疟原虫子孢子攻击每组剩余的小鼠，并在第6、7、8和13天通过流式细胞术测量寄生虫血症。连续两天从血液中挑出可见寄生虫的小鼠。图12A，接种后第21天肝TRM细胞的数量。图12B和图12C，在接种后第35天肝(B)和脾(C)中存在的TRM、TEM和TCM细胞的数量。图12D，200个子孢子攻击后第7天红细胞中存在的寄生虫百分比。图12E，疟疾攻击后死亡或受到保护的小鼠的数量。图12F，3000个子孢子攻击后第7天红细胞中存在的寄生虫百分比。图12G，疟疾攻击后死亡或受到保护的小鼠的数量。
图13显示缀合化合物可以产生对疟疾表位特异的内源性CD8+记忆T细胞。
如实施例13所述，在第0天、第14天和第35天(初免-加强-加强，PBB)给C57BL/6小鼠注射0.135nmol的包括NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)(V.Ox.FFRK.NVFSP)的糖脂肽缀合物疫苗，或使其保持未初免(幼稚)。免疫后56天计数PBB组的脾和肝中的四聚体+记忆CD8+T细胞(A)。收集来自2个独立实验的数据，总共4只小鼠/组。(B)在接种57天后，用200WT PbA子孢子攻击用V.Ox.FFRK.NVFSP接种3次的幼稚小鼠和PBB小鼠。当直到攻击后第12天没有检测到血液阶段寄生虫时，认为保护是无菌的。收集来自2个独立实验的数据，总共多达12只小鼠/组。
图14显示单个剂量的缀合化合物可以保护小鼠免受疟疾。
如实施例14中所讨论的，在第0天，给C57BL/6小鼠注射0.135nmol的糖脂肽缀合物疫苗(V.Ox.FFRK.NVFLP)，其包括侧翼序列[AAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：5)]的NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)。免疫后35天计数脾和肝中的四聚体+记忆CD8+T细胞(A)。收集来自2个独立实验的数据，总共10只小鼠/组。在接种后42天，用200 WT PbA子孢子攻击幼稚小鼠和接种过的小鼠(B)。当直到攻击后第12天没有检测到血液阶段寄生虫时，认为保护是无菌的。存活的小鼠在接种疫苗后第70天用3000个子孢子再攻击。在高剂量攻击后第5、6、7、8和12天测量寄生虫血症。收集来自2个独立实验的数据，总共10只小鼠/组。
图15显示缀合物化合物的第二剂量可增强对疟疾的保护。
如实施例15中所讨论的，在第0天，给C57BL/6小鼠仅注射0.135nmol的糖脂肽缀合物疫苗(V.Ox.FFRK.NVFLP)，包括具有侧翼序列[AAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：5)]的NVFDFNNL(SEQ ID NO：2)(组1-NVF/-)，仅在第30天注射V.Ox.FFRK.NVFLP(组2--NVF)，或在第0天和第30天注射V.Ox.FFRK.NVFLP(组3-NVF/NVF)。相对于第0天免疫，在第60天计数肝(A)和脾(B)中的四聚体+记忆CD8+T细胞。收集来自2个独立实验的数据，总共10只小鼠/组。在第0天接种后66天，用200WT PbA子孢子攻击幼稚小鼠和接种的小鼠(C)。当直到攻击后第12天没有检测到血液阶段寄生虫时，认为保护是无菌的。存活的小鼠在第0天接种后第85天用3000个子孢子再攻击。在高剂量攻击后第5、6、7、8和12天测量寄生虫血症。收集来自2个独立实验的数据，总共10-11只小鼠/组。
图16显示来自单一剂量的保护维持200天。
如实施例16所述，在第0天，给C57BL/6小鼠注射0.135nmol的糖脂肽缀合物疫苗(V.Ox.FFRK.NVFLP)。在200天内的不同时间点计数肝脏中的四聚体+记忆CD8+T细胞(A)。收集来自2-3个独立实验的数据，总共>9只小鼠/组。另外的小鼠在收获时用200个伯氏疟原虫子孢子攻击。(B)当直到攻击后第12天没有检测到血液阶段寄生虫时，认为保护是无菌的。收集来自2个独立实验(除了第35天和第75天，它们来自单个实验)的数据，总共10-11只小鼠/组。
图17显示来自单一剂量的保护优于当前金标准疟疾疫苗，辐射减毒子孢子(RAS)。
如实施例17中所述，给C57BL/6小鼠注射0.135nmol的糖脂肽缀合物疫苗(V.Ox.FFRK.NVFLP)或50,000个经照射的子孢子(RAS)，并在一个月后用200个伯氏疟原虫子孢子攻击。在安乐死时收获肝脏，所述安乐死是在检测到血液阶段感染时(攻击后第7天-灰色圆圈)或一旦小鼠被评估为受保护(第12天-空心圆圈)。然后评价肝细胞中NVF特异性TRM细胞(A)或总肝TRM细胞(B)的存在。保护数据概述于(C)中。收集来自2个独立实验的数据，总共10-11只小鼠/组。
图18显示了恶性疟原虫(P.falciparum)RPL6(PfRPL6(PF3D7_1338200))中HLA-A*02:01-限制性表位ILNSGLLAV(SEQ ID NO：18)的鉴定。
用25mg抗-CD40mAb+25mg聚肌胞+100mg PfRPL677-85肽(ILNSGLLAV)(SEQ ID NO：18)或无肽免疫表达人HLA-A*02:01且缺乏鼠MHC类分子表达的HHD小鼠。7天后，通过ELISpot，通过用相同的肽再刺激，测量脾中的PfRPL677-85特异性应答。使用双因素ANOVA分析数据；实验数＝2，小鼠数量＝3-4。
具体实施方式
5.1定义
提供以下定义以更好地定义本发明并作为本领域普通技术人员在实施本发明时的指导。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语应理解为与本公开内容所属的相关领域的普通技术人员所理解的含义相同。还相信可以使用本领域已知的标准微生物学、分子生物学、药理学和生物化学方案和程序来实施本发明。
术语“施用(administering)”或“施用(administration)”是指通过适于引起免疫应答的方法将本发明的化合物置于受试者中。
如本文所用，关于肝组织常驻记忆CD8+ T细胞(TRM)的如本文所用的术语“增加”(及其语法变化形式)意指相对于在适当对照(例如，未经处理)受试者(例如安慰剂或非活性剂)中观察到的肝TRM细胞的数量、用如本文所述的缀合化合物处理的受试者中肝TRM T细胞的数量的可测量或可观察到的增加。在优选的实施方案中，相对于适当的对照，可测量的或可检测的增加是统计学显著的增加。
“治疗有效量”(或“有效量”)是足以实现有益或期望结果(包括临床结果)的量，但不限于此。可以通过各种施用途径以一次或多次施用来施用治疗有效量。待施用至受试者的治疗有效量的缀合物化合物取决于例如化合物施用目的，施用模式，任何共同施用的化合物的性质和剂量，以及受试者的特征，诸如一般健康、其他疾病、年龄、性别、基因型、体重和对药物的耐受性。本领域技术人员能够根据这些任何其他相关因素确定合适的剂量。
在本公开的上下文中，用作人疫苗的化合物的治疗有效量是基于本文公开的小鼠数据预期在人中有效的缀合物化合物的量。这样的量可以由技术人员使用适当的转换模型来确定。
“受试者”是指人或非人动物，优选为哺乳动物的脊椎动物。非人类哺乳动物包括但不限于：家畜，例如牛、绵羊、猪、鹿和山羊；运动和伴侣动物，诸如狗、猫和马；和研究动物，诸如小鼠、大鼠、兔和豚鼠。优选地，受试者是人。
本文所用的“对照受试者”是指相关实验或测定所涉及的本领域技术人员将认识到的合适的对照受试者。
本文所用的术语“预防”及其语法上的变化形式当用于指肝感染，特别是寄生虫或病原体感染，优选疟原虫属感染，意指至少10％、优选至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、优选所有用本发明化合物处理的受试者在用感染肝细胞的药剂攻击后将不被感染。“无菌保护”意指100％用本发明用本发明化合物处理的受试者在用感染肝细胞的药剂攻击时将不被感染。
如本文所用的关于肝细胞感染的术语“减少”(及其语法变化形式)意指相对于在适当对照(例如，未经处理)受试者(例如,安慰剂或非活性剂)中观察到的感染细胞的数量、受试者中感染细胞的数量、优选用如本文所述的缀合化合物处理的受试者中肝细胞的数量的可测量或可观察到的减少。在优选的实施方案中，相对于适当的对照，可测量的或可检测的减少是统计学上显著的减少。
如本文所用的术语“感染肝细胞的药剂”是指可进入动物体、特别是人体并感染肝细胞的任何感染剂或生物体(例如，真菌、细菌、原生生物或病毒)。在一些实施方案中，药剂是Plasmodium。
本文所用的术语“疫苗”和语法变体是指刺激免疫应答，即诱导产生提供针对疾病的免疫力的抗体的物质。疫苗可以由疾病因子、疾病因子的产物或部分、或合成的替代物制备，并起激发抗原反应而不诱导实际疾病的作用。
如本文所用，用于肝脏感染的疫苗、特别是用于寄生虫感染、优选疟原虫感染的疫苗，是指在向受试者施用后至少10％、优选至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、优选所有接种的受试者提供来自感染的免疫力的物质。优选地，疫苗为接种的受试者提供无菌保护。
术语“抗原”是指含有一个或多个表位(线性的、重叠的、构象的或这些的组合)的分子，其在暴露于受试者后可诱导对该抗原特异的免疫应答。
本文所用的术语“肽抗原”是指由感染受试者肝脏中至少一种细胞的生物体表达的抗原。在一个实施方案中，所述肽抗原被CD8+ T细胞识别并增加响应于感染性生物体的肝TRM细胞的数量。
在一些实施方案中，与未施用所述化合物的本领域已知的合适对照受试者相比，在已施用本文所述的化合物的受试者中，肽抗原将肝TRM细胞的数量增加至少10、优选至少1×102、优选至少1×103、优选至少1×104个细胞。
在一些实施方案中，与仅施用单剂量的化合物的合适的对照受试者相比，在已施用第二剂量的如本文所述的化合物的受试者中，肽抗原将肝TRM细胞的数量增加至少10、优选至少1×102、优选至少1×103、优选至少1×104、优选至少1×105、优选至少1×106个细胞。
在一些实施方案中，增加肝TRM细胞的数量包括，与未施用所述化合物的本领域已知的合适对照受试者相比，在已经施用本文所述的化合物的受试者中肝TRM细胞的数量增加至少两倍、优选增加至少五倍、增加至少10倍、增加至少100倍、增加至少1000倍、优选增加至少10,000倍。
在一些实施方案中，增加肝TRM细胞的数量包括，与仅施用单一剂量的化合物的合适的对照受试者相比，在已经施用本文所述的化合物的受试者中肝TRM细胞的数量增加至少两倍、优选增加至少五倍、增加至少10倍、增加至少100倍、增加至少1000倍、增加至少10,000倍、增加至少100,000倍、优选增加至少1,000,000倍。
本文所用的术语“抗原攻击”是指将至少一种肝细胞暴露于由感染受试者肝脏中至少一种细胞的生物体表达的抗原。
术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指与组合物的其它成分相容并且对施用组合物的受试者无害的赋形剂或载体。
许多药学上可接受的载体和赋形剂由相关政府管理机构批准。药学上可接受的载体和赋形剂的示例包括无菌液体，如水和油(包括动物、植物、合成或石油)、盐水溶液、含水右旋糖和甘油溶液、淀粉葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、丙二醇、乙醇、润湿剂、乳化剂、粘合剂、分散剂、增稠剂、润滑剂、pH调节剂、增溶剂、软化剂、表面活性剂等。本发明的化合物可以配制成溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末和缓释制剂。合适的药学上可接受的载体和赋形剂的实例描述于雷明顿制药科学第18版，Gennaro编(Mack出版公司1990)。在与本发明化合物的组合物中存在药学上可接受的载体或赋形剂不损害本发明化合物的活性。
术语“烷基”是指具有至多30个碳原子的任何饱和烃基，并且包括任何C1-C25、C1-C20、C1-C15、C1-C10或C1-C6烷基。在一些实施方案中，“烷基”是指具有至多30个碳原子的任何直链饱和烃基。
术语“氨基酸”包括天然和非天然氨基酸。
术语“酰胺”包括N-连接的(-NHC(O)R)和C-连接的(-C(O)NHR)酰胺。
出于本发明的目的，对所公开的化合物的任何提及包括所有可能的制剂、构型和构象，例如呈游离形式(例如作为游离酸或碱)，呈盐或水合物形式，呈异构体(例如顺式/反式异构体)、立体异构体形式，诸如对映异构体、非对映异构体和差向异构体，呈对映异构体或非对映异构体的混合物形式，呈外消旋体或外消旋混合物形式，或呈个别对映异构体或非对映异构体形式。本文详细描述了化合物的具体形式。
术语“约”当与所引用的数字指示结合使用时意指所引用的数字指示加上或减去高达所引用的数字指示的10％。例如，“约100”是指90至110，“约六”是指5.4至6.6。
本说明书中使用的术语“包含”是指“至少部分由.组成”。当解释本说明书中包括该术语的陈述时，在每个陈述中以该术语序言的特征都需要存在，但也可以存在其他特征。诸如“包含(comprise)”和“包含(comprised)”的相关术语将以相同的方式解释。
此处所用的术语“基本上由……组成”是指特定的材料或步骤，以及不会对要求保护的发明的基本和新颖特征产生实质性影响的材料或步骤。
本文所用的术语“由……组成”是指所要求保护的发明的指定材料或步骤，不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。
意图是，对本文公开的数字范围的引用(例如1至10)也包含对该范围内所有合理数字的引用(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6，6.5、7、8、9和10)以及该范围内的任何有理数范围(例如2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)，并且因此，此处明确公开了所有范围的所有子范围。这些仅仅是具体意图的示例，并且所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合被认为在本申请中以类似的方式清楚地陈述。
5.2具体实施例
由于缺乏对哺乳动物免疫系统如何响应引起疟疾的寄生虫疟原虫的了解，寻找有效的疟疾疫苗受到阻碍。
30多年前，用辐射减毒子孢子(RAS)接种被证明通过靶向寄生虫生命周期的红细胞前期而引起无菌保护。发现对肝阶段感染的保护主要由CD8+ T细胞介导(Weiss WR,1988)(Seguin MC,1994)(RodriguesM,1993)，需要大量疟疾特异性CD8+T细胞(Schmidt NWP.R.,2008)(Schmidt NW B.N.,2010)。
然而，虽然长期以来已知CD8+ T细胞应答在疟疾疫苗接种中的重要性，但最近才发现组织驻留记忆CD8+T(TRM)细胞的作用。与在身体周围循环的大多数记忆T细胞不同，TRM细胞是永久驻留在组织中的非循环记忆T细胞群体，充当对抗病原体的防护物。TRM细胞具有独特的表型，并且可以通过特定标志物的表达与其它记忆T细胞类型区分。
最近发现，在肝脏中产生大量疟疾特异性TRM细胞(使用初免-诱捕接种方法)能够引发无菌免疫(即完全防止寄生虫从肝脏流出至血液)，并且是比目前的金标准红细胞前疟疾疫苗RAS更有效的接种方法。通过任一疫苗接种方法的保护绝对依赖于TRM的存在，因为使用抗CXCR3抗体消除该亚群的保护(Fernandez-Ruiz D,2016)。
因此，可刺激肝TRM细胞群产生的新疫苗可提供针对疟疾和其它肝感染的强保护。不幸的是，确定疫苗是否会诱导TRM而不是循环T细胞的因素定义不明确，使得难以预测哪些免疫原性剂可能能够产生提供有效疫苗所需的大量肝TRM细胞。
研究表明，局部抗原表达和炎症是肝脏中TRM产生的关键驱动因素(Fernandez-Ruiz D,2016)(Holz LE,2018)(Davies B,2017)(Khan TN,2016)(Mackay LK,2012)。尽管肝TRM细胞已显示在不存在肝相关抗原或炎症的情况下发育，但其数量显著减少(Holz LE,2018)。因此，发明人推论在肝脏中提供炎症和抗原信号的试剂可能有利于肝脏TRM产生。
佐剂如Toll-like样受体(TLR)激动剂是在接种过程中产生炎症的有效手段，并且可用于克服肽疫苗的差的免疫刺激能力，触发增强的T(16)和B细胞应答。因此，本发明人研究了这样的佐剂在一起施用时可以帮助疟疾抗原加强肝TRM细胞群的可能性。
然而，如实施例1所述，几种这样的佐剂与包含抗Clec9A-NVF缀合物的融合蛋白的共同施用发现仅CpG寡核苷酸对肝TRM细胞水平具有任何显著的影响(参见图1)。
还发现CpG佐剂在使用相同融合蛋白和重组腺伴随病毒载体的初免-捕获接种策略中是有效的。然而，用佐剂α-半乳糖基Ceramine(α-GalCer)替代CpG在初免-和-诱捕接种中产生差得多的肝TRM细胞应答(参见图3)，表明该关系更复杂。
α-Gal-Cer是与激活1型自然杀伤T(NKT)细胞的抗原呈递细胞(APC)上的CD1d受体结合的糖脂抗原。已知NKT细胞在许多动物模型的疫苗接种环境中提供佐剂作用(Gonzalez-Aseguinolaza G,2002)(Fujii S,2003)(Hermans IF,2003)(Anderson RJ,2017)。
NKT细胞通常在肝和脾中大量发现，并对APC上的CD1d分子中存在的α-GalCer快速反应，从而通过CD40L相互作用和可溶性因子激活APC(Fujii S,2003)。这种NKT细胞介导的“许可”促进趋化因子的释放以吸引幼稚T细胞(Semmling V,2010)，并且已经显示在增强抗原特异性CD8+ T 20细胞的交叉致敏中特别有效(Hermans IF,2003)，包括子孢子疫苗(Gonzalez-Aseguinolaza G,2002)。
重要的是，通常不认为NKT细胞是抗疟疾保护所必需的。缺乏NKT细胞的RAS-接种的CD1d缺陷小鼠在伯氏疟原虫子孢子攻击后显示与野生型小鼠相似的保护率(Widmann C,1992)。此外，CD1d敲除小鼠或NKT细胞耗尽的小鼠在RAS接种后显示正常的CD8+ T细胞应答，表明NKT细胞不提供对CD8+ T细胞的帮助(Li J,2015)(Scheiblhofer S,2017)。
本领域中的这种预期强调了本文所述的令人惊讶的结果，由此本发明人已经鉴定了一类化合物，其在增加肝TRM细胞群体方面极其有效，并且因此不仅可以用作疟疾疫苗接种策略中的佐剂，而且潜在地用作疫苗本身。
本文所述的化合物包含经由可裂解连接基缀合至肽表位的修饰的α-GalCer结构。α-GalCer组分是在酸性条件下通过二十六酰基部分的N→O酰基迁移修饰的α-GalCer，以暴露便于肽的化学连接的游离氨基。
该修饰的α-GalCer结构通过裂解后裂解的连接基与肽表位连接，一旦缀合物被APC获得，允许糖脂和肽组分在细胞内与连接基完全分离。
然后在糖脂结构内有利于反向O→N酰基迁移，形成α-GalCer，其然后可以通过CD1d呈递到NKT细胞。
这种通用的糖脂-肽缀合物疫苗设计方法在癌症和流感感染的小鼠模型中显示出前景。然而，α-GalCer不能增加肝TRM细胞群体使得α-GalCer-肽缀合物作为疟疾疫苗可能是有效，这令人惊讶，其中无菌保护需要在肝中产生大量疟疾特异性TRM细胞群体。
5.3本发明的化合物
本发明涉及一类特定的α-GalCer-肽缀合物，其已被发现在增加肝TRM细胞的数量中是高度有效的。
在一个方面，本发明涉及式I的化合物：
Figure BDA0003347507440000151
其中
R1是(C17-C25)烷基，
R2是为丙氨酸或瓜氨酸的侧链，
E是选自S或Ox的连接基，
Figure BDA0003347507440000152
G不存在或是选自由以下组成的组的氨基酸序列：FFRK(SEQ ID NO：1)、FKFL(SEQID NO：16)和GFLG(SEQ ID NO：17)；以及
J是肽抗原。
本发明的化合物包括缬氨酸-瓜氨酸或缬氨酸-丙氨酸基团。
在一个实施方案中，式I的化合物是式V.S.G.J的化合物：
Figure BDA0003347507440000161
其中
R1是(C17-C25)烷基，
R2是为丙氨酸或瓜氨酸的侧链，
G不存在或是选自由以下组成的组的氨基酸序列：FFRK(SEQ ID NO：1)、FKFL(SEQID NO：16)和GFLG(SEQ ID NO：17)；以及
J是肽抗原。
在一个实施方案中，式I的化合物是式V.Ox.G.J的化合物：
Figure BDA0003347507440000162
其中
R1是(C17-C25)烷基，
R2是为丙氨酸或瓜氨酸的侧链，
G不存在或是选自由以下组成的组的氨基酸序列：FFRK(SEQ ID NO：1)、FKFL(SEQID NO：16)和GFLG(SEQ ID NO：17)；以及
J是肽抗原。
名称V.S.G.J和V.Ox.G.J用于分别区分包含连接基基团SPAAC(应变促进的炔烃-叠氮化物环加成)和肟的本发明的缀合物。
除非另有说明，否则名称V.S.G.J和V.Ox.G.J表示其中R1为C25的化合物。
在一个实施方案中，R1为(C19–C25)烷基，优选(C21–C25)烷基，更优选(C25)烷基。在一个实施方案中，(Cx–Cy)烷基是指x至y个碳原子的直链饱和烃基。
在一个实施方案中，R1为(C19–C25)烷基、优选(C21–C25)烷基、更优选(C25)烷基，其中烷基为直链饱和烃基。
在一个实施方案中，R2是瓜氨酸的侧链。
在一个实施方案中，G是FFRK(SEQ ID NO：1)、FKFL(SEQ ID NO：16)或GFLG(SEQ IDNO：17)。
在一个实施方案中，G是FFRK(SEQ ID NO：1)。
在一个实施方案中，J包含结合由感染所述个体的肝中的至少一个细胞的生物体表达的抗原的表位。
在一个实施方案中，J包含结合由感染所述个体的肝的生物体表达的抗原的表位。
在一个实施方案中，肝脏中的细胞是树突细胞或巨噬细胞。
在一个实施方案中，肝脏中的细胞是抗原呈递细胞(APC)。
在一个实施方案中，肝脏中的细胞是肝细胞。
在一个实施方案中，J包含至少一个选自疟原虫表位的表位。
在一个实施方案中，疟原虫表位选自选自由以下组成的组的表位：DELDYENDIEKKICKMEKCS(SEQ ID NO：22)、ENDIEKKICKMEKCSSVFNV(SEQ ID NO：23)、GIQVRIKPGSANKPKDELDY(SEQ ID NO：24)、IKPGSANKPKDELDYENDIE(SEQ ID NO：25)、VTCGNGIQVRIKPGSANKPK(SEQ ID NO：26)、KPIVQYDNF(SEQ ID NO：27)、KPKDELDY(SEQ IDNO：28)、KPNDKSLY(SEQ ID NO：29)、KSKDELDY(SEQ ID NO：30)、MMRKLAILSV(SEQ ID NO：31)、MMRKLAILSVSSFLFVEALF(SEQ ID NO：32)、YLKKIKNSL(SEQ ID NO：33)、YLKKIQNSL(SEQID NO：34)、YLNKIQNSL(SEQ ID NO：35)、ASKNKEKAL(SEQ ID NO：36)、GIAGGLALL(SEQ IDNO：37)、HLGNVKYLV(SEQ ID NO：38)、KNKEKALII(SEQ ID NO：39)、KSLYDEHI(SEQ ID NO：40)、LRKPKHKKL(SEQ ID NO：41)、MINAYLDKL(SEQ ID NO：42)、MPNDPNRNV(SEQ ID NO：43)、LLMDCSGSI(SEQ ID NO：44)、MPNNPNRNV(SEQ ID NO：45)、HLGNKYLV(SEQ ID NO：46)、FILVNLLIFH(SEQ ID NO：47)、ALFFIIFNK(SEQ ID NO：48)、FLIFFDLFLV(SEQ ID NO：49)、GLIMVLSFL(SEQ ID NO：50)、GLLGNVSTV(SEQ ID NO：51)、GVSENIFLK(SEQ ID NO：52)、HVLSHNSYEK(SEQ ID NO：53)、ILSVSSFLFV(SEQ ID NO：54)、KILSVFFLA(SEQ ID NO：55)、LACAGLAYK(SEQ ID NO：56)、LLACAGLAY(SEQ ID NO：57)、MPLETQLAI(SEQ ID NO：58)、QTNFKSLLR(SEQ ID NO：59)、TPYAGEPAPF(SEQ ID NO：60)、VLAGLLGNV(SEQ ID NO：61)、VLLGGVGLVL(SEQ ID NO：62)、VTCGNGIQVR(SEQ ID NO：63)、EPSDKHIKEY(SEQ ID NO：64)、DLDEPEQFRL(SEQ ID NO：65)、IMVLSFLFL(SEQ ID NO：66)、KLKKIKNSI(SEQ ID NO：67)、KLQEQQSDL(SEQ ID NO：68)、KLRKPKHKKL(SEQ ID NO：69)、NLNDNAIHL(SEQ ID NO：70)、NMPNDPNRNV(SEQ ID NO：71)、SLKKNSRSL(SEQ ID NO：72)、TLRKPKHKKL(SEQ ID NO：73)、PSDKHIKEYLNKIQNSLSTE(SEQ ID NO：74)、IKEYLNKIQNSLSTEWSPCS(SEQ ID NO：75)、IKPGSANKPKDELDYANDIE(SEQ ID NO：76)、DLLEEGNTL(SEQ ID NO：77)、ILYISFYFI(SEQ IDNO：78)、RLEIPAIEL(SEQ ID NO：79)、VLDKVEETV(SEQ ID NO：80)、APFISAVAA(SEQ ID NO：81)、LLACAGLLAYK(SEQ ID NO：82)、AILSVSSFLF(SEQ ID NO：83)、DKHIKEYLNKIQNSL(SEQ IDNO：84)、EALFQEYQCYGSSSN(SEQ ID NO：85)、EKKICKMEKCSSVFN(SEQ ID NO：86)、ELNYDNAGTNLYNEL(SEQ ID NO：87)、FLFVEALF(SEQ ID NO：88)、FLFVEALFQEYQCYG(SEQ IDNO：89)、FVEALFQEY(SEQ ID NO：90)、KCSSVFNVVNSSIGL(SEQ ID NO：91)、KEYLNKIQNSLSTEW(SEQ ID NO：92)、LFVEALFQEY(SEQ ID NO：93)、LIMVLSFLF(SEQ ID NO：94)、QEYQCYGSSSNTRVL(SEQ ID NO：95)、SFLFVEALF(SEQ ID NO：96)、SSIGLIMVLSFLFLN(SEQ IDNO：97)、SSNTRVLNELNYDNA(SEQ ID NO：98)、SVFNVVNSSI(SEQ ID NO：99)、SVSSFLFVEA(SEQID NO：100)、SVSSFLFVEALFQEY(SEQ ID NO：101)、TNLYNELEMNYYGKQ(SEQ ID NO：102)、VFNVVNSSI(SEQ ID NO：103)、VFNVVNSSIGLIMVL(SEQ ID NO：104)、VNSSIGLIMVLSFLF(SEQID NO：105)、CEIFNVKPTCLINNS(SEQ ID NO：106)、EMRHFYKDNKYVKNL(SEQ ID NO：107)、ETQKCEIFNVKPCL(SEQ ID NO：108)、FEFTYMINF(SEQ ID NO：109)、FKADRYKSHGKGYNW(SEQ IDNO：110)、HPKEYEYPL(SEQ ID NO：111)、KLVFELSA(SEQ ID NO：112)、NEFPAIDLF(SEQ ID NO：113)、NEVVVKEEY(SEQ ID NO：114)、NQYLKDGGFAFPTE(SEQ ID NO：115)、SDVYRPINEH(SEQ IDNO：116)、TLDEMRHFYK(SEQ ID NO：117)、TQKCEIFNV(SEQ ID NO：118)、YEYPLHQEH(SEQ IDNO：119)、TLDEMRHFY(SEQ ID NO：120)、KSHGKGYNW,(SEQ ID NO：121)NSTCRFFVCK(SEQ IDNO：122)、YKSHGKGYNW(SEQ ID NO：123)、KSRGKGYNW(SEQ ID NO：124)、DASKNKEKALIIIKS(SEQ ID NO：125)、IRLHSDASKNKEKAL(SEQ ID NO：126)、KNKEKALI(SEQ ID NO：127)、LPMSNVKNV(SEQ ID NO：128)、LSMSNVKNV(SEQ ID NO：129)、LTMSNVKNV(SEQ ID NO：130)、ATSVLAGL(SEQ ID NO：131)、EPKDEIVEV(SEQ ID NO：132)、GLLNKLENI(SEQ ID NO：133)、KLEELHENV(SEQ ID NO：134)、MEKLKELEK(SEQ ID NO：135)、KLKEFIPKV(SEQ ID NO：136)、ALLACAGLAYKFVVP(SEQ ID NO：137)、ALLQVRKHLNDRINR(SEQ ID NO：138)、APFDETLGEEDKDLD(SEQ ID NO：139)、CEEERCLPKREPLDV(SEQ ID NO：140)、CLPKREPLDVPDEPE(SEQ ID NO：141)、ENVKNVIGPFMKAVC(SEQ ID NO：142)、EVDLYLLMDCSGSIR(SEQ ID NO：143)、LLSTNLPYGKTNLTD(SEQ ID NO：144)、LPYGKTNLTDALLQV(SEQ ID NO：145)、MNHLGNVKYLVIVFL(SEQ ID NO：146)、TLGEEDKDLDEPEQF(SEQ ID NO：147)、和TNLTDALLQVRKHLN(SEQ ID NO：148)。
在一个实施方案中，J包含至少一个选自由以下组成的组的表位：肝炎病毒表位，优选A、B、C和/或D表位，优选HBV表位。
在一个实施方案中，由感染肝脏或感染受试者肝脏中至少一种细胞的生物体表达的抗原是疟原虫抗原。
在一个实施方案中，疟原虫抗原在巨噬细胞或树突细胞上表达。在一个实施方案中，巨噬细胞或树突细胞是抗原呈递细胞。
在一个实施方案中，疟原虫抗原在肝细胞上表达。
在一个实施方案中，由感染肝脏或感染受试者肝脏中至少一种细胞的生物体表达的抗原是肝炎病毒抗原。
在一个实施方案中，肝炎病毒抗原在巨噬细胞或树突细胞上表达。在一个实施方案中，巨噬细胞或树突细胞是抗原呈递细胞。
在一个实施方案中，肝炎病毒抗原在肝细胞上表达。
在一个实施方案中，肝炎病毒抗原是A、B、C和/或D型肝炎抗原，优选HBV抗原。
在一个实施方案中，J包含位于至少一个表位侧翼的至少一个氨基酸残基。
在一个实施方案中，J包含在至少一个表位的N-末端和C-末端侧翼的至少一个氨基酸残基。
在一个实施方案中，J包含至少一个表位的N-末端或C-末端侧翼的一至十个氨基酸残基。
在一个实施方案中，J包含一个、优选两个、优选三个、优选四个位于表位的N-末端或C-末端或两者侧翼的氨基酸残基。
在一个实施方案中，J包含位于至少一个表位的N-末端或C-末端或两者侧翼的四个氨基酸残基。优选J包含位于表位N-末端侧翼的四个氨基酸残基和位于表位C-末端侧翼的四个氨基酸残基。优选地J包含HSLS或LERD或两者。
在一个实施方案中，至少一个表位包含含有HSLS的侧翼氨基酸序列和含有LERD的侧翼氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述至少一个表位包含由HSLS组成的侧翼氨基酸序列和由LERD组成的侧翼氨基酸序列。
在一个实施方案中，至少一个表位包含含有HSLS的N-末端氨基酸序列和含有LERD的C-末端氨基酸序列。
在一个实施方案中，至少一个表位包含由HSLS组成的N-末端氨基酸序列和由LERD组成的C-末端氨基酸序列。
在J包含多于一个表位的一些实施方案中，每个表位可包含如本文中“至少一个表位”所述的侧翼氨基酸残基。
在一个实施方案中，肽抗原包含N-末端间隔区。
在一个实施方案中，N-末端间隔区包含一个氨基酸残基，优选两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、优选十个或更多个氨基酸残基。
在一个实施方案中，N-末端间隔区包含三个氨基酸残基，优选三个氨基酸残基是AAA。
在一个实施方案中，J是疟原虫属抗原，优选伯氏疟原虫(P.Berghei)抗原，优选伯氏疟原虫ANKA抗原。
在一个实施方案中，G是FFRK(SEQ ID NO：1)。
在一个实施方案中，J选自由以下组成的组：NVYDFNLL(SEQ ID NO：2)(NVYSP)、AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：3)(NVYLP)、NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)(NVFSP)和AAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：5)(NVFLP)、DNQKDIYYITGESINAVS(SEQ ID NO：6)、AAALTSALLNVDNLIQ(SEQ ID NO：7)、STNVFDFNNLS(SEQ ID NO：8)、EIYIFTNI(SEQ ID NO：13)、ILNSGLLAV(SEQ ID NO：18)、TKILNSGLLAVVG(SEQ ID NO：19)和HSLSILNSGLLAVLERD(SEQ ID NO：20)。
在一个实施方案中，J选自由以下组成的组：NVYDFNLL(SEQ ID NO：2)(NVYSP)、AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：3)(NVYLP)、NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)(NVFSP)和AAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：5)(NVFLP)。
在一个实施方案中，J选自由以下组成的组：ILNSGLLAV(SEQ ID NO：18)、TKILNSGLLAVVG(SEQ IDNO：19)和HSLSILNSGLLAVLERD(SEQ ID NO：20)。
在一个实施方案中，式I化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003347507440000201
Figure BDA0003347507440000211
以及
Figure BDA0003347507440000212
在一个方面，本发明涉及包含式I化合物和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
一方面，本发明涉及包含式I化合物和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的疫苗。
本文所述的药物组合物和疫苗可以局部、口服或胃肠外施用，优选胃肠外。
例如，本文所述的药物组合物和疫苗可以胃肠外注射，例如静脉内、肌内或皮下注射。对于肠胃外给药，组合物和疫苗可以如本领域已知的配制，例如，在任选包含如盐或葡萄糖的其它物质的无菌水溶液或悬浮液中，但不限于此。
在肠胃外给药的一个非限制性示例中，将本发明的组合物或疫苗配制为可注射组合物，并且可以以无菌溶液或乳液的形式制备。
本文所述的组合物和疫苗可以以单位剂型存在并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。术语“单位剂型”是指单一剂量，其中所有活性和非活性成分在合适的系统中组合，使得施用药物的患者或人可以打开其中含有全部剂量的单一容器或包装，并且不必将来自两个或更多个容器或包装的任何组分混合在一起。单位剂型的任何示例不旨在以任何方式进行限制，而仅仅代表单位剂型药学领域中的典型示例。
5.4本发明化合物的用途
如上所述，本发明人惊奇地发现，所选择的一类化合物在增加受试者中肝TRM细胞的数量方面极其有效，因此本身是有效的疟疾疫苗。
本发明人已经表明，本发明的缀合化合物用于增加小鼠中肝TRM细胞的数量，如图4、5和6所示(参见实施例6)。
基于本文详述的它们的创造性贡献，本发明人相信，尽管本领域技术人员可能期望观察到受试者中肝TRM细胞的数量响应于增加受试者中肝TRM细胞的数量的抗原攻击而增加，技术人员将不期望看到在施用本发明化合物的受试者中观察到的肝TRM细胞数量的惊人相对增加(与对照受试者相比)。不希望受理论的束缚，本发明人相信提供在随后的试验中观察到的预防水平的肝TRM细胞的相对数量的这种惊人的增加。
此外，如实施例5中所示，已知佐剂对肝TRM细胞产生的作用是不可预测的，使得发明人甚至更惊讶的是，本发明的缀合物能够产生这种强烈的肝TRM细胞应答。
为了精确地证明肝TRM细胞对抗疟疾攻击的保护作用，本发明人显示用缀合化合物V.FFRK.NVYSP接种保护一部分小鼠免于疟疾(图4、7、8、9、10、12和14)。
在本发明化合物作为疫苗的效力的进一步证明中，本发明人显示缀合化合物V.FFRK.NVYSP是有效的初免-加强疫苗(图8)。
本发明人还已经确定，本发明的缀合物化合物可以被修饰以包含肽侧翼残基(至如本文所述的肽抗原中的表位序列的一侧或另一侧，或两者)，并且与包含含有缺乏肽侧翼残基的表位的抗原性肽的本发明的化合物相比，这样的修饰可以增加产生的肝TRM细胞的数量。
本发明人还显示，本发明化合物的特定子集(其是使用肟化学的如本文所述连接的缀合物)引发针对疟原虫的无菌免疫。
例如，当使用多剂量的具有侧翼序列[AAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：5)]的缀合物化合物V.Ox.FFRK.NVFLP[NVFDFNNL(SEQ ID NO：2)]接种小鼠时，肝TRM细胞对抗疟疾攻击的保护作用大大增强(图15)。
另外，本发明人已经显示，通过用本文所述的缀合化合物接种提供的针对疟疾攻击的肝TRM细胞的保护作用是长期的，单剂量的缀合化合物疫苗在接种后至少200天提供保护(图16)。
此外，用本文所述的缀合化合物的单次疫苗接种显示出比基于放射减毒子孢子(RAS)的当前金标准疟疾疫苗更有效(图17)。
此外，本文描述的是由疟原虫RPL6表位ILNSGLLAV(SEQ ID NO：18)触发的表位特异性CD8+T细胞应答(图18)。不希望受理论束缚，本发明人相信该表位可用作如本文所公开的缀合物化合物中的“J”(其中“J”包含SEQ ID NO：18、19或20中的任一个，基本上其组成，或由其组成)。当用作疫苗时，预期这样的缀合化合物在接种的受试者中起到增加肝TRM细胞的相对数量的作用，从而提供针对疟原虫的至少一定水平的预防。
总之，本文公开的数据表明，本发明的化合物，特别是当包含肽侧翼残基和肟键时，是有效的疟疾疫苗，并且可以直接或在初免-加强方案中使用以引发针对疟疾的TRM无菌保护。
肝感染
疟疾不是肝脏感染介导的唯一疾病或病症。肝感染是由各种寄生虫引起的，包括原生生物、细菌和病毒，它们可感染肝，引起可起到降低肝功能作用的炎症。损伤肝脏的某些病毒也可在血液或精液、污染的食物或水、或与感染者密切接触中传播。引起肝脏感染的常见病毒是肝炎病毒，包括甲肝(HBA)、乙肝(HBV)、丙肝(HBC)和丁肝(HBD)。
关于HBV，Pallet等人(Pallett,2017)证明存在大量的肝脏常驻的HBV特异性记忆T细胞群体，其表现出不同的表型并且被策略性地定位用于位点特异性免疫监视和免疫应答。
Pallet等人注意到，进一步解释肝脏常驻的HBV特异性记忆T细胞的作用以开发用于慢性HBV感染的有效免疫治疗方法是关键的。然而，Pallet等人未提供如何完成的指南。
鉴于本文提供的公开内容，本发明人相信，本领域技术人员认识到，通过修饰肽抗原以包含来自给定感染药剂的至少一个表位，其中所述表位增加肝TRM细胞的数量，本发明和本文所述的化合物可向受试者提供预防任何肝感染的水平。
特别地，本发明人相信，基于本文提供的公开内容，本领域技术人员可以通过修饰肽抗原以包含HBV表位而将本发明和本文描述的化合物用作针对HBV的疫苗，所述HBV表位激活CD8+T细胞群体，所述CD8+T细胞群体将肝TRM细胞的数量增加至足以提供针对或预防HBV感染的至少一定水平的预防的量。
因此，本公开不仅仅限于预防疟疾的方法，而是更广泛地包括将受试者中肝TRM细胞的数量增加至预防受试者肝中至少一种细胞感染的量的方法。
医疗用途
在另一个方面，本发明涉及增加受试者中肝TRM细胞的数量的方法，其包括向所述受试者施用式I的化合物。
在一个实施方案中，式I的化合物如本文针对本发明的化合物方面所阐述和涵盖的任何实施方案所定义。
在一个实施方案中，受试者中肝TRM细胞的数量相对于对照受试者增加。
在一个实施方案中，受试者中肝TRM细胞的数量相对于施用前受试者中肝TRM细胞的数量增加。
在一个实施方案中，相对于在对照受试者中观察到的肝TRM细胞的数量的任何增加或相对于施用前受试者中肝TRM细胞的数量，肝TRM细胞的数量增加约10倍、优选约100倍、优选约1000倍、优选约10,000倍、优选约100,000倍、优选约1,000,000倍。
在一个实施方案中，相对于在对照受试者中观察到的任何增加或相对于施用前受试者中肝TRM细胞的数量，肝TRM细胞的数量增加至少10倍、优选至少100倍、优选至少1000倍、优选至少10,000倍、优选至少100,000倍、优选至少1,000,000倍。
在一个实施方案中，相对于在对照受试者中观察到的任何增加或相对于施用前受试者中肝TRM细胞的数量，肝TRM细胞的数量增加至少1×101、优选至少1×102、优选至少1×103、优选至少1×104、优选至少1×105、优选至少1×106个细胞。
在一个实施方案中，相对于在对照受试者中观察到的任何增加或相对于施用前受试者中肝TRM细胞的数量，肝TRM细胞的数量增加约1×101、优选约1×102、优选约1×103、优选约1×104、优选约1×105、优选约1×106个细胞。
在一个实施方案中，相对于在对照受试者中观察到的任何增加或相对于施用前受试者中肝TRM细胞的数量，肝TRM细胞的数量增加约10％、优选约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、优选约100％。
在一个实施方案中，相对于在对照受试者中观察到的任何增加或相对于施用前受试者中肝TRM细胞的数量,肝TRM细胞的数量增加至少10％、优选至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、优选至少100％。
在一个实施方案中，肝TRM细胞的数量增加足以向受试者提供至少一些水平的预防的数量。
在一个实施方案中，提供的预防持续约60天、优选约70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、优选约200天。
在一个实施方案中，提供的预防持续至少60天、优选至少70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、优选至少200天。
在一个实施方案中，所提供的预防比向已施用包含放射减毒子孢子(RAS)的疟疾疫苗的受试者提供的预防大至少40％、优选大至少50％、优选大至少60％、优选大至少70％。
在一个实施方案中，所提供的预防比向已施用包含放射减毒子孢子(RAS)的疟疾疫苗的受试者提供的预防高约40％、优选高约50％、优选高约60％、优选高约70％。
在一个实施方案中，肝TRM细胞表达选自选自由以下组成的组的至少一种细胞表面标记：CD8、CD44和CD69，优选至少两种，优选全部三种细胞表面标记。
在一个实施方案中，肝TRM细胞表达CD8、CD44和CD69。
在一个实施方案中，肝TRM不表达KLRG1或CX3CR1。
在一个实施方案中，肝TRM细胞是CD8+Ly5.1+ CD44+ CD69+ CD62Llow。
在一个实施方案中，肝TRM细胞在CD8+、CD44high上门控后是CD69+CD62Llow。
在一个实施方案中，所述化合物与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂一起配制用于施用。
在一个实施方案中，施用包括全身施用，优选肠胃外施用。在一个实施方案中，肠胃外施用是通过注射。
在一个实施方案中，施用包括使用初免加强方案，优选异源初免加强方案施用化合物。
在一个实施方案中，初免加强方案包括第一次施用(A1)和第二次施用(A2)。
在一个实施方案中，A2与A1分开至少7、至少14、至少21、至少28、至少35、至少42、至少49、至少56、至少63、至少70、至少77、至少84、至少93、至少100天。
在一个实施方案中，A2与A1分开约7、约14、约21、约28、约35、约42、约49、约56、约63、约70、约77、约84、约93、约100天。
在一个实施方案中，A2与A1分开约30天。
在一个实施方案中，A2与A1分开至少30天。
在一个实施方案中，A2与A1分开30天。
在一个实施方案中，所述方法包括第三次施用A3。
在一个实施方案中，A1包括施用治疗有效量的化合物。
另一方面，本发明涉及式I化合物在制备用于增加受试者中肝TRM细胞数量的药物中的用途。
在一个实施方案中，药物包含有效量的式I化合物。
在一个实施方案中，有效量是治疗有效量。
在一个实施方案中，所述药物被配制用于向有此需要的受试者施用或呈用于施用的形式。
在一个实施方案中，所述药物为肠胃外施用的形式或被配制用于肠胃外施用。在一个实施方案中，肠胃外施用是注射、静脉内滴注或输注、吸入、吹入或鞘内或心室内施用。
在一个实施方案中，药物被配制为可注射组合物，或为可注射组合物的形式，或当施用时，通过注射施用。在一个实施方案中，药物被配制用于静脉内组合物，或为静脉内组合物的形式，或当施用时，静脉内施用。
在一个实施方案中，所述药物为用于胃肠外施用的形式，或配制为用于胃肠外施用的任何合适的溶液，优选无菌水溶液，其还可含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。
在一个实施方案中，所述药物是用于初免强化方案的形式或被配制用于初免强化方案。
在另一方面，本发明涉及式I的化合物，其用于增加受试者中肝TRM细胞的数量。
特别考虑作为涉及用于增加受试者中肝TRM细胞的数量的式I化合物和式I化合物在制备用于增加受试者中肝TRM细胞的数量的药物中的用途的本发明的实施方案，是式I化合物和增加受试者中肝TRM细胞数量的方法的所有实施方案，并且包括在本发明的方面内。
在另一个方面，本发明涉及在受试者中诱导将减少肝细胞感染的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用式I的化合物。
在一个实施方案中，免疫应答将肝细胞感染减少到没有正在进行的感染的程度。
在一个实施方案中，免疫应答预防血液阶段感染。
在一个实施方案中，免疫应答预防血液阶段感染持续约60天、优选约70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、优选约200天。
在一个实施方案中，免疫应答预防血液阶段感染至少60天、优选至少70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、优选至少200天。
在一个实施方案中，免疫应答防止红细胞感染。
在一个实施方案中，免疫应答防止红细胞感染持续约60天、优选约70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、优选约200天。
在一个实施方案中，免疫应答防止红细胞感染持续至少60天、优选至少70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、优选至少200天。
在一个实施方案中，与对照受试者相比，感染减少至少10％、优选至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、优选100％。
在一个实施方案中，与已经施用包含辐射减毒子孢子(RAS)的疟疾疫苗的受试者相比，感染减少至少10％、优选至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、优选至少70％。
在一个实施方案中，与已经施用包含辐射减毒子孢子(RAS)的疟疾疫苗的受试者相比，感染减少约10％、优选约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、优选约70％。
在一个实施方案中，肝细胞感染是疟原虫感染。
在一个实施方案中，肝细胞感染是肝炎病毒感染，优选肝炎病毒A、B、C和/或D感染，优选HBV感染。
在另一个方面，本发明涉及式I的化合物，其用于在受试者中诱导将减少肝细胞感染的免疫应答。
在另一方面，本发明涉及式I化合物在制备用于诱导免疫应答的药物中的用途，所述免疫应答将减少受试者的肝细胞感染。
特别考虑的本发明实施方案涉及诱导将减少受试者中肝细胞感染的免疫应答的方法，用于诱导将减少受试者中肝细胞感染的免疫应答的式I化合物，和式I化合物在制备用于诱导将减少受试者中肝细胞感染的免疫应答的药物中的用途，均为本发明式I化合物、增加肝TRM细胞数量的方法、用于增加肝TRM细胞数量的式I化合物和式I化合物在制备用于增加肝TRM细胞数量的药物中的用途的所有实施方案，并包括在所有方面内。
在另一个方面，本发明涉及免疫接种受试者以抵抗肝感染的方法，其包括向受试者施用式I的化合物。
在一个实施方案中，给受试者接种疫苗包括与对照受试者相比，在至少10％、优选至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、优选所有接种疫苗的受试者中，提供针对感染的免疫力。优选地，与对照受试者相比，接种受试者对受试者提供无菌保护。
在另一个方面，本发明涉及式I的化合物，其用于接种受试者以抵抗肝感染。
在另一个方面，本发明涉及式I的化合物在制备用于接种受试者以抵抗肝感染的药物中的用途。
本领域技术人员将能够参考文献和本文所述选择药物的适当施用模式。作为非限制性实例，包含注射或静脉内施用的肠胃外施用将优选用于针对肝感染的疫苗接种。
特别考虑的本发明实施方案涉及针对肝脏感染对受试者进行疫苗接种的方法，用于接种的式I化合物和式I化合物在制备用于接种的药物中的用途，均为本发明式I化合物，增加肝TRM细胞数量的方法、用于增加肝TRM细胞数量的式I化合物、式I化合物在制备用于增加肝TRM细胞数量的药物中的用途、诱导将减少受试者肝细胞感染的免疫应答的方法、用于诱导将减少受试者肝细胞感染的免疫应答的式I化合物和式I化合物在制造用于诱导免疫应答的药物(该免疫应答将减少受试者的肝细胞感染)中的用途的所有实施方案，并包括在所有方面内。
现在将通过参考以下实施例以非限制性方式说明本发明的各个方面。
6.实施例
6.1材料和方法
小鼠
C57BL/6(B6)、OT-I(Hogquist KA,1994)、PbT-I(Lau LS,2014)和CD1d-/-(ExleyMA,2003)小鼠在墨尔本大学微生物学和免疫学系或新西兰马拉汉医学研究所BRU饲养和维持。使用的所有小鼠均为6-12周龄，并且将相同性别的同窝出生仔畜随机分配至实验组。用于产生子孢子的动物是4-5周龄雄性SwissWebster小鼠，购自Monash Animal Services(澳大利亚维多利亚州墨尔本)并在22°至25℃下在12小时光/暗循环中在澳大利亚墨尔本大学生物科学学院饲养。
疟原虫感染
斯氏按蚊(STE2、MRA-128，来自BEI Resources)在澳大利亚生物安全部(农业和水资源部)批准的昆虫室中饲养。将条件保持在27℃和75-80％湿度下，在过滤的饮用水(Frantelle饮料，澳大利亚)中进行12h光和暗的光周期，并用Sera vipan幼鱼食物(Sera)喂养。幼虫在含有300只幼虫的塑料食物盘(P.O.S.M Pty，澳大利亚)中繁殖，每只每3天定期换水。在感染后，将成年蚊子转移到铝笼(BioQuipProducts公司，St.Rancho Dominguez，加利福尼亚州，美国)中并保持在安全培养箱(Conviron)中，在昆虫室中在相同的温度和湿度下并保持在10％蔗糖上。
伯氏疟原虫ANKA野生型Cl15cy1(BEI Resources，NIAID，NIH:MRA-871，由ChrisJ.Janse和Andrew P.Waters提供)用于攻击接种的小鼠(Kimura K,2013)。通过腹膜内(i.p)接种从供体小鼠获得的PbA感染的RBC，在第一次和第四次传代之间从冷藏保存的原液进行幼稚Swiss小鼠的感染。通过吉姆萨(Giemsa)涂片监测寄生虫血症，并在感染后3天量化外鞭毛。将1μL尾刺血与100μL去鞭培养基(补充有10％v/v胎牛血清、pH 8.4的RPMI[Invitrogen])混合，在20℃下孵育15分钟，并且对每1×104个红细胞的去鞭事件进行计数。一旦在每1×104个红细胞的12-15个外鞭毛事件之间评估外鞭毛速率，就允许斯氏按蚊喂给麻醉的小鼠。咬后22天，解剖唾液腺并检查子孢子的存在。
从蚊子唾液腺中切下子孢子(Ramakrishnan C,2013)，重新悬浮在冷PBS中，不进行攻击实验或使用γ60Co源以20,000rads照射。对于攻击实验，如所示静脉内注射200个新鲜解剖的PbA子孢子。在第6、7、8、10和12天使用流式细胞术评估小鼠的寄生虫血症。简言之，从小鼠收集一滴血，并用Hoechst 33258染料(ThermoFisher，Scoresby，维多利亚州，澳大利亚)在37℃染色1小时。使用紫色激光(405nm)在LSR Fortessa(BD Biosciences，圣何塞，美国)上分析样品以激发染料。在RBC上门控后，测量Hoechst阳性细胞的百分比。将数值与未感染的对照进行比较，一般认为>0.1％的数值对寄生虫是阳性的。对连续两天寄生虫阳性的小鼠实施安乐死。如果小鼠在攻击后第12天保持寄生虫血症阴性，则认为它们是无菌保护的。
糖脂-肽缀合物的合成：一般合成方法
无水溶剂可商购获得。空气敏感反应在Ar下进行。在涂覆有60F254二氧化硅的铝板上进行薄层色谱(TLC)。在
Figure BDA0003347507440000281
硅胶柱(38.6μm)或
Figure BDA0003347507440000282
硅胶(40-63μm)上进行快速柱层析。在Bruker 500MHz光谱仪上记录NMR光谱(Anderson RJ,2017)。1H NMR光谱参照在0ppm(内标)的四甲基硅烷或残留溶剂峰(CHCl3 7.26ppm，CHD2OD 3.31ppm，CHD2(SO)CD32.50ppm)。13C NMR光谱参照在0ppm(内标)的四甲基硅烷或氘代溶剂峰(CDCl3 77.0ppm，CD3OD 49.0ppm，(CD3)2SO 39.5ppm)。CDCl3-CD3OD溶剂混合物总是参照甲醇峰。在装配有Waters 2795 HPLC的Waters Q-TOF PremierTM串联质谱仪上进行高分辨率电喷雾电离(ESI)质谱。在Agilent 1100系统上获得半制备HPLC和合成纯度HPLC数据，并通过LCMS在具有Agilent 6130单四极质谱检测器的Agilent 1260 HPLC上使用ESI证实峰身份。这后两个系统中的每一个根据需要耦合到Dionex Corona Ultra RS CAD。
用于生物学研究的化合物的增溶：
α-Gal-Cer和α-Gal-Cer-肽缀合物的溶解通过将样品在前述用于溶解α-Gal-Cer的蔗糖水溶液、L-组氨酸和Tween 20存在下冻干来实现(Giaccone G,2002)。通常，将所有化合物在水中重构，然后在PBS中进一步稀释用于静脉内施用。
组织蛋白酶B试验反应
将植物鞘氨醇(190μM)在DMSO中的储备溶液与含有EDTA(2.5mM)和二硫苏糖醇(2.5mM)的乙酸铵缓冲液(50mM，pH 5.3)预混合至最终植物鞘氨醇浓度为6.3uM。将底物缀合物(190μM，在DMSO中)加入到预混合的缓冲溶液中，得到12.7μM的最终底物浓度。将溶解在乙酸铵缓冲液(50mM，pH 5.3，EDTA(2.5mM)、二硫苏糖醇(2.5mM))中的来自人肝的组织蛋白酶B(Sigma)加入到反应混合物中以得到2.9单位/mL的最终组织蛋白酶B浓度。对于对照反应(没有酶)，加入相同体积的缓冲液。然后将反应混合物在37℃温育。从反应中取出10uL的等分试样并在反应开始后1、4和24小时通过LCMS分析。
CD8+T细胞转移
如前所述，通过阴性选择从淋巴结和/或脾分离幼稚PbT-I CD8+ T细胞(Fernandez-Ruiz D,2016)。简言之，通过70μm细胞过滤器破坏组织并裂解红细胞。在与BioMag山羊抗大鼠IgG珠(Qiagen，Chadstone，VIC，Australia)温育之前，用对小鼠CD4、MHCII类、巨噬细胞和嗜中性粒细胞特异性的大鼠单克隆抗体的混合物标记单细胞悬浮液，并用磁体分离。计数富集的幼稚CD8+ T细胞，并通过用抗-CD8α和抗-Vα8.3TCR抗体染色分析它们的纯度。将PBS中的细胞计数调节至2.5x105/mL，并对小鼠静脉注射200μL。从汇集的淋巴结中分离出OT-I细胞。将一部分OT-I细胞用抗CD8α、抗Vα2、抗CD44和抗CD62L抗体染色以确定幼稚(CD8+CD44loCD62Lhi)CD8+ T细胞的比例。然后将104幼稚CD8+OT-I T细胞静脉注射到所有处理组的每只小鼠中。在用600pfu的重组PR8-OVA(H1N1)流感病毒，0.135nmol的αGalCer或0.135nmol的缀合物-疫苗静脉注射前一天，用幼稚OT-I或PbT-I细胞静脉注射小鼠。通过静脉内注射5nmol的CpG 2006-21798(Fernandez-Ruiz D,2016)(Krieg,2006)和8μg与LSNYVDFNLLLERD(SEQ ID NO：14)(Fernandez-Ruiz D,2016)(Caminschi I,2008)遗传融合的抗-Clec9A抗体在B6小鼠中引发幼稚PbT-I细胞。在一些实验中，接受抗Clec9a的小鼠另外用2.5×109拷贝的AAV-NVY(SEQ ID NO：15)处理(Fernandez-Ruiz D,2016)。
器官淋巴细胞分离
在免疫后的不同时间点从小鼠收获组织。对于脾细胞制备物，使器官通过70μm目并裂解红细胞。使肝细胞悬浮液通过70μm目并重悬于35％等渗Percoll(Sigma)中。然后将细胞在室温以500g离心20min，收获沉淀，然后在进一步分析前裂解红细胞。
流式细胞术
将淋巴细胞用单克隆抗体染色：CD49a(Ha31/8)，NK1.1(PK136)，来自BD(NorthRyde,NSW,Australia)，CD8α(53-6.7)，KLRG1(2F1)，Ly5.1(A20)，Ly5.1(104)，CD8α(53-6.7)，CD44(IM7)，Ly6C(HK1.4)，TCRβ(H57-597)，CXCR6(SA051D1)，CXCR3(CXCR3-173)，CX3CR1(SA011F11)，来自Biolegend(Australian Biosearch，Karrinyup，WA.Australia)，和CD62L(MEL-14)，CD101(Moushi101)和CD69(H1.2F3)，来自eBioscience(Jomar LifeResearch，Scoresby，VIC，澳大利亚)。通过碘化丙啶染色或远红外活/死可固定染料(ThermoFisher)排除死细胞。在一些实验中，在4℃下，细胞用内部生产的装载α-GalCer(PBS-44-来自美国犹他州杨百翰大学Paul Savage教授的礼物)的CD1d四聚体染色30min，洗涤，并在4℃下进一步进行抗体染色10分钟。使用的抗体：CD3(17A2)，CD45R/B220(RA3-6B2)，NK1.1(PK136)，CD69(H1.2F3)，全部来自BioLegend(CA，USA)。使用的存活染料是DAPI(Invitrogen，NZ)。使用单色阳性对照样品调节补偿，并使用Flowjo软件(Tree Star公司)在LSR Fortessa(BD Biosciences)或LSRII SORP上通过流式细胞术分析细胞。
血清ALT测量
血清ALT水平的测量由Gribbles兽医诊所(Hamilton，新西兰州)根据由国际认证新西兰批准的标准操作程序用模块化分析仪(Roche/Hitachi Modular P800，RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)进行。
统计分析
图是使用GraphPad Prism 7生成的。数据以平均值±S.E.M表示，如附图图例所示。将数据进行对数转换，评估正态性，然后进行具有Tukey多重比较检验的单因素ANOVA。为了比较攻击后的存活率，使用Fisher精确检验比较各组。对数据进行的统计检验显示在图例和结果中，样本量显示使用的动物数量。P值<0.05(*)，<0.01(**)，0.001(***)或0.0001(****)被认为具有统计学显著性。
用于SEQ ID NO的标记惯例：
在以下实施例和说明书的其它地方，本文所述缀合物中存在的氨基酸或核酸序列由SEQ ID NO：X–SEQ ID NO：Y编号。该标记惯例不表示序列范围，而是表示缀合物中连接在一起的氨基酸序列残基的离散区域；即例如：SEQ ID NO：1“连接至”SEQ ID NO：4(SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：4)。
实施例1-用于缀合的肽的合成
5-叠氮基戊酰基-FFRK-AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3)
5-叠氮戊酰基-FFRK-AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：1–SEQ ID NO：3)由FmocSPPS在4-(4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸(HMPB)
Figure BDA0003347507440000302
树脂上合成，该树脂预装了Fmoc-L-天冬氨酸4-叔丁酯(Fmoc-Asp(tBu))作为第一个氨基酸。使用具有以下侧链保护基的α-氨基酸：Arg(Pbf)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Asn(Trt)、His(Trt)、Tyr(tBu)、Asp(tBu)、Glu(tBu)，并且使用
Figure BDA0003347507440000301
Initiator+AlstraTM微波肽合成仪以0.1mmol规模合成肽。将树脂在DMF中溶胀(20min，70℃，50W)，随后进行由以下组成的合成反应循环：用DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护(3min，然后10min，室温)；和氨基酸偶联(5min，75℃，50W)，使用5当量的在DMF中的受保护的氨基酸(0.5M)，通过5当量的二异丙基碳二亚胺和
Figure BDA0003347507440000303
(均为0.5M，在DMF中)活化。将Fmoc-Arg(Pbf)和Fmoc-His(Trt)在室温下偶联60min。在最终的Fmoc脱保护后，使用标准氨基酸偶联条件在N-末端掺入5-叠氮基戊酸(0.5M，在DMF中)。用CH2Cl2洗涤树脂并真空干燥。随后通过在0℃下在10mL 88:5:5:2TFA/水/苯酚/i-Pr3SiH中孵育树脂10min实现从树脂的裂解。将树脂过滤，用另外的10mL裂解溶液并在室温静置2h。将粗肽沉淀并用冷乙醚研磨、分离(离心)并从95:5:0.2水/MeCN/TFA冻干。将肽溶解于DMSO(40mg/mL)中并在Agilent 1260 InfinityHPLC系统上通过将约30mg连续注射到Phenomenex LunaC18(2)4.6μm，250×21.2mm柱上，使用从36％MeCN/水(0.1％TFA)至50％MeCN/水(0.1％TFA)的线性梯度经10min纯化(流速＝16mL/min，T＝40℃)。收集含有足够纯度的所需肽的级分并冻干。纯化的肽显示目标肽的主峰，保留时间为9.27min，在9.14min有少量(1.6％)杂质。在m/z 951.4处的质量信号(对于[M+3H]3+计算为951.2)证实了主要产物的身份。
氨氧基乙酰基-FFRK-NVFDFNNL(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5)
如对于5-叠氮基戊酰基-FFRK-AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3)所述，氨基氧基乙酰基-FFRKNVFDFNNL(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5)由Fmoc SPPS在4-(4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸(HMPB)
Figure BDA0003347507440000304
树脂上合成,该树脂预装载Fmoc-L-天冬氨酸4-叔丁酯(Fmoc-Asp(tBu))作为第一氨基酸。使用具有以下侧链保护基的α-氨基酸：Arg(Pbf)、Lys(Boc)、Asn(Trt)，肽以0.1mmol规模合成。将Fmoc-Arg(Pbf)在室温下偶联60分钟。在最终的Fmoc脱保护后，通过与7当量的2,4,6-三甲基吡啶一起搅拌(20分钟，室温)，在N-末端引入氨氧基乙酸(3当量，0.06M，在DMF中)。用1:1CH2Cl2/异丙醇洗涤树脂并真空干燥。随后通过将树脂在5mL 88:5:5:2TFA/水/苯酚/i-Pr3SiH和180mg氨氧基乙酸半盐酸盐中在0℃下孵育10min来实现从树脂的裂解。将树脂过滤，用另外的5mL裂解溶液冲洗并在室温静置2h。如5-叠氮基戊酰基-FFRK-AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3)所述，将粗肽沉淀、研磨和冻干。将肽溶解在DMSO(40mg/mL)中，用水(0.2％TFA)稀释至1.8mg/mL，并在Agilent 1260Infinity HPLC系统上通过装载到Phenomenex Gemini 5μm C18110A，250×10mm柱上，使用21％MeCN/水(0.1％TFA)至31％MeCN/水(0.1％TFA)的线性梯度经100min纯化(流速＝5mL/min，T＝40℃)。收集含有足够纯度的所需肽的级分并冻干。纯化的肽显示目标肽的主峰(96％)，在m/z 817.4处的质量信号(对于[M+2H]2+计算为817.9)证实了产物的同一性。
氨氧基乙酰基-FFRK-AAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5)
如对于5-叠氮基戊酰基-FFRK-AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3)所述，氨基氧基乙酰基-FFRK-AAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5)由Fmoc SPPS在4-(4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸(HMPB)
Figure BDA0003347507440000312
树脂上合成,该树脂预加载Fmoc-O-叔丁基-L-丝氨酸(Fmoc-Ser(tBu))作为第一氨基酸。使用具有以下侧链保护基的α-氨基酸：Arg(Pbf)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Asn(Trt)、Asp(tBu)，肽以0.1mmol规模合成。将Fmoc-Arg(Pbf)在室温下偶联60分钟。在最终的Fmoc脱保护后，通过与7当量的2,4,6-三甲基吡啶一起搅拌(20分钟，室温)，在N-末端引入氨氧基乙酸(3当量，0.06M，在DMF中)。用1:1CH2Cl2/异丙醇洗涤树脂并真空干燥。随后通过将树脂在8mL 88:5:5:2TFA/水/苯酚/i-Pr3SiH和180mg氨氧基乙酸半盐酸盐中在0℃下孵育10min来实现从树脂的裂解。将树脂过滤，用另外的8mL裂解溶液冲洗并在室温静置2h。如5-叠氮基戊酰基-FFRK-AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3)所述，将粗肽沉淀、研磨和冻干。将肽溶解于DMSO(30mg/mL)中并在Agilent 1260Infinity HPLC系统上通过将约10mg连续注射到Phenomenex Luna C18(2)4.6μm，250×21.2mm柱上，使用从40％MeCN/水(0.1％TFA)至55％MeCN/水(0.1％TFA)的线性梯度经10min纯化(流速＝16mL/min，T＝40℃)。收集含有足够纯度的所需肽的级分并冻干。纯化的肽显示目标肽的主峰(93％)，在m/z 1061.9处的质量信号(对于[M+2H]2+计算为1062.2)证实了主要产物的同一性。
5-叠氮戊酰基-AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：3)，5-叠氮戊酰基-FFRK-NVYDFNLL(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2)，氨氧基乙酰基-FFRK-NVFDFNLL(SEQ ID NO：1-SEQID NO：4)和氨氧基乙酰基-FFRK-EIYIFTNI(SEQ ID NO：13)获自商业制造商Peptides andElephants。
实施例2：用于肟缀合的糖脂-连接基的合成
4-(N-((9H-芴-9-基)甲氧基羰基)-L-缬氨酰基-L-瓜氨酸酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯(Fmoc-VCPAB-pNP)
Figure BDA0003347507440000311
向醇Fmoc-VC-PABOH(Dubowchik,2002)(400mg，0.665mmol)在DMF(6.0mL)中的混合物中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(255mg，0.796mmol)和i-Pr2NEt(0.13mL，0.75mmol)。在室温下在Ar下搅拌18h后，在旋转蒸发器中将溶剂与甲苯共蒸发数次。通过硅胶快速色谱法(梯度洗脱，MeOH/CHCl3＝0:100至8:92)纯化，得到标题化合物，为浅黄色固体(380mg，75％)。1H NMR(500MHz,d6-DMSO)δ0.85(d,J＝6.7Hz,3H),0.88(d,J＝6.7Hz,3H),1.33-1.49(m,2H),1.56-1.64(m,1H),1.67-1.74(m,1H),1.95-2.02(m,1H),2.91-2.97(m,1H),2.99-3.06(m,1H),3.92(dd,J＝7.2,8.7Hz,1H),4.20-4.26(m,2H),4.28-4.33(m,1H),4.39-4.43(m,1H),5.24(s,2H),5.39(br s,2H),5.98(br t,J＝5.7Hz,1H),7.30-7.33(m,2H),7.36-7.42(m,5H),7.54-7.57(m,2H),7.63(d,J＝8.4Hz,2H),7.70-7.74(m,2H),7.87(d,J＝7.4Hz,2H),8.10(d,J＝7.4Hz,1H),8.29-8.32(m,2H),10.10(s,1H)；13C NMR(126MHz,d6-DMSO)δ18.3,19.2,26.8,29.4,30.5,38.7,46.8,53.2,60.2,65.8,70.3,119.2,120.1,122.7,125.4,125.5,127.2,127.7,129.46,129.54,139.4,140.8,143.8,143.9,145.3,152.0,155.4,156.2,159.1,170.8,171.4；HRMS-ESI:m/z计算C40H43N6O10[M+H]+ 767.3041,实测767.3070。
(2S,3S,4R)-2-(N-((9H-芴-9-基)甲氧基羰基)-L-缬氨酰基-L-瓜氨酸基-4-氨基苄氧基羰基氨基)-1-(δ-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基己酸酯(MaGC-PAB-CV-Fmoc)
Figure BDA0003347507440000321
在室温和Ar下，向胺MaGC(Anderson,2014)((73mg，0.085mmol)和碳酸酯Fmoc-VC-PAB-pNP(93mg，0.12mmol)在无水吡啶(1.5mL)中的混合物中加入Et3N(16μL，12mg，0.11mmol)。搅拌18小时后，将混合物浓缩至干，通过硅胶柱色谱法(MeOH/CHCl3＝0:100至20:80)纯化，得到标题化合物，为白色固体(66mg，52％)。1H NMR(500MHz,2:3CDCl3/CD3OD)δ0.87-0.90(m,6H),0.95-0.98(m,6H),1.24-1.37(m,68H),1.51-1.78(m,7H),1.89-1.96(m,1H),2.07-2.13(m,1H),2.32-2.42(m,2H),3.07-3.13(m,1H),3.20-3.25(m,1H),3.66-3.81(m,8H),3.84-3.87(m,2H),3.99(d,J＝6.7Hz,1H),4.24(t,J＝6.9Hz,1H),4.37(dd,J＝6.9,10.5Hz,1H),4.45(dd,J＝6.9,10.5Hz,1H),4.54(dd,J＝5.2,8.6Hz,1H),4.84(d,J＝3.7Hz,1H),4.97-5.03(m,2H),5.06-5.10(m,1H),7.30-7.33(m,4H),7.38-7.41(m,2H),7.58(d,J＝8.1Hz,2H),7.63-7.65(m,2H),7.78(d,J＝7.6Hz,2H)；13C NMR(126MHz,2:1CDCl3/CD3OD)δ14.3,18.2,19.4,23.0,25.5,25.7,26.7,29.2,29.6,29.27,29.74,29.8,29.93,29.95,29.98,30.02,30.05,30.08,30.10,31.4,32.3,35.0,39.4,47.6,52.7,53.8,61.2,62.3,66.8,67.4,68.4,69.4,70.2,70.7,71.0,72.3,75.1,100.4,120.3,120.5,125.40,125.44,127.5,128.2,129.1,133.0,138.2,141.7,144.2,144.3,157.1,157.6,161.1,171.1,173.2,175.0；HRMS-ESI m/z计算C84H137N6O16[M+H]+ 1486.0091，实测1486.0099。
(2S,3S,4R)-2-(L-缬氨酰基-L-瓜氨酸基-4-氨基苄氧基羰基氨基)-1-(δ-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基己酸酯(MaGC-PAB-CV-NH2)
Figure BDA0003347507440000322
在Ar下，向冰冷却的MaGC-PAB-CV-Fmoc(66mg，0.044mmol)的无水DMF(2mL)溶液中加入哌啶(0.20mL，2.0mmol)。5min后，将混合物温热至室温并再搅拌30min，然后在高真空下浓缩。通过硅胶快速色谱法(MeOH/CHCl3＝0:100至60:40)纯化，得到标题化合物，为白色固体(45mg，81％)。1H NMR(500MHz,2:1CDCl3/CD3OD)δ0.87-0.91(m,9H),1.00(d,J＝6.9Hz,3H),1.23-1.35(m,68H),1.49-1.77(m,7H),1.87-1.94(m,1H),2.07-2.13(m,1H),2.32-2.39(m,2H),3.10-3.16(m,1H),3.21(d,J＝4.9Hz,1H),3.24-3.29(m,1H),3.65-3.80(m,8H),3.85-3.87(m,2H),4.57(dd,J＝5.3,8.5Hz,1H),4.85(d,J＝3.7Hz,1H),4.92-4.99(m,2H),5.10-5.15(m,1H),7.33(d,J＝8.3Hz,2H),7.56(d,J＝8.3Hz,2H)；13C NMR(75MHz,3:1CDCl3/CD3OD)δ14.1,16.8,19.5,22.8,25.2,25.5,26.4,29.0,29.4,29.5,29.6,29.7,29.8,29.9,30.0,31.9,32.1,34.8,39.2,52.3,53.1,60.4,62.1,66.6,68.2,69.2,70.0,70.5,70.6,72.2,74.9,100.1,120.3,128.9,132.9,138.0,156.8,160.8,171.1,174.8,175.7；HRMS-ESI m/z calcd for C69H127N6O14[M+H]+ 1263.9410，实测1263.9419。
(2S,3S,4R)-2-(N-(8-氧杂壬酰基)-L-缬氨酰基-L-瓜氨酸基-4-氨基苄氧基羰基氨基)-1-(δ-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基己酸酯(MaGC-PAB-CV-Non)
Figure BDA0003347507440000331
将含有8-氧代壬酸(2.2mg，12μmol)，i-Pr2NEt(2.5μL，14μmol)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)(2.6mg，6.8μmol)的DMF溶液(250μL)加入到胺MaGC-PAB-CV-NH2(6.9mg，5.5μmol)中，并将混合物在室温下搅拌17小时。真空浓缩后，将残余物通过硅胶快速色谱法(MeOH/CH2Cl2＝8:92至20:80)纯化，随后用水研磨，得到标题化合物，为白色固体(6.6mg，85％)。1H NMR(500MHz,2:1CDCl3/CD3OD)δ0.87-0.90(m,6H),0.95-0.97(m,6H),1.11-1.43(m,72H),1.50-1.77(m,11H),1.87-1.94(m,1H),2.02-2.11(m,1H),2.15(s,3H),2.22-2.31(m,2H),2.32-2.41(m,2H),2.46(t,J＝7.3Hz,2H),3.09-3.14(m,1H),3.21-3.26(m,1H),3.64-3.83(m,8H),3.85-3.92(m,2H),4.18(d,J＝7.3Hz,1H),4.54(dd,J＝5.1,8.5Hz,1H),4.85(d,J＝3.7Hz,1H),4.93-5.02(m,1H),5.13(d,J＝12.2Hz,1H),7.32(d,J＝8.2Hz,2H),7.57(d,J＝8.2Hz,2H)；13C NMR(126MHz,2:1CDCl3/CD3OD)δ14.21,14.22,18.5,19.4,23.0,23.9,25.3,25.4,25.7,25.9,26.7,29.1,29.3,29.6,29.69,29.71,29.8,29.89,29.91,29.95,29.98,30.01,30.04,30.05,30.06,31.0,32.3,35.0,36.4,43.9,52.6,53.7,59.4,62.3,66.8,68.4,69.4,70.2,70.7,71.0,72.3,75.1,100.4,120.5,129.1,133.0,157.1,161.1,171.0,172.9,175.0,175.2,211.4；HRMS-ESI m/z计算C78H140N6NaO16[M+Na]+ 1440.0218,实测1440.0214.
实施例3：糖脂-肽缀合物的合成
SPAAC缀合疫苗
如前所述合成MaGC-PAB-CV-环辛炔和缀合物化合物V.S.FFRK.OVALP(C26)。(Anderson RJ,2017)
Figure BDA0003347507440000341
缀合物V.S.FFRK.NVYSP
Figure BDA0003347507440000342
将5-叠氮基戊酰基-FFRK-NVYDFNLL(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2)(1.6mg，0.96μmol)和MaGC-PABA-CV-环辛炔(1.0mg，0.69μmol)在DMSO(100μL)中的溶液在室温下保持2天。将产物溶液通过半制备型HPLC(Phenomenex Luna C18(1)，4.6μm，250×10mm，40℃，流动相A＝100:0.05水/TFA；流动相B＝100:0.05MeOH/TFA；梯度程序：T0＝80％B，T12＝100％B，T14＝100％B，T14.5＝80％B，T16＝80％B；流量：T0＝3mL/min，T1＝3mL/min，T12＝4.5mL/min，T14＝4.5mL/min，T16＝3mL/min)，得到V.S.FFRK.NVYSP，为白色粉末(1.8mg，82％)。HRMS-ESI m/z计算C162H257N27O35[M+2H]2+ 1570.4580，实测1570.4591。
缀合物V.S.NVYLP
Figure BDA0003347507440000351
将5-叠氮基戊酰基-AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：3)(2.2mg，0.97μmol)和MaGC-PABA-CV-环辛炔(1.0mg，0.69μmol)在DMSO(100μL)中的溶液在室温下保持2天。如上文对V.S.FFRK.NVYSP所述纯化产物溶液，得到V.S.NVYLP，为白色粉末状(1.9mg，73％)。HRMS-ESI m/z计算C180H293N35O48[M+2H]2+ 1856.5781，实测1856.5786。
缀合物V.S.FFRK.NVYLP
Figure BDA0003347507440000352
将5-叠氮基戊酰基-FFRK-AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3)(8.4mg，2.9μmol)和MaGC-PABA-CV-环辛炔(2.9mg，2.0μmol)在DMF(300μL)中的溶液在室温下放置1天。将粗产物V.S.FFRK.NVYLP溶液用另外的DMF(300μL)稀释并且按原样用于配制。用DMSO(127μL)稀释73μL体积(理论上1mg产物)，得到5mg/mL溶液，如方法部分中所述配制。HRMS-ESI m/z计算C210H336N43O52[M+3H]3+ 1430.8318，实测1430.8323。
肟缀合物疫苗
缀合物V.Ox.FFRK.NVYSP
Figure BDA0003347507440000353
苯胺缓冲液(pH＝4.1，300mM)通过将新蒸馏的苯胺(5.5mL)和TFA(3.9mL)在MilliQ水中混合并补足至200mL的总体积来制备。从2,4-二硝基苯肼中蒸馏THF。将肽氨氧基乙酰基-FFRK-NVYDFNLL(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2)(3.9mg，2.4μmol)和酮MaGC-PAB-CV-Non(2.0mg，1.4μmol)的混合物在4:2:3THF/甲醇/苯胺缓冲液(300μL)中在50℃下加热16h。将产物混合物通过制备型HPLC[Phenomenex Luna C18(2)，5μm，250×21.2mm,30℃,17mL/min；流动相A＝30:70:0.05水/甲醇/TFA；流动相B＝100:0.05MeOH/TFA；0-13min：100％A至100％B；13-15min：100％B；15-16min：100％B至100％A；16-18min：100％A]，得到标题化合物V.Ox.FFRK.NVYSP，为白色固体(3.3mg，77％)。HRMS-ESI m/z计算C157H252N25O35[M+2H]2+ 1524.4388，实测1524.4380。
缀合物V.Ox.FFRK.NVFSP
Figure BDA0003347507440000361
将肽氨氧基乙酰基-FFRKNVFDFNNL(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4)(4.4mg，2.7μmol)和酮MaGC-PAB-CV-Non(2.1mg，1.5μmol)的混合物在4:2:3THF/甲醇/苯胺缓冲液(300μL，如上文关于V.Ox.FFRK.NVYSP所述制备)中在50℃下加热16h。如上文对V.Ox.FFRK.NVYSP所述纯化产物溶液，得到V.S.NVFSP,为白色粉末(2.1mg，47％)。HRMS-ESI m/z计算C155H246N26O35[M+2H]2+ 1516.9252，实测1516.9213。
缀合物V.Ox.FFRK.NVFLP
Figure BDA0003347507440000362
将肽氨氧基乙酰基-FFRKAAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5)(4.3mg，2.0μmol)和酮MaGC-PAB-CV-Non(2.0mg，1.4μmol)的混合物在4:2:3THF/甲醇/苯胺缓冲液(300μL，如上文关于V.Ox.FFRK.NVYSP所述制备)中在50℃下加热16h。如上文对V.Ox.FFRK.NVYSP所述纯化产物溶液，得到V.S.NVFLP,为白色粉末(2.2mg，46％)。HRMS-ESIm/z计算C174H278N32O44[M+3H]3+1174.3578，实测1174.3564。
缀合物V.Ox.FFRK.EIYSP
Figure BDA0003347507440000363
将肽氨氧基乙酰基-FFRK-EIYIFTNI(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：13)(3.9mg，2.3μmol)和酮MaGC-PAB-CV-Non(2.0mg，1.4μmol)的混合物在4:2:3THF/甲醇/苯胺缓冲液(300μL，如上文针对V26Ox.FFRK.NVYSP所述制备)中在50℃下加热16h。如上文对V26Ox.FFRK.NVYSP所述纯化产物溶液，得到V.S.EIYSP，为白色粉末(3.6mg，84％)。HRMS-ESI m/z计算C159H256N24O35[M+2H]2+1531.9573，实测1531.9589。
实例4：具有不同长度的脂肪酸(R1)的缀合物的合成
使用下述通用方法B-E化学合成含有不同长度脂肪酸的前药化合物(方案1)。
方案1
Figure BDA0003347507440000371
用于酰化α-半乳糖基植物鞘氨醇的通用方法(B)
在室温下向脂肪酸(1.2-1.5当量)于CH2Cl2中的搅拌溶液中添加Et3N(10当量)和IBCF(1.5当量)。50min后，将溶液冷却至0℃并滴加至在冰上冷却至0℃的胺(MaGC，24)(0.1摩尔/升)的DMF溶液中。将反应物在Ar下在室温下搅拌直至通过TLC和HPLC(A：水+0.05％TFA，B：甲醇+0.05％TFA；A：B-在15min内70:30至0:100)。将反应混合物在真空下浓缩。
用于脂肪酰基链的N→O迁移的通用方法(C)
从酸化的2,4-二硝基苯肼中新蒸馏出1,4-二恶烷。在Ar下将糖脂起始物质悬浮于1,4-二恶烷(0.1摩尔/L)中且加热至63℃。向该溶液中加入37％HCl水溶液(11当量)并在61℃下搅拌。使用TLC和HPLC监测反应(A：水+0.05％TFA，B：MeOH+0.05％TFA；A：B-在11min内60:40至0:100)。30分钟后，将反应混合物浓缩。
用于连接基连接的通用方法(D)
在Ar下，向由通用方法C获得的粗胺和pNP-碳酸酯11(1.4当量)在无水吡啶(相对于胺0.1摩尔/L)中的搅拌混合物中加入Et3N(1.4当量)。将反应物在室温下搅拌过夜，并使用TLC和HPLC监测(A：水+0.05％TFA，B：MeOH+0.05％TFA；A：B-在12min内70:30至0:100)。然后将反应在真空下浓缩，将固体重新溶解在5％MeOH/CHCl3中并使用硅胶快速色谱法纯化。
用于SPAAC反应的通用方法(E)
将5-叠氮基戊酰基-FFRK-KISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT(SEQ ID NO：1-SEQID NO：11)(68)
(1.1当量)和从通用方法D获得的环辛炔原料溶解于DMSO中并将反应物在室温下放置过夜。在反应完成后，如通过HPLC所监测，使用C18制备型HPLC(A：水+0.05％TFA，B：MeOH+0.05％TFA)。合并含有纯化的缀合物的级分，浓缩并冻干。
(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(((2S,3S,4R)-3,4-二乙酰氧基-2-二十六酰胺基十八烷基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(25)
Figure BDA0003347507440000381
向蜡酸(35mg，0.087mmol)在CH2Cl2(0.42mL)中的搅拌溶液中加入Et3N(84μL，0.60mmol)和IBCF(12μL，0.088mmol)。将反应物在室温下搅拌1小时。然后将溶液冷却并滴加到胺24(30mg，0.058mmol)的冷DMF(0.1mL)溶液中。将反应物在Ar下在室温下搅拌2.5h。向反应混合物中加入乙酸酐(0.35mL，3.6mmol)和催化量的DMAP(0.8mg，0.007mmol)并搅拌过夜。将反应物用MeOH(5mL)稀释，在室温下搅拌1h并在真空下浓缩。将粗产物再溶解于10％EtOAc/石油醚中，并使用硅胶快速色谱法(25％EtOAc/石油醚)纯化，得到化合物25，为白色固体(25mg，38％，Rf＝0.2,30％EA/PE)1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ6.53(d,J＝9.7Hz,1H),5.45(d,J＝3.3Hz,1H),5.35(dd,J＝10.8,3.4Hz,1H),5.31(dd,J＝10.2,2.4Hz,1H),5.13(dd,J＝10.8,3.6Hz,1H),4.92(d,J＝3.7Hz,1H),4.90-4.84(m,1H),4.37(tt,J＝10.0,2.7Hz,1H),4.16-4.08(m,2H),4.06-3.99(m,1H),3.66(dd,J＝10.7,2.8Hz,1H),3.39(dd,J＝10.7,2.4Hz,1H),2.30-2.24(m,2H),2.13(s,3H),2.10(s,3H),2.06(s,3H),2.04(s,3H),1.99(d,J＝4.5Hz,6H),1.89-1.79(m,2H),1.70-1.58(m,4H),1.38-1.18(m,68H),0.88(t,J＝6.9Hz,6H)。
N-((2S,3S,4R)-3,4-二羟基-1-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)十八烷-2-基)二十六酰胺(12)
Figure BDA0003347507440000382
将甲醇钠(5μL，0.027mmol)加入到per-OAc-α-GalCer 25(25mg，0.022mmol)在1:2CH2Cl2:MeOH(0.6mL)中的搅拌溶液中。将反应物在室温下搅拌。在反应开始2min后形成白色沉淀。1.5h后，用1:1CH2Cl2:MeOH(2mL)稀释反应，并真空浓缩。将粗产物再溶解于10％MeOH/CHCl3中，并使用硅胶快速色谱法(10％MeOH/CHCl3)纯化，得到化合物12，为白色固体。(15mg，78％，Rt＝10.2min，99.8％由CAD纯化)。1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.91(d,J＝3.8Hz,1H),4.23-4.15(m,1H),3.96-3.86(m,2H),3.84-3.65(m,6H),3.59-3.52(m,2H),2.21(t,J＝7.7Hz,2H),1.72-1.51(m,4H),1.38-1.21(m,68H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H)。13CNMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ175.0,100.2,75.1,72.4,71.3,70.7,70.2,69.4,67.8,62.2,50.9,36.8,32.9,32.3,30.1,30.07,30.03,29.9,29.8,29.7,26.3,26.2,23.0,14.2。HRMS-ESI-计算C50H100NO9[M+H]+ 858.7398，观察858.7398
N-((2S,3S,4R)-3,4-二羟基-1-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)十八烷-2-基)二十四酰胺(67)
Figure BDA0003347507440000391
使用通用实验方法B进行胺24(32mg，0.066mmol)与木蜡酸(38mg，0.10mmol)的酰化。将粗产物再溶解于热EtOH中并在-18℃下冷却以形成沉淀。然后将充分干燥的沉淀再溶解于温热的5％MeOH/CHCl3中，并使用硅胶快速色谱法(80％MeOH/CHCl3)纯化，得到化合物67，为白色固体(32mg，58％，Rt＝9.7min，99.8％纯，由CAD测得)。1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.91(d,J＝3.7Hz,1H),4.24-4.15(m,1H),3.96-3.86(m,2H),3.84-3.66(m,6H),3.59-3.53(m,2H),2.21(t,J＝7.7Hz,2H),1.72-1.50(m,4H),1.42-1.18(m,64H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H)。13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ175.0,100.2,75.1,72.4,71.2,70.7,70.2,69.4,67.8,62.2,50.98,50.9,36.9,36.8,32.8,32.3,30.15,30.07,30.04,29.9,29.8,29.7,26.3,26.2,23.0,14.2。HRMS-ESI-计算C48H96NO9[M+H]+ 830.7085,观察830.7058
N-((2S,3S,4R)-3,4-二羟基-1-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)十八烷-2-基)二十二酰胺(65)
Figure BDA0003347507440000392
使用通用实验方法B进行胺24(32mg，0.066mmol)与二十二烷酸(35mg，0.10mmol)的酰化。将粗产物重新溶解在温热的50％MeOH/CHCl3中并干燥负载在二氧化硅上。使用硅胶快速色谱法(21％MeOH/CHCl3)纯化产物，得到化合物65，为白色固体(26mg，49％，Rt＝9.3min，99.8％纯,由CAD测得)。1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.91(d,J＝3.8Hz,1H),4.23-4.17(m,1H),3.96-3.86(m,2H),3.83-3.66(m,6H),3.55(dd,J＝5.7,2.5Hz,2H),2.21(t,J＝7.7Hz,2H),1.72-1.50(m,4H),1.43-1.19(m,60H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H)。13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ175.0,100.2,75.1,72.4,71.3,70.7,70.2,69.4,67.8,62.2,50.9,36.8,32.9,32.3,30.17,30.13,30.08,30.07,30.05,30.03,30.01,29.9,29.8,29.76,29.73,29.71,26.28,26.25,23.0,14.2。HRMS-ESI-计算C46H92NO9[M+H]+ 802.6772，观察802.6784
N-((2S,3S,4R)-3,4-二羟基-1-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)十八烷-2-基)二十酰胺(64)
Figure BDA0003347507440000401
使用一般实验方法B进行胺24(34mg，0.071mmol)与花生酸(34mg，0.11mmol)的酰化，有一些变化。反应完成后，加入哌啶(0.2mL，0.44mmol)以淬灭反应并再搅拌1h。将反应混合物在真空下浓缩，并将粗产物溶解于温热的50％MeOH/CHCl3中并干燥装载至二氧化硅。使用硅胶快速色谱法(22％MeOH/CHCl3)纯化产物，得到化合物64，为白色固体(23mg，42％，Rt＝9.1min，99.8％纯,由CAD测得)。1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.91(d,J＝3.8Hz,1H),4.23-4.17(m,1H),3.96-3.86(m,2H),3.83-3.66(m,6H),3.55(dd,J＝5.7,2.5Hz,2H),2.21(t,J＝7.7Hz,2H),1.72-1.50(m,4H),1.43-1.19(m,56H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H)。13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ175.0,100.1,75.0,72.4,71.2,70.6,70.1,69.3,67.7,62.2,50.8,36.8,32.8,32.2,30.1,30.05,30.0,29.9,29.96,29.94,29.9,29.7,29.69,29.65,29.64,26.2,26.17,23.0,14.2。HRMS-ESI-计算C44H88NO9[M+H]+774.6459,观察774.6476
N-((2S,3S,4R)-3,4-二羟基-1-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)十八烷-2-基)硬脂酰胺(40)
Figure BDA0003347507440000402
使用一般实验方法B进行胺24(30mg，0.058mmol)与硬脂酸(25mg，0.088mmol)的酰化，有一些变化。反应完成后，加入哌啶(0.2mL，0.44mmol)以淬灭反应并再搅拌1h。将反应混合物在真空下浓缩。将粗产物用水研磨，过滤并干燥。将粗产物再溶解于温热的8％MeOH/CHCl3中，并使用硅胶快速色谱法(15％MeOH/CHCl3)纯化，得到化合物40，为白色固体(19mg，44％，Rt＝8.8min，99.8％纯，由CAD测得)。1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.90(d,J＝3.8Hz,1H),4.22-4.16(m,1H),3.94(d,J＝3.4Hz,1H),3.89(dd,J＝10.8,4.5Hz,1H),3.84-3.65(m,6H),3.55(dd,J＝7.8,2.9Hz,2H),2.21(t,J＝7.7Hz,2H),1.71-1.49(m,4H),1.36-1.22(m,52H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H)。与文献一致(Du,2007)。13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ175.1,100.2,75.1,72.4,71.3,70.7,70.2,69.4,67.8,62.2,51.0,36.8,32.8,32.3,30.2,30.1,30.1,30.0,29.9,29.8,29.77,29.73,26.3,26.25,23.0,14.2。HRMS-ESI-计算C42H84NO9[M+H]+ 746.6146,观察746.6130。
N-((2S,3S,4R)-3,4-二羟基-1-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)十八烷-2-基)辛酰胺(37)
Figure BDA0003347507440000411
使用通用实验方法B进行胺24(60mg，0.12mmol)与辛酸(30μL，0.20mmol)的酰化，有一些变化。反应完成后，加入哌啶(0.25mL，0.55mmol)以淬灭反应并再搅拌30min。将反应混合物在真空下浓缩。将粗产物再溶解于5％MeOH/CHCl3中，并使用硅胶快速色谱法(50％MeOH/CHCl3)纯化，得到化合物37，为白色固体(10mg，38％，Rt＝7.7min，99.8％纯，由CAD测得)。1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.91(d,J＝3.8Hz,1H),4.23-4.17(m,1H),3.94(d,J＝3.6Hz,1H),3.89(dd,J＝10.7,4.7Hz,1H),3.83-3.67(m,6H),3.57-3.53(m,2H),2.21(t,J＝8.4,6.9Hz,2H),1.72-1.51(m,4H),1.29-1.25(m,32H),0.91-0.86(m,6H)。
13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ175.0,100.1,75.1,72.3,71.2,70.7,70.1,69.3,67.7,62.2,50.8,36.8,33.0,32.2,32.0,30.12,30.1,30.02,29.9,29.7,29.6,29.4,26.2,26.19,14.2,14.1。HRMS-ESI-计算C32H64NO9[M+H]+ 606.4581,观察606.4574
N-((2S,3S,4R)-3,4-二羟基-1-(((2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)十八烷-2-基)丁酰胺(48)
Figure BDA0003347507440000412
使用一般实验方法B进行胺24(25mg，0.048mmol)与丁酸(10μL,0.075mmol)的酰化，有一些变化。反应完成后，加入哌啶(0.2mL，0.44mmol)以淬灭反应并再搅拌1h。将反应混合物在真空下浓缩，并将粗产物溶解于温热的50％MeOH/CHCl3中并干燥装载至二氧化硅。使用硅胶快速色谱法(50％MeOH/CHCl3)纯化产物。然而，纯化的产物是被污染的Et3N盐，其通过在C18硅胶上的快速色谱法(100％MeOH/水)除去，得到化合物48，为白色固体(10mg，38％，Rt＝7.2min，99.8％纯,由CAD再运行LCMS测得)。1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.91(d,J＝3.9Hz,1H),4.24-4.20(m,1H),3.94(d,J＝3.3Hz,1H),3.90(dd,J＝10.8,4.6Hz,1H),3.83-3.67(m,6H),3.56-3.53(m,2H),2.22-2.17(m,2H),1.66(dh,J＝14.9,7.4Hz,3H),1.59-1.51(m,1H),1.30-1.25(m,24H),0.96(t,J＝7.4Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,3H)。
13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ175.0,100.1,75.2,72.4,71.2,70.7,70.1,69.3,67.7,62.2,50.8,38.6,33.0,32.2,30.1,30.04,30.01,29.9,29.7,26.1,23.0,19.5,14.2,13.8。HRMS-ESI-计算C28H56NO9[M+H]+ 550.3955,观察550.3951
(2S,3S,4R)-2-氨基-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基己酸酯(13)
Figure BDA0003347507440000421
按照通用实验方法C进行糖脂12(20mg，0.023mmol)的脂肪酰基链的N->O迁移。将粗产物再溶解于8％MeOH/CHCl3中，并使用硅胶快速色谱法(20％MeOH/CHCl3)纯化，得到迁移产物13，为白色固体(16mg，80％，Rt＝5.2min，99.8％纯，由CAD测得)。1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.95-4.86(m,2H),4.14(d,J＝10.5Hz,1H),4.04-3.63(m,8H),3.58(t,J＝9.6Hz,1H),2.43-2.33(m,2H),1.70-1.53(m,4H),1.40-1.19(m,68H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H)。HRMS-ESI-计算C50H100NO9[M+H]+ 858.7389,观察858.7403
(2S,3S,4R)-2-氨基-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基二十四烷酸酯(69)
Figure BDA0003347507440000422
按照通用实验方法C进行糖脂67(18mg，0.022mmol)的脂肪酰基链的N->O迁移。LCMS指示所有原料转化为迁移产物69(19mg，Rt＝5.1min，96％纯,由CAD测得)。
1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.97-4.84(m,2H),4.14(d,J＝10.6Hz,1H),4.02-3.63(m,8H),3.57(t,J＝9.7Hz,1H),2.37(q,J＝7.8Hz,2H),1.70-1.53(m,4H),1.37-1.20(m,64H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H)。13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ175.0,100.0,73.4,71.2,70.8,70.3,70.2,69.3,64.4,62.2,53.4,34.8,32.3,31.6,30.0,29.9,29.8,29.7,29.5,25.4,25.2,23.0,14.2。HRMS-ESI-计算C48H96NO9[M+H]+ 830.7085观察830.7071
(2S,3S,4R)-2-氨基-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基二十二烷酸酯(70)
Figure BDA0003347507440000423
按照通用实验方法C进行糖脂65(19mg，0.024mmol)的脂肪酰基链的N->O迁移。LCMS指示所有原料转化为迁移产物70(20mg，Rt＝4.95min，95％纯,由CAD测得)。
1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.9-4.85(m,2H),4.14(d,J＝10.5Hz,1H),4.02-3.63(m,8H),3.57(t,J＝9.8Hz,1H),2.38(t,J＝7.4Hz,2H),1.71-1.54(m,4H),1.40-1.20(m,60H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H)。13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ174.5,100.0,73.4,71.3,70.8,70.4,70.2,69.3,64.4,62.2,53.4,34.9,32.2,31.6,30.0,29.9,29.8,29.7,29.6,25.5,25.2,23.0,14.2。HRMS-ESI-计算C46H92NO9[M+H]+ 802.6772,观察802.6774
(2S,3S,4R)-2-氨基-1-(α-D-吡喃半乳糖氧基)-3-羟基-十八烷-4-基二十烷酸酯(71)
Figure BDA0003347507440000431
按照通用实验方法C进行糖脂64(15mg，0.019mmol)的脂肪酰基链的N->O迁移。LCMS指示所有原料转化为迁移产物71(15mg，Rt＝4.9min，95％纯,由CAD测得)。
1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.98-4.85(m,2H),4.14(d,J＝10.5Hz,1H),4.02-3.63(m,8H),3.61-3.53(m,1H),2.43-2.34(m,2H),1.71-1.53(m,4H),1.39-1.21(m,56H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H)。13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ174.4,100.1,73.5,71.3,71.0,70.7,70.4,70.2,69.4,64.4,62.3,53.5,35.0,32.3,31.7,30.1,30.0,29.8,29.76,29.6,25.5,25.3,23.1,14.3。HRMS-ESI-计算C44H88NO9[M+H]+ 774.6459,观察774.6465
(2S,3S,4R)-2-氨基-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基二十烷酸酯(71)硬脂酸酯(46)
Figure BDA0003347507440000432
按照通用实验方法C进行糖脂40(14mg，0.018mmol)的脂肪酰基链的N->O迁移。LCMS指示所有原料转化为迁移产物46(14mg，Rt＝4.7min，89％纯,由CAD测得)。
1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.96-4.85(m,2H),4.14(d,J＝10.6Hz,1H),4.02-3.62(m,8H),3.57(t,J＝9.8Hz,1H),2.37(t,J＝7.4Hz,2H),1.69-1.53(m,4H),1.36-1.22(m,52H),0.89(t,J＝6.8Hz,6H)。13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ174.5,100.0,73.3,71.1,70.7,70.2,70.1,69.3,64.3,62.2,53.3,34.7,32.2,31.6,30.0,29.7,29.6,29.5,25.3,25.2,23.0,14.2。HRMS-ESI-计算C42H84NO9[M+H]+ 746.6146，观察746.6150
(2S,3S,4R)-2-氨基-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基二十烷酸酯(71)辛酸酯(44)
Figure BDA0003347507440000441
按照通用实验方法C进行糖脂37(22mg，0.036mmol)的脂肪酰基链的N->O迁移。LCMS指示所有原料转化为迁移产物44(23mg，Rt＝3.8min，87％纯,由CAD测得)。
1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.96-4.86(m,2H),4.14(d,J＝10.6Hz,1H),4.03-3.68(m,8H),3.58(t,J＝10.2Hz,1H),2.38(t,J＝7.4Hz,2H),1.69-1.52(m,4H),1.37-1.22(m,32H),0.94-0.85(m,6H)。13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ174.5,100.0,73.4,71.2,70.7,70.2,70.1,69.3,64.3,62.2,53.3,34.7,32.2,32.0,31.6,30.0,29.95,29.9,29.7,29.6,29.4,29.26,29.2,25.4,25.2,23.0,22.9,14.2,14.1。HRMS-ESI-计算C32H64NO9[M+H]+ 606.4581,观察606.4585
(2S,3S,4R)-2-氨基-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基二十烷酸酯(71)丁酸酯(49)
Figure BDA0003347507440000442
按照通用实验方法C进行糖脂48(9mg，0.016mmol)的脂肪酰基链的N->O迁移。LCMS指示所有原料转化为迁移产物49(9mg，Rt＝3.4min，96％纯,由CAD测得)。1H NMR-(500MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ4.96-4.85(m,2H),4.15(d,J＝10.6Hz,1H),4.04-3.64(m,8H),3.57(t,J＝9.8Hz,1H),2.36(t,J＝7.3Hz,2H),1.88-1.75(m,1H),1.71-1.62(m,2H),1.57(d,J＝11.4Hz,2H),1.36-1.23(m,24H),0.98(t,J＝7.2Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,3H)。13C NMR-(126MHz,2:1CDCl3:CD3OD)δ174.3,100.0,73.4,71.2,70.8,70.3,70.1,69.3,64.3,62.2,53.4,36.5,32.2,31.6,29.97,29.94,29.8,29.7,29.6,25.2,23.0,18.7,14.2,13.8。HRMS-ESI-计算C28H56NO9[M+H]+ 550.3955,观察550.3950。
(2S,3S,4R)-2-(N-((二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基羰基)-L-缬氨酰基-L-瓜氨酸基-4-氨基苄氧基羰基氨基)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基二十六酸酯(MaGC-PAB-环辛炔14)
Figure BDA0003347507440000451
按照通用实验方法D，将pNP-碳酸酯连接基连接至纯化的胺13原料(16mg，0.019mmol)。将粗产物纯化(8％MeOH/CHCl3)，得到化合物14，为白色固体(15mg，56％，Rt＝9.1min，99.2％纯,由UV254nm测得)。1H NMR-(500MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ7.57(d,J＝8.3Hz,2H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),5.18-5.09(m,1H),5.03-4.91(m,2H),4.85(d,J＝3.8Hz,1H),4.61-4.51(m,1H),4.08-3.91(m,3H),3.90-3.84(m,2H),3.82-3.64(m,8H),3.29-3.18(m,1H),3.12(m,1H),2.47-2.21(m,5H),2.19-2.03(m,3H),1.97-1.84(m,1H),1.79-1.50(m,7H),1.41-1.20(m,70H),0.99(d,J＝6.8Hz,3H),0.95(d,J＝6.8Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H),0.81-0.66(m,3H)。13C NMR-(126MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ175.0,173.2,171.0,161.0,157.8,157.0,138.2,129.0,120.4,100.4,99.1,75.0,72.3,71.0,70.6,70.2,69.4,68.4,66.8,62.3,61.0,53.7,52.6,39.3,35.0,33.5,32.2,31.3,30.0,29.98,29.75,29.7,29.5,29.2,26.7,25.6,25.4,24.0,23.4,23.3,23.0,21.6,19.0,18.0,14.2。HRMS-ESI-计算C80H139N6O16[M+H]+ 1440.0248,观察1440.0259
(2S,3S,4R)-2-(N-((二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基羰基)-L-缬氨酰基-L-瓜氨酸基-4-氨基苄氧基羰基氨基)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基二十四烷酸酯(72)
Figure BDA0003347507440000452
按照通用实验方法D将pNP-碳酸酯连接基连接至粗胺原料69(18mg，0.022mmol)并且纯化(17％MeOH/CHCl3)。纯化的化合物72具有痕量的Et3N盐，其通过用水研磨除去，得到白色固体(22mg，72％，经两步，由原料67计算，Rt＝8.3min，98％纯，由UV254nm测得)。1HNMR-(500MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ7.57(d,J＝8.1Hz,2H),7.32(d,J＝8.2Hz,2H),6.55(d,exch,J＝8.9Hz,0.1H),5.13(d,J＝12.2Hz,1H),5.03-4.93(m,2H),4.85(d,J＝3.9Hz,1H),4.62-4.51(m,1H),4.07-3.92(m,4H),3.90-3.65(m,9H),3.30-3.20(m,1H),3.19-3.07(m,1H),2.47-2.05(m,9H),1.98-1.87(m,1H),1.80-1.47(m,7H),1.27(s,66H),0.99(d,J＝6.8Hz,3H),0.95(d,J＝6.7Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H),0.80-0.66(m,3H)。13C NMR-(126MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ175.0,173.2,171.0,161.0,158.0,157.1,138.2,133.0,129.0,125.6,120.5,100.4,99.1,97.0,75.0,72.3,71.0,70.6,70.2,70.0,69.4,68.4,66.8,62.3,61.0,53.7,52.6,47.0,46.6,39.4,35.0,33.6,32.28,32.26,31.4,30.05,30.01,30.0,29.94,29.91,29.9,29.8,29.7,29.68,29.5,29.2,26.7,25.7,25.4,24.0,23.4,23.3,23.0,21.5,19.4,18.0,14.23,14.21。HRMS-ESI-计算C78H135N6O16[M+H]+ 1411.9929，观察1411.9909
(2S,3S,4R)-2-(N-((二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基羰基)-L-缬氨酰基-L-瓜氨酸基-4-氨基苄氧基羰基氨基)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基二十二烷酸酯(73)
Figure BDA0003347507440000461
按照通用实验方法D将pNP-碳酸酯连接基连接至粗胺原料70(19mg，0.024mmol)并且纯化(18％MeOH/CHCl3)。纯化的化合物73具有痕量的Et3N盐，其通过用水研磨除去，得到白色固体(14mg，43％，经两步，由原料65计算，Rt＝7.9min，98％纯，由UV254nm测得)。1HNMR-(500MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ7.57(d,J＝8.2Hz,2H),7.35-7.28(m,2H),5.13(d,J＝12.3Hz,1H),5.03-4.93(m,2H),4.85(d,J＝3.9Hz,1H),4.61-4.49(m,1H),4.06-3.83(m,5H),3.82-3.64(m,8H),3.29-3.20(m,1H),3.19-3.07(m,1H),2.47-2.05(m,9H),1.98-1.86(m,1H),1.80-1.48(m,7H),1.40-1.21(m,66H),0.99(d,J＝6.7Hz,3H),0.94(d,J＝6.8Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H),0.80-0.65(m,3H)。13C NMR-(126MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ175.0,171.0,161.0,157.0,138.2,133.0,129.0,120.4,100.3,99.1,75.0,72.3,71.0,70.6,70.2,70.0,69.4,68.4,66.8,62.3,61.0,53.7,52.5,47.0,33.5,32.23,32.22,31.3,30.01,30.0,29.94,29.9,29.86,29.74,29.7,29.6,29.5,29.2,26.7,25.6,25.4,24.0,23.4,23.3,23.0,21.5,19.4,18.0,14.2。HRMS-ESI-计算C76H132N6O16[M+H]+ 1383.9616，观察1383.9614
(2S,3S,4R)-2-(N-((二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基羰基)-L-缬氨酰基-L-瓜氨酸基-4-氨基苄氧基羰基氨基)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基二十烷酸酯(74)
Figure BDA0003347507440000462
按照通用实验方法D，将pNP-碳酸酯连接基连接至粗胺原料71(15mg，0.019mmol)。将粗产物纯化(12％MeOH/CHCl3)，得到化合物74，为白色固体的(16mg，61％，经两个步骤，从原料64计算，Rt＝7.5min，98％纯，由UV254nm测得)。1H NMR-(500MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ7.57(d,J＝8.2Hz,2H),7.32(d,J＝8.1Hz,2H),5.13(d,J＝12.3Hz,1H),5.03-4.93(m,2H),4.85(d,J＝3.8Hz,1H),4.63-4.50(m,1H),4.08-3.83(m,5H),3.83-3.63(m,8H),3.29-3.19(m,1H),3.16-3.07(m,1H),2.47-2.04(m,9H),1.98-1.85(m,1H),1.81-1.47(m,7H),1.39-1.16(m,58H),0.99(d,J＝6.7Hz,3H),0.95(d,J＝6.8Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H),0.79-0.66(m,3H)。13C NMR-(126MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ175.0,173.2,171.0,161.1,158.0,157.1,138.2,129.1,120.5,100.4,99.1,75.0,72.3,71.0,70.7,70.2,70.0,69.4,68.4,66.8,62.3,61.0,53.7,52.6,39.4,35.0,33.6,32.3,31.4,30.05,30.02,29.93,29.9,29.7,29.68,29.5,29.2,26.8,25.7,25.4,24.0,23.4,23.3,23.0,21.5,19.4,18.0,14.2。HRMS-ESI-计算C74H127N6O16[M+H]+ 1355.9303，观察1355.9304
(2S,3S,4R)-2-(N-((二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基羰基)-L-缬氨酰基-L-瓜氨酸基-4-氨基苄氧基羰基氨基)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基硬脂酸酯(47)
Figure BDA0003347507440000471
按照通用实验方法D，将pNP-碳酸酯连接基连接至粗胺原料46(14mg，0.019mmol)。将粗产物纯化(38％MeOH/CHCl3)，得到化合物47，为白色固体(9mg，36％，经两步，由原料40计算，Rt＝7.3min，89％纯，由UV254nm测得)。1H NMR-(500MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ7.57(d,J＝8.2Hz,2H),7.32(d,J＝8.1Hz,2H),5.13(d,J＝12.4Hz,1H),5.03-4.90(m,2H),4.85(d,J＝3.8Hz,1H),4.57(d,J＝18.3Hz,1H),4.07-3.83(m,5H),3.83-3.63(m,8H),3.30-3.19(m,1H),3.18-3.07(m,1H),2.48-2.05(m,8H),1.98-1.87(m,1H),1.80-1.48(m,8H),1.44-1.11(m,54H),0.99(d,J＝6.8Hz,3H),0.95(d,J＝6.8Hz,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H),0.80-0.66(m,3H)。13C NMR-(126MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ175.0,171.0,158.0,157.0,138.2,133.0,129.1,120.4,100.3,99.1,75.0,72.3,71.0,70.6,70.2,70.0,69.4,68.4,67.0,61.0,52.6,39.4,35.0,33.5,32.2,31.3,30.0,29.9,29.75,29.7,29.5,29.2,26.7,25.6,25.4,24.0,23.36,23.3,23.0,21.5,19.4,18.4,18.01,14.2。HRMS-ESI-计算C72H123N6O16[M+H]+1327.8996，观察1327.8990
(2S,3S,4R)-2-(N-((二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基羰基)-L-缬氨酰基-L-瓜氨酸基-4-氨基苄氧基羰基氨基)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基辛酸酯
Figure BDA0003347507440000472
按照通用实验方法D，将pNP-碳酸酯连接基连接至粗胺原料44(22mg，0.036mmol)。将粗产物纯化(20％MeOH/CHCl3)，得到化合物45，为白色固体(13mg，30％，经两步，由原料37计算，Rt＝6.4min，99.8％纯，由UV254nm测得)。1H NMR-(500MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ7.57(d,J＝8.3Hz,2H),7.32(d,J＝8.3Hz,2H),5.12(d,J＝12.3Hz,1H),5.03-4.91(m,2H),4.85(d,J＝4.0Hz,1H),4.62-4.50(m,1H),4.07-3.83(m,5H),3.83-3.64(m,8H),3.28-3.20(m,1H),3.16-3.07(m,1H),2.46-2.05(m,9H),1.98-1.86(m,1H),1.80-1.48(m,7H),1.41-1.20(m,34H),0.98(d,J＝6.8Hz,3H),0.94(d,J＝6.8Hz,3H),0.92-0.86(m,6H),0.79-0.67(m,3H)。13C NMR-(126MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ175.0,173.1,171.0,161.0,158.0,157.0,138.2,133.0,129.1,120.4,100.3,99.1,75.0,72.3,71.0,70.6,70.2,70.0,69.4,68.4,66.7,62.3,61.0,53.7,52.5,39.4,35.0,33.5,32.2,32.0,31.3,30.0,29.91,29.9,29.75,29.7,29.4,29.3,29.2,26.7,25.6,25.4,24.0,23.3,23.0,21.5,19.4,18.01,14.2,14.2。HRMS-ESI-计算C62H103N6O16[M+H]+ 1187.7431，观察1187.7432
(2S,3S,4R)-2-(N-((二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基羰基)-L-缬氨酰基-L-瓜氨酸基-4-氨基苄氧基羰基氨基)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-3-羟基-十八烷-4-基丁酸酯(50)
Figure BDA0003347507440000481
按照通用实验方法D，将pNP-碳酸酯连接基连接至粗胺原料49(9mg，0.016mmol)。纯化粗产物(20％MeOH/CHCl3)。存在痕量的Et3N盐，其通过柱色谱法在C18二氧化硅(100％MeOH/水)上除去，得到纯化的产物50(8mg，43％，经两步，由原料48计算，Rt＝6.0min，99.8％纯，由UV254nm测得)。1H NMR-(500MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ7.57(d,J＝8.3Hz,2H),7.32(d,J＝8.5Hz,2H),5.11(d,J＝12.3Hz,1H),5.04-4.93(m,2H),4.85(d,J＝3.8Hz,1H),4.60-4.52(m,1H),4.06-3.83(m,5H),3.82-3.65(m,8H),3.29-3.20(m,1H),3.17-3.06(m,1H),2.45-2.06(m,9H),2.00-1.86(m,1H),1.79-1.48(m,7H),1.35-1.22(m,26H),1.01-0.92(m,9H),0.92-0.86(m,3H),0.80-0.66(m,3H)。13C NMR-(126MHz,2:3CDCl3:CD3OD)δ174.5,173.3,171.2,161.2,157.4,138.4,129.0,120.5,100.4,99.2,75.2,72.3,71.0,70.7,70.2,70.0,69.4,68.4,66.8,62.2,61.0,53.8,52.7,40.4,36.8,33.6,32.3,31.4,30.05,30.01,29.94,29.9,29.8,29.7,26.8,25.7,24.0,23.43,23.4,23.0,21.6,19.4,19.0,14.2,13.8。HRMS-ESI-计算C58H95N6O16[M+H]+ 1131.6805，观察1131.6801
V.S.FFRK.OVALP C26缀合物(54)
Figure BDA0003347507440000491
按照通用实验方法E，将环辛炔原料14(2.0mg，0.0014mmol)与5-叠氮基戊酰基-FFRK-KISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：11)偶联。纯化缀合物54(A:B–70:30至0:100，超过14min)，得到白色蓬松固体(5.4mg，69％，99.9％纯，由UV254nm测得，Rt＝6.2min)。HRMS-ESI-计算C269H433N61O70[M+4H]4+ 1410.3071，观察1410.3015
V.S.FFRK.OVALP C24缀合物(75)
Figure BDA0003347507440000492
按照通用实验方法E，将环辛炔原料72(1.2mg，0.00085mmol)与肽偶联。纯化缀合物75(A:B–70:30至0:100，超过14min)，得到白色蓬松固体(2.7mg，57％，99.9％纯，由UV254nm测得，Rt＝6.1min)。HRMS-ESI-计算C267H430N61O70[M+5H]5+ 1122.8411，观察1122.8387
V.S.FFRK.OVALP C22缀合物(76)
Figure BDA0003347507440000493
按照通用实验方法E，将环辛炔原料73(1.3mg，0.00094mmol)与肽偶联。纯化缀合物76(A:B–70:30至0:100，超过14min)，得到白色蓬松固体(4.1mg，78％，99.9％纯，由UV254nm测得，Rt＝6.0min)。HRMS-ESI-计算C265H426N61O70[M+5H]5+ 1117.2347，观察1117.2301
V.S.FFRK.OVALP C20缀合物(77)
Figure BDA0003347507440000501
按照通用实验方法E，将环辛炔原料74(1.2mg，0.00089mmol)与肽偶联。纯化缀合物77(A:B–70:30至0:100，超过14min)，得到白色蓬松固体(0.85mg，17％，99.9％纯，由UV254nm测得，Rt＝5.9min)。HRMS-ESI-计算C263H421N61O70[M+4H]4+ 1389.2837，观察1389.2781
V.S.FFRK.OVALP C18缀合物(51)
Figure BDA0003347507440000502
按照通用实验方法E，将环辛炔原料47(2.0mg，0.0015mmol)与肽偶联。纯化缀合物51(A:B–70:30至0:100，超过14min)，得到白色蓬松固体(4.12mg，49％，99.9％纯，由UV254nm测得，Rt＝5.9min)。HRMS-ESI-计算C261H418N61O70[M+5H]5+ 1106.0222，观察1106.0193
V.S.FFRK.OVALP C8缀合物(52)
Figure BDA0003347507440000503
按照通用实验方法E，将环辛炔原料45(2.0mg，0.0017mmol)与肽偶联。纯化缀合物52(A:B–70:30至0:100，超过13min)，得到白色蓬松固体(3.3mg，36％，99.9％纯，由UV254nm测得，Rt＝5.45min)。HRMS-ESI-计算C251H398N61O70[M+5H]5+ 1077.9910，观察1077.9894
V.S.FFRK.OVALP C4缀合物(53)
Figure BDA0003347507440000511
按照通用实验方法E，将环辛炔原料50(2.0mg，0.0018mmol)与肽偶联。纯化缀合物53(A:B–70:30至0:100，超过12min)，得到白色蓬松固体(6.14mg，65％，99.9％纯，由UV254nm测得，Rt＝5.25min)。HRMS-ESI-计算C247H389N61O70[M+4H]4+ 1333.2211，观察1333.2168
V.S.FFRK.OVALP C0缀合物(55)
Figure BDA0003347507440000512
按照通用实验方法E，将环辛炔原料62(2.0mg，0.0019mmol)与肽偶联。纯化缀合物55(A:B–70:30至0:100，超过12min)，得到白色蓬松固体(4.91mg，49％，99.9％纯，由UV254nm测得，Rt＝5.15min)。HRMS-ESI-计算C243H383N61O69[M+4H]4+ 1315.7106，观察1315.7039
实施例5：佐剂对免疫接种增加肝TRM细胞数量的作用
佐剂效果不可预测
用由与抗原性肽(NVFDFNNL-SEQ ID NO：4)遗传融合的抗Clec9A单克隆抗体组成的融合蛋白接种B6小鼠。为了用该融合蛋白产生免疫应答，将其与佐剂(启动免疫系统的化合物)组合。在这些实验中，给小鼠注射50,000PbT-I幼稚疟疾特异性T细胞，然后接种疫苗。35天后，杀死小鼠，测定脾和肝中存在的PbT-I细胞的数量和表型。虽然将该融合蛋白与佐剂CpG组合作为疫苗导致肝PbT-I TRM细胞的诱导(图1)，然而将该融合蛋白与5种备选佐剂组合不能诱导大量的PbT-I TRM细胞，但是诱导可检测的循环PbT-I记忆T细胞(通过脾中的应答检测)。这些结果强调了这样的事实，即佐剂有利于肝TRM细胞的诱导是罕见的，并且需要测试来确定给定的建议佐剂是否实际上将有利于肝TRM细胞的诱导。
用于初免和捕获方法的病毒载体选择
以前已经表明，将上述融合蛋白与CpG佐剂组合，与重组腺伴随病毒载体抗原一起用于肝中肝细胞中的表达，虽然是一种复杂的方法，但导致大量的肝TRM细胞。这种方法被称为初免和捕获。在该方法中，融合蛋白和CpG引发脾中的T细胞，而rAAV和CpG捕获肝中的细胞以形成肝TRM细胞。
为了测试已知感染肝脏的替代病毒是否可以作为诱导肝TRM细胞的疫苗，我们在小鼠巨细胞病毒(MCMV)中表达疟疾抗原(TRAP)，然后测试用该病毒感染是否会诱导肝TRM细胞(图2)。
作为阳性对照，我们使用具有相同疟疾抗原的初免-诱捕策略。我们使用检测识别该抗原的T细胞的装载荧光肽的MHC四聚体通过流式细胞术测量应答。尽管对照初免-诱捕小鼠产生大量肝TRM细胞，但令人惊讶的是发现MCMV-TRAP免疫不产生，尽管在脾中检测到产生良好的循环T细胞应答。
使用初免和捕获，单独的α-GalCer不产生大量的肝TRM细胞。
如上所述，使用CpG作为佐剂的初免-捕获接种在诱导肝TRM细胞方面非常有效。为了测试CpG佐剂是否可以被α-GalCer取代，我们比较了使用CpG与α-GalCer的初免-和-捕获(图3)。向C57BL/6小鼠注射50,000个幼稚PbT-I T细胞以追踪反应，然后用抗Clec9A-NVY融合蛋白以及CpG或α-GalCer作为佐剂以及rAAV-NVY(SEQ ID NO：15)接种疫苗。尽管在脾和肝中存在大量的对α-GalCer应答的NKT细胞，但该佐剂在初免-捕获设置中不产生大量的肝TRM细胞。然而，我们的已知诱导TRM细胞的对照佐剂CpG在诱导初免-和-捕获设置中产生了高数量。
实施例6：糖脂-肽疫苗诱导OVA特异性肝驻留记忆CD8+T细胞
C57BL/6小鼠过继转移40,000个幼稚OT-I细胞，然后用糖脂-肽缀合物V.S.FFRK.OVALP接种疫苗，该缀合物结合了迁移形式的α-GalCer和包含OVA的I-Ab和H-2Kb表位的融合肽(KISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT)(SEQ ID NO：11)。该融合肽称为“长肽”(OVALP)。
当被富含组织蛋白酶介导的蛋白酶活性的树突细胞摄取时，肽和糖脂部分通过连接基的裂解从缀合物中释放，每个部分可用于加工并分别负载到MHC和CD1d分子上。作为刺激CD8+ T细胞的阳性对照，用修饰的甲型流感病毒PR8-OVA接种小鼠，该病毒表达肽序列SIINFEKL(SEQ ID NO：10)-限制OT-I细胞的OVA的H-2Kb结合表位。另一组小鼠用未缀合的α-GalCer和融合肽作为混合物接种。
在第21天和第60天收获各组接种的小鼠，如通过标志物CD69和CD62L的染色所评估，检查肝TRM细胞形成。
图4A显示了我们如何基于图5所示的门控策略鉴定在用V.S.FFRK.OVALP接种后第21天肝脏中TRM细胞(CD8+Ly5.1+ CD44+ CD69+ CD62Llow)和TEM细胞(CD8+Ly5.1+ CD44+ CD69-CD62Llow)的表型。图4C显示V.S.FFRK.OVALP能够在第21天诱导大量OT-I肝TRM细胞(约106个细胞)，并且这些细胞持续超过60天(图4C、F)。这些CD69+OT-I细胞显示与通过其它接种方法产生的肝TRM细胞一致的表型，即CXCR6、CD49a和CD101的高表达，以及KLRG1和CX3CR1的低表达(图4B)。
相反，PR8-OVA和具有肽的未缀合的α-GalCer都不能有效诱导肝TRM细胞，如从接种后第21天存在于肝中的TRM细胞的数量可以看出，如图4C所示。图4C显示了在接种后第21天肝脏中存在的TRM、TEM、和TCM(CD8+Ly5.1+ CD44+ CD69- CD62Lhigh)细胞的数量。
虽然α-GalCer和肽的混合物在刺激脾中的记忆T细胞方面也是差的，但是PR8-OVA和V.FFRK.OVALP都诱导该器官中的OT-I效应细胞和中枢记忆(TEM和TCM)细胞(图4D、G)。图4E显示了在接种后第21天脾中存在的TRM、TEM、和TCM细胞的数量，图4H显示了在接种后第60天脾中存在的TRM、TEM、和TCM细胞的数量。
不希望受理论束缚，本发明人相信PR8-OVA(SEQ ID NO：10)和V.S.FFRK.OVALP都诱导循环记忆T细胞，但只有V.S.FFRK.OVALP在诱导肝TRM细胞方面是有效的，其中图4F显示在接种后第60天存在于肝中的TRM细胞的数量。在用α-GalCer和肽的混合物激发的小鼠中的不良应答也显示两种组分的化学键合对于有效的激发是必需的。
图4A-H中给出的结果来自使用总共10只小鼠的两个独立实验。显示的数据显示平均值±S.E.M和在一些情况下(C、F)来自个体小鼠的数据。C和F组通过单因素ANOVA与Tukey's多重检验后比较进行比较。****p<0.001。
实施例7：用于检测图4中检查的记忆CD8+T细胞群体的门控策略
参考图5，为了通过流式细胞术在用OT-I Ly5.1+ T细胞过继转移的小鼠中鉴定肝Trm细胞，通过在左上图(SSA-A对FSC-A)中激光的低侧散射和宽前向散射门控淋巴细胞群。通过在前向散射高度对前向散射振幅(FSC-H对FSC-A)的对角线上在上中图中门控来检查单个细胞并排除双联体。然后通过对碘化丙啶(PI)的低染色进行门控来选择活细胞，从而排除死细胞(右上图)。然后通过门控对Ly5.1染色和对Ly5.2缺乏染色的细胞来选择表达Ly5.1的转移的OT-I细胞(左下图)，Ly5.2由受体小鼠细胞表达。通过在表达T细胞受体分子Va2和活化标志物CD44的那些Ly5.1+细胞上门控来进一步选择OT-I细胞(下部中间图)。最后，每个记忆OT-I细胞群体(TEM、TRM和TCM)可以通过如下对CD62L和CD69染色来粗略地鉴定：TEM(CD62L-CD69-)、TRM(CD62L-CD69+)和TCM(CD62L+CD69-)细胞。
实施例8：用糖脂-肽疫苗初免和加强免疫接种诱导大量保护免受肝阶段感染的疟原虫特异性肝TRM细胞。
因为在用V.FFRK.NVYSP一次免疫后保护是次优的(9/12小鼠)，所以使用加强免疫以试图增加肝TRM细胞产生和改善保护。
将50,000PbT-I.GFP细胞转移到受体B6或CD1d-/-小鼠中。在第0天和第30天，用V.FFRK.NVYSP处理CD1d-/-小鼠(组1)。B6小鼠仅在第30天用V.FFRK.NVYSP处理(组2)，在第0天和第30天用V.FFRK.NVYSP处理(组3)，在第0天用αClec9a-NVY和CpG处理，在第30天用V.FFRK.NVYSP处理(组4)，或在第0天用αClec9a-NVY和CpG(CC)处理(组5)(图9)。然后在第50-60天从每组的小鼠中收获器官并评估记忆T细胞的产生。检查肝和脾记忆T细胞(图9A-C)。图9A显示了接种后50-60天肝PbT-I TRM细胞的数量。图9B和9C显示了在接种后50-60天肝(B)和脾(C)中存在的TRM、TEM和TCM细胞的数量。
与在加强阶段仅接受单一剂量的替代小鼠组相比，使用V.FFRK.NVYSP的这种同源加强方案诱导PbT-I肝TRM细胞增加以及脾中记忆T细胞增加(图9A-C)。这表明与单次激发相比，初免-加强方案产生显著更高的TRM细胞数。
或者，采用异源初免-加强免疫接种方法，其中用CpG加抗Clec9A-NVY(没有P&T中使用的病毒)接种小鼠，然后用V.FFRK.NVYSP加强免疫，或不加强免疫。这也导致TRM细胞的显著增加，表明V.FFRK.NVYSP在加强CpG+anti-Clec9A-NVY诱导的初级应答方面也非常有效。值得注意的是，CD1d-/-小鼠中缺乏PbT-I细胞扩增证明了在用V.FFRK.NVYSP初免-加强接种后对iNKT细胞帮助扩增PbT-I应答的依赖性(图9A-C)。
为了研究这些初免-加强方案诱导的保护程度，用200个伯氏疟原虫子孢子攻击小鼠(图9D、E)。在第73天用200个伯氏疟原虫子孢子攻击每组中剩余的小鼠，并在第79、80、81天测量寄生虫血症。连续两天从血液中挑出可见寄生虫的小鼠。用低剂量子孢子攻击存活的小鼠用3000个子孢子再攻击。在高剂量攻击后第5、6、7、8和12天测量寄生虫血症。图9D显示了在初次疟疾攻击后第7天含有寄生虫的红细胞的百分比。这是在实验开始后80天。
两种初免-加强方案在所有接种的小鼠中诱导无菌保护。为了进一步测试这些接种方案的潜力，再次用高剂量的3000个子孢子攻击存活的小鼠(图9E)。图9E显示了在200、或200和3000子孢子攻击后死亡或受到保护的小鼠的数量。
来自每组的约一半小鼠受到保护，表明非常有效的免疫。总之，这些数据表明V.FFRK.NVYSP可用于初免-加强方案中，并且这种疫苗诱导大量肝TRM细胞，其有效地保护免受子孢子攻击。
结果来自3个独立实验，每个实验每组使用至少4只小鼠。显示的数据显示平均值±S.E.M和在一些情况下(图9A、D)来自个体小鼠的数据。图9A和D中的组通过单因素ANOVA与测试后的Tukey多重比较进行比较。使用Fisher精确检验比较图9E中的组。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
实施例9：中等长度的脂肪酰基链是最佳肝TRM细胞形成和保护免受疟疾所需的。
如上所述，尽管已知α-GalCer肽缀合物刺激免疫应答，但已发现本发明的缀合物对增加肝TRM细胞的数量特别有效。式I的缀合物的一个重要特征是脂肪酰基链的长度，其需要为至少C18。如图6所示，C26、C24、C22和C20缀合物使肝NKT细胞数量增加(图5D)，并且尽管所有测试的化合物诱导一定水平的肝NKT细胞活化，但C26、C24、C22、C20和C18缀合物的活化(如通过在测量的时间点NKT细胞上NK1.1的下调所确定的)更大(图5E)。对于CD69观察到类似但较不明显的趋势(图5F)。在脾中可观察到类似的观察结果(图A-C)。
如图7所示，C26、C24、C22、C20和C18缀合物有效诱导肝TRM细胞(图7A、B)。C8或更低的值对诱导肝TRM细胞无效。脾中的总应答显著降低C24或更少(图7C)，表明全长FA链长度对于良好的循环T细胞应答是重要的。
与肝TRM细胞对有效保护的要求一致，C18或更大的脂肪酸链诱导针对子孢子攻击的保护性免疫(图7D和E)。在该系统中，子孢子表达抗原SIINFEKL(SEQ ID NO：10)(来自鸡卵清蛋白)，并且通过表达该抗原的缀合物产生应答。
实施例10：糖脂-肽疫苗诱导保护免受肝阶段感染的疟原虫特异性肝驻留记忆CD8+T细胞
V.S.FFRK.NVYSP(包含含有NVYDFNLL(SEQ ID NO：2)最小表位的短肽，由来自PbT-ITCR转基因系的疟原虫特异性CD8+ T细胞识别)用于诱导对肝病原体伯氏疟原虫ANKA具有特异性的肝TRM细胞。NYVSP表位是通过组合肽文库方法鉴定的PbT-I细胞识别的抗原的肽抗原模拟物。需要使用这种模拟物，因为伯氏疟原虫ANKA的真正抗原是未知的。将50,000PbT-I.GFP细胞过继转移到受体B6小鼠中。一天后，用αClec9a-NVY/CpG(确立的阳性对照)，单独的α-GalCer(αGC)或含有NVY短肽的糖脂-肽缀合物[V.S.FFRK.NVYSP]处理受体小鼠。用αClec9a-NVY/CpG处理的小鼠也在第1天用rAAV-NVY处理(即，通过由两个步骤组成的既定(阳性对照)初免-诱捕(P&T)接种方案：首先，用CpG寡核苷酸加上与重链上的NVYDFNLL(SEQID NO：2)共价连接的Clec9A特异性单克隆抗体(mAb)的组合接种小鼠，然后第二天，用经由肝细胞特异性α-1抗胰蛋白酶启动子表达NVYDFNLL(SEQ ID NO：2)表位的非复制型重组腺伴随病毒感染小鼠)。
在第35天对接种的小鼠的肝脏进行检查并通过流式细胞术对记忆T细胞的产生进行评估，显示PbT-I肝TRM细胞响应于P&T阳性对照和V.FFRK.NVYSP而产生。图8A显示了在接种后第35天肝脏中存在的TRM细胞(CD8+GFP+ CD44+ CD69+ CD62Llow KLRG1-)的数量。图8B显示用V.S.FFRK.NVYSP接种后35天肝脏中TRM和TEM细胞的表型。图8C和8D显示接种后第35天肝(C)和脾(D)中PbT-I TRM、TEM(CD44+ CD69- CD62Llow)和TCM(CD44+ CD69- CD62Lhigh)细胞的数量。
在V.S.FFRK.NVYSP组中观察到的数量略低于(图8A、C)P&T组。通过用本文所述的缀合疫苗接种产生的肝TRM细胞表达高水平的CXCR6、CD49和CD101，并且因此在表型上与P&T产生的TRM细胞相同(图8B)。使用疟疾系统观察到的肝TRM细胞数比OVA系统少约10倍，并且在肝和脾中观察到TEM细胞数量的类似趋势(图2C，D)。尽管使用疟疾系统观察到的肝TRM细胞的数量比OVA系统少约10倍，并且在肝和脾中观察到TEM细胞数量的类似趋势，但是观察到的数量令人惊讶地高，并且具有与初免和捕获接种相似的顺序。不希望受理论束缚，本发明人相信这些数字将能够保护肝脏免受疟原虫感染。
考虑到肝TRM细胞抵抗疟疾的能力，本发明人然后考虑αClec9a-NVY/CpG或V.S.FFRK.NVYSP是否能够诱导能够抵抗子孢子攻击的无菌保护的免疫。来自上述第35天分析的相同组的单独小鼠用200个伯氏疟原虫ANKA子孢子攻击，相当于在第42天一至两次蚊子叮咬。当子孢子在离开该位点进入血液之前在肝脏中生长两天时，通过从第6-13天检查血液的寄生虫血症来测量肝脏阶段保护(图8E、F)。图8D显示了疟疾攻击后第7天感染寄生虫的红细胞的百分比。图8F显示了疟疾攻击后死亡或受到保护的小鼠的数量。
几乎所有用P&T对照接种的小鼠都被保护免受感染(13/14小鼠)。重要的是，显著比例(9/12)的小鼠在用V.S.FFRK.NVYSP接种后也受到保护，而在单独接受α-GalCer后没有小鼠受到保护(图8F)。这些数据证明了本文所述的糖脂-肽缀合物提供针对感染性肝病原体的TRM细胞介导的保护的功效。不希望受理论束缚，本发明人相信该数据表明V.S.FFRK.NVYSP疫苗诱导足够数量的TRM细胞以成功地对抗疟疾。
结果来自2或3个独立实验，每个实验每组使用至少4只小鼠，未使用过的组除外。显示的数据显示平均值±S.E.M和在一些情况下(A、E)来自个体小鼠的数据。A和E组通过单因素ANOVA与Tukey's多重检验后比较进行比较。使用Fisher’s精确检验比较F组。****p<0.001。
实施例11-用含有表位-侧翼序列的缀合疫苗接种改善肝TRM细胞产生
利用含有由PbT-I T细胞(即NVYDFNLL)(SEQ ID NO：2)识别的最小抗原模拟表位的疫苗是诱导肝TRM细胞形成的有效手段。然而，本发明人做出了另一个令人惊讶的确定，即通过向包含在缀合物的肽部分中的表位的任一侧添加一定数量的额外氨基酸残基可以增强肝TRM形成的诱导。不希望受理论束缚，本发明人相信添加这些残基保护抗原免于降解和/或增强抗原的加工。用于本文所述的P&T疫苗接种对照的“较长的肽”在蛋白质抗原序列(HSLSNVYDFNLLLERD)(SEQ ID NO：12)的任一端含有4个侧翼氨基酸残基，并有效产生大量肝TRM细胞。
为了检验它们的理论，本发明人合成了两种新的糖脂-长肽缀合物。V.S.NVYLP，含有N-末端-AAA-间隔区(类似于我们的融合蛋白-肽中使用的间隔区)；和V.S.FFRK.NVYLP，含有额外的-FFRK-(SEQ ID NO：1)蛋白酶体切割序列。
用单独的α-GalCer(α-GC)和以下缀合物化合物V.S.FFRK.NVYSP、V.S.FFRK.NVYLP或V.S.NVYLP(各0.135nmol)接种C57BL/6小鼠组。
在接种后第3天从每组的小鼠收获器官，并通过流式细胞术评估NKT细胞的扩增和活化。图11A和B显示V.S.FFRK.NVYSP、V.S.FFRK.NVYLP或α-GalCer令人惊讶地比V.S.NVYLP更有效地扩增NKT细胞。图11C-F显示与V.S.NVYLP相比，V.S.FFRK.NVYSP、V.S.FFRK.NVYLP或α-GalCer更有效地活化NKT细胞。
用50,000PbT-I T细胞过继转移小鼠组，然后在第二天用单独的α-GalCer(αGC)、α-GalCer和NVY长肽的混合物(αGC+NVYLP)以及以下缀合物化合物V.S.FFRK.NVYSP、V.S.FFRK.NVYLP或V.S.NVYLP接种。添加V.S.NVYLP允许在这种更长的肽变体的背景下对FFRK(SEQ ID NO：1)序列的要求进行额外的评估(图10)。
在接种后第21-35天从每组小鼠收集器官，并通过流式细胞术评估记忆T细胞的产生。图10A显示接种后第21-35天肝TRM细胞的数量，而图10B和C显示接种后第21-35天肝(B)和脾(C)中存在的TRM、TEM和TCM细胞的数量。
第21-35天的分析显示V.S.FFRK.NVYLP在诱导肝TRM细胞方面最有效(图10A和B)。类似地，该组合的脾TEM和TRM细胞数量最高(图10C)。
接种V.S.NVYLP的小鼠组的肝TRM细胞数量最低；即，缺少FFRK(SEQ ID NO：1)切割序列。处理后iNKT细胞的早期分析(第3天)显示，V.S.NVYLP在小鼠的肝或脾中产生最差的数量增加(分别为图11A和B)，暗示缺乏FFRK(SEQ ID NO：1)的缀合物的iNKT细胞的活化受损。该结论由这些小鼠中iNKT细胞向NK1.1-阴性的转化减少和它们差的CD69下调支持(图11C-F)。这一结论进一步得到在这些小鼠中观察到的正常血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平的支持，与含有FFRK的疫苗观察到的升高的水平形成对比(图11G)。
疟疾攻击后第7天感染寄生虫的红细胞的百分比如图10D所示，疟疾攻击后死亡或受到保护的小鼠的数量如图10E所示。
为了测定所提供的缀合物化合物的保护水平，在第42天用200个伯氏疟原虫子孢子攻击接种的小鼠，并在第6、7、8和13天通过流式细胞术测量寄生虫血症。连续两天从血液中挑出可见寄生虫的小鼠。在用V.S.FFRK.NVYSP或V.S.FFRK.NVYLP处理的所有小鼠和约50％的用V.S.NVYLP处理的小鼠中观察到完全的子孢子攻击保护，结果反映了通过接种产生的肝TRM细胞数量(图10E)。综合起来，这些数据证明当在缀合物疫苗中使用具有(a)另外的N-末端切割序列和(b)侧翼C和N末端序列的肽时，观察到效力的惊人增加，所述肽一起产生最大数量的肝TRM细胞，特别是在提供抗疟疾保护的情况下。
结果来自两个或三个独立实验，每个实验每组使用至少四只小鼠。显示的数据显示平均值±S.E.M和在一些情况下(图10A、D)来自个体小鼠的数据。图10A和10D中的缀合物疫苗组通过单因素ANOVA与测试后的Tukey's多重比较进行比较。使用Fisher精确检验比较图10E中的组。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
实施例12-用通过肟连接合成的缀合物疫苗接种改善肝TRM细胞产生
如下将肟缀合物(V.Ox.G.J)的效力与SPAAC缀合物(V.S.G.J)的效力进行比较。将50,000PbT-I.GFP细胞转移到受体B6小鼠中。一天后，用V.S.FFRK.NVYSP或V.Ox.FFRK.NVYSP处理受体小鼠。在接种后第21天从每组小鼠收集器官，并通过流式细胞术评估记忆T细胞的产生。在第35天用200个伯氏疟原虫子孢子攻击每组剩余的小鼠，并在第6、7、8和13天通过流式细胞术测量寄生虫血症。连续两天从血液中挑出可见寄生虫的小鼠。
图12A显示接种后第21天肝TRM细胞的数量，而图12B和C显示接种后第35天肝(B)和脾(C)中存在的TRM、TEM和TCM细胞的数量。在200个子孢子攻击后第7天红细胞中存在的寄生虫的百分比显示于图12D中，且图12E显示疟疾攻击后死于或受到保护的小鼠的数量。在图12F中，显示了3000个子孢子攻击后第7天被寄生虫感染的红细胞的百分比，而在图12G中显示了疟疾攻击后死亡或受到保护的小鼠的数量。
这些结果表明，尽管本发明的所有缀合物可用作针对肝脏疾病、特别是疟疾的疫苗，但利用肟连接基的缀合物是特别有效的。
结果来自两个独立的实验，每个实验每组使用至少四只小鼠(图12F和G除外)。显示的数据显示平均值±S.E.M和在一些情况下(图12A、D、F)来自个体小鼠的数据。图12A、D和F中的缀合物疫苗组通过单因素ANOVA与Tukey's多重检验后比较进行比较。使用Fisher精确检验比较图12E和G中的组。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
实施例13：通过糖脂-肽缀合物疫苗产生NVFDFNNL特异性内源性CD8记忆T细胞
到目前为止，所有显示肝TRM细胞产生和使用糖脂-肽疫苗接种系统的保护的数据已经使用具有来自PbT-I小鼠或OT-I小鼠的过继转移T细胞受体转基因细胞的小鼠来监测T细胞应答。因此，TRM细胞应答的监测和针对子孢子攻击诱导的保护都通过人工加入对子孢子特异的幼稚转基因T细胞得到帮助。为了显示本发明的缀合物可以从正常小鼠T细胞库诱导TRM细胞，并且这种接种可以保护小鼠对抗子孢子，我们开始使用PbT-I细胞识别的实际疟疾抗原进行研究。
该抗原来自PBANKA_1351900(60S核糖体蛋白L6-2，推定的)并具有以下氨基酸序列：NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)。C57Bl/6小鼠用短肽版本V.Ox.FFRK.NVFSP以2周间隔接种3次，然后在最后一次加强免疫后3周，对特异性肝和脾T细胞进行计数(图13A)或用200个子孢子攻击(图13B)。接种的小鼠平均含有超过300,000个对疫苗表位具有特异性的肝TRM细胞(如通过四聚体染色所测量)，并且完全防止子孢子攻击。该实验表明，本发明的糖脂-肽缀合物可以接种正常的T细胞库以产生可以保护免受疟疾的肝TRM细胞。
实施例14：单剂量的缀合化合物可以保护小鼠免于疟疾。
虽然图13中的数据令人鼓舞，但它仅测试了多次接种的小鼠，并且它利用了我们随后实现的疫苗将是次优的，因为它仅具有短的肽基序，没有周围的序列。为了检查具有包含NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)表位的延长的肽基序(即AAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：5))的疫苗是否可以诱导肝TRM细胞并使用小鼠的正常T细胞库保护免受子孢子攻击，我们用VOx.FFRK.NFVLP单次接种C57Bl/6小鼠，然后检查一些小鼠的对该表位特异的肝和脾T细胞(第35天)或在第42天用200PbA子孢子攻击的小鼠(图14)。这些数据显示该缀合物产生约250,000个对NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)特异的肝TRM细胞(图14A)，并且接种的小鼠完全免受200个子孢子的影响(图14B)。为了进一步测试保护水平，在第70天用3000子孢子再次攻击小鼠(图14B)。这表明大多数小鼠也受到保护而免于这种大的攻击，表明疫苗是高度有效的。
实施例15：第二剂缀合物化合物可增强免受疟疾
图9中显示的数据揭示了用第二剂疫苗加强PbT-I T细胞应答的潜力。为了检查第二剂量的疫苗是否可以扩增由内源性T细胞库产生的肝TRM细胞数量，并增强对子孢子攻击的保护，我们在对C57Bl/6小鼠仅第0天接种VOx.FFRK.NFVLP(NVF/-)，第30天仅(-/NVF)，或第0天和第30天(NVF/NVF)。这些数据揭示，与单剂量的250-500,000相比，第二剂量的VOx.FFRK.NFVLP在第60天产生超过一百万个对NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)特异的肝TRM细胞(图15A)，并增强脾中的应答(图15B)。为了进一步测试保护水平，在第66天用200PbA子孢子攻击小鼠，并且如果受到保护，则在第85天用3000个子孢子再攻击(图15C)。这表明接受两个剂量的所有小鼠都受到保护而免受两种攻击，表明疫苗是高度有效的。
实施例16：对单一剂量的缀合化合物的保护保持200天。
虽然图14中的数据令人鼓舞，但其仅在接种后的单个时间点(第35-42天)测试小鼠。为了检查保护的寿命，我们用VOx.FFRK.NFVLP单次接种C57Bl/6小鼠，然后在200天内的不同时间点检查一些小鼠的肝T细胞，或在不同时间用200PbA子孢子攻击小鼠。这些数据揭示了对NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)特异的肝TRM细胞具有约425天的半衰期(图16A)，并且90％的小鼠在接种后最多200天受到保护(图16B)。这表明VOx.FFRK.NFVLP是提供长期保护的高效疫苗。
实施例17：对单一剂量的缀合化合物的保护优于当前金标准疟疾疫苗，辐射减毒子孢子(RAS)。
图14和16中所示的数据揭示了糖脂-肽疫苗接种系统的有效性，但这些疫苗尚未与当前金标准疟疾疫苗，辐射减毒子孢子(RAS)进行比较。为了进行该比较，我们用VOx.FFRK.NVFLP或50,000个RAS接种C57Bl/6小鼠，并在一个月后用200WT PbA子孢子攻击小鼠。杀死死于子孢子攻击的小鼠并评估其肝脏的NVF特异性TRM细胞的数量(图17A，灰色圆圈)和任何特异性的TRM细胞的数量(图17B，灰色圆圈)。没有变成寄生虫的小鼠被认为是受保护的，并且在攻击后第12天类似地分析它们的肝脏(图17A和B，空心圆圈)。这些数据揭示了VOx.FFRK.NFVLP接种的小鼠比RAS接种的小鼠(图17C)和NVF特异性肝TRM细胞数量(图17A)受到更好的保护，并且在VOx.FFRK.NVFLP接种的小鼠中总肝TRM细胞数量(图17B)更高。该实验显示糖脂-肽缀合物疫苗是优于RAS的疫苗。
实施例18：恶性疟原虫RPL6(PfRPL6(PF3D7_1338200))中HLA-A*02:01-限制性表位ILNSGLLAV(SEQ ID NO：18)的鉴定。
已将PBANKA_1351900(60S核糖体蛋白L6-2，推定的)RPL6表征为恶性疟原虫的有前途的抗原，我们试图鉴定恶性疟原虫直向同源物(PF3D7_1338200，也称为PF13_0213)中潜在的人相关抗原。在这个意义上，我们使用免疫表位数据库(IEDB:https://www.iedb.org/)表位预测资源(Vita,R.et al.2019)寻找能够结合HLA-A*02:01的恶性疟原虫RPL6内的肽；共同的等位基因。这鉴定了ILNSGLLAV(SEQ ID NO：18)(PfRPL677-85)作为有前途的候选物。HHD小鼠的免疫(Pascolo,S.et al.,1997)，其表达人HLA-A*02:01且缺乏鼠类MHC类分子的表达，用此肽触发表位特异性CD8+ T细胞应答(图18)，提高其作为人抗原的潜力。
实施例19：通过用包含HLA-A*02:01-限制性表位ILNSGLLAV(SEQ ID NO：18)的缀合化合物接种产生TRM应答。
表位PfRPL677-85(ILNSGLLAV)(SEQ ID NO：18)包含在基因PfRPL6(PF3D7_1338200)的序列中，如下以粗体突出显示：
Figure BDA0003347507440000592
我们相信该表位作为保护性靶抗原包含在我们的疫苗中的潜力可如下所示。本领域技术人员可以通过用上述表位和周围的C-和N-末端序列取代NVFLP来产生类似于VOx.FFRK.NVFLP的疫苗。在一个实施例中，围绕该表位的侧翼C-和N-末端序列可以是1至4个氨基酸残基，特别是2个残基，如在TKILNSGLLAVVG(SEQ ID NO：19)中。如本文所述制备的这种缀合物疫苗然后将用于如实施例18接种HHD小鼠。可如本文所述在第35天使用四聚体染色和流式细胞术检测肝脏中的记忆T细胞应答，以确定该疫苗是否产生具有正确特异性的肝TRM细胞。此后，可以通过用表达PfRPL6的重组伯氏疟原虫子孢子攻击接种的HHD小鼠来显示所产生的TRM细胞的保护能力的测定。这些寄生虫的制备目前正在进行中并且被认为在本领域技术人员的技能范围内。
在已经参考专利说明书，其他外部文件或其他信息源的本说明书中，这通常是出于提供讨论本发明的特征的上下文的目的。除非另外具体说明，否则对这些外部文件的引用不应被解释为承认这些文件或这些信息源在任何权限中是现有技术或形成本领域公知常识的一部分。这些外部文献中的每一篇也具体通过引用并入本文。
Figure BDA0003347507440000591
7.工业实用性
本发明的化合物、方法和用途可用于在受试者中诱导减少感染、特别是肝感染、特别是疟疾的免疫应答。
参考文献
(n.d.).
Anderson RJ,L.J.(2017).Augmenting Influenza-Specific T Cell MemoryGeneration with a Natural Killer T Cell-Dependent Glycolipid-PeptideVaccine.ACS Chem Biol.,12(11),2898-905.
Anderson,R.J.(2014).A self-adjuvanting vaccine induces cytotoxicTlymphocytes that suppress allergy.Nature Chemical Biology,10(11),943-949.
Caminschi I,P.A.(2008).The dendritic cell subtype-restricted C-typelectin Clec9A is a target for vaccine enhancement.Blood,112(8),3264-73.
Davies B,P.J.(2017).Cutting Edge:Tissue-Resident Memory T CellsGenerated by Multiple Immunizations or Localized Deposition Provide EnhancedImmunity.J Immunol.,198(6),2233-7.
Du,W.S.-H.(2007).Efficient,one-pot syntheses of biologically activealpha-linked glycolipids.Chem Commun(Camb),23,2336-2338.
Dubowchik,G.M.(2002).Cathepsin B-labile dipeptide linkers forlysosomal release of doxorubicin from internalizing immunoconjugates:modelstudies of enzymatic drug release and antigen-specific in vitro anticanceractivity.Bioconjug Chem,13(4),855-869.
Exley MA,B.N.(2003).Innate immune response to encephalomyocarditisvirus infection mediated by CD1d.Immunology.Immunology,110(4),519-26.
Fernandez-Ruiz D,N.W.(2016).Liver-resident memory CD8+ T cells form afront-line defense against malaria liver-stage infection.Immunity,45.
Fujii S,S.K.(2003).Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide rapidly induces the full maturation of dendritic cells invivo and thereby acts as an adjuvant for combined CD4 and CD8 T cell immunityt.J Exp Med.,198(2),267-79.
Giaccone G,P.C.(2002).A phase I study of the natural killer T-cellligand alpha-galactosylceramide(KRN7000)in patients with solid tumors.ClinCancer Res,8(12),3702-9.
Gonzalez-Aseguinolaza G,V.K.(2002).Natural killer T cell ligandalpha-galactosylceramide enhances protective immunity induced by malariavaccines.J Exp Med.,195(5),617-24.
Hermans IF,S.J.(2003).NKT cells enhance CD4+and CD8+ T cell responsesto soluble antigen in vivo through direct interaction with dendritic cells.JImmunol.,171(10),5140-7.
Hogquist KA,J.S.(1994).T cell receptor antagonist peptides inducepositive selection.Cell,76(1),17-27.
Holz LE,P.J.(2018).CD8(+)T Cell Activation Leads to ConstitutiveFormation of Liver Tissue-Resident Memory T Cells that Seed a Large andFlexible Niche in the Liver.Cell Rep.,25(1),68-79 e4.
Khan TN,M.J.(2016).Local antigen in nonlymphoid tissue promotesresident memory CD8+ T cell formation during viral infection.J Exp Med.,213(6),951-66.
Kimura K,K.D.(2013).CD8+ T cells specific for a malaria cytoplasmicantigen form clusters around infected hepatocytes and are protective at theliver stage of infection.Infect Immun.,81(10),3825-34.
Krieg,A.(2006).Therapeutic potential of Toll-like receptor 9activation.Nat Rev Drug Discov.,5(6),471-84.
Lau LS,F.-R.D.(2014).CD8+ T cells from a novel T cell receptortransgenic mouse induce liver-stage immunity that can be boosted by blood-stage infection in rodent malaria.PLoS Pathog.,10(5),e21004135.
Li J,A.F.(2015).Antibodies targeting Clec9A promote strong humoralimmunity without adjuvant in mice and non-human primates.Eur J Immunol.,45(3),856-64.
Mackay LK,S.A.(2012).Long-lived epithelial immunity by tissue-resident memory T(TRM)cells in the absence of persisting local antigenpresentation.Proc Natl Acad Sci U.S.A.,109(18),7037-42.
Pallett,L.J.(2017).IL-2high tissue-resident T cells in the humanliver:Sentinels for hepatotropic infection.The Journal of ExperimentalMedicine,214(6),1567-1580.
Pascolo,S.,Bervas,N.,Ure,J.M.,Smith,A.G.,Lemonnier,F.A.,and Pe′rarnau,B.(1997)).HLA-A2.1-restricted education and cytolytic activity of CD8+T lymphocytes from beta2 microglobulin(beta2m)HLA-A2.1 monochain transgenicH-2Db beta2m double knockout mice.J.Exp.Med.185,2043–2051.
Ramakrishnan C,D.M.(2013).Laboratory maintenance of rodent malariaparasites.Methods Mol Biol.,923,51-72.
Rodrigues M,N.R.(1993).The relative contribution of antibodies,CD4+and CD8+ T cells to sporozoite-induced protection against malaria.Immunology,80(1),1-5.
Scheiblhofer S,L.J.(2017).Influence of protein fold stability onimmunogenicity and its implications for vaccine design.Expert Rev Vaccines,16(5),479-89.
Schmidt NW,B.N.(2010).Extreme CD8 T cell requirements for anti-malarial liver-stage immunity following immunization with radiationattenuated sporozoites.PLoS Pathog.,6(7),e1000998.
Schmidt NW,P.R.(2008).Memory CD8 T cell responses exceeding a largebut definable threshold provide long-term immunity to malaria.Proc Natl AcadSci U.S.A.,105(37),14017-22.
Seguin MC,K.F.(1994).Induction of nitric oxide synthase protectsagainst malaria in mice exposed to irradiated Plasmodium berghei infectedmosquitoes:involvement of interferon gamma and CD8+ T cells.J Exp Med,180(1),353-8.
Semmling V,L.-K.V.(2010).Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs.Nat Immunol.,11(4),313-20.
Vita,R.,Mahajan,S.,Overton,J.A.,Dhanda,S.K.,Martini,S.,Cantrell,J.R.,Wheeler,D.K.,Sette,A.,and Peters,B.(2019).The Immune Epitope Database(IEDB):2018 update.Nucleic Acids Res.47,D339–D343
Weiss WR,S.M.(1988).CD8+ T cells(cytotoxic/suppressors)are requiredfor protection in mice immunized with malaria sporozoites.Proc Natl Acad SciU.S.A.,85(2),573-6.
Widmann C,R.P.(1992).T helper epitopes enhance the cytotoxic responseof mice immunized with MHC class I-restricted malaria peptides.J ImmunolMethods,155(1),95-9.
序列表
<110> 维多利亚联结有限公司(Victoria Link Ltd)
惠灵顿维多利亚大学(Victoria University of Wellington)
马尔科普生物探索有限公司(Malcorp Biodiscoveries Limited)
<120> 糖肽疫苗
<130> P00092WO
<150> US 62/846,327
<151> 2019-05-10
<160> 21
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 1
Phe Phe Arg Lys
1
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 2
Asn Val Tyr Asp Phe Asn Leu Leu
1 5
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 3
Ala Ala Ala His Ser Leu Ser Asn Val Tyr Asp Phe Asn Leu Leu Leu
1 5 10 15
Glu Arg Asp
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 4
Asn Val Phe Asp Phe Asn Asn Leu
1 5
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 5
Ala Ala Ala Ser Thr Asn Val Phe Asp Phe Asn Asn Leu Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 6
Asp Asn Gln Lys Asp Ile Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ser Ile Asn Ala
1 5 10 15
Val Ser
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 7
Ala Ala Ala Leu Thr Ser Ala Leu Leu Asn Val Asp Asn Leu Ile Gln
1 5 10 15
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 8
Ser Thr Asn Val Phe Asp Phe Asn Asn Leu Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 9
Ser Ala Leu Leu Asn Val Asp Asn
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 10
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys
1 5
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 11
Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala
1 5 10 15
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr
20 25 30
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 12
His Ser Leu Ser Asn Val Tyr Asp Phe Asn Leu Leu Leu Glu Arg Asp
1 5 10 15
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 13
Glu Ile Tyr Ile Phe Thr Asn Ile
1 5
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 14
Leu Ser Asn Tyr Val Asp Phe Asn Leu Leu Leu Glu Arg Asp
1 5 10
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 15
Ala Ala Val Asn Val Tyr
1 5
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 16
Phe Lys Phe Leu
1
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 17
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 18
Ile Leu Asn Ser Gly Leu Leu Ala Val
1 5
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 19
Thr Lys Ile Leu Asn Ser Gly Leu Leu Ala Val Val Gly
1 5 10
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工蛋白质(Artificial protein)
<220>
<223> 人工蛋白质
<400> 20
His Ser Leu Ser Ile Leu Asn Ser Gly Leu Leu Ala Val Leu Glu Arg
1 5 10 15
Asp
<210> 21
<211> 221
<212> PRT
<213> 恶性疟原虫直接同源PF3D7_1338200 (Plasmodium falciparum orthologPF3D7_1338200)
<400> 21
Met Thr Asn Thr Ser Asn Glu Leu Lys His Tyr Asn Val Lys Gly Lys
1 5 10 15
Lys Lys Val Leu Val Pro Val Asn Ala Lys Lys Thr Ile Asn Lys Lys
20 25 30
Tyr Phe Gly Arg Lys Val Ala Ser Lys Lys Lys Tyr Val Val Gln Arg
35 40 45
Lys Leu Arg Lys Ser Ile Glu Val Gly Lys Val Ala Ile Ile Leu Thr
50 55 60
Gly Lys His Met Gly Lys Arg Cys Ile Ile Thr Lys Ile Leu Asn Ser
65 70 75 80
Gly Leu Leu Ala Val Val Gly Pro Tyr Glu Ile Asn Gly Val Pro Leu
85 90 95
Lys Arg Val Asp Ser Arg Tyr Leu Val Val Thr Ser Thr Asn Ile Phe
100 105 110
Asn Phe Glu Asn Ile Ala Lys Leu Lys Asp Asp Phe Leu Asn Tyr Ala
115 120 125
Gln Asp Ile Asp Asp Asp Ser Phe Ile Lys Thr Leu Glu Ile Lys Lys
130 135 140
Lys Gln Lys Lys Leu Leu Lys Asn Lys Asn Glu Ala Leu Phe Met Asn
145 150 155 160
Asn Val Ile Asp Lys Ile Lys Glu Ile Arg Lys Glu Asp Pro Lys Val
165 170 175
Gln Lys Leu Glu Gly Ile Gln Lys Asp Ile Gly Ser Leu Leu Lys Pro
180 185 190
Glu Ile Leu Lys Asn Lys Val Phe Ala His Tyr Leu Lys Ser Lys Phe
195 200 205
Thr Leu Arg Asn Asp Met Val Leu His Lys Met Lys Phe
210 215 220

Claims (19)

1.一种式I的化合物，
Figure FDA0003347507430000011
其中
R1是(C17-C25)烷基，
R2是为丙氨酸或瓜氨酸的侧链，
E是选自S或Ox的连接基，
Figure FDA0003347507430000012
G不存在或是选自由以下组成的组的氨基酸序列：FFRK(SEQ ID NO：1)、FKFL(SEQ IDNO：16)和GFLG(SEQ ID NO：17)；以及
J是肽抗原。
2.如权利要求1所述的化合物，其是式V.S.G.J的化合物：
Figure FDA0003347507430000021
其中
R1是(C17-C25)烷基，
R2是为丙氨酸或瓜氨酸的侧链，
G不存在或是选自由以下组成的组的氨基酸序列：FFRK(SEQ ID NO：1)、FKFL(SEQ IDNO：16)和GFLG(SEQ ID NO：17)；以及
J是肽抗原。
3.如权利要求1所述的化合物，其为式V、Ox、G、J的化合物：
Figure FDA0003347507430000022
其中
R1是(C17-C25)烷基，
R2是为丙氨酸或瓜氨酸的侧链，
G不存在或是选自由以下组成的组的氨基酸序列：FFRK(SEQ ID NO：1)、FKFL(SEQ IDNO：16)和GFLG(SEQ ID NO：17)；以及
J是肽抗原。
4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中R1为(C19–C25)烷基，优选(C21–C25)烷基，更优选(C25)烷基。
5.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中R2为瓜氨酸的侧链。
6.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中G是FFRK(SEQ ID NO：1)。
7.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中J包含结合由感染所述个体的肝脏中的至少一个细胞的生物体表达的抗原的表位。
8.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中J包含结合由感染所述个体的肝脏的生物体表达的抗原的表位。
9.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中J选自由以下组成的组：NVYDFNLL(SEQID NO：2)(NVYSP)、AAAHSLSNVYDFNLLLERD(SEQ ID NO：3)(NVYLP)、NVFDFNNL(SEQ ID NO：4)(NVFSP)和AAASTNVFDFNNLS(SEQ ID NO：5)(NVFLP)、DNQKDIYYITGESINAVS(SEQ ID NO：6)、AAALTSALLNVDNLIQ(SEQ ID NO：7)、STNVFDFNNLS(SEQ ID NO：8)、EIYIFTNI(SEQ ID NO：13)、ILNSGLLAV(SEQ ID NO：18)、TKILNSGLLAVVG(SEQ ID NO：19)和HSLSILNSGLLAVLERD(SEQ ID NO：20)。
10.一种药物组合物，其包含如权利要求1至9中任一项所述的化合物和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
11.一种疫苗，其包含如权利要求1至9中任一项所述的化合物和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
12.一种增加个体中肝TRM细胞数量的方法，其包含向所述个体施用如权利要求1至9中任一项权利要求所限定的化合物、如权利要求10所限定的组合物或如权利要求11所限定的疫苗。
13.如权利要求12所述的方法，其中相对于对照受试者或相对于所述受试者施用前中肝TRM细胞的数量，处理的受试者中肝TRM细胞的数量增加。
14.如权利要求13所述的方法，其中肝TRM细胞的数量增加足以为受试者提供至少一定水平的预防的数量，优选其中提供预防持续至少60天，优选持续至少70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190天，优选持续至少200天。
15.一种在受试者中诱导将减少肝细胞感染的免疫应答的方法，所述方法包含向所述受试者施用如权利要求1至9中任一项所限定的化合物、如权利要求10所限定的组合物或如权利要求11所限定的疫苗。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述免疫应答将肝细胞感染减少到没有持续感染的程度。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述免疫应答预防血液阶段感染。
18.如权利要求17所述的方法，其中血液阶段感染被预防持续至少60天，优选持续至少70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190天，优选持续至少200天。
19.如权利要求12至18中任一项所述的方法，其中所述肝细胞感染是疟原虫感染。
CN202080035050.7A 2019-05-10 2020-05-08 糖肽疫苗 Pending CN114555629A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962846327P 2019-05-10 2019-05-10
US62/846,327 2019-05-10
PCT/NZ2020/050048 WO2020231274A1 (en) 2019-05-10 2020-05-08 Glycopeptide vaccine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114555629A true CN114555629A (zh) 2022-05-27

Family

ID=73289628

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080035050.7A Pending CN114555629A (zh) 2019-05-10 2020-05-08 糖肽疫苗

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220233668A1 (zh)
EP (1) EP3966229A1 (zh)
CN (1) CN114555629A (zh)
WO (1) WO2020231274A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL305174A (en) * 2021-02-16 2023-10-01 Vaccitech North America Inc Self-assembly of nanoparticles based on amphiphilic peptides

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1713817A (zh) * 2002-10-23 2005-12-28 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 抗疟疾的疫苗接种方法
WO2014075047A2 (en) * 2012-11-12 2014-05-15 Genvec, Inc. Malaria antigens and methods of use
WO2014088432A1 (en) * 2012-12-06 2014-06-12 Callaghan Innovation Research Limited Conjugate compounds
WO2015187040A1 (en) * 2014-06-05 2015-12-10 Regan James Anderson Amino sphingoglycolipid analogues

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019122050A1 (en) * 2017-12-22 2019-06-27 Isa Pharmaceuticals B.V. Methods of immunization

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1713817A (zh) * 2002-10-23 2005-12-28 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 抗疟疾的疫苗接种方法
WO2014075047A2 (en) * 2012-11-12 2014-05-15 Genvec, Inc. Malaria antigens and methods of use
WO2014088432A1 (en) * 2012-12-06 2014-06-12 Callaghan Innovation Research Limited Conjugate compounds
WO2015187040A1 (en) * 2014-06-05 2015-12-10 Regan James Anderson Amino sphingoglycolipid analogues

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL FERNANDEZ-RUIZ等: "Liver-Resident Memory CD8+ T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection", IMMUNITY, vol. 51, no. 4, pages 780 *
LAUREN E. HOLZ等: "NVYDFNLL", SCIENCE IMMUNOLOGY, pages 1 - 13 *
REGAN J ANDERSON等: "Augmenting Influenza-Specific T Cell Memory Generation with a Natural Killer T Cell-Dependent Glycolipid-Peptide Vaccine", ACS CHEM BIOL ., pages 2898 - 2905 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220233668A1 (en) 2022-07-28
WO2020231274A1 (en) 2020-11-19
EP3966229A1 (en) 2022-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2756053C (en) Alpha-galactosyl ceramide analogs and their use as immunotherapies, adjuvants, and antiviral, antibacterial, and anticancer agents
ES2400249T3 (es) Vacunas recombinantes y utilización de las mismas
KR102235870B1 (ko) 접합체 화합물
RU2668560C2 (ru) Конъюгированная вакцина на основе пептида антигена wt1
Renaudet et al. Linear and branched glyco-lipopeptide vaccines follow distinct cross-presentation pathways and generate different magnitudes of antitumor immunity
ES2584430T3 (es) Estrategias para prevenir y/o tratar las respuestas inmunitarias a los alofactores solubles
DE69733352T2 (de) Hla-a2.1 bindende peptide und deren verwendung
Simerska et al. Modern lipid‐, carbohydrate‐, and peptide‐based delivery systems for peptide, vaccine, and gene products
US20080260774A1 (en) Alpha-galactosyl ceramide analogs and their use as immunotherapies
JP2002506003A (ja) インターフェロン−γフラグメントを含むリポペプチド、及び薬学的組成物におけるその使用
Hussein et al. Double conjugation strategy to incorporate lipid adjuvants into multiantigenic vaccines
Castro-Díaz et al. Saponins from the Spanish saffron Crocus sativus are efficient adjuvants for protein-based vaccines
Uppada et al. Enhanced humoral and mucosal immune responses after intranasal immunization with chimeric multiple antigen peptide of LcrV antigen epitopes of Yersinia pestis coupled to palmitate in mice
US20220233668A1 (en) Glycopeptide vaccine
RU2745720C2 (ru) Иммуногенная композиция lhrh и ее применение у свиней
Simerska et al. Development of a liposaccharide-based delivery system and its application to the design of group A streptococcal vaccines
WO2019122050A1 (en) Methods of immunization
WO2018162450A1 (en) New inmunostimulatory compositions comprising an entity of cold inducible rna-binding protein with an antigen for the activation of dendritic cells
US20180186897A1 (en) Novel vaccines in prevention and treatment of malaria
US20220054631A1 (en) MHC Class I Associated Hepatitis B Peptides
WO2010063865A1 (es) Uso de modulinas solubles en fenol para el desarrollo de vacunas
Gras-Masse Single-chain lipopeptide vaccines for the induction of virus-specific cytotoxic T cell responses in randomly selected populations
Cooney et al. Synthesis and Biological Evaluation of Peptide-Adjuvant Conjugate Vaccines with Increasing Antigen Content
Hussein et al. Synthesis of multicomponent peptide-based vaccine candidates against group A streptococcus
WO2024196771A2 (en) Lipid gb3 as adjuvant for vaccination

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20220527