DE60129725T2

DE60129725T2 - Schwefel analoge von 21-hydroxy-6,19-oxidoprogesteronen (21oh-6op) zur behandlung von glucocorticoidüberschuss

Info

Publication number: DE60129725T2
Application number: DE60129725T
Authority: DE
Inventors: Gerardo 1602 Florida BURTON; Carlos P. Lantos; Adriana Silvia 1640 Martinex VELEIRO
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 2000-09-18
Filing date: 2001-09-17
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2021-09-18
Also published as: IL154775A; PT1330468E; US7053228B2; DK1330468T3; US20050222104A1; IL154775A0; CA2419887A1; EP1330468A1; ES2288987T3; JP2004509132A; ATE368683T1; EP1330468B1; AU8988901A; US20040029846A1; SI1330468T1; CA2419887C; CY1107756T1; DE60129725D1; WO2002022647A1; US7479486B2

Description

Gebiet der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue 21-Hydroxy-6,19-oxidoprogesteron(21OH-6OP)-Analoga, ihre Verwendung als Antiglucocorticoide für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, die mit einem Überschuss an Glucocorticoiden assoziiert sind. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Verwendung von neuen 21-Hydroxy-6,19-oxidoprogesteron(21OH-6OP)-Analoga zur Behandlung von Cushing-Syndrom, i-atrogenem Hypercortisolismus oder Depression. Die Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Herstellung der neuen 21-Hydroxy-6,19-oxidoprogesteron(21OH-6OP)-Analoga.
Hintergrund der Erfindung
Corticosteroide sind Steroidhormone, die strukturell mit Cholesterin verwandt sind. Diese Hormone werden in der Nebennierenrinde synthetisiert und umfassen die Glucocorticoide (z.B. Cortisol), die Mineralocorticoide (z.B. Aldosteron) wie auch schwache Androgene und Östrogene. Die Nebennierenfunktion steht wie die der Schilddrüse unter der Kontrolle des Hypothalamus (HPT) und der Hypophyse (PIT). Wenn Cortisol (das natürlich vorkommende Glucocorticoid)-Spiegel unter einen Sollwert fallen, setzt der Hypothalamus CRH (Corticotropinfreisetzendes Hormon) frei, welches die Freisetzung von adrenocorticotropem Hormon aus der Hypophyse stimuliert. ACTH ist ein tropes Hormon, das stimuliert:

• die Synthese und Sekretion von Cortisol (es hat minimale Wirkungen auf Aldosteronsynthese/-sekretion) und
• das Wachstum der Nebenniere. Wenn Cortisollevel ansteigen, sperrt dies die CRH- und ACTH-Sekretion (siehe 1).

Cortisol wird durch seine Eigenschaften, die mit der Biosynthese und dem Metabolismus von Glucose in Verbindung stehen und die Eigenschaften, die mit nicht-spezifischer wie auch spezifischer Immunität in Verbindung stehen, gekennzeichnet. Infolge ihrer Wirkungen auf den Glucosemetabolismus werden Cortisol und natürliche oder synthetische Analoga davon üblicherweise als Glucocorticoide bezeichnet. Sie binden an den Glucocorticoidrezeptor (GR).
Der Glucocorticoidrezeptor ist ein Mitglied einer Proteinsuperfamilie eng verwandter intracellulärer Rezeptoren, welche als Liganden-aktivierte Transkriptionsfaktoren wirken. Weitere Mitglieder dieser Superfamilie sind der Mineralocorticoidrezeptor (MR) und der Progesteronrezeptor (PR). MR und GR haben sich als hoch homolog gezeigt, so zeigen natürliche und sogar synthetische Steroide eine Kreuzreaktion zwischen diesen Rezeptoren. Was PR angeht, so geht sein natürlicher Ligand Progesteron eine Kreuzreaktion mit MR und GR ein.
Cushing-Syndrom ist eine Störung, die aus einer verstärkten adrenocorticalen Sekretion von Cortisol resultiert. Eine Hyperfunktion der Nebennierenrinde kann ACTH-abhängig sein oder kann von einer ACTH-Regulation unabhängig sein, zum Beispiel Produktion von Cortisol durch ein adrenocorticales Adenom oder Karzinom. Die Verabreichung von supraphysiologischen Mengen an exogenem Cortisol oder verwandter synthetischer Analoga unterdrückt die Nebennierenfunktion und täuscht eine ACTH-unabhängige Glucocorticoidhyperfunktion vor. Eine ACTH-abhängige Hyperfunktion der Nebennierenrinde kann durch Hypersekretion von ACTH durch die Hypophyse, Sekretion von ACTH durch einen Nicht-Hypophysen-Tumor, zum Beispiel kleinzelli ges Karzinom in der Lunge (das ektopische ACTH-Syndrom), oder Verabreichung von exogenem ACTH bedingt sein. Während der Ausdruck „Cushing-Syndrom" auf das klinische Bild angewendet wird, das aus einem Cortisolüberschuss ungeachtet der Ursache resultiert, wurde Hyperfunktion der Nebennierenrinde, die aus Hypophysen-ACTH-Überschuss resultiert, häufig als Cushing-Erkrankung bezeichnet, die eine bestimmte physiologische Abnormalität impliziert. Patienten mit Cushing-Erkrankung können ein basophiles Adenom der Hypophyse oder ein chromophobes Adenom haben. Mikroadenome können üblicherweise durch CT oder vorzugsweise MRI-Scan unter Verwendung einer Hochauflösungstechnik, die durch Gadolinium verstärkt wird, sichtbar gemacht werden. Einige Mikroadenome sind selbst mit diesen Modalitäten schwer sichtbar zu machen. In einigen Fällen wird trotz des klaren Beweises einer ACTH-Überproduktion keine histologische Abnormalität in der Hypophyse gefunden.
Die Bezeichnung Cushing-Syndrom soll hierin das klinische Bild bezeichnen, das aus einem Cortisolüberschuss ungeachtet der Ursache resultiert, wobei diese auch iatrogen sein kann sowohl durch die Injektion von ACTH als auch durch die direkte Verabreichung von Cortisol oder synthetischer Analoga, zum Beispiel Prednison, Prednisolon, Dexamethason oder andere, die in großem Umfang bei verschiedenen Krankheitstypen eingesetzt werden, einschließlich allergischer, asthmatischer, inflammatorischer oder immunologischer Krankheiten. Cushing-Syndrom umfasst zusätzlich Nebennierentumore, die Corticoide sezernieren, ektopische ACTH-Produktion und Cushing-Krankheit.
Klinische Manifestationen umfassen runde „Mond"-Gesichter mit plethorischem Aussehen. Es gibt Stammfettsucht mit herausragenden supraclavicularen und dorsalen zervikalen Fettpolstern („buffalo hump"); die distalen Extremitäten und Finger sind üblicherweise ziemlich schlank. Es liegen Muskelschwund und Schwäche vor. Die Haut ist dünn und atrophisch mit schlechter Wundheilung und leichter Blutergussbildung. Am Abdomen können purpurrote Streifen auftreten. Bluthochdruck, Nierensteine, Osteoporose, Glucoseintoleranz, verringerte Resistenz gegen Infektion und psychiatrische Störungen sind üblich. Bei Kindern ist das Aufhören von linearem Wachstum charakteristisch. Frauen haben üblicherweise Menstruationsunregelmäßigkeiten. Eine erhöhte Produktion von Androgenen zusätzlich zu Cortisol kann zu Hypertichose, temporärer Glatze und anderen Anzeichen für Virilismus bei der Frau führen.
Obgleich die Entwicklung von antihormonalen Mitteln, die mit den Östrogen- und Androgenrezeptoren in Verbindung stehen, erfolgreich war, ist die Suche nach selektiven Anticorticoiden eingeschränkter.
Eine Übersicht über bekannte Mittel, die die Synthese von Steroidhormonen bei verschiedenen Leveln supprimieren (d.h. Inhibitoren von Enzymen, die verschiedene Stufen der Synthese von Steroidhormonen katalysieren) ist in J. Steroid Biochem., Band 5, S. 501 (1974) gegeben und umfasst Folgendes:

a) Derivate von Diphenylmethan, z.B. Amphenon B (das die Synthese von Steroidhormonen in den Stufen 11-beta-, 17-und 21-Hydroxylase supprimiert);
b) Pyridinderivate (SU-c-Reihe), z.B. Metirapon (welches die Synthese in der Stufe 11-beta-Hydroxylase supprimiert);
c) substituierte alpha,alpha-Glutaramide, z.B. Aminoglutetimid (welches die Synthese von Pregnenolon aus Cholesterin durch Suppression von 20-alpha-Hydroxylase und C₂₀, C₂₂-Liase behindert);
d) Steroidsubstanzen, z.B. Trilostan (3 beta-substituierte Steroid-3 beta-Hydroxy-5-androsten-17-on), welches die 3 beta-Desoxysteroidhydrogenase-5,4-isomerase supprimiert (Steroids, Band 32, S. 257);
e) Steroide der Spironolactonfamilie, die als schnell dissoziierende Anti-Mineralocorticoide verwendet werden (PNAS USA 71(4) S. 1431–1435 (1974));
f) synthetisches Steroid, das als Anti-Mineralocorticoid, ZK91587, beschrieben wird, das spezifische Bindungseigenschaften für die Niere (Z. Naturforsch. 45b, S. 711–715 (1990)) und MR vom Hippocampus-Typ I zeigt (Life Science, 59, S. 511–21 (1996)), nicht aber für GR Typ II. Es kann daher in zweckdienlicher Weise bei der Untersuchung von MR-Funktion in Geweben, die beide Rezeptorsysteme enthalten, nützlich sein.

Mittel, die spezifisch die Wechselwirkung von Glucocorticoidhormonen mit Hormonrezeptoren unterdrücken, sind:

a) Mifepriston, (11β,17ß)-11-[4-(Dimethylamino)phenyl]-17-hydroxy-17-(1-propinyl)estra-4,9-dien-3-on, das auf Rezeptoren von Glucocorticoidhormonen unter Bildung eines Komplexes wirkt, der unfähig ist, Mechanismen zu initiieren, die zu einer Glucocorticoidwirkung führen (Annals of New-York Academy of Science, Band 761, S. 296–310 (1995)); diese Verbindung ist auch als Kontragestivum bekannt (RU38486 oder RU486);
b) Nicht-Steroid-Substanzen (J: Steroid Biochem., Band 31, S. 481–492 (1988)), z.B. Drataverinahydrochlorid (ein Derivat von Isochinolin-1-(3,4-dietoxibenziliden)-6,7-dietoxy-1,2,3,4-tetrahydrizochinolin) oder Acetylsalicyl säure (Moskovskaya Meditsina, 1990, „Receptor mechanisms of the glucocorticoid effect" von V.P. Golikov).

Bis heute ist die einzige therapeutische Anwendung für Antiglucocorticoide (z.B. Mifepriston), die in einem klinischen Rahmen versucht wurde, die Behandlung von inoperablen Fällen von Nicht-Hypophysen-Cushing-Syndrom. Im Fall von Mifepriston (sowohl ein Antiprogesteron als auch ein Antiglucocorticoid) sind hohe Dosen (bis zu 800 mg pro Tag) erforderlich. Bei Verwendung einer systemischen Anwendung von Strategien zur Erhöhung der Aktivität und Verringerung der Kreuzreaktivität und unerwünschter Nebenwirkungen wurden eindrucksvolle Fortschritte bei der Entwicklung neuer antihormoneller Mittel mit größerer Wirksamkeit und Selektivität, speziell auf dem Antiöstrogen- und Antiandrogengebiet, beschrieben.
Ein weiteres Antiglucocorticoidmittel ist in EP-903,146 offenbart, die sich auf ein synthetisches Steroid bezieht, das 21-Hydroxy-6,19-oxidoprogesteron(21OH-6,19-OP) genannt wird und die Formel I hat:
21OH-6, 19-OP wird als selektives Antiglucocorticoid beschrieben, das nicht wesentlich mit Uterus-PR oder Nieren-MR kreuzreagiert.
Beschreibung der Erfindung:
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung neuer Antiglucocorticoidverbindungen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Behandlung von Krankheitszuständen, die mit einem Überschuss an Glucocorticoiden assoziiert sind.
Nach einem ersten Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung der Formel (II) bereit:
worin X S, SO und SO₂ ist und R entweder H oder OH ist.
Nach einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (II)
worin X S, SO und SO₂ ist und R entweder H oder OH ist, zur Verwendung als Medikament bereit.
Nach einem dritten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel (II)
worin X S, SO und SO₂ ist und R entweder H oder OH ist, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit einem Überschuss an Glucocorticoiden assoziiert sind, bereit.
Nach einem vierten Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend wenigstens ein 21-Hydroxy-6,19-oxido-progesteron-Analogon der Formel II und einen oder mehrere geeignete Träger dafür.
Nach einem fünften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Erfindung bereit.
Die neuen Verbindungen haben eine 6,19-Sulfanyl-, 6,19-Sulfoxid- und 6,19-Sulfon-Brücke anstelle einer 6,19-Sauerstoffbrücke im 21-Hydroxy-6,19-oxido-progesteron der Formel (I). Somit stellen sie die Schwefelanaloga (II) des 21-Hydroxy-6,19-oxido-progesteron (I) dar.
worin X S, SO und SO₂ ist, während R entweder H oder OH ist; und insbesondere Schwefelanaloga der folgenden Formel IIa dar
worin X SO oder SO₂ ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich spezifischer auf die folgenden drei 21-Desoxy- und drei 21-Hydroxy-6,19-oxidoprogesteron-Analoga:
Ein weiterer Vorteil der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist ihre bequeme Synthese. Die Transformation der Sulfanylbrücke der Verbindungen 3 und 6 in die Sulfoxide 4 und 7 und die Sulfone 5 und 8 durch Oxidation ist insbesondere bequem durchzuführen. Darüber hinaus verbessern das Sulfoxid und die Sulfonbrücke die Wasserlöslichkeit und die Stabilität der Verbindungen.
Die Antiglucocorticoide der vorliegenden Erfindung sind für die Behandlung von Krankheiten geeignet, die mit einem Überschuss an Glucocorticoiden assoziiert sind. Die Antiglucocorticoide der vorliegenden Erfindung sind insbesondere für die Behandlung von Cushing-Syndrom, iatrogenem Hypercortisolismus und Depression, die mit einem Überschuss an Glucocorticoiden im Körper assoziiert sind, insbesondere bei Säugern, einsetzbar. Sie sind auch zur Behandlung von Störungen verwendbar, die eine Modulation der Immunantwort erfordern.
Die vorliegende Erfindung stellt somit die 21-Hydroxy-6,19-sulfanyl- und -sulfoxy- und -sulfonyl-progesterone der Formel II zur Verwendung als Medikament bereit.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung der 21-Hydroxy-6,19-sulfanyl- und -sulfoxy- und -sulfonyl-progesterone der Formel II bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit einem Überschuss an Glucocorticoiden assoziiert sind. Bevorzugter wird die Verbindung der Formel II bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Cushing-Syndrom, iatrogenem Hypercortisolismus, Depression oder zur Modulierung der Immunantwort verwendet.
Die Verbindung der Formel I kann in Übereinstimmung mit üblichen Steroidformulierungen mit einem geeigneten Träger dafür oder mehreren geeigneten Trägern dafür formuliert werden.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht den Stoffwechselweg, der sich auf die endogene Cortisolproduktion bezieht.
2 zeigt ein „least squares overlay" von Röntgenstrukturen von 6,19-Oxidoprogesteron (I) (6OP) und 6,19-Sulfanylprogesteron (6).
3a–3f zeigen Cytogramme, in denen GR-FL die Fluoreszenz aus FITC darstellt und RD-FL die Fluoreszenz von Propidiumiodid darstellt (Daten erhalten aus dem unten beschriebenen Thymocyten-Apoptose-Assay). Lebende Zellen, die weder Annexin-FITC noch Propidiumiodid binden, erscheinen im unteren rechten Quadranten. Nekrotische oder späte apoptotische Zellen erscheinen im oberen rechten Quadranten.
3a stellt die Zellapoptose dar, die in Thymocyten durch Dexamethason allein (10^-8 M) induziert wird.
3b stellt die Zellapoptose dar, die in Thymocyten durch Dexamethason (10^-8 M) + 21OH-6OP (10^-5 M) (Verbindung (I)) induziert wird.
3c stellt die Zellapoptose dar, die in Thymocyten durch Dexamethason (10^-8 M) + 21OH-6SOP (10^-5 M) (Verbindung (4)) induziert wird.
3d stellt die Zellapoptose dar, die in Thymocyten durch Dexamethason (10^-8 M) + RU-486 (10^-6 M) induziert wird.
3e stellt die Zellapoptose dar, die in Thymocyten durch Dexamethason (10^-8 M) + 21OH-6SP (10^-5 M) (Verbindung (3)) induziert wird.
3f stellt die Zellapoptose dar, die in Thymocyten durch Dexamethason (10^-8 M) + 21OH-6SO₂P (10^-5 M) (Verbindung (5)) induziert wird.
4 bezieht sich auf den Reportergen-Assay, der unten beschrieben wird, und zeigt die Aktivität der Testverbindungen (1), (3), (4) und (5), die in einer Endkonzentration von 10^-6 M verwendet werden, gegenüber einer Referenzverbindung (RU 486). Dexa bedeutet Dexamethason und RU 486 (11-(4-Dimethylaminophenyl)-17-hydroxy-13-methyl-17-prop-1-inyl-1,2,6,7,8,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-cyclopenta[α]phenanthren-3-on) wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Werte auf der Ordinate entsprechen Luciferaseeinheiten/β-Galactosidaseeinheiten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Synthese der neuen 21-Hydroxy-6,19-sulfanyl- und -sulfoxy- und -sulfonyl-progesterone der Formel Ir (d.h. Verbindungen 3–8).
Grundsätzlich umfasst das Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Formel 3 die Schritte (siehe Schema 3):

a) Bereitstellen des 19-Thioacetylsteroids der Formel 16 (siehe Schema 3);
b) Schützen der 3-Ketogruppe desselben, vorzugsweise durch eine Ethylenglycolgruppe;
c) Transformieren der 19-Thioacetylgruppe in eine Thiolgruppe und
d) Durchführen einer Hydrolyse an der Verbindung von Schritt c).

Die Sulfoxy- und Sulfonylverbindungen 4 und/oder 5 werden im Allgemeinen erhalten durch

a) Bereitstellen einer Verbindung der Formel 3 (siehe Schema 4);
b) Unterwerfen der genannten Verbindung einer Oxidation, vorzugsweise mit einem Oxidationsmittel, z.B. Ozon oder Kaliummonopersulfat (zum Beispiel Oxone^®).

Eine Behandlung mit Kaliummonopersulfat bei niedriger Temperatur (zum Beispiel 0°C) liefert das Sulfoxid, wohingegen eine Behandlung bei Raumtemperatur das Sulfon ergibt.
Die Herstellung der Verbindung gemäß Formel 6 umfasst die folgenden Schritte (siehe Schema 1):

a) Bereitstellen des 19-Hydroxyprogesterons der Formel 11 (siehe Formel in Schema 1);
b) Transformieren der 19-Hydroxygruppe in eine Thioacetoxygruppe;
c) Schützen der 3-Ketogruppe desselben, vorzugsweise mit einer Ethylenglycolgruppe;
d) Transformieren der 19-Thioacetoxygruppe in eine Thiolgruppe und
e) Durchführen einer Hydrolyse mit der Verbindung von Schritt d).

Die Sulfoxy- und Sulfonylverbindungen 7 und/oder 8 werden im Allgemeinen erhalten durch

c) Bereitstellen einer Verbindung der Formel 6,
d) Unterwerfen der genannten Verbindung einer Oxidation, vorzugsweise mit einem Oxidationsmittel, zum Beispiel Kaliummonopersulfat (zum Beispiel Oxone^®).

Im Folgenden soll ein bevorzugtes Verfahren für die Herstellung der 21-Desoxy-Analoga 6, 7 und 8 erläutert werden.
Das Folgende ist eine Liste von verwendeten Abkürzungen:

– NBA: N-Bromacetamid,
– THF: Tetrahydrofuran,
– VFC: Dampfströmungschromatographie,
– PTSA: para-Toluolsulfonsäure,
– RT: Raumtemperatur.

Schritte

a) 1. NBA-HClO₄/THF-Et₂O 30 Min., RT; 2. Diacetoxyiodbenzol, I₂, CH₂Cl₂, 300 W Wolframlampe, 2 h, RT; 3. NaOH, MeOH, 30 Min., RT; 4. PCC, 4 Å-Molekularsiebe; BaCO₃, CH₂Cl₂, RT.
b) Zn, AcOH, i-PrOH, 3 h, 70° (dann VFC);
c) 1. Trifluormethansulfonsäureanhydrid, Pyridin, 1 h, RT; 2. KSAc, Aceton (wasserfrei), N₂, über Nacht, RT (dann VFC).
d) 1. Ethylenglycol, Ethylorthoformiat, PTSA, 2 h, 60°, N₂; 2. K₂CO₃, MeOH, 1 h, RT, N₂.
e) I₂, Et₃N, CH₂Cl₂, 2 h, RT (dann VFC).

Ausgehend von Pregnenolonacetat (9) wird der Bromether (10) erhalten, der reduktiv mit Zn/AcOH in Isopropanol unter Erhalt von 19-Hydroxyprogesteron (11) gespalten wird. Die 19-Hydroxygruppe desselben wird in das Triflat umgewandelt und mit Kaliumthioacetat unter Erhalt von (12) verdrängt. Um die 6,19-Brücke zu bilden, wird die 4,5-Doppelbindung durch die Bildung des 3-Ethylenketals in die 5,6-Position umgelagert. Das Thioacetat wird mit einer geeigneten Base hydrolysiert, wodurch das freie 19-Thiol (13) erhalten wird, das unverzüglich mit Iod und Triethylamin in Dichlormethan behandelt wird. Dies führt zu einer Kaskadenreaktion (siehe Schema 2), die ohne Isolierung von Zwischenprodukten zu dem Endprodukt 6,19-Sulfanylprogesteron (6) fortschreitet.
Die Bildung der oxidierten Derivate 7 und 8 wird durch Oxidation, vorzugsweise mit Kaliummonopersulfat, zum Beispiel Oxone (geliefert von DuPont de Nemours) in wässrigem Methanol erreicht. Kurze Reaktionszeiten und niedrige Temperatur (0°C) ergibt das Sulfoxid (7) (einzelnes Stereoisomer), während längere Reaktionszeiten bei Raumtemperatur das Sulfon 8 ergeben.
Eine Röntgenstrukturanalyse (siehe 1) zeigt die Superposition der Röntgenstrahlkristallstrukturen sowohl der Verbindung (6) als auch des Sauerstoff-verbrückten Analogons (21-Desoxy-Verbindung der Formel I).
Schema 2 zeigt die „Eintopf"-Iodcyclisierungs/entschützungs/-dehydrohalogenierungsreaktion des 3-geschützten 19-Sulfanylsteroids sowie mögliche Nebenreaktionen. Die gewünschte Verbindung 18 kann durch Chromatographie oder Umkristallisieren isoliert werden. Schema 2
Im Folgenden soll ein bevorzugtes Verfahren für die Herstellung der 21-Hydroxy-Analoga 3, 4 und 5 erläutert werden.
Das entsprechende Schwefel-Analogon von (I), d.h. 21-Hydroxy-6,19-sulfanylprogesteron ((3); 21OH-6SP) wird zusammen mit den oxidierten Derivaten (4) und (5) synthetisiert. Das Syntheseverfahren beginnt mit Bromketon (14) (siehe Schema 3).
Verbindung (14) kann geringe Mengen des Eliminierungsproduktes enthalten, allerdings beeinflusst dies die Ausbeute nicht, da sowohl Verbindung (14) als auch ihr Eliminierungsprodukt unter denselben Reaktionsbedingungen in 19-Hydroxydesoxycorticosteron umgewandelt werden. Aus Gründen der Einfachheit ist das bevorzugte entwickelte Syntheseverfahren von Bromketon (14) ausgehend gezeigt. Schema 3
Schritte

a) Zn-ACOH/iPrOH, 70°C (VFC);
b) 1. (F₃CSO₂)₂O/Py; 2. KSAc/Aceton;
c) Ethylenglycol (EtO)3CH/PTSA, (dann VFC);
d) KOH/MeOH;
e) I₂, Et₃N, CH₂Cl₂ (dann VFC).

Die Hydrolyse des Thioacetats in Schema 3 wird gleichzeitig mit der Deacetylierung am C-21 mit KOH in Methanol anstelle von Kaliumcarbonat durchgeführt, da das letztgenannte Reagenz die α-Ketol-Seitenkette, die mit 21-Hydroxy-20-keto-Steroiden inkompatibel ist, spaltet. Eine direkte Oxidation von (3) mit Kaliummonopersulfat, z.B. Oxone^®, ergibt die Sulfoxidverbindung (4) und die Sulfonverbindung (5), und zwar in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen, ohne dass die Seitenkette beeinträchtigt wird (Schema 4). Schema 4
Die Erfindung wird nun mit den folgenden Beispielen weiter erläutert:
BEISPIELE
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Reagenzien:
Allgemeines. Schmelzpunkte wurden mit einem Fisher-Johns-Gerät bestimmt und sind unkorrigiert. IR-Spektren werden in dünnen Filmen unter Verwendung von KBr-Scheiben mit einem Nicolet Magna IR 550 FT-IR-Spektrometer aufgezeichnet. ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren werden in einem Bruker AC-200- oder AM-500-NMR-Spektrometer in Deuteriochloroform (unter Verwendung von TMS als innerer Standard) gemessen. Die J-Werte sind in Hz angegeben. Spektren wurden durch Analyse der DEPT-, COSY 45- und HETCOSY-Spektren und durch Vergleich mit denen von Progesteron zugeordnet.
Die Elektronenstoß-Massenspektren (EI) werden in einem VG Trio 2-Massenspektrometer bei 70 eV durch direkten Einlass gemessen. FAB-Massenspektren und Elektronenstoß-Hochauflösungs-Massenspektren (HRMS) werden in einem VG ZAB BEQQ-Massenspektrometer erhalten. Alle Lösungsmittel haben Analysenqualität. Lösungsmittel werden bei etwa 45°C unter Vakuum verdampft. Zinkstaub wird aktiviert, indem er in 1M HCl suspendiert wird, mit Wasser, absolutem Ethanol und Diethylether gewaschen wird und 2 h bei 120°C getrocknet wird. Die Homogenität aller Verbindungen wird durch Dünnschichtchromatographie bestätigt.
In den folgenden Beispielen 1 bis 4 ist die Verbindung 14a die Ausgangsverbindung und die Verbindungen 14b, 14c und 14d sind Zwischenverbindungen, die zur Synthese von Verbindung 14 (5α-Brom-21-acetyloxy-6,19-oxidopregnan-3,20-dion) führen.
Beispiel 1
3β-Formyloxy-21-acetyloxy-5-pregnen-20-on (14a)
Essigsäureanhydrid (13,4 ml) wird tropfenweise zu Ameisensäure (6,6 ml) mit 0 °C gegeben, die Lösung wird für 15 Minuten bei 50°C erwärmt und rasch auf 0°C abgekühlt. Die resultierende Essig-Ameisensäureanhydridlösung wird tropfenweise zu einer gerührten Suspension von 21-Acetoxypregnenolon (im Handel verfügbar, 8,0 g) in trockenem Pyridin (20,8 ml) mit 0°C gegeben und bei dieser Temperatur für 2 h weitergerührt. Die Reaktion wird über kalte gesättigte wässrige Natriumbicarbonatlösung gegossen, filtriert und der Feststoff wird mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung, Wasser und 1N HCl und Wasser (bis neutral) gewaschen, um so die Formiattitelverbindung zu erhalten (8,0 g); ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,70 (3H, s, 13-CH₃), 1,02 (3H, s, 10-CH₃), 2,16 (3H, s, 21-CH₃CO), 2,53 (1H, t, J = 8,0 Hz, 17-H), 4,50 (1H, d, J = 17,0 Hz, 21a-H), 4,70 (1H, d, J = 17,0 Hz, 21b-H), 5,32 (1H, m, 3-H), 5,38 (1H, d, J = 3,0 Hz, 6-H), 8,02 (1H, s, HCOO).
Beispiel 2
3β-Formyloxy-5α-brom-6β-hydroxy-21-acetyloxypregnan-20-on (14b)
Das Formiat 14a (8,0 g) wird in Diethylether (100 ml) und THF (37,2 ml) gelöst und auf 10°C abgekühlt. Zu der gerührten Lösung mit 10–15°C, die vor Licht geschützt wird, wird 7,5%ige Perchlorsäure (11,88 ml) zugesetzt, anschließend wird N-Bromacetamid (4,75 g) in 8 Portionen in einem Zeitraum von 25 Min. zugesetzt. Das Rühren wird für 45 Min. bei 25°C fortgesetzt und die Reaktion wird durch Zusatz von 10%iger wässriger Natriumthiosulfatlösung bis zur vollständigen Entfärbung gestoppt. Das Reaktionsgemisch wird dann mit Dichlormethan/Methanol 10:1 extrahiert und die organische Schicht wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird unter Erhalt von Brom hydrin 14a (10,4 g, enthaltend etwa 20% des 5α-Hydroxy-6β-brom-Isomers, bestimmt durch ¹H NMR) verdampft.
Beispiel 3
3β-Formyloxy-5α-brom-21-acetyloxy-6,19-oxidopregnan-20-on (14c)
Stickstoff wird für 5 Min. durch eine Lösung der Bromhydrinverbindung 14b (10,4 g, enthaltend etwa 20% des 5α-Hydroxy-6β-brom-Isomers) in frisch destilliertem Dichlormethan (723 ml), die in einem 1-Liter-Glassgefäß enthalten ist, das mit einer externen Kühlungsummantelung mit zirkulierendem Wasser mit 25°C und einem Magnetrührer ausgestattet ist, perlen gelassen. Diacetoxyiodbenzol (Suarez-Reagenz, 7,66 g) und Iod (5,46 g) werden sukzessive unter Rühren zugesetzt. Das Gefäß wird zwei 300 Watt-Wolframlampen (5.000 lm jeweils) ausgesetzt und das kräftige Rühren wird für 1 h bei 25°C fortgesetzt. Die Bestrahlung wird abgeschaltet und es wird eine gesättigte wässrige Natriumthiosulfatlösung bis zur vollständigen Entfärbung zugesetzt. Die organische Schicht wird abgetrennt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird abgedampft. Der resultierende Feststoff wird in Dichlormethan (8 ml) gelöst und auf eine Silicagel G-60-Säule (12 cm Durchmesser × 8 cm Höhe), die vorher mit Hexan gespült worden war, aufgebracht; eine sukzessive Elution (anlegen von Vakuum am Auslaß) mit Hexan-Ethylacetat 9:1 (1.100 ml), 8:2 (700 ml), 7:3 (700 ml) und 6:4 (600 ml) liefert 31 × 100 ml-Fraktionen. Die Fraktionen werden mit TLC analysiert und die, die Bromether 14c enthalten, werden gesammelt und zur Trockne eingeengt, wodurch 14c (6,8 g) erhalten wird. ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,70 (3H, s, 13-CH₃), 2,16 (3H, s, 21-CH₃CO), 2,52 (1H, t, J = 8,8 Hz, 17-H), 3,73 (1H, d, J = 8,4 Hz, 19a-H), 3,94 (1H, d, J = 8,4 Hz, 19b-H) 4,08 (1H, d, J = 4,2 Hz, 6-H), 4,50 (1H, d, J = 16,8 Hz, 21a-H), 4,71 (1H, d, J = 16,8 Hz, 21b-H), 5,34 (1H, m, 3-H), 8,02 (1H, s, HCOO).
Beispiel 4
3β-Hydroxy-5α-brom-21-acetyloxy-6,19-oxidopregnan-20-on (14d)
Eine gerührte Lösung des Bromethers 14c (6,8 g), der oben erhalten wurde, wird in Dichlormethan (45,7 ml) und Methanol (154,7 ml) gelöst und in einem Eisbad und Wasser (10,9 ml) auf 0°C gekühlt, während konz. HCl (23,0 ml) zugesetzt wird. Nach etwa 30-minütigem kräftigen Rühren bei 0°C (Verschwinden des Ausgangsmaterials wird durch TLC überwacht) wird das Reaktionsgemisch mit 20%igem wässrigen Natriumhydroxid neutralisiert und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird unter Erhalt der Alkoholverbindung 14d (6,5 g) verdampft. ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,69 (3H, s, 13-CH₃), 2,16 (3H, s, 21-CH₃CO), 2,52 (1H, t, J = 8,5 Hz, 17-H), 3,62 (1H, d, J = 8,5 Hz, 19a-H), 3,92 (1H, d, J = 8,5 Hz, 19b-H), 4,07 (1H, d, J = 4,0 Hz, 6-H), 4,15 (1H, m, 3-H), 4,51 (1H, d, J = 17,0 Hz, 21a-H), 4,70 (1H, d, J = 17,0 Hz, 21b-H).
Beispiel 5
5α-Brom-21-acetyloxy-6,19-oxidopregnan-3,20-dion (14)
Eine Suspension von Pyridiniumchlorchromat (12,1 g), Bariumcarbonat (5,0 g) und 3 Å-Molekularsieben (9,60 g) in trockenem Dichlormethan (480 ml) wird für etwa 10 Min. unter Stickstoff gerührt. Zu der resultierenden orangefarbenen Aufschlemmung wird eine Lösung von Bromether 14d (6,5 g), der oben erhalten wurde, in trockenem Dichlormethan (324 ml) gegeben und das Rühren wird für etwa 90 Min. bis zum Verschwinden des Ausgangsmaterials (TLC) fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird durch eine kurze Silicagel G 60-Säule (12 cm Durchmesser × 8 cm Höhe) perlen gelassen, mit Diethylether gewaschen (2 × 150 ml) und mit Hexan-Ethylacetat 1:2 (3 × 150 ml) gewaschen. Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden gesammelt und zur Trockne eingeengt, was 5,5 g Keton 14 (enthaltend etwa 10% Δ⁴-3-Keton) ergibt; ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,70 (3H, s, 13-CH₃), 2,16 (3H, s, 21-CH₃CO), 2,51 (1H, t, J = 8,5 Hz, 17-H), 2,85 (1H, d, J = 16,0 Hz, 4a-H), 3,40 (1H, d, J = 16,0 Hz, 4b-H), 3,90 (1H, d, J = 9,0 Hz, 19a-H), 4,07 (1H, d, J = 4,0 Hz, 6-H), 4,15 (1H, d, J = 9,0 Hz, 19b-H), 4,50 (1H, d, J = 17,0 Hz, 21a-H), 4,71 (1H, d, J = 17,0 Hz, 21b-H).
Den Syntheseverfahren der Beispiele 1–5 folgend werden unter Verwendung von Pregnenolonacetat anstatt von 21-Acetoxypregnenolon als Ausgangsverbindung in Beispiel 1 die entsprechenden 21-Desoxyderivate von 14 und 14a-d erhalten.
Beispiel 6
19-Hydroxy-21-acetyloxy-4-pregnen-3,20-dion (15)
5α-Brom-21-acetyloxy-6,19-oxidopregnan-3,20-dion (14) von Beispiel 5 (2,5 g, 5,4 mmol) wird in Propan-2-ol (257 ml) bei 70°C suspendiert. Essigsäure (19,3 ml) und aktivierter Zinkstaub (6,4 g, mmol) werden zugesetzt. Die Suspension wird gerührt und 4 h bei 70–75°C erwärmt, abgekühlt, filtriert, konzentriert und mit Dichlormethan extrahiert. Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt 19-Hydroxy-21-acetoxyprogesteron (15) (1,1 g, 53%); ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,70 (3H, s, 13- CH₃), 2,16 (3H, s, 21-CH₃CO), 2,50 (1H, t, J = 8,0 Hz, 17-H), 3,89 (1H, d, J = 10,8 Hz, 19a-H), 4,05 (1H, d, J = 10,8 Hz, 19b-H), 4,50 (1H, d, J = 16,8 Hz, 21a-H), 4,70 (1H, d, J = 16,8 Hz, 21b-H), 5,95 (1H, s, 4-H).
Beispiel 7
3,3-Ethylendioxy-19-acetylsulfanyl-21-acetyloxy-5-pregnen-20-on (17)
Eine Lösung von 19-Hydroxy-21-acetoxyprogesteron (15) (620 mg, 1,60 mmol) in kaltem Pyridin (6,4 ml) wird tropfenweise zu einer gerührten Lösung von Trichlormethansulfonsäureanhydrid (0,7 ml, 4,16 mmol) in kaltem Pyridin (3,6 ml) unter Stickstoff gegeben. Die Lösung wird auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und nach 1 h wird kaltes Dichlormethan (98,0 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird mit kalter 1 M Schwefelsäure, 5%iger wässriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet und zur Trockne eingeengt, was rohes 19-Triflylprogesteron-21-acetat ergibt, welches dann (780 mg, 1,60 mmol) mit Kaliumthioacetat (780 mg, 6,83 mmol) in Aceton (40,0 ml) gemischt wurde und für 24 h unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt wird. Das Reaktionsgemisch wird mit Dichlormethan verdünnt, filtriert und zur Trockne eingeengt, was rohes 19-Acetylsulfanylsteroid 16 (712 mg, 100) ergibt; ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,74 (3H, s, 13-CH₃), 2, 16 (3H, s, 21-CH₃CO), 2,32 (3H, s, 19CH₃COS), 2,50 (1H, t, J = 8,0 Hz, 17-H), 3,18 (1H, d, J = 13,7 Hz, 19a-H), 3,47 (1H, d, J = 13,7 Hz, 19b-H), 4,50 (1H, d, J = 16,8 Hz, 21a-H), 4,70 (1H, d, J = 16,8 Hz, 21b-H), 5,87 (1H, s, 4-H).
Zu einer Lösung von Verbindung 16 (460 mg, 1,03 mmol) in Ethylenglycol (0,55 ml, 9,9 mmol) werden Ethylorthoformiat (0,80 ml, 4,8 mmol) und p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (39,0 mg, 0,205 mmol) gegeben. Das Gemisch wird für 2 h bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt, über gesättigtes wässriges NaHCO₃ gegossen und mit Dichlormethan extrahiert. Säulenchromatographie an Silicagel mit Ethylacetat-Hexan als Elutionsmittel ergibt Verbindung 17 (220 mg, 46%); ¹H-NMR δ_H 0,70 (3H, s, 13-CH₃), 2,31 (3H, s, 19-CH₃COS), 2, 50 (1H, t, J = 8,4 Hz, 17-H), 3,03 (1H, d, J = 14,0 Hz, 19a-H), 3,36 (1H, d, J = 14,0 Hz, 1H), 3,94 (4H, m, Ketal), 4,50 (1H, d, J = 16, 7 Hz, 21a-H), 4,70 (1H, d, J = 16,7 Hz, 21b-H), 5, 53 (1H, br d, J = 2,7 Hz, 6-H).
Beispiel 8
21-Hydroxy-6,19-sulfanyl-4-pregnen-3,20-dion (3)
Thioacetat 17 (88,0 mg, 0,19 mmol) wird in trockenem Methanol (2,5 ml) gelöst und das Gemisch wird durch Einperlenlassen von trockenem Stickstoff für 15 Min. desoxygeniert. Eine Lösung von KOH (20 mg, 0,38 mmol) in Methanol (0,14 ml) wird zugesetzt und das Gemisch wird für 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit 1N HCl neutralisiert, mit Wasser verdünnt, konzentriert und mit Dichlormethan extrahiert. Eine Verdampfung des Lösungsmittels lieferte das 19-Sulfanylderivat 18 (55,0 mg, 77%). Zu einer Lösung von Triethylamin (0,022 ml, 0,16 mmol) und Iod (78,6 mg, 0,31 mmol) in trockenem Dichlormethan (40 ml), gekühlt auf 0°C, wird eine Lösung des Thiols 18 (55 mg, 0,15 mmol) gegeben und das Gemisch wird bei 0°C für 30 Min. und bei Raumtemperatur für 2 h gerührt. Es wird gesättigtes wässriges Natriumthiosulfat zugesetzt, bis ein farbloses Gemisch erhalten wird, und das Reaktionsgemisch wird mit Dichlormethan extrahiert. Eine Verdampfung des Lösungsmittels, gefolgt von Säulenchromatographie an Silicagel mit Ethylacetat als Elutionsmittel liefert 21-Hydroxy-6,19-sulfanyl-4-pregnen-3,20-dion (3, 23 mg, 44%). ν_max(KBr)/cm^-1 3465, 2938, 1712, 1676, 1070, 735; ¹H NMR (500,13 MHz) δ_H 0,76 (3H, s, 13-CH₃), 2,46 (1H, t, J = 9,3 Hz, 17-H), 2,57 (1H, d, J = 10,7, 19a-H), 3,04 (1H, d, J = 10,7, 19b-H), 3,90 (1H, dd, J = 1,0 und 1,5 Hz, H-6), 4,16 (1H, d, J = 11,0 Hz, 21a-H), 4,22 (1H, d, J = 11,0 Hz, 21b-H), 5,79 (1H, s, H-4); ¹³C NMR siehe Tabelle 9; EIMS m/z 360 (32) [M]⁺, 344 (16), 329 (54), 301 (100), 153 (34), 91 (43), 43 (99).
Beispiel 9
21-Hydroxy-6,19-sulfoxy-4-pregnen-3,20-dion (4)
Zu einer Lösung der rohen Verbindung 3 (47, 5 mg, 0,13 mmol) in Methanol (4,3 ml) bei 0°C wird eine Lösung von Oxone^® (127,4 mg, 0,40 mmol) in Wasser (2,8 ml) gegeben. Nach 30-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Gemisch mit gesättigter wässriger Natriumbisulfitlösung verdünnt, konzentriert und mit Dichlormethan extrahiert. Eine Reinigung durch präpartive TLC (CH₂Cl₂-MeOH 20:1) liefert das Sulfoxid 4 (24,0 mg, 48 %); ν_max (KBr)/cm^-1 3458, 2938, 1719, 1667, 1077, 1041; ¹H NMR (500,13 MHz) δ_H 0,68 (3H, s, 13-CH₃), 2, 50 (1H, t, J = 8,0 Hz, 17-H), 3,72 (1H, d, J = 20,0 Hz, 19a-H), 3,88 (1H, d, J = 20,0 Hz, 19b-H), 3,83 (1H, bt, 6-H), 4,18 (2H, bs, 21-H), 6,08 (1H, s, 4-H); ¹³C NMR siehe Tabelle 9; EIMS m/z 376 (12) [M]⁺, 359 (38), 345 (6), 313 (62), 159 (38), 91 (55), 55 (100), 41 (99).
Beispiel 10
21-Hydroxy-6,19-sulfon-4-pregnen-3,20-dion (5)
Zu einer Lösung der rohen Verbindung 3 (47,5 mg, 0,13 mmol) in Methanol (4,3 ml) mit 0°C wird eine Lösung von Oxone^® (190,4 mg, 0,60 mmol) in Wasser (4,3 ml) gegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das Gemisch mit gesättigter wässriger Natriumbisulfitlösung verdünnt, konzentriert und mit Dichlormethan extrahiert. Eine Reinigung durch präpartive TLC (CH₂Cl₂-MeOH 20:1) ergibt das Sulfon 5 (26,0 mg, 50%); ν_max (KBr)/cm^-1 3465, 2945, 1712, 1676, 1305, 7420; ¹H NMR (500,13 MHz) δ_H 0,75 (3H, s, 13-CH₃), 2, 50 (1H, t, J = 8,0 Hz, 17-H), 3,45 (1H, d, J = 13,5 Hz, 19a-H), 3,98 (1H, d, J = 13,5 Hz, 19b-H), 3,82 (1H, br s, 6-H), 4,19 (2H, bs, 21-H), 6,09 (1H, s, 4-H); EIMS m/z 392 (1) [M]⁺, 361 (29), 333 (11), 267 (23), 253 (15), 91 (43), 55 (77), 43 (100).
Beispiel 11
19-Hydroxy-4-pregnen-3,20-dion (11)
21-Desoxy-6,19-bromether 10 (2,09 g, 4,9 mmol), der dem 21-Acetoxy-6,19-bromether 14, der nach den Beispielen 1–5 erhältlich ist, entspricht, wird in Propan-2-ol (175 ml) und Essigsäure (15,6 ml) suspendiert und es wird aktivierter Zinkstaub (5,2 g) zugesetzt. Die Suspension wird gerührt und 4 h bei 70–75°C erwärmt, abgekühlt, filtriert, konzentriert und mit Dichlormethan extrahiert. Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt 19-Hydroxyprogesteron (11) (0,92 g, 53%), Fp. 165–168°C (aus Methanol); ¹H NMR identisch mit einem authentischen Standard.
Beispiel 12
3,3-Ethylendioxy-19-acetylsulfanyl-5-pregnen-20-on
Eine Lösung von 19-Hydroxyprogesteron (11) (522 mg, 1,58 mmol) in kaltem Pyridin (5,2 ml) wird tropfenweise zu einer gerührten Lösung von Trifluormethansulfonsäureanhydrid (0,7 ml, 4,16 mmol) in kaltem Pyridin (3,6 ml) unter Stickstoff gegeben. Die Lösung wird auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und nach 1 h wird kaltes Dichlormethan (95,0 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird mit kalter 1M Schwefelsäure, 5%iger wässriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet und zur Trockne eingeengt, wodurch ein rohes Triflat als orangefarbener Feststoff erhalten wird (680 mg, 100%); ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,68 (3H, s, 13-CH₃), 2, 12 (3H, s, 20-CH₃), 2,50 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-17), 4, 68 (2H, qAB, J = 10,0 Hz, 19-H), 5,00 (1H, s, H-4).
Ein Gemisch aus rohem 19-Triflylprogesteron (680 mg, 1,58 mmol) und Kaliumthioacetat (680 mg, 6,0 mmol) in Aceton (35,0 ml) wird beim Raumtemperatur für 20 h unter Stickstoff gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Dichlormethan verdünnt, filtriert und zur Trockne eingeengt, wodurch rohes 19-Acetylsulfanylsteroid 12 (614 mg, 100%) erhalten wird; ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,70 (3H, s, 13-CH₃), 2,12 (3H, s, 20-CH₃), 2,32 (3H, s, 19-CH₃COS), 2,55 (1H, t, J = 8,7 Hz, H-17), 3,19 (1H, d, J = 13, 6 Hz, 19a-H), 3,49 (1H, d, J = 13, 6 Hz, 19b-H), 5,88 (1H, s, 4-H).
Zu einer Lösung der 19-Acetylsulfanylsteroid-Verbindung 12 (614 mg, 1,58 mmol) in Ethylenglycol (0,85 ml, 15,4 mmol) werden Ethylorthoformiat (1,26 ml, 7,2 mmol) und p-Toluolsulfonsäure (52,0 mg, mmol) gegeben. Das Gemisch wird für 2 h bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt, über gesättigte wässrige NaHCO₃-Lösung gegossen und mit Dichlormethan extrahiert. Säulenchromatographie an Silicagel mit Ethylacetat-Hexan als Elutionsmittel ergibt 3,3-Ethylendioxy-19-acetylsulfanyl-5-pregnen-20-on (256 mg, 63%); Fp. 151–153°C (aus EtAcO-Hexan). (gefunden: C 69,1, H 8,4 %; C₂₅H₃₆O₄S erfordert C 69,41, H 8,39 %); ν_max (KBr)/cm^-1; ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,65 (3H, s, 13-CH₃), 1,62 (1H, m, 7a-H), 2,11 (3H, s, 20-CH₃), 2,31 (3H, s, 19-CH₃COS), 2,10 (1H, m, 7a-H), 2, 53 (1H, t, J = 8,8 Hz, H-17), 3,03 (1H, d, J = 14,4 Hz, 19a-H), 3,37 (1H, d, J = 14,4 Hz, 19b-H), 3,94 (4H, m, Ketal) 5,53 (1H, brd, J = 5,0 Hz, 6-H).
Beispiel 13
6,19-Sulfanyl-4-pregnen-20-on (6)
Das 3,3-Ethylendioxy-19-acetylsulfanyl-5-pregnen-20-on von Beispiel 12 (64 mg, 0,16 mmol) wird in trockenem Methanol (1,8 ml) gelöst und das Gemisch wird durch Einperlenlassen von trockenem Stickstoff für 15 Minuten desoxygeniert. Es wird eine Lösung von KOH (14,5 mg, 0,28 mmol) in Methanol (0,10 ml) zugesetzt und das Gemisch wird für 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 1N HCl neutralisiert, mit Wasser verdünnt, konzentriert und mit Dichlormethan extrahiert. Die Verdampfung des Lösungsmittels liefert das 19-Sulfanylderivat 13 (45 mg, 77%); ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,70 (3H, s, 13-CH₃), 1,25 (1H, dd, J = 4, 7 und 8,5 Hz, 19-HS), 1,63 (1H, m, 7α-H), 2,12 (1H, m, 7β-H), 2,77 (1H, t, J = 8,5 Hz, 17-H), 2,56 (1H, dd, J = 11,1 und 8,5, 19a-H), 3,07 (1H, dd, J = 11,1 und 4,7, 19b-H), 3,94 (4H, m, Ketal), 5,66 (1H, br d, J = 5,0 Hz, H-6).
Zu einer Lösung von Triethylamin (0,018 ml, 0,13 mmol) und Iod (63 mg, 0,25 mmol) in trockenem Dichlormethan (32 ml), gekühlt auf 0°C, wird eine Lösung des Thiols 13 (45 mg, 0,12 mmol) gegeben und das Gemisch wird bei 0°C für 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur 2 h gerührt. Es wird gesättigte wässrige Natriumthiosulfatlösung zugegeben, bis ein farbloses Gemisch erhalten wird, und das Reaktionsgemisch wird mit Dichlormethan extrahiert. Die Verdampfung des Lösungsmittels mit anschließender Säulenchromatographie an Silicagel mit Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt 6,19-Sulfanyl-4-pregnen-20-on (6) (19 mg, 46%); Fp. 183–185°C (aus EtAcO-Hexan); (gefunden: C 73,2, H 8,4, S 9,4%; C₂₁H₂₈O₂S erfordert C 73,21, H 8,19, S 9,31); ν_max (KBr)/cm^-1 2945, 1712, 1667, 1362, 1191, 742; ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,74 (3H, s, 13-CH₃), 1,62 (1H, m, 7α-H), 1,99 (1H, m, 7β-H), 2,12 (3H, s, 20-CH₃), 2,50 (1H, t, J = 8,0 Hz, 17-H), 2,57 (1H, d, J = 10,5 Hz, 19a-H), 3,05 (1H, d, J = 10,5 Hz, 19b-H), 3,89 (1H, dd, J = 2,2 und 3,6, 6-H), 5,80 (1H, s, 4-H); EIMS m/z 344 (3) [M]⁺, 254 (5), 149 (5), 84 (50), 49 (100).
Beispiel 14
6,19-Sulfoxy-4-pregnen-3,20-dion (7)
Zu einer Lösung der rohen Verbindung 6 (20,0 mg, 0,06 mmol) in Methanol (1,9 ml) mit 0°C wird eine Lösung von Oxone^® (56,9 mg, 0,18 mmol) in Wasser (1,26 ml) gegeben. Nach 30-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Gemisch mit gesättigter wässriger Natriumbisulfitlösung verdünnt, konzentriert und mit Dichlormethan extrahiert. Eine Reinigung durch präparative TLC (CH₂Cl₂-MeOH 20: 1) lieferte 6,19-Sulfoxy-4-pregnen-3, 20-dion (7, 9,5 mg, 45 %); ν_max (KBr)/cm^-1 2938, 1705, 1669, 1362, 1177, 1035, 735; ¹H NMR (200,13 MHz) δ_H 0,70 (3H, s, 13-CH₃), 2, 11 (3H, s, 20-CH₃), 2,50 (1H, t, J = 8,0 Hz, 17-H), 3,75 (1H, d, J = 24 Hz, 19a-H), 3,98 (1H, d, J = 24 Hz, 19b-H), 3, 83 (1H, bt, J = 2,2 und 3,6, 6-H), 6,07 (1H, s, 4-H); EIMS m/z 360 [M]⁺ (1,3), 345 (1), 344 (3), 312 (1), 297 (6), 255 (5), 43 (100).
Beispiel 15
6,19-Su1fon-4-pregnen-3,20-dion (8)
Zu einer Lösung der rohen Verbindung 6 (20,0 mg, 0,06 mmol) in Methanol (1,9 ml) mit 0°C wird eine Lösung von Oxone^® (87,9 mg, 0,27 mmol) in Wasser (3,0 ml) gegeben. Nach 24 h Rühren bei Raumtemperatur wird das Gemisch mit gesättigter wässriger Natriumbisulfitlösung verdünnt, konzentriert und mit Dichlormethan extrahiert. Eine Reinigung durch präpartive TLC (CH₂Cl₂-MeOH 20: 1) ergibt 6,19-Sulfon-4-pregnen-3,20-dion (8, 10,0 mg, 44 %); ν_max (KBr)/cm^-1 2945, 1697, 1312, 1134, 735; ¹H NMR (500,13 MHz) 6H 0,73 (3H, s, 13-CH₃), 2,12 (3H, s, 20-CH₃), 2,50 (1H, t, J = 8,0 Hz, 17-H), 2,98 (1H, d, J = 13,3 Hz, 19a-H), 3,46 (1H, d, J = 13,3 Hz, 19b-H), 3,83 (1H, t, J = 2,6, 6-H), 6,09 (1H, s, 4-H); EIMS m/z 376 [M]⁺ (4), 358 (1), 343 (1), 344 (1), 329 (1), 312 (13), 279 (1,5).
BIOLOGISCHE ASSAYS
2. Anti-Immunsuppressionsaktivität:
Zellassay: Apoptose in Rattenthymocyten
a) Grundprinzip:
Analyse von Zelltod (in vitro):
Es wurde gezeigt, dass Glucocorticoide Thymocytenapoptose induzieren (J. Exp. Med. 184(5) S. 1631-8, 1. Nov. 1996). Auf dieser Basis können die Antiglucocorticoideigenschaften der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bestimmt werden, indem die Abnahme/der Anstieg von Apoptose bei Rattenthymocyten nach Behandlung mit einer gegebenen Testverbindung untersucht wird.
Daher wurden die Experimente durchgeführt, um die Apoptoseblockierende Fähigkeit des Sulfanylanalogons (3), des Sulf oxyanalogons (4) und des Sulfonanalogons (5) im Vergleich zu der Aktivität von 21OH-6OP (I) zu evaluieren. Die Experimente zeigen, dass die getesteten Analoga bei 10^-4M entweder gleich wirksam wie 21OH-6OP (I) oder wirksamer waren.
Eine Regulation der Apoptose wurde durch Durchflusscytometrie analysiert. Das Verfahren besteht in einer fluorometrischen quantitativen Bestimmung der apoptotischen Zellen in der Probe. In normalen lebensfähigen Zellen ist Phosphatidylserin (PS) an der cytoplasmatischen Oberfläche der Zellmembran lokalisiert. Bei Induktion der Apoptose erfolgt eine schnelle Veränderung bei der Organisation von Phospholipiden bei den meisten Zelltypen, was zu einer Exposition von PS an der Zelloberfläche führt. Eine in vitro-Detektion von externalisiertem PS kann durch Wechselwirkung mit dem Anticoagulanz Annexin V erreicht werden. In Gegenwart von Kalzium erfolgt eine rasche Hochaffinität-Bindung von Annexin V an PS. Die PS-Translokation an die Zelloberfläche geht einem nukleären Zusammenbruch, einer DNA-Fragmentierung und dem Auftreten von meist mit Apoptose assoziierten Molekülen voraus, was die Annexin V-Bindung zu einem Marker für die Apoptose in einer frühen Stufe macht.
In dem verwendeten Assay wird ein Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Konjugat von Annexin V verwendet, was eine Detektion einer Apoptose durch Durchflusscytometrie ermöglicht. Da bei Nekrose eine Membranpermeabilisierung beobachtet wird, werden nekrotische Zellen auch Annexin V-FITC binden. Propidiumiodid wird verwendet, um zwischen lebensfähigen und frühapoptotischen Zellen zu unterscheiden, wobei die letztgenannten nur mit FITC markiert werden, während spätapoptotische Zellen mit FITC und Propidiumiodid markiert werden.
b) Methodologie:
Es wurde ein Annexin V-FITC-Apoptose-Detektionskit von Oncogen Research Products (Katalognr. PF032) verwendet, wobei dem vom Hersteller empfohlenen RAPID-Protokoll gefolgt wurde. Kurz zusammengefasst, nach Inkubation mit verschiedenen Verbindungen (siehe unten) wurden Zellen mit 2.000 UpM für 5 Min. zentrifugiert, das Medium wurde entfernt und die Zellpellets wurden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen: Zellen wurden zu einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml im Bindungspuffer resuspendiert. Bindungsreagenz (10 μl) und Annexin V/FITC (1,25 µl) wurden zugesetzt und die Zellen wurden für 15 Min. bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert und dem Pellet wurden Bindungspuffer (0,5 ml) und Propidiumiodid (10 µl) zugesetzt. Die Proben wurden durch Durchflusscytometrie in einem Cytoron Absolute-Cytometer (Ortho Diagnostic Systems) analysiert. Die Daten wurden mit Wimdi 2.7 analysiert.
c) Resultate:
Das obige Protokoll wurde verwendet, um eine Zellapoptose zu analysieren, die in Thymocyten induziert wurde, welche mit 10^-8 M Dexamethason allein (das Apoptose induziert) und in Gegenwart der Testverbindungen inkubiert wurden. RU-486 (11-(4-Dimethylamino-phenyl)-17-hydroxy-13-methyl-17-prop-1-inyl-1, 2, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-dodecahydro-cyclopenta[α]phenanthren-3-on) wurde mit 10¹⁶ M als positive Kontrolle (Referenzverbindung) verwendet; die Testverbindungen wurden mit 10^-5 M getestet. Thymocyten wurden in Gegenwart von Dexamethason und der entsprechenden Testverbindungen (3), (5) und (8) für 4 h bei 37°C inkubiert und dann wie oben angegeben verarbeitet.
Die erhaltenen Cytogramme sind in den 3a–3f gezeigt, worin GR-FL Fluoreszenz von FITC darstellt und RD-FL Fluoreszenz von Propidiumiodid darstellt. Lebensfähige Zellen, die weder Annexin-FITC noch Propidiumiodid binden, erscheinen im unteren Quadranten links. Frühapoptotische Zellen mit exponiertem PS aber intakten Zellmembranen erscheinen im unteren linken Quadranten. Nekrotische oder spätapoptotische Zellen erscheinen im oberen rechten Quadranten. Es kann auch ein geringer prozentualer Anteil an normalem Zelltod auftreten, wird aber in diesem Fall nicht beobachtet.
In der folgenden Tabelle 1 wird der beobachtete prozentuale Anteil an Gesamtapoptose (frühe Apoptose + späte Apoptose) für jede Verbindung angegeben.
Tabelle 1
II. Expression eines Reportergens: (Reportergen-Assay):
pMMTV (Maus-Mammatumorvirus)-Luc (Luciferase)-Expression in Cos-1-Linie Eine allgemeine Beschreibung eines Reportergen-Assays kann in Biotechniques Band 7 Nr. 10 (1989) gefunden werden. Der Assay kann zwischen Gluco/Antigluco- und Progestin/Antiprogestin-Effekten der Testverbindungen unterscheiden. Zellen wurden auf 100 mm-Platten mit 8 ml D-MEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, Gibco BRL), supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (Bioser), 3,7 g/l Natriumbicarbonat und 100 IU/Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin, 0,25 µg Amphotericin B, in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ bei 37°C wachsen gelassen. Die Zellen wurden mit 0,25 Trypsin, 1 mM EDTA behandelt und in einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/Platte auf 60 mm-Platten plattiert. Cos-1-Zellen wurden mit einem Konstrukt, das für den Glucocorticoidrezeptor kodiert und einem Konstrukt mit dem Luciferasegen unter dem MMTV-Promoter transfiziert. Die Zellen wurden durch Präzipitation mit Calciumphosphat unter Zusatz von 25 µl einer 2M CaCl₂-Lösung zu einer Lösung, die 3 pmol Vektoren pMMTV-Luc und pRSV-GR, die für Luciferase bzw. den Glucocorticoidrezeptor kodieren, transfiziert. Der Maus-Mammatumorvirus (MMTV)-Promotor wird durch Glucocorticoidhormon über den Glucocorticoidrezeptor (GR) induziert (EMBO Jun 1 20(11), S. 2802-11 (2001)). Der PRSV-lac Z-Vektor wurde als Transfektionskontrolle verwendet.
Das Transfektionsgemisch wurde tropfenweise zu einem gleichen Volumen an Transfektionspuffer 2X BBS, der Phosphat enthielt, gegeben. 500 µl des gesamten Gemisches wurden in jede Platte gegeben und während 16 h inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und in einem Medium, das 10% Steroid-freies Serum enthielt, während 36 h mit Dexamethason behandelt. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit TBS gewaschen. Es wurden 300 µl Lysepuffer zu jeder Platte gegeben und es wurde bei Raumtemperatur während 15 Min. inkubiert. Aus dem Überstand wurde die Luciferaseaktivität bestimmt. Die beta-Galactosidase-Aktivität wurde als interner Standard verwen det. Die Luciferaseexpression wurde unter Verwendung eines Promega-Kits bei teilweiser Dunkelheit analysiert und mit einem Junior-Luminometer (EG&G Berthold, Deutschland) gemessen.
β-Galactosidase wurde durch Hydrolyse eines Phenylgalactosids bestimmt.
Wie in 4 gezeigt ist, liefert die Verwendung der Testverbindungen (4) (d.h. 21OH-6,19SP) bei einer Konzentration von 10^-6 M eine etwa 65%ige Verringerung des Luciferase/β-Galactosidase-Verhältnisses. RU 486 wurde als positive Kontrolle verwendet. Dieses Experiment bestätigt die inhibierende Wirkung des Sulfoxids 21 OH-SOP (4) auf den Glucocorticoidrezeptor. Keines der getesteten Steroide zeigte per se eine Wirkung, wenn es in Abwesenheit von Dexamethason verwendet wurde, das heißt sie sind unter den experimentellen Bedingungen keine Agonisten am Glucocorticoidrezeptor.

Claims

Verbindung der Formel (II)
worin X S, SO oder SO₂ ist und R entweder H oder OH ist.
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel (IIa)
worin X SO oder SO₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel
Verbindung nach Anspruch 2 mit der Formel
Verbindung nach Anspruch 2 mit der Formel
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel
Verbindung der Formel (II)
worin X S, SO und SO₂ ist und R entweder H oder OH ist, zur Verwendung als Medikament.
Verwendung einer Verbindung der Formel (II)
worin X S, SO und SO₂ ist und R entweder H oder OH ist, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit einem Überschuss an Glucocorticoiden assoziiert sind.
Verwendung einer Verbindung der Formel (IIa)
worin X SO oder SO₂ ist bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit einem Überschuss an Glucocorticoiden assoziiert sind.
Verwendung einer Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 8 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe von Cushing-Syndrom, iatrogenem Hypercortisolismus oder Depression.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Herstellung eines Medikaments, um die Immunantwort zu modulieren.
Verwendung nach Anspruch 13 für die Behandlung eines Krankheitszustandes, der die Inhibierung der Immunantworten erfordert.
Verwendung nach Anspruch 13 für die Behandlung eines Krankheitszustandes, der eine Erhöhung von positiven Immunantworten erfordert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die wenigstens ein 21-Hydroxy-6,19-oxido-Progesteron-Analogon der Formel II, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, und ein oder mehrere geeignete Träger dafür, umfasst.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 4 oder 5, umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer Verbindung nach Anspruch 3, b) Unterwerfen der genannten Verbindung einer Oxidation, vorzugsweise mit Kaliummonopersulfat.
Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 7 oder 8, umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer Verbindung nach Anspruch 6, b) Unterwerfen der genannten Verbindung einer Oxidation, vorzugsweise mit Kaliummonopersulfat.