DE60111653T2

DE60111653T2 - Aminoflavonverbindungen, zusammensetzungen und ihre verwendung

Info

Publication number: DE60111653T2
Application number: DE60111653T
Authority: DE
Inventors: M. Kenneth SNADER; Rao B. Vishnuvajjala; Tsutomu Machida-shi AKAMA
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Government Of United States, Us; Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2000-04-06
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2021-04-07
Also published as: ES2243475T3; DE60111653D1; ATE298329T1; AU2001249940B2; US6812246B2; WO2002081462A1; WO2002081462A8; US20040019227A1; EP1373243B1; CA2405747A1; CA2405747C; EP1373243A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue 5-Aminoflavonverbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren zum Verwenden dieser Verbindungen als zytotoxische Mittel.
Hintergrund der Erfindung
Es wurde erkannt, dass natürliche oder synthetische Flavonoide verschiedene biologische Aktivitäten aufweisen. Solche Verbindungen können z.B. die Aktivität von Proteinkinase C, Aromatase, Topoisomerase oder cyclinabhängiger Kinase hemmen oder können eine antimitotische Aktivität aufweisen. Insbesondere wurde berichtet, dass 5,4'-Diaminoflavone eine Cytotoxizität z.B. gegen die menschliche Brustkrebs-Zelllinie MCF-7 aufweisen. Siehe Akama et al., J. Med. Chem., 41, 2056–2067 (1998).
Der Wirkungsmechanismus und das Zielmolekül der 5,4'-Diaminoflavonverbindungen bleiben weitgehend unbekannt. Experimente, bei denen verschiedene Substituentengruppen in die 6, 7, 8 und 3'-Stellungen an dem Flavonring eingebaut wurden, führten zu einigen Spekulationen über die Struktur-Aktivität-Beziehung der Substituenten, insbesondere in der 7-Stellung von 5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon. Wenngleich die wirkliche Rolle der verschiedenen Substituentengruppen unklar bleibt, wurde gezeigt, dass bestimmte physikalische Eigenschaften der Flavon-Stammverbindung, wie die Löslichkeit, durch die Anwesenheit von einigen, aber nicht allen Substituentengruppen in der 7-Stellung verbessert werden konnten. Einige der 7-substituierten Verbindungen wiesen auch eine Cytotoxizität gegen menschliche Brustkrebszellen auf. Siehe Akama et al., J. Med. Chem., auf den Seiten 2061–62.
Trotz der Cytotoxizität von 5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon gegen bestimmte menschliche Krebszellen besitzt die Verbindung eine schlechte Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und löst sich kaum in Wasser. In der Tat wurde festgestellt, dass die Löslichkeitsdaten von 5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon weniger als 0,2 μg/ml in Wasser und 1,2 mg/ml in Ethanol betragen. Siehe Akama et al., J. Med. Chem., auf Seite 2067.
Die Wasserlöslichkeit stellt einen entscheidenden Vorteil für eine pharmazeutische Verbindung dar, insbesondere im Hinblick auf die Formulierung des Arzneimittels und die orale Absorption nach der Verabreichung. In den meisten Fällen liegt der Ort der Arzneimittelwirkung in einer Region, die von dem Ort der Arzneimittelverabreichung durch eine Membran getrennt ist. Arzneimittel, welche oral, intramuskulär oder subkutan verabreicht werden, müssen Membranen überqueren, um absorbiert zu werden und in den Körperkreislauf einzutreten. Selbst Arzneimittel, die durch intravenöse Injektion verabreicht werden, müssen kapillare Membranen überqueren, um den Körperkreislauf zu verlassen und an intrazelluläre und extrazelluläre Wirkorte zu gelangen. Siehe Human Pharmacology, Wingard et al., Hrsg., St. Louis : Mosby-Year Book, Inc., 1991, Seiten 50–51.
In dieser Hinsicht müssen die meisten Arzneimittel eine Affinität für Wasser aufweisen, um durch Blut und andere Körperflüssigkeiten zu ihren Wirkorten transportiert zu werden. Eine Lösung für die geringe Wasserlöslichkeit eines Wirkstoffs ist, den Wirkstoff mit Emulgatoren oder Komplexbildnern zu vermischen, um zu verhindern, dass das Arzneimittel am Ort der Verabreichung ausfällt. Siehe Human Pharmacology, Seiten 50–51. Jegliche Manipulation des Wirkstoffs in dem Bemühen, eine physikalische Eigenschaft zu verbessern, sollte jedoch seine biologische Aktivität nicht nachteilig beeinflussen. Wenngleich sie eine annehmbare Vorgehensweise ist, kann die Verwendung von Emulgatoren und Komplexbildnern die Arten der Verabreichung des Arzneimittels beschränken und/oder den Gebrauch und die Aufbewahrung des Arzneimittels schwieriger machen.
Deshalb besteht weiterhin ein Bedarf für neue 5-Aminoflavonverbindungen und Zusammensetzungen, welche starke Antitumoreigenschaften aufweisen. Es besteht auch weiterhin ein Bedarf für 5-Aminoflavonverbindungen, welche eine verbesserte Löslichkeit in Wasser und organischen Lösungsmitteln haben. Die vorliegende Erfindung stellt solche Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren bereit. Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie zusätzliche erfinderische Merkmale gehen aus der hier angegebenen Beschreibung der Erfindung hervor.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt Trifluoraminoflavonverbindungen, welche in der 5- und/oder 4'-Stellung an dem Flavouring mit aminhaltigen Gruppen substituiert sind und gegebenenfalls mit einem Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkanoyloxyalkyl, Alkanoyloxy, Alkoxy oder Alkoxyalkyl in der 7-Stellung des Flavonrings substituiert sind, oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon bereit. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen wünschenswerte physikalische Eigenschaften, wie etwa eine Löslichkeit in wässrigen Lösungsmitteln, auf.
Zusätzlich zu ihren wünschenswerten physikalischen Eigenschaften weisen die Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung auch eine Antitumoraktivität gegen eine Reihe von Krebszellen auf.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Aminoflavonverbindung, wie vorstehend allgemein definiert, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Aminoflavons der Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen des Wachstums eines Tumors in einem Wirt durch Verabreichen einer das Tumorwachstum hemmenden Menge einer Aminoflavonverbindung, wie vorstehend allgemein definiert, an den Wirt vor. Bei dem Wirt kann es sich um einen beliebigen Säuger, einschließlich der Menschen handeln.
Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen und in der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen am besten verstanden werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1A veranschaulicht den GI₅₀-basierten Mean-Graph-"Fingerabdruck" von 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Trihydrobromid in dem NCl 60 Zelllinien-Screen.
1B veranschaulicht den GI₅₀-basierten Mean-Graph-"Fingerabdruck" von 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Dimethansulfonat in dem NCl 60 Zelllinien-Screen.
1C veranschaulicht den GI₅₀-basierten Mean-Graph-"Fingerabdruck" von 5-Amino-2-[4-[[2-amino-5-guanidinpentanoyl]amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Trihydrobromid in dem NCl 60 Zelllinien-Screen.
1D veranschaulicht den GI₅₀-basierten Mean-Graph-"Fingerabdruck" von 5-Amino-6,8-difluor-7-methyl-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on in dem NCl 60 Zelllinien-Screen.
1E veranschaulicht den GI₅₀-basierten Mean-Graph-"Fingerabdruck" von 6,8-Difluor-7-methyl-5-(dimethylamino)acetamido-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on in dem NCl 60 Zelllinien-Screen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst eine neue Klasse von Aminoflavonverbindungen, Zusammensetzungen, welche diese Verbindungen enthalten, und ihre Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen des Wachstums von Tumoren. Jede geeignete aminhaltige Komponente kann in einer oder beiden der R¹- und R²-Stellungen von Verbindung I, die nachstehend abgebildet ist, substituiert sein. Vorzugsweise ist jedes von R¹ und R² H, COCH₂-R⁷, wobei R⁷ Amino, verzweigtes oder geradkettiges Alylamino, Dialkylamino oder Alkyl- oder Dialkylaminoalkyl ist, oder ein α-Aminosäurerest, mit der Maßgabe, dass wenigstens eines von R¹ oder R² von H verschieden ist, und R³ ist H, verzweigtes oder geradkettiges Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkanoyloxyalkyl, Alkanoyloxy, Alkoxy oder Alkoxyalkyl. Jede geeignete Alkylgruppe kann an R³ substituiert sein, wozu z.B. eine Alkylgruppe mit ungefähr 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ungefähr 1 bis ungefähr 15 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 10 Kohlenstoffatomen und am meisten bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen gehört. So wie er hier verwendet wird, schließt der Begriff "Alkyl" verzweigte oder geradkettige Alkylgruppen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Heptyl und Octyl ein.
Jede geeignete Mono- oder Dialkylamino- oder Mono- oder Dialkylaminoalkylgruppe kann an R⁷ substituiert sein, wozu z.B. eine Gruppe mit einer Alkylgruppe mit ungefähr 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ungefähr 1 bis ungefähr 15 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 10 Kohlenstoffatomen und am meisten bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen gehört. Der Begriff "Alkyl" kann z.B. beliebige der vorstehend aufgeführten Gruppen einschließen.
Jede geeignete Hydroxyalkylgruppe kann an R³ substituiert sein, wozu z.B. eine Hydroxyalkylgruppe mit ungefähr 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit ungefähr 1 bis ungefähr 15 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 10 Kohlenstoffatomen und am meisten bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen gehört. Der Begriff "Alkyl" kann z.B. beliebige der vorstehend aufgeführten Gruppen einschließen.
Jedes geeignete Alkanoyloxy oder Alkanoyloxyalkyl kann an R³ substituiert sein, wozu z.B. eine Gruppe mit ungefähr 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ungefähr 1 bis ungefähr 15 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 10 Kohlenstoffatomen und am meisten bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen gehört. Der Begriff "Alkanoyloxy" kann verzweigte oder geradkettige Gruppen, wie Methanoyloxy, Ethanoyloxy, Propanoyloxy, Butanoyloxy, Pentanoyloxy, Hexanoyloxy, Heptanoyloxy und Octanoyloxy einschließen. Der Begriff "Alkyl" kann z.B. beliebige der vorstehend aufgeführten Gruppen einschließen.
Jede geeignete Alkoxy- oder Alkoxyalkylgruppe kann an R³ substituiert sein, wozu z.B. eine Gruppe mit ungefähr 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ungefähr 1 bis ungefähr 15 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 10 Koh lenstoffatomen und am meisten bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen gehört. Der Begriff "Alkoxy" kann z.B. verzweigte oder geradkettige Alkoxygruppen, wie Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, Isobutoxy, sec-Butoxy, tert-Butoxy, Pentoxy, Hexoxy, Heptoxy und Octoxy einschließen. Der Begriff "Alkyl" kann z.B. beliebige der vorstehend aufgeführten Gruppen einschließen.
Jeder geeignete α-Aminosäurerest und Derivate davon können an R⁷ substituiert sein. Zu Beispielen für solche α-Aminosäurereste gehören in der Natur vorkommende Aminosäuren, wie Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin. Zu geeigneten Substituentengruppen und den dadurch gebildeten Verbindungen gehören z.B. die in Tabelle 1 nachstehend dargestellten.
Tabelle 1: Repräsentative Strukturen von neuen Aminoflavonverbindungen
Dem Fachmann ist auch klar, dass Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung von wohlbekannten und leicht verfügbaren Reaktionen, Reagenzien und Arbeitsweisen in pharmazeutisch annehmbare Salze umgewandelt werden können.
Wenn in den Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung jedes von R¹ oder R² der Struktur I ein α-Aminosäurerest ist, ist die Stereochemie von R¹ und ² vorzugsweise L. Zu Beispielen für solche Verbindungen gehören 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on und 5-Amino-2-[4-[[2-amino-5-guanidinopentanoyl]amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on.
Die Substitution einer aminhaltigen Komponente an R¹ und R² verleiht der Verbindung eine hohe Löslichkeit in Lösungsmitteln wie Wasser. Eine hohe Wasserlöslichkeit ist wünschenswert und günstig. Außer der leichten Verabreichung von wasserlöslichen Verbindungen erhöht eine hohe Wasserlöslichkeit auch die Absorption der Verbindungen beispielsweise nach einer oralen Verabreichung der Verbindungen an ein Idividuum oder einen Wirt. Eine hohe Wasserlöslichkeit ist auch günstig, wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff in der Zusammensetzung zu pharmazeutischen Produkten formuliert werden.
Überraschenderweise zeigen die aminhaltigen Komponenten an R¹ und R² an den Verbindungen der vorliegenden Erfindung neben den löslichkeitsverbessernden Eigenschaften auch eine gewisse Dauerhaftigkeit und werden nicht leicht von der Verbindung abgespalten. Die offensichtliche Persistenz dieser Substituentengruppen kann auf ihren Beitrag zu der biologischen Aktivität der Verbindungen hindeuten, wenngleich der genaue Mechanismus, durch den diese Gruppen die biologische Aktivität beeinflussen, derzeit nicht bekannt ist.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von wohlbekannten und leicht verfügbaren chemischen Reaktionen, Reagenzien und Arbeitsweisen synthetisiert werden. Dem Fachmann ist auch klar, dass Verbindungen der vorliegenden Erfindung, einschließlich Antitumorderivate und Prodrugs davon durch chemische Modifikationen) von synthetischen oder in der Natur vorkommenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von wohlbekannten und leicht verfügbaren Reaktionen, Reagenzien und Arbeitsweisen erhalten werden können.
Zum Beispiel kann Verbindung I hergestellt werden, indem zunächst ein 7-substituiertes-5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon mit einer auf geeignete Weise N-geschützten Aminosäure oder ihrem reaktiven Derivat in Gegenwart einer Base und/oder eines Kondensationsreagenzes, wie Carbodiimid, Carbonyldiimidazol und dergleichen in einem inerten Lösungsmittel umgesetzt wird. Zu Beispielen für das reaktive Derivat der auf geeignete Weise N-geschützten Aminosäure gehören ein Säurechlorid, ein N-Hydroxysuccinimidester und dergleichen. Als die Base können tertiäre Amine, wie Triethylamin, Diisopropylethylamin, Pyridin und 4-Dimethylaminopyridin verwendet werden. Als das inerte Lösungsmittel können Dimethylformamid, Dichlormethan, Chloroform und dergleichen allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Als die geeignete N-Schutzgruppe der Aminosäure kann eine Butoxycarbonylgruppe, eine Benzyloxycarbonylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe und dergleichen verwendet werden. Die Reaktion wird bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und dem Siedepunkt des Lösungsmittels durchgeführt. Das resultierende Produkt, wobei R¹ bzw. R² auf geeignete Weise geschützt sind, kann dann durch Entfernen der Schutzgruppen von dem Produkt durch Verfahren wie die in Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Green, Hrsg., John Wiley & Sons, Inc. (1981) beschriebenen Verfahren in Verbindung I überführt werden.
Verbindung I kann auch hergestellt werden, indem zunächst eine 7-substituierte-5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavonverbindung mit einer durch die allgemeine Formel HOOC-Y-X wiedergegebenen Säure oder ihrem reaktiven Derivat, worin X Chlor, Brom oder Iod bedeutet und Y ein verzweigtes oder geradkettiges C_1-20-Alkyl bedeutet, auf eine Weise umgesetzt wird, die der vorstehend beschriebenen entspricht. Das resultierende Produkt kann dann mit Natriumazid in einem inerten Lösungsmittel umgesetzt werden. Als das inerte Lösungsmittel kann Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, 1,2-Dimethoxyethan und dergleichen allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 50–100°C durchgeführt. Das Endprodukt kann durch Reduktion der Azidogruppen zu Aminogruppen durch katalytische Hydrierung oder durch Verwenden von Triphenylphosphin und Wasser in einem inerten Lösungsmittel erhalten werden. Als Katalysator kann Palladium auf Holzkohle, Palladiumhydroxid, Platinoxid und dergleichen verwendet werden. Als das inerte Lösungsmittel kann Methanol, Ethanol, Propanol, Ethylacetat, Tetrahydrofuran, 1,2-Dimethoxyethan, Toluol, Dimethylformamid, Dimethylacetamid und dergleichen allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 20–30°C durchgeführt.
Verbindung I, wobei R¹ H ist, kann auch hergestellt werden, indem zunächst eine 7-substituierte-5-Aminotrifluorflavonverbindung, wobei das 4'-Amino mit einer Allyloxycarbonylgruppe substituiert ist, mit einer auf geeignete Weise N-geschützten Aminosäure oder ihrem reaktiven Derivat auf eine Weise umgesetzt wird, die der vorstehend beschriebenen entspricht. Das Endprodukt kann erhalten werden, indem zunächst die vorstehende Verbindung von der Schutzgruppe befreit wird und anschließend die resultierende Verbindung mit Tetrakis(triphenylphosphin)palladium in Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels in einem inerten Lösungsmittel behandelt wird. Als das Reduktionsmittel kann Triethylammoniumformiat, Pyrrolidin und dergleichen verwendet werden. Als das inerte Lösungsmittel kann Tetrahydrofuran, 1,2-Dimethoxyethan und dergleichen verwendet werden. Die Reaktion wird typischerweise bei einer Temperatur zwischen 0°C und Raumtemperatur durchgeführt. Die Reihenfolge der vorstehenden Arbeitsweisen kann gemäß anerkannten Prinzipien und Verfahren im Fachgebiet modifiziert werden.
Die neuen Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung (und pharmazeutisch annehmbare Salze davon) können in einer geeigneten Zusammensetzung, z.B. einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthalten sein. Die Zusammensetzung kann durch Kombinieren von einer oder mehreren Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einem passenden pharmazeutisch annehmbaren Träger hergestellt werden und kann zu einer geeigneten Zubereitung formuliert werden. Zu geeigneten Zubereitungen gehören z.B. Zubereitungen in fester, halbfester, flüssiger oder gasförmiger Form wie Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulate, Salben, Lösungen, Suppositorien, Injektionen, Inhalationsmittel und Aerosole, und andere Formulierungen, die im Fachgebiet für ihre jeweiligen Verabreichungswege bekannt sind. In pharmazeutischen Darreichungsformen kann eine Verbindung der vorliegenden Erfindung allein oder in zweckmäßiger Assoziation sowie in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen, einschließlich anderer Antitumor- oder Krebsmittel verwendet werden.
Zu geeigneten Krebsmitteln gehören z.B. Doxorubicin, Bleomycin, Vincristin, Vinblastin, VP-16, VM-26, Cisplatin, Procarbazin und Taxol. Alkylierungsmittel, wie BCNU, CCNU, Methyl-CCNU und DTIC sind ebenfalls geeignet. Antimetaboliten, wie 5-FU und Methotrexat können ebenfalls in dem vorliegenden erfinderischen Verfahren verwendet weiden. Für weitere Beispiele für geeignete Krebsmittel siehe Tabelle 1 und 2 von Boyd In: Current Therapy in Oncology, J. E. Niederhuber, Hrsg., Philadelphia: B. C. Decker, Inc., Seiten 11–22 (1993).
Es kann von jedem geeigneten Träger Gebrauch gemacht werden. Zu geeigneten Trägern gehören pharmazeutisch oder physiologisch annehmbare Träger. Die folgenden Verfahren und Träger sind nur beispielhaft und sind in keiner Weise beschränkend. Im Fall von oralen Zubereitungen kann eine Verbindung der vorliegenden Erfindung allein oder in Kombination mit einer therapeutisch wirksamen Menge von wenigstens einer anderen Verbindung verabreicht werden. Zusammensetzungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können außerdem wenigstens eine weitere Verbindung, die keine Verbindung der vorliegenden Erfindung ist, z.B. ein weiteres Krebsmittel enthalten. Der aktive Wirkstoff bzw. die aktiven Wirkstoffe können, falls dies gewünscht wird, mit zweckmäßigen Additiven kombiniert werden, um Tabletten, Pulver, Granulate, Kapseln oder dergleichen herzustellen.
Zu geeigneten Additiven können z.B. herkömmliche Additive, wie Lactose, Mannitol, Maisstärke oder Kartoffelstärke gehören. Zu geeigneten Additiven können auch Bindemittel, z.B. kristalline Cellulose, Cellulosederivate, Akaziengummi, Maisstärke oder Gelatinearten gehören. Außerdem können Zerfallhilfsmittel wie Maisstärke, Kartoffelstärke oder Natriumcarboxymethylcellulose und Gleitmittel wie Talk oder Magnesiumstearat ebenfalls enthalten sein. Fall es gewünscht wird, können weitere Additive wie z.B. Verdünnungsmittel, Puffersubstanzen, Befeuchtungsmittel, Konservierungsmittel und/oder Aromastoffe und dergleichen in der Zusammensetzung enthalten sein.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch Auflösung, Suspension oder Emulgierung in einem wässrigen oder nicht-wässrigen Lösungsmittel, wie Pflanzenöl, synthetischen aliphatischen Säureglyceriden, Estern von höheren aliphatischen Säuren oder Propylenglycol (falls gewünscht mit herkömmlichen Additiven, wie Lösungsvermittlern, isotonischen Mitteln, Suspendiermitteln, Emulgatoren, Stabilisatoren und Konservierungsmitteln) zu einer Zubereitung zur Injektion formuliert werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch zu einer Aerosolformulierung verarbeitet werden, die durch Inhalation verabreicht werden soll. Solche Aerosolformulierungen können in unter Druck gesetzte annehmbare Treibmittel wie Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen eingebracht werden.
Einheitsdosisformen für eine orale Verabreichung wie Sirupe, Elixiere und Suspensionen können bereitgestellt werden, worin jede Dosiseinheit, z.B. ein Teelöffel, Esslöffel oder eine Tablette eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung enthält, welche die Verbindung der vorliegenden Erfindung enthält. Entsprechend können Einheitsdosisformen zur Injektion oder intravenösen Verabreichung eine Zusammensetzung als eine Lösung in sterilem Wasser, normaler Salzlösung oder einem anderen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
Der Begriff "Einheitsdosisform", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosen für menschliche und tierische Subjekte geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge von wenigstens einer Verbindung oder Verbindungen der vorliegenden Erfindung (allein oder, falls dies gewünscht wird, in Kombination mit einem weiteren therapeutischen Mittel) enthält. Die Einheitsdosis kann durch Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind, z.B. durch Berech nen der Menge des Wirkstoffs, die ausreicht, um die gewünschte Wirkung in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger hervorzurufen. Die Spezifikationen für die Einheitsdosisformen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, hängen von der jeweiligen Wirkung, die erzielt werden soll, und der speziellen Pharmakodynamik ab, die mit der Verbindung bzw. den Verbindungen in dem einzelnen Wirt verbunden ist.
Pharmazeutisch annehmbare Träger, z.B. Vehikel, Adjuvantien, Exzipienzien oder Verdünnungsmittel sind dem Fachmann zugänglich und sind typischerweise im Handel erhältlich. Der Fachmann kann leicht das zweckmäßige Verfahren zur Verabreichung für die genaue Formulierung der Zusammensetzung bestimmen, die verwendet wird. Eventuell notwendige Anpassungen der Dosis können leicht vom Fachmann vorgenommen werden, um die Natur oder Schwere des Zustands, der behandelt wird, zu berücksichtigen. Anpassungen der Dosis können auch auf der Grundlage von anderen Faktoren, wie z.B. der körperlichen Gesundheit insgesamt, dem Geschlecht, dem Alter, der medizinischen Vorgeschichte des einzelnen Patienten und dergleichen vorgenommen werden.
Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung eines Aminoflavons der Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen des Wachstums eines Tumors in einem Wirt, einschließlich eines Menschen, vor, welche das Verabreichen einer das Tumorwachstum hemmenden Menge einer Aminoflavonverbindung der vorliegenden Erfindung an den Wirt umfasst. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung schließt auch die Verabreichung von Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung (und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon) zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger ein. Ferner schließt die Verwendung der vorliegenden Erfindung das Verabreichen einer Aminoflavonverbindung der vorliegenden Erfindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder wenigstens einem weiteren Krebsmittel ein. Es kann jedes geeignete Krebsmittel in Verbindung mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie es vorstehend beschrieben ist.
Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung können dem Wirt verabreicht werden. Wünschenswerterweise gehören zu den einem Wirt verabreichten Aminoflavonverbindungen z.B. die in Tabelle 1 aufgeführten Aminoflavonverbindungen. Die be vorzugten Aminoflavonverbindungen zum Verabreichen an einen Wirt sind 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino)]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on, 5-Amino-2-[4-[[2-amino-5-guanidinopentanoyl]amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on, 6,8-Difluor-7-methyl-5-(dimethylamino)acetamido-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on und 5-Amino-6,8-difluor-7-methyl-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on. Besonders bevorzugt ist 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino)]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Dimethansulfonat.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auf jedem geeigneten Weg verabreicht werden, wozu z.B. eine orale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung, subkutane Verabreichung, intravenöse Verabreichung oder dergleichen gehören. Zum Beispiel können eine oder mehrere Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung (oder eine Zusammensetzung davon) als eine Lösung, welche sich für eine intravenöse Injektion oder Infusion eignet, eine Tablette, eine Kapsel oder dergleichen oder in einer beliebigen anderen geeigneten Zusammensetzung oder Formulierung, wie sie in dieser Anmeldung beschrieben ist, verabreicht werden.
Die "das Tumorwachstum hemmende Menge" ist die Dosis, die erforderlich ist, um einen das Tumorwachstum "hemmenden Spiegel" der aktiven Verbindung in einem einzelnen Patienten zu erzielen. Die das Tumorwachstum hemmende Menge kann z.B. als die Menge definiert werden, die einem einzelnen Patienten verabreicht werden muss, um einen das Tumorwachstum hemmenden Blutspiegel, Gewebespiegel und/oder intrazellulären Spiegel einer Verbindung der vorliegenden Erfindung zum Bewirken der gewünschten medizinischen Behandlung zu erzielen.
Wenn der wirksame Spiegel als der bevorzugte Endpunkt für die Verabreichung verwendet wird, kann die tatsächliche Dosis und das Schema in Abhängigkeit z.B. von interindividuellen Unterschieden der Pharmakokinetik, der Arzneimittelverteilung, des Metabolismus und dergleichen variieren. Der wirksame Spiegel kann auch variieren, wenn eine oder mehrere Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit anderen Krebsmitteln verwendet werden. Außerdem kann der wirksame Spiegel in Abhängigkeit von der Krankheit variieren, für welche die Behandlung gewünscht wird.
In dieser Hinsicht können die Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch als antibakterielle Wirkstoffe und/oder als Antiöstrogene verwendet werden. Der Fachmann kann beliebige geeignete im Fachgebiet bekannte Mittel zum Bestimmen der zweckmäßigen Dosierung und des wirksamen Spiegels der Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf der Grundlage der Krankheit, für welche eine Behandlung gewünscht wird, verwenden.
In dem Maß, wie die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung als Krebsmittel verwendet werden, kann der wirksame Blutspiegel durch Analogie auf der Basis des wirksamen Blutspiegels entsprechend der Anti-Krebs-Aktivität bestimmt werden. Der wirksame Spiegel kann z.B. als der Spiegel gewählt werden, welcher wirksam die Proliferation von Tumorzellen in einem Screening-Assay hemmt. Entsprechend kann der wirksame Spiegel z.B. auf der Grundlage des Blut- oder Gewebespiegels in einem Patienten bestimmt werden, welche einer Konzentration eines therapeutischen Mittels entspricht, welche das Wachstum von menschlichen Krebsen in einem Assay wirksam hemmt, welcher eine klinische Vorhersage einer Anti-Krebs-Aktivität erlaubt. Ferner kann der wirksame Spiegel z.B. auf der Grundlage einer Konzentration bestimmt werden, bei der bestimmte Krebsmarker im Blut eines Patienten durch eine bestimmte Verbindung gehemmt werden. Alternativ kann der wirksame Spiegel z.B. auf der Grundlage einer Konzentration bestimmt werden, die das Wachstum des Krebses eines Patienten wirksam verlangsamt oder anhält, den Krebs eines Patienten veranlasst, sich zurückzubilden oder zu verschwinden, einen Patienten für einen bestimmten Krebs asymptomatisch macht oder das subjektive Empfinden des Zustands eines Krebspatienten verbessert.
Der zur Krebsbekämpfung wirksame Spiegel kann dann verwendet werden, um den Spiegel näherungsweise zu ermitteln (z.B. durch Extrapolation) oder sogar zu bestimmen, welcher klinisch erforderlich ist, um einen das Tumorwachstum hemmenden Blut-, Gewebe- und/oder intrazellulären Spiegel zum Bewirken der gewünschten medizinischen Behandlung zu erzielen. Es ist klar, dass die Bestimmung der therapeutisch wirksamen Menge, die klinisch erforderlich ist, um das Tumorwachstum wirksam zu hemmen, die Berücksichtigung von anderen Variablen erfordert, welche den wirksamen Spiegel beeinflussen können. Wenn eine festgesetzte wirksame Menge als ein bevorzugter Endpunkt für die Dosierung verwendet wird, können die tatsächliche Dosis und das Dosierungsschema für die Arzneimittelverabreichung für jeden Patienten in Abhängigkeit von Faktoren variieren, zu denen z.B. interindividuelle Unterschiede der Pharmakokinetik, der Arzneimitteldisposition, des Metabolismus oder andere hier beschriebene Faktoren gehören, welche den wirksamen Spiegel beeinflussen.
Der Fachmann kann leicht die zweckmäßige Dosis, das zweckmäßige Schema oder Verfahren zum Verabreichen einer speziellen Formulierung bestimmen, um den gewünschten wirksamen Spiegel in einem einzelnen Patienten zu erzielen. Der Fachmann kann auch leicht einen zweckmäßigen Indikator des wirksamen Spiegels der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bestimmen und verwenden. Zum Beispiel kann der wirksame Spiegel durch direkte Analyse (z.B. analytische Chemie) oder durch indirekte Analyse (z.B. mit Indikatoren der klinischen Chemie) von geeigneten Patientenproben (z.B. Blut oder Gewebe) bestimmt werden. Der wirksame Spiegel kann auch z.B. durch direkte oder indirekte Beobachtungen, wie die Azidität des Urins, die Änderung der Knochendichte, die Abnahme des Augendrucks oder durch das Schrumpfen eines Tumors in einem Krebspatienten bestimmt werden. Es gibt viele Literaturstellen im Fachgebiet, welche Protokolle beschreiben, die bei der Verabreichung von aktiven Verbindungen an einen Patienten verwendet werden, der diese benötigt. Zum Beispiel sind die bei der Verabreichung von Krebsmitteln an Patienten verwendeten Protokolle beschrieben, z.B. in Cancer Chemotherapy: Principles and Practice, Chabner und Collins, Hrsg., J. B. Lippincott, (1990) (insbesondere Kapitel 2).
Die einzigartige, das Tumorwachstum hemmende Aktivität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist unter Verwendung des auf menschliche Tumorerkrankungen gerichteten 60 Zelllinien-Screens des U.S. National Cancer Institute (NCl) gezeigt worden, welcher die Anti-Krebs-Aktivität von chemischen Verbindungen genau vorhersagen kann.
Der NCl 60 Zelllinien-Screen für menschliche Tumoren misst die Fähigkeit einer Verbindung, verschiedene menschliche Krebsarten selektiv abzutöten oder ihr Wachstum zu hemmen. Im Allgemeinen weisen in dem NCl-Screen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine starke Aktivität gegen bestimmte Typen von menschlichen soliden Tumoren (z.B. nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Nierenkrebs und Melanom) und resistente Stämme davon auf. Durch diese Beobachtungen und mit anderen ausführlichen Ana lysen der charakteristischen Tumorzellen-Reaktionsprofile kann gezeigt werden, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung ein einzigartiges charakteristisches Bioaktivitätsprofil haben.
Die neuen Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen neben ihren wünschenswerten Löslichkeitseigenschaften auch starke, das Tumorwachstum hemmende Aktivitäten für eine Reihe von menschlichen Krebsarten, wie etwa denjenigen, die in dem NCl 60 Zelllinien-Screen getestet wurden. Zum Beispiel wiesen die Verbindungen 1a-d aus Tabelle 1 oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon alle eine Hemmung des Tumorwachstums in vitro, insbesondere gegen menschliche Brust-, Eierstock-, Dickdarm- und Nierenkrebszelllinien auf. Sie zeigten auch eine das Tumorwachstum hemmende Aktivität gegen bestimmte menschliche Leukämie-, nicht-kleinzellige Lungenkrebs- und Melanomzelllinien. Siehe 1a–e. Für eine weitere Erläuterung der das Tumorwachstum hemmenden Aktivität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung siehe Beispiel 16.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiterhin die vorliegende Erfindung, sollten aber natürlich nicht so aufgefasst werden, als würden sie auf irgendeine Weise ihren Umfang beschränken. Die Massenspektrendaten für die in den folgenden Beispielen beschriebenen Verbindungen wurden entweder durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie ("ESI-MS") (Beispiele 1–5) oder durch Massenspektroskopie mit schnellen Atomstrahlen (Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry ("FABMS")) (Beispiele 6–15 und 18–20) bestimmt.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Trihydrobromid (Ia).
Zu einer gerührten Lösung von N²,N⁶-(Dicarbobenzyloxy)-L-lysine (187 mg, 0,45 mmol) in Tetrahydrofuran (6,0 ml) bei 3°C unter Argon wurde Oxalylchlorid (41 μl, 0,47 mmol) und N,N-Dimethylformamid (10 μl) zugegeben. Nach 15 Minuten bei 3°C wurde eine kalte Lösung von 5,4'-Diamino-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on (100 mg, 0,31 mmol) in N,N-Dimethylformamid (2,4 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 15 Minu ten bei 3°C und anschließend 1,5 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen EtOAc (75 ml) und Wasser (10 ml) verteilt. Die Schichten wurden getrennt und die Wasserschicht wurde mit CH₂Cl₂ (3×100 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und anschließend konzentriert, um das Rohprodukt zu erhalten. Eine Zweitreaktion wurde durchgeführt und das Rohmaterial vereinigt und durch Säulenchromatografie an Silicagel (Stufengradientenelution von 1:1 bis 3:2 EtOAc:Hexan) gereinigt, wobei 91 mg (20%) gereinigtes Produkt (d.h. 5-Amino-4'-[N²,N⁶-(dicarbobenzyloxy)-L-lysinamido]-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on, nachstehend "Produkt 1") erhalten wurden. Weitere Reaktionen wurden durchgeführt, wobei insgesamt 236 mg entsprechendes Material erhalten wurden.
Eine Lösung von Produkt 1 (90 mg, 0,13 mmol) in Bromwasserstoff, 30% Gew./Gew. Lösung in Essigsäure (5 ml) wurde 2 Stunden bei Umgebungstemperatur unter Argon gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Et₂O (40 ml) verdünnt, wobei eine Suspension erhalten wurde, und der Feststoff wurde durch Zentrifugation isoliert. Der Feststoff wurde mit Et₂O (5 × 15 ml) mittels Zentrifugation gewaschen und anschließend über Argon und danach 5 Stunden im Vakuum bei Umgebungstemperatur getrocknet, wobei 80 mg (92%) 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Trihydrobromid erhalten wurden. Weitere Reaktionen wurden durchgeführt, wobei insgesamt 113 mg entsprechendes Produkt erhalten wurden.
Berechnet für C₂₂H₂₆F₃N₄O₃Br₃·1,3 H₂O, C, 36,98; H, 4,03; N, 7,84; Br, 33,54.
Gefunden: C, 37,06/36,97; H, 4,08/4,13; N, 7,66/7,59; Br, 32,59.
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Dimethansulfonat (Ia).
Zu einer gerührten Lösung von N²,N⁶-(Dicarbobenzyloxy)-L-lysin (1,94 g, 4,68 mmol) in Tetrahydrofuran (40 ml) bei 0°C unter Argon wurde Oxalylchlorid (412 μl, 4,72 mmol) und N,N-Dimethylformamid (76 μl) zugegeben. Nach 15 Minuten bei 0°C wurde eine kalte Lösung von 5-Amino-2-(4-amino-3-fluorphenyl)-6,8-difluor-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on (1,0 g, 3,12 mmol) in N,N-Dimethylformamid (20 ml) dazugegeben. Das Ge misch wurde 15 Minuten bei 0°C und anschließend 30 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen EtOAc (1,0 l) und Wasser (1,0 l) verteilt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde getrocknet, filtriert und anschließend konzentriert, wobei das Rohprodukt (4,8 g) erhalten wurde. Insgesamt wurden 10 × 1 g-Chargen des Aminoflavons hergestellt, wobei insgesamt 49,4 g Material erhalten wurden, welches das Zwischenprodukt 5-Amino-4'-[N²,N⁶-(dicarbobenzyloxy)-L-lysinamido]-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on enthält. Dieses Material wurde an einer Silicagelsäule (3 kg) chromatografiert, die in EtOAc/Hexan (3:2) gepackt war, und anschließend mit EtOAc/Hexan/DMF (60:40:1) eluiert. Fraktionen, die reines Produkt enthielten, wurden vereinigt, anschließend im Vakuum zu einem Rückstand konzentriert. Dieses Material wurde mit Et₂O (ungefähr 20 ml) verrieben, wobei 2,8 g (13%) gereinigtes Zwischenprodukt erhalten wurden, das sich für die Umwandlung eignet.
Das Zwischenprodukt (1,50 g, 2,09 mmol) wurde in Methansulfonsäure (100 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser Zeit traten Farbänderungen auf und schließlich bildete sich ein fein verteilter Feststoff. Das Reaktionsgemisch wurde in EtOAc (500 ml) hineingemischt. Die resultierende Lösung wurde durch Glasfaserpapier geklärt und anschließend im Vakuum zu einem Rückstand konzentriert. Dieses Material wurde mit Et₂O (700 ml) gerührt. Nach einer kühlen Aufbewahrung bei –10°C wurde das Et₂O von einem gummiartigen Feststoff dekantiert und verworfen. Das feste Material wurde in Methanol (300 ml) gelöst, geklärt, im Vakuum bis zum Trübungspunkt konzentriert und anschließend in Et₂O (600 ml) hineingemischt. Das ausgefällte Produkt wurde durch Zentrifugation gesammelt. Die Verfahrensschritte der Auflösung in Methanol, der Etherfällung und der Sammlung durch Zentrifugation wurden wiederholt. Es wurden insgesamt 3,25 g Zwischenprodukt auf entsprechende Weise verarbeitet, wobei 2,6 g (90%) 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Dimethansulfonat erhalten wurden.
Berechnet für C₂₂H₂₃F₃NaO₃·2CH₃SO₃H·H₂O, C, 43,76; H, 5,05; N, 8,51; S, 9,74.
Gefunden: C, 43,45; H, 4,89; N, 8,24; S, 9,90.
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-2-[4-[[2-amino-5-guanidinopentanoyl]amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Trihydrobromid (1b).
Zu einer gerührten Lösung von Nα,N^G,N^G'-(Tricarbobenzyloxy)-L-arginin (5,4 g, 9,4 mmol) in Tetrahydrofuran (60 ml) bei 0°C unter Argon wurde Oxalylchlorid (875 μl, 10,0 mmol) und N,N-Dimethylformamid (50 μl) zugegeben. Nach 15 Minuten bei 0°C wurde eine kalte Lösung von 5,4'-Diamino-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on (1,0 g, 3,12 mmol) in N,N-Dimethylformamid (30 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 0°C und anschließend 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen EtOAc (200 ml) und Wasser (200 ml) verteilt. Die Schichten wurden getrennt und die Wasserschicht wurde mit CH₂Cl₂ (5 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und anschließend konzentriert, wobei das Rohprodukt erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatografie an Silicagel (Stufengradientenelution von 1:2 bis 1:1 EtOAc:Hexan) gereinigt, wobei 93 mg (3%) gereinigtes Produkt (d.h. 5-Amino-4'-[Nα,N^G,N^G'-(tricarbobenzyloxy)-L-argininamido]-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on, nachstehend "Produkt 2") erhalten wurden.
Eine Lösung von Produkt 2 (90 mg, 0,10 mmol) in Bromwasserstoff, 30% Gew./Gew. Lösung in Essigsäure (5 ml) wurde 24 Stunden bei Umgebungstemperatur unter Argon gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Et₂O (40 ml) verdünnt, wobei eine Suspension erhalten wurde, und der Feststoff wurde durch Zentrifugation isoliert. Der Feststoff wurde mit Et₂O (5 × 20 ml) mittels Zentrifugation gewaschen, anschließend über Argon und anschließend 8 Stunden im Vakuum bei Umgebungstemperatur getrocknet, wobei 36 mg des Endprodukts erhalten wurden.
C₂₂H₂₃F₃N₆O₃ = 476 (freie Base). Gefunden: 477,2 (M+H)⁺.
Beispiel 4
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 6,8-Difluor-7-methyl-5-(dimethylamino)acetamido-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on (1d).
Zu einer gerührten Lösung von 5,4'-Diamino-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on (500 mg, 1,56 mmol) und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) (254 μl, 1,70 mmol) in Tetrahydrofuran (25 ml) unter Argon wurde eine 2,51 mol/l Lösung von Chloracetylchlorid in Tetrahydrofuran (640 μl, 1,61 mmol) zugegeben. Nach 1 Stunde Rühren bei Raumtemperatur wurde weiteres DBU (64 μl) und 2,51 mol/l Chloracetylchlorid (160 μl) zugegeben. Nach weiteren 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde mehr DBU (64 μl) und 2,51 mol/l Chloracetylchlorid (160 μl) zugegeben. Nach 40 Minuten bei Raumtemperatur wurde ein letztes Aliquot von DBU und Chloracetylchlorid zugegeben. Nach 15 Minuten zeigte die DSC, dass die Reaktion vollständig abgelaufen war. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und der gummiartige Rückstand wurde mit Tetrahydrofuran (2 × 20 ml) gewaschen. Das Filtrat und die damit vereinigten Waschlösungen enthielten das Rohprodukt 5,4'-Bis(chloracetamido)-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on (nachstehend "Produkt 3").
Zu einer gerührten Lösung von Produkt 3 in Tetrahydrofuran (65 ml) wurde Dimethylamingas 5 Minuten lang zugegeben, um eine gesättigte Lösung zu erhalten. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, anschließend konzentriert, wobei ein gelber Feststoff (0,7 g) erhalten wurde. Der Feststoff wurde in heißem EtOAc (300 ml) gelöst und an einem Silicagelkissen gereinigt. Die Produktfraktionen ergaben einen gelben Feststoff, welcher mit einem Gemisch aus EtOAc (25 ml) und Hexan (100 ml) verrieben und anschließend saugfiltriert wurde. Der Feststoff wurde mit Hexan (2 × 25 ml) gewaschen und anschließend 6 Stunden im Vakuum bei 40°C getrocknet, wobei 330 mg (52%) des Endprodukts erhalten wurden.
C₂₄H₂₅F₃N₄O₄ = 490,2. Gefunden: 491,2 (M+H)⁺.
Beispiel 5
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-7-methyl-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on (1c).
Zu einer gerührten Lösung von 5,4'-Diamino-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on (1,5 g, 4,68 mmol) und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) (2961 μl, 19,8 mmol) in Tetrahydrofuran (150 ml) unter Argon wurde eine 2,51 mol/l Lösung von Chloracetylchlorid in Tetrahydrofuran (7,5 ml, 18,8 mmol) zugegeben. Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wurden weiteres DBU (1,7 ml) und 2,51 mol/l Chloracetylchlorid (4,5 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und der gummiartige Rückstand wurde mit Tetrahydrofuran (2 × 50 ml) gewaschen. Das Filtrat und die damit vereinigten Waschlösungen enthielten das Rohprodukt 5-Amino-4'-chloracetamido-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on (nachstehend "Produkt 4").
Zu einer gerührten Lösung von Produkt 4 (ungefähr 2,2 g, 4,68 mmol) in Tetrahydrofuran (250 ml) wurde Dimethylamingas 10 Minuten lang zugegeben, wobei eine gesättigte Lösung erhalten wurde. Das Gemisch wurde 4,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde an einer Silicagel-Säule (180 g, 3 × 25 cm), die mit 15:1 EtOAc:MeOH eluiert wurde, gereinigt, wobei ein Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde mit Hexan (100 ml) verrieben, saugfiltriert und 6 Stunden im Vakuum bei 40°C getrocknet, wobei 1,09 g (47%) des Endprodukts erhalten wurden.
C₂₀H₁₈F₃N₃O₃ = 405,1. Gefunden: 406,0 (M+H)⁺.
Beispiel 6
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-2-[4-(aminoacetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on (1e).
Zu einer Lösung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-(chloracetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (1,00 g, 2,20 mmol) in Dimethylformamid (50 ml) wur de Natriumazid (715 mg, 11 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde zugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, wobei 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-(azidoacetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (1,01 g, 100%) erhalten wurde.
Zu einer Suspension der vorstehenden Verbindung (1,00 g, 2,17 mmol) in Methanol (100 ml) wurde 1 mol/l Kaliumcarbonat (10 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 25 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der pH wurde mit 1 mol/l HCl auf 7 eingestellt. Wasser wurde zugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, wobei 5-Amino-2-[4-(azidoacetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on (764 mg, 84%) erhalten wurde.
Zu einer Lösung der vorstehenden Verbindung (750 mg, 1,79 mmol) in Ethylacetat (300 ml) und Methanol (150 ml) wurde Palladium auf Holzkohle (10%, 350 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 1,5 Stunden unter einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem der Wasserstoff durch Stickstoff ersetzt worden war, wurde das Gemisch durch ein Celitekissen filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatografie gereinigt, wobei eine freie Base von 1e (460 mg, 65%) erhalten wurde, welche in ein Hydrochlorid umgewandelt wurde.
C₁₈H₁₄F₃N₃O₄ = 393. Gefunden: 394 (M+H)⁺.
Beispiel 7
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-6,8-difluor-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on (1f).
Zu einer Lösung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-(chloracetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (2,02 g, 4,44 mmol) in Dimethylformamid (50 ml) wurden Dimethylamin-hydrochlorid (1,81 g, 22,2 mmol) und Diisopropylethylamin (3,90 ml, 22,4 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, wobei Verbindung 1f (1,97 g, 96%) erhalten wurde.
C₂₂H₂₀F₃N₃O₅ = 463. Gefunden: 464 (M+H)⁺.
Beispiel 8
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on (1g).
Zu einer Suspension von Verbindung 1f (1,97 g, 4,25 mmol) in Methanol (135 ml) wurde 1 mol/l Natriumhydroxid (15 ml) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie (9:1 Chloroform/Methanol) ergab eine freie Base von 1g (834 mg, 47%), welche in ein Hydrochlorid umgewandelt wurde.
C₂₀H₁₈F₃N₃O₄ = 421. Gefunden: 422 (M+H)⁺.
Beispiel 9
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-[[3-(dimethylamino)propionyl]amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (1h).
Zu einer Lösung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-amino-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (1,51 g, 4,00 mmol) in Dimethylformamid (40 ml) wurden 3-Brompropionsäure (3,06 g, 20,0 mmol) und 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (3,83 g, 20,0 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 45 Minuten gerührt. Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie (6:1 Chloroform/Acetat) ergab 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-[(3-brompropionyl)amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (554 mg, 27%).
Zu einer Lösung der vorstehenden Verbindung (500 mg, 0,975 mmol) in Dimethylformamid (15 ml) wurden Dimethylamin-hydrochlorid (397 mg, 4,87 mmol) und Diisopropylethylamin (0,85 ml, 4,88 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 50°C gerührt. Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie (20:1 Chloroform/Methanol) ergab 1h (442 g, 95%).
C₂₃H₂₂F₃N₃O₅ = 477. Gefunden: 478 (M+H)⁺.
Beispiel 10
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-2-[4-[[3-(dimethylamino)propionyl]amino]-3-fluorphenyl]-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on (1i).
Zu einer Suspension von 1h (400 mg, 0,839 mmol) in Methanol (36 ml) wurde 1 mol/l Natriumhydroxid (4 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie (9:1 Chloroform/Methanol) ergab eine freie Base von 1i (365 mg, 100%), welche in ein Hydrochlorid umgewandelt wurde.
C₂₁H₂₀F₃N₃O₄ = 435. Gefunden: 436 (M+H)⁺.
Beispiel 11
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-6,8-difluor-2-[4-[[4-(dimethylamino)butyryl]amino]-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on (1j).
Zu einer Lösung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-amino-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (500 mg, 1,32 mmol) in Dimethylformamid (15 ml) wurden 4-Dimethylaminobuttersäure-hydrochlorid (3,06 g, 16,9 mmol) und 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (3,23 g, 16,9 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie (9:1 Chloroform/Methanol) ergab 1j (386 mg, 60%).
C₂₄H₂₄F₃N₃O₅ = 491. Gefunden: 492 (M+H)⁺.
Beispiel 12
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-2-[4-[[4-(dimethylamino)butyryl]amino]-3-fluorphenyl]-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on (1k).
Zu einer Suspension von 1j (363 mg, 0,739 mmol) in Methanol (36 ml) wurde 1 mol/l Natriumhydroxid (4 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie ergab eine freie Base von 1 k (299 mg, 69%), welche in ein Hydrochlorid umgewandelt wurde.
C₂₂H₂₂F₃N₃O₄ = 449. Gefunden: 450 (M+H)⁺.
Beispiel 13
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-(Aminoacetamido)-2-(4-amino-3-fluorphenyl)-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on (1l).
Zu einer Lösung von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-(chloracetamido)-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (1,16 g, 2,00 mmol) in Dimethylformamid (20 ml) wurde Natriumazid (650 mg, 10,0 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, wobei 7-[(Allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-(azidoacetamido)-2-[4-(allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (1,01 g, 100%) erhalten wurde.
Zu einer Lösung der vorstehenden Verbindung (877 mg, 1,49 mmol) in Tetrahydrofuran (30 ml) wurden Triethylammoniumformiat (1,2 ml, 9,1 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (172 mg, 0,15 mmol) unter Argonatmosphäre zugegeben und das Gemisch wurde 50 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie (20:1 Chloroform/Methanol) ergab 5-(Azidoacetamido)-2-(4-amino-3-fluorphenyl)-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on (560 mg, 90%).
Zu einer Lösung der vorstehenden Verbindung (540 mg, 1,30 mmol) in Ethylacetat (150 ml) und Methanol (50 ml) wurde Palladium auf Holzkohle (10%, 250 ml) zugegeben und das Gemisch wurde 2 Stunden unter einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem der Wasserstoff durch Stickstoff ersetzt worden war, wurde das Gemisch durch ein Celitekissen filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatografie (9:1:1 Chloroform/Methanol/Ammoniak) gereinigt, wobei eine freie Base von 1l (330 mg, 65%) erhalten wurde, welche in ein Hydrochlorid umgewandelt wurde.
C₁₈H₁₄F₃N₃O₄ = 393. Gefunden: 394 (M+H)⁺.
Beispiel 14
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-(4-Amino-3-fluorphenyl)-5-(dimethylamino)acetamido-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on (1m).
Zu einer Lösung von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-(chloracetamido)-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (2,12 g, 3,65 mmol) in Dimethylformamid (40 ml) wurden Dimethylamin-hydrochlorid (1,49 g, 18,3 mmol) und Diisopropylethylamin (3,2 ml, 18 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 2 Stunden bei 50°C gerührt. Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert, wobei 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-(dimethylamino)acetamido-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (2,12 g, 99%) erhalten wurde.
Zu einer Lösung der vorstehenden Verbindung (2,12 mg, 3,60 mmol) in Tetrahydrofuran (50 ml) wurden Triethylammoniumformiat (2,4 ml, 18 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (419 mg, 0,36 mmol) unter einer Argonatmosphäre zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt. Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie (20:1 Chloroform/Methanol) ergab eine freie Base von 1m (1,05 g, 69%), welche in ein Hydrochlorid umgewandelt wurde.
C₂₀H₁₈F₃N₃O₄ = 421. Gefunden: 422 (M+H)⁺.
Beispiel 15
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-[4-Amino-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-5-[3-(dimethylamino)propionyl]amino-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on (1n).
Zu einer Lösung von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-amino-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (1,00 g, 1,90 mmol) in Dimethylformamid (30 ml) wurden 3-Brompropionsäure (3,04 g, 19,9 mmol) und 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (3,80 g, 19,8 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert, wobei ein rohes 2-[4-Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-[(3-brompropionyl)amino]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (1,98 g) erhalten wurde.
Zu einer Lösung der vorstehenden Verbindung (1,98 mg) in Dimethylformamid (20 ml) wurden Dimethylamin-hydrochlorid (807 mg, 9,90 mmol) und Diisopropylethylamin (1,7 ml, 9,93 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 7 Stunden bei 50°C gerührt. Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie (20:1 Chloroform/Methanol) ergab 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-[[3-(dimethylamino)propionyl]amino]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on.
Zu einer Lösung der vorstehenden Verbindung (688 mg, 1,14 mmol) in Tetrahydrofuran (20 ml) wurden Triethylammoniumformiat (0,75 ml, 5,7 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (132 mg, 0,11 mmol) unter Argonatmosphäre zugegeben und das Gemisch wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie ergab eine freie Base von 1n (74 mg, 15%), welche in ein Hydrochlorid umgewandelt wurde.
C₂₁H₂₀F₃N₃O₄ = 435. Gefunden: 436 (M+H)⁺.
Beispiel 16
Dieses Beispiel veranschaulicht die das Tumorwachstum hemmende Aktivität der neuen Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung, speziell die Aktivität, welche 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on (Verbindung 1a in Tabelle 1) aufweist.
Wie vorstehend erwähnt, wurden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in dem NCl 60 Zelllinien-Screen getestet. Der NCl 60 Zelllinien-Primärscreen auf menschliche Tumoren stellt ein Mittel bereit, durch welches natürliche Ausgangsmaterialien von Verbindungen identifiziert werden können. Der NCl-Screen wurde in den Jahren 1985–1990 unter der Leitung, genauen Prüfung und Aufsicht von mehreren international zusammengesetzten und namhaften unabhängigen (nicht-NCl) Beratungs- und Prüfungsgruppen entworfen und implementiert, zu denen die NCl Division of Cancer Treatment's Board of Scientific Counselors, ein Ad Hoc Expert Review Committee davon, der National Cancer Advisory Board und das President's Cancer Panel gehören. Siehe Boyd, In: Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials and Approval, Teicher, B. A., Hrsg., Totowa, N. J.: Humana Press, Inc., Seiten 23–42 (1997). Wenngleich der NCl-Screen erst seit 1990 eingesetzt wird, hat er bereits zur Entdeckung, Entwicklung und klinischen Verwendung von wichtigen neuen Krebsarzneimitteln bei menschlichen Krebspatienten geführt. Siehe z.B. Weinstein et al., Science, 275, 343-349 (1997); Grever und Chabner, In: Cancer: Principles und Practice von Oncology, 5. Auflage, DeVita et al., Hrsg., Philadelphia: Lippincott-Raven, Seiten 385–394 (1997).
Der NCl-Screen besteht aus einer Gruppe von 60 verschiedenen menschlichen Tumorzelllinien, gegen welche Verbindungen über einen definierten Bereich von Konzentrationen getestet werden, um den relativen Grad der Wachstumshemmung oder Cytotoxizität gegen jede Zelllinie zu bestimmen. Der Aufbau und die Durchführung des Screens ist so, dass für jede getestete Verbindung sowohl die absoluten als auch die relativen Empfindlichkeiten von einzelnen Zelllinien, aus denen der Screen zusammengesetzt ist, ausreichend reproduzierbar sind, dass ein charakteristisches Profil oder "Fingerabdruck" der zellulären Reaktion erzeugt wird. Verbindungen, die in dem NCl-Screen aktiv sind, weisen ausgeprägte unterschiedliche, das Tumorwachstum hemmende und/oder zytotoxische Effekte auf die verschiedenen Zelllinien auf, aus denen die 60 Zelllinien-Gruppe zusammengesetzt ist. Der Grad der unterschiedlichen Reaktion zwischen den am meisten und am wenigsten empfindlichen Linien kann typischerweise relativ klein sein (z.B. 2-10-fach), oder gelegentlich 3–4 Größenordnungen betragen. Außerdem können die Zelllinien in Reaktion auf eine bestimmte Verbindung sehr heterogen sein oder sie können vergleichsweise homogen sein, wobei nur relativ wenige Linien eine größere oder geringere Empfindlichkeit als der Durchschnitt aufweisen. Ungeachtet der Größe des Unterschieds oder des Grades der Heterogenität der Reaktion der Zelllinien-Gruppe ist es die Reproduzierbarkeit des Reaktions "Fingerabdrucks", welche für die darin enthaltene nützliche Information wichtig ist.
Eine ausführliche Beschreibung des Screening-Assays ist z.B. in Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83, 757–766 (1991); Skehan et al., J.Natl. Cancer Inst., 82, 1107–1112 (1990); und Boyd und Paull, Drug Dev. Res., 34, 484–488 (1995) veröffentlicht. Die Identitäten, Ausgangsmaterialien, Herleitung, morphologischen und immunocytochemischen Kennzeichen und Verfahren zur Aufrechterhaltung der Zelllinien, aus denen sich die NCl 60 Zelllinien-Gruppe zusammensetzt, sind z.B. in Boyd, In: Cancer: Principles and Practice of Oncology Updates, DeVita et al., Hrsg., Philadelphia: Lippincott, Seiten 1–12 (1989); Stinson et al., Anticancer Res., 12, 1034–1035 (1992) ausführlich beschrieben.
In dem Screening-Assay wird jedes Mittel über einen breiten Konzentrationsbereich gegen jede Zelllinie in der Gruppe getestet. Alle Linien werden am Tag 0 auf eine Reihe von Standard 96-Napf-Mikrotiterplatten inokuliert, gefolgt von einer 24-stündigen Inkubation in Abwesenheit der Testverbindung. Die eingesetzten Inokulationsdichten hängen von der jeweiligen Zelllinie und ihren Wachstumseigenschaften ab. Die verwendeten Inokulationsdichten sind wie in Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83, 757–766 (1991); und Boyd und Paull, Drug Dev. Res., 34, 91–109 (1995) veröffentlicht. Testverbindungen werden in fünf 10-fachen Verdünnungen bewertet. Im Anschluss an eine 48-stündige Inkubation mit der Testverbindung werden die Zellen durch das Sulforhodamin B-Verfahren getestet, wie es in Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst., 82, 1107–1112 (1990); Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83, 757–766 (1991); und Rubinstein et al., J. Natl. Cancer Inst., 82, 1112–1118 (1990) beschrieben ist. Optische Dichten werden an automatischen Plattenlesegeräten gemessen, gefolgt von einer computergestützten Datenerfassung, Verarbeitung, Speicherung und Verfügbarkeit zur Anzeige und Analyse.
Jeder erfolgreiche Test einer Verbindung erzeugt 60 Dosis-Reaktions-Kurven, welche in dem NCl-Screening-Datenbericht als eine Reihe von zusammengesetzten Objekten ausgedruckt werden, aus denen sich die Tumor-Typ-Untergruppen zusammensetzen. Daten für (eine) beliebige einzelne Zelllinie(n), welche die Qualitätskontrollkriterien nicht erfüllen oder anderweitig Mängel aufweisen für (eine) beliebige Zelllinie(n), die nicht erfolgreich getestet wurde(n), werden aus der weiteren Analyse ausgeschlossen und aus dem Screening-Bericht entfernt.
Die Bedeutung und Berechnung von Reaktionsparametern, GI₅₀, TGI und LC₅₀, und die Konstruktion und Verwendung von "Mean-Graphs" wird kurz wie folgt zusammengefasst. Der 50% Wachstumshemmungsparameter (GI₅₀) ist die Konzentration des Testarzneimittels, bei dem 100×(T-T₀)/(C-T₀)=50=PG ("prozentuales Wachstum"). Die optische Dichte des Testnapfs nach dem 48-stündigen Kontakt mit dem Arzneimittel ist T; die optische Dichte zum Zeitpunkt Null ist T₀; und die optische Dichte der Kontrolle ist C. Das PG ist ein T/C-artiger Parameter, welcher Werte von +100 bis –100 aufweisen kann. Während das GI₅₀ als ein wachstumshemmend wirksamer Spiegel bzw. ein wachstumshemmendes Wirkungsniveau angesehen werden kann, bedeutet das TGI eine "vollständige Wachstumshemmung" oder einen cytostatisch wirksamen Spiegel bzw. ein cytostatisches Wirkungsniveau. Das TGI ist die Arzneimittelkonzentration, bei der 100×(T-T₀)/(C-T)=O=PG. Die LC₅₀ ist die tödliche Konzentration, "Nettozellabtötung" oder der Cytotoxizitätsparameter. Es ist die Konzentration, bei der 100×(T-T₀)/T₀=-50=PG. Die optische Dichte der Kontrolle wird nicht bei der Berechnung der LC₅₀ verwendet. Für eine ausführliche Beschreibung der Reaktionsparameter und der Konstruktion und Verwendung von Mean-Graphs, siehe Boyd et al., In: Cytotoxic Anticancer Drugs: Models And Concepts for Drug Discovery and Development, Valeriote et al., Hrsg., Amsterdam: Kluwer Academic Publishers, Seiten 11–34 (1992).
Ein Mean-Graph ist ein Muster, das durch Auftragen von positiven und negativen Werten, die als "Delta" bezeichnet werden, erhalten wird, die aus einem Satz von GI₅₀, TGI oder LC₅₀-Konzentrationen erzeugt werden, die für eine bestimmte, gegen jede Zelllinie in dem NCl in-vitro-Screen getestete Verbindung erhalten werden. Die Deltas werden aus den GI₅₀-, TGI- und LC₅₀-Daten durch eine dreistufige Berechnung erzeugt. Zum Beispiel wird der GI₅₀-Wert für jede Zelllinie, die erfolgreich gegen eine bestimmte Verbindung getestet wurde, in ihren log₁₀GI₅₀-Wert umgewandelt. Der mittlere Gruppen-log₁₀GI₅₀-Wert wird durch Bilden des Mittelwerts aus den einzelnen log₁₀GI₅₀-Werten erhalten. Jeder log₁₀GI₅₀-Wert wird dann von dem Gruppenmittelwert abgezogen, um das entsprechende Delta zu erzeugen.
Um den Mean-Graph zu konstruieren, werden die Deltas horizontal in Bezug auf eine senkrechte Linie aufgetragen, welche den berechneten mittleren Gruppen-GI₅₀ wiedergibt. Die negativen Deltas werden auf der rechten Seite der Mittelwertbezugslinie aufge tragen, wodurch sie proportional Zelllinien wiedergeben, die empfindlicher sind als der berechnete Durchschnitt. Umgekehrt werden die positiven Deltas auf der linken Seite der Bezugslinie aufgetragen, wo sie die weniger empfindlichen Zelllinien für das bestimmte Mittel wiedergeben. So zeigt z.B. ein Balken, der 3 Einheiten auf der rechten Seite der senkrechten Bezugslinie in einem GI₅₀ Mean-Graph herausragt, an, dass die GI₅₀-Konzentration für diese Zelllinie 1000-fach geringer ist als die gruppengemittelte GI₅₀-Konzentration. Die TGI- und LC₅₀ Mean-Graphs werden entsprechend hergestellt und interpretiert.
Drei weitere Zahlen sind im unteren Teil von jedem der drei jeweiligen Mean-Graphs abgedruckt. Diese Zahlen sind das MG-MID, das Delta und der Bereich. Das MG-MID ist der berechnete mittlere Gruppen-GI₅₀, TGI und LC₅₀-Wert. Das Delta ist die Anzahl von log₁₀-Einheiten, um die das Delta der empfindlichsten Linie(n) der Gruppe sich von dem Delta der am wenigsten empfindlichen Linie(n) unterscheidet bzw. unterscheiden.
Repräsentative Mean-Graphs für verschiedene Verbindungen der vorliegenden Erfindung, welche die Ergebnisse des Screens zeigen, sind in den 1a–e abgebildet. Um die Verbindungen zu screenen, wurden zunächst Stammlösungen der Verbindungen in Dimethylsulfoxid bei 400× der gewünschten höchsten Test-Endkonzentrationen hergestellt und bei –70°C bis zum Gebrauch aufbewahrt. Die in diesem Beispiel untersuchten höchsten Test-Endkonzentrationen schwankten zwischen 10^–4 und 10^–6 molar. Zur Zeit des Screenings wurde ein Aliquot der aufgetauten Stammlösung mit vollständigem Medium, das 50 μg/ml Gentamycin enthielt, verdünnt, so dass eine Konzentration von 2× der gewünschten höchsten Test-Endkonzentration erhalten wurde. Anschließend wurden weitere vier 10-fach Reihenverdünnungen durchgeführt, um insgesamt fünf Konzentrationen bereitzustellen, die einen 4-log₁₀-Konzentrationsbereich umspannen. 100 μl Aliquots von diesen Zwischenverdünnungen wurden sofort zu den geeigneten Mikrotiternäpfen zugegeben, welche jeweils bereits die geeigneten Anzahlen und Typen von Zellen in 100 μl Kulturmedium enthielten, was zu den gewünschten fünf Endkonzentrationen führte.
Die verwendeten 60 Zelllinien und die entsprechenden Inokulationsdichten waren wie in Boyd und Paull, Drug Dev. Res., 34, 91–109 (1995); Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83, 757–766 (1991) beschrieben. Im Anschluss an die Zugaben der Verbindung wurden die Platten 48 Stunden bei 37°C unter einer 5% CO₂/Luft-Atmosphäre und 100% Feuchtigkeit inkubiert. Anschließend wurden adhärente Zellen (alle Linien mit Ausnahme der Leukämiezellen) durch vorsichtige Zugabe von kalter Trichloressigsäure (50 μl von 50% Gew./Vol.) in situ fixiert und 60 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Überstände wurden verworfen und die Platten wurden fünfmal mit entionisiertem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Sulforhodamin B-Lösung wurde zu jeder Platte zugegeben, gefolgt von einer weiteren Inkubation während 10 Minuten bei Raumtemperatur. Überschüssiger ungebundener Farbstoff wurde anschließend durch 5-maliges Waschen mit 1% Essigsäure, gefolgt von Lufttrocknung, entfernt. Die gebundene Färbung in jedem Napf wurde durch Zugabe von 100 μl von 10 mmol/l ungepufferter Tris-Base gelöst; darauf folgte eine Bestimmung der optischen Dichten an einem automatischen Plattenlesegerät. Für Suspensionszellkulturen (die Leukämiezellen) war das Verfahren das gleiche mit der Ausnahme, dass am Ende des Arzneimittel-Inkubationszeitraums die abgesetzten Zellen in situ an die Böden der Mikrotiternäpfe durch vorsichtige Zugabe von 50 μl von 80% Trichloressigsäure fixiert wurden. Geeignete Kontrollnäpfe wurden in das Testplattenformat aufgenommen, um eine Subtraktion der optischen Hintergrunddichten, Arzneimittel-Blindprobenkorrekturen und eine Bestimmung der Zelldichten zum Zeitpunkt 0 (dem Zeitpunkt, zu dem die Verbindungen zugegeben wurden) zu ermöglichen.
Wie z.B. aus 1B hervorgeht, wies die Verbindung 1a eine das Tumorwachstum hemmende Aktivität gegen mehrere menschliche Krebszelllinien, insbesondere gegen Brust- (z.B. MCF7), Eierstock- (z.B. OVCAR-5), Nieren- (z.B. CAKI-1) und Dickdarm- (z.B. SW-620) Krebszelllinien auf.
Beispiel 17
Dieses Beispiel veranschaulicht die wünschenswerten Löslichkeitseigenschaften der Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung. In nachstehender Tabelle 2 sind die Wasserlöslichkeit der Verbindungen 1a-d von Tabelle 1 bei verschiedenem pH mit einem Citrat- oder Phosphatpuffer, wie angegeben, dargelegt. Die Löslichkeit wurde durch Sichtprüfung bei einer festgesetzten Konzentration von 5 mg/ml bestimmt.
Tabelle 2: Löslichkeitsbewertung von Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung durch Sichtprüfung
Die Daten in Tabelle 2 zeigen, dass die Verbindungen 1a, b und d bei pH 3 vollständig löslich waren. Verbindung 1d war auch bei pH 5 vollständig löslich. Wenngleich bei höheren pH-Werten die meisten der Verbindungen eine verringerte Löslichkeit aufwiesen, bleiben sie stärker wasserlöslich als einige andere 5,4'-Diaminoflavone, wie 5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon. Siehe Akama et al., J. Med. Chem., 41, 2056–2067 (1998) (wobei angemerkt wird, dass die Wasserlöslichkeit von 5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon weniger als 0,2 μg/ml beträgt).
Beispiel 18
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-(chloracetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on.
Zu einer Lösung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-(4-amino-3-fluorphenyl)-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (3,20 g) in Dimethylformamid (60 ml) wurden Monochloressigsäure (1,60 g) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (3,23 g) zugegeben und das Gemisch wurde 22 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, wobei das Endprodukt erhalten wurde.
C₂₀H₁₄ ³⁵CIF₃N₂O₅ = 454. Gefunden: 455 (M+H)⁺.
Beispiel 19
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-amino-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on.
Zu einer Lösung von 5-Amino-2-(4-amino-3-fluorphenyl)-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on (1,01 g) in Pyridin (30 ml) wurde Allylchlorformiat (3,2 ml) bei 0°C zugegeben und das Gemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie (Chloroform) ergab das Endprodukt.
C₂₄H₁₉F₃N₂O₇ = 504. Gefunden: 505 (M+H)⁺.
Beispiel 20
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-(chloracetamido)-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on.
Zu einer Lösung von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl)-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-amino-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (2,02 g) in Dimethylformamid (40 ml) wurden Monochloressigsäure (1,90 g) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (3,84 g) zugegeben und das Gemisch wurde 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie (9,1 Chloroform/Ethylacetat) ergab das Endprodukt.
C₂₆H₂₀ ³⁵CIF₃N₂O₈ = 580. Gefunden: 581 (M+H)⁺.
Alle hier zitierten Literaturstellen einschließlich der Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen werden hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen.
Wenngleich diese Erfindung mit einer Betonung auf bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist dem Fachmann klar, dass Abwandlungen der bevorzugten Aus führungsformen verwendet werden können und dass es beabsichtigt ist, dass die Erfindung anders als in dieser Anmeldung speziell beschrieben durchgeführt werden kann. Entsprechend schließt diese Erfindung alle Modifikationen ein, die innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen, wie er durch die folgenden Ansprüche definiert ist.

Claims

Aminoflavon mit der folgenden Formel
wobei jedes von R¹ und R² H, COCH₂-R⁷, wobei R⁷ Amino, verzweigtes oder geradkettiges Alkylamino, Dialkylamino oder Alkyl- oder Dialkylaminoalkyl ist, oder ein α-Aminosäurerest ist, mit der Maßgabe, dass wenigstens eines von R¹ oder R² von H verschieden ist, und wobei R³ H, verzweigtes oder geradkettiges Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkanoyloxyalkyl, Alkanoyloxy, Alkoxy oder Alkoxyalkyl ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Aminoflavon nach Anspruch 1, wobei, wenn jedes von R¹ oder R² ein α-Aminosäurerest ist, die Stereochemie von R¹ und R² L ist.
Aminoflavon nach Anspruch 1, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on, 5-Amino-2-[4-[[2-amino-5-guanidinopentanoyl]amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on, 6,8-Difluor-7-methyl-5-(dimethylami no)acetamido-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on und 5-Amino-6,8-difluor-7-methyl-2-[4(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on.
Zusammensetzung, umfassend ein Aminoflavon nach einem der Ansprüche 1 – 3 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Zusammensetzung außerdem wenigstens ein weiteres Krebsmittel umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5 zum Hemmen des Wachstums eines Tumors.
Verwendung eines Aminoflavons nach einem der Ansprüche 1 – 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen des Wachstums eines Tumors in einem Wirt.
Verwendung nach Anspruch 7, außerdem umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei eine das Tumorwachstum hemmende Menge von wenigstens einem weiteren Krebsmittel zusätzlich verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Brust-, Eierstock- und Nierentumoren.