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Technisches
Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue 5-Aminoflavonverbindungen,
Zusammensetzungen und Verfahren zum Verwenden dieser Verbindungen
als zytotoxische Mittel.
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Hintergrund
der Erfindung
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Es
wurde erkannt, dass natürliche
oder synthetische Flavonoide verschiedene biologische Aktivitäten aufweisen.
Solche Verbindungen können
z.B. die Aktivität
von Proteinkinase C, Aromatase, Topoisomerase oder cyclinabhängiger Kinase
hemmen oder können
eine antimitotische Aktivität
aufweisen. Insbesondere wurde berichtet, dass 5,4'-Diaminoflavone eine
Cytotoxizität
z.B. gegen die menschliche Brustkrebs-Zelllinie MCF-7 aufweisen.
Siehe Akama et al., J. Med. Chem., 41, 2056–2067 (1998).
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Der
Wirkungsmechanismus und das Zielmolekül der 5,4'-Diaminoflavonverbindungen bleiben weitgehend
unbekannt. Experimente, bei denen verschiedene Substituentengruppen
in die 6, 7, 8 und 3'-Stellungen an
dem Flavonring eingebaut wurden, führten zu einigen Spekulationen über die
Struktur-Aktivität-Beziehung der
Substituenten, insbesondere in der 7-Stellung von 5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon.
Wenngleich die wirkliche Rolle der verschiedenen Substituentengruppen
unklar bleibt, wurde gezeigt, dass bestimmte physikalische Eigenschaften
der Flavon-Stammverbindung, wie die Löslichkeit, durch die Anwesenheit
von einigen, aber nicht allen Substituentengruppen in der 7-Stellung
verbessert werden konnten. Einige der 7-substituierten Verbindungen
wiesen auch eine Cytotoxizität
gegen menschliche Brustkrebszellen auf. Siehe Akama et al., J. Med.
Chem., auf den Seiten 2061–62.
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Trotz
der Cytotoxizität
von 5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon gegen
bestimmte menschliche Krebszellen besitzt die Verbindung eine schlechte
Löslichkeit
in organischen Lösungsmitteln
und löst
sich kaum in Wasser. In der Tat wurde festgestellt, dass die Löslichkeitsdaten
von 5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon weniger
als 0,2 μg/ml
in Wasser und 1,2 mg/ml in Ethanol betragen. Siehe Akama et al.,
J. Med. Chem., auf Seite 2067.
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Die
Wasserlöslichkeit
stellt einen entscheidenden Vorteil für eine pharmazeutische Verbindung
dar, insbesondere im Hinblick auf die Formulierung des Arzneimittels
und die orale Absorption nach der Verabreichung. In den meisten
Fällen
liegt der Ort der Arzneimittelwirkung in einer Region, die von dem
Ort der Arzneimittelverabreichung durch eine Membran getrennt ist.
Arzneimittel, welche oral, intramuskulär oder subkutan verabreicht
werden, müssen
Membranen überqueren,
um absorbiert zu werden und in den Körperkreislauf einzutreten.
Selbst Arzneimittel, die durch intravenöse Injektion verabreicht werden,
müssen
kapillare Membranen überqueren,
um den Körperkreislauf
zu verlassen und an intrazelluläre
und extrazelluläre
Wirkorte zu gelangen. Siehe Human Pharmacology, Wingard et al.,
Hrsg., St. Louis : Mosby-Year Book, Inc., 1991, Seiten 50–51.
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In
dieser Hinsicht müssen
die meisten Arzneimittel eine Affinität für Wasser aufweisen, um durch
Blut und andere Körperflüssigkeiten
zu ihren Wirkorten transportiert zu werden. Eine Lösung für die geringe
Wasserlöslichkeit
eines Wirkstoffs ist, den Wirkstoff mit Emulgatoren oder Komplexbildnern
zu vermischen, um zu verhindern, dass das Arzneimittel am Ort der
Verabreichung ausfällt.
Siehe Human Pharmacology, Seiten 50–51. Jegliche Manipulation
des Wirkstoffs in dem Bemühen,
eine physikalische Eigenschaft zu verbessern, sollte jedoch seine
biologische Aktivität
nicht nachteilig beeinflussen. Wenngleich sie eine annehmbare Vorgehensweise
ist, kann die Verwendung von Emulgatoren und Komplexbildnern die
Arten der Verabreichung des Arzneimittels beschränken und/oder den Gebrauch
und die Aufbewahrung des Arzneimittels schwieriger machen.
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Deshalb
besteht weiterhin ein Bedarf für
neue 5-Aminoflavonverbindungen und Zusammensetzungen, welche starke
Antitumoreigenschaften aufweisen. Es besteht auch weiterhin ein
Bedarf für
5-Aminoflavonverbindungen, welche eine verbesserte Löslichkeit
in Wasser und organischen Lösungsmitteln
haben. Die vorliegende Erfindung stellt solche Verbindungen, Zusammensetzungen
und Verfahren bereit. Diese und andere Vorteile der vorliegenden
Erfindung sowie zusätzliche
erfinderische Merkmale gehen aus der hier angegebenen Beschreibung
der Erfindung hervor.
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Kurze Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung stellt Trifluoraminoflavonverbindungen, welche in der
5- und/oder 4'-Stellung
an dem Flavouring mit aminhaltigen Gruppen substituiert sind und
gegebenenfalls mit einem Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkanoyloxyalkyl,
Alkanoyloxy, Alkoxy oder Alkoxyalkyl in der 7-Stellung des Flavonrings
substituiert sind, oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon bereit.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen wünschenswerte
physikalische Eigenschaften, wie etwa eine Löslichkeit in wässrigen
Lösungsmitteln,
auf.
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Zusätzlich zu
ihren wünschenswerten
physikalischen Eigenschaften weisen die Aminoflavonverbindungen
der vorliegenden Erfindung auch eine Antitumoraktivität gegen
eine Reihe von Krebszellen auf.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung
bereit, die eine Aminoflavonverbindung, wie vorstehend allgemein
definiert, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
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In
einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung
eines Aminoflavons der Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels
zum Hemmen des Wachstums eines Tumors in einem Wirt durch Verabreichen
einer das Tumorwachstum hemmenden Menge einer Aminoflavonverbindung,
wie vorstehend allgemein definiert, an den Wirt vor. Bei dem Wirt
kann es sich um einen beliebigen Säuger, einschließlich der Menschen
handeln.
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Die
Erfindung kann unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen und in der
folgenden ausführlichen
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen am besten verstanden
werden.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1A veranschaulicht
den GI50-basierten Mean-Graph-"Fingerabdruck" von 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Trihydrobromid
in dem NCl 60 Zelllinien-Screen.
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1B veranschaulicht
den GI50-basierten Mean-Graph-"Fingerabdruck" von 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Dimethansulfonat
in dem NCl 60 Zelllinien-Screen.
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1C veranschaulicht
den GI50-basierten Mean-Graph-"Fingerabdruck" von 5-Amino-2-[4-[[2-amino-5-guanidinpentanoyl]amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Trihydrobromid
in dem NCl 60 Zelllinien-Screen.
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1D veranschaulicht
den GI50-basierten Mean-Graph-"Fingerabdruck" von 5-Amino-6,8-difluor-7-methyl-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on
in dem NCl 60 Zelllinien-Screen.
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1E veranschaulicht
den GI50-basierten Mean-Graph-"Fingerabdruck" von 6,8-Difluor-7-methyl-5-(dimethylamino)acetamido-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on
in dem NCl 60 Zelllinien-Screen.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung umfasst eine neue Klasse von Aminoflavonverbindungen,
Zusammensetzungen, welche diese Verbindungen enthalten, und ihre
Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen des
Wachstums von Tumoren. Jede geeignete aminhaltige Komponente kann
in einer oder beiden der R1- und R2-Stellungen von Verbindung I, die nachstehend
abgebildet ist, substituiert sein. Vorzugsweise ist jedes von R1 und R2 H, COCH2-R7, wobei R7 Amino, verzweigtes oder geradkettiges Alylamino,
Dialkylamino oder Alkyl- oder Dialkylaminoalkyl ist, oder ein α-Aminosäurerest,
mit der Maßgabe,
dass wenigstens eines von R1 oder R2 von H verschieden ist, und R3 ist
H, verzweigtes oder geradkettiges Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkanoyloxyalkyl,
Alkanoyloxy, Alkoxy oder Alkoxyalkyl. Jede geeignete Alkylgruppe
kann an R3 substituiert sein, wozu z.B.
eine Alkylgruppe mit ungefähr
1 bis ungefähr
20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ungefähr 1 bis ungefähr 15 Kohlenstoffatomen,
mehr bevorzugt ungefähr
1 bis ungefähr
10 Kohlenstoffatomen und am meisten bevorzugt ungefähr 1 bis
ungefähr
6 Kohlenstoffatomen gehört.
So wie er hier verwendet wird, schließt der Begriff "Alkyl" verzweigte oder
geradkettige Alkylgruppen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl,
Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl,
Hexyl, Heptyl und Octyl ein.
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Jede
geeignete Mono- oder Dialkylamino- oder Mono- oder Dialkylaminoalkylgruppe
kann an R7 substituiert sein, wozu z.B.
eine Gruppe mit einer Alkylgruppe mit ungefähr 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise
ungefähr
1 bis ungefähr
15 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 10 Kohlenstoffatomen
und am meisten bevorzugt ungefähr
1 bis ungefähr
6 Kohlenstoffatomen gehört.
Der Begriff "Alkyl" kann z.B. beliebige
der vorstehend aufgeführten
Gruppen einschließen.
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Jede
geeignete Hydroxyalkylgruppe kann an R3 substituiert
sein, wozu z.B. eine Hydroxyalkylgruppe mit ungefähr 1 bis
ungefähr
20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit ungefähr 1 bis ungefähr 15 Kohlenstoffatomen,
mehr bevorzugt ungefähr
1 bis ungefähr
10 Kohlenstoffatomen und am meisten bevorzugt ungefähr 1 bis
ungefähr
6 Kohlenstoffatomen gehört.
Der Begriff "Alkyl" kann z.B. beliebige
der vorstehend aufgeführten Gruppen
einschließen.
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Jedes
geeignete Alkanoyloxy oder Alkanoyloxyalkyl kann an R3 substituiert
sein, wozu z.B. eine Gruppe mit ungefähr 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen,
vorzugsweise ungefähr
1 bis ungefähr
15 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 10 Kohlenstoffatomen
und am meisten bevorzugt ungefähr 1
bis ungefähr
6 Kohlenstoffatomen gehört.
Der Begriff "Alkanoyloxy" kann verzweigte
oder geradkettige Gruppen, wie Methanoyloxy, Ethanoyloxy, Propanoyloxy,
Butanoyloxy, Pentanoyloxy, Hexanoyloxy, Heptanoyloxy und Octanoyloxy
einschließen.
Der Begriff "Alkyl" kann z.B. beliebige
der vorstehend aufgeführten
Gruppen einschließen.
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Jede
geeignete Alkoxy- oder Alkoxyalkylgruppe kann an R3 substituiert
sein, wozu z.B. eine Gruppe mit ungefähr 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen,
vorzugsweise ungefähr
1 bis ungefähr
15 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt ungefähr 1 bis ungefähr 10 Koh lenstoffatomen
und am meisten bevorzugt ungefähr
1 bis ungefähr
6 Kohlenstoffatomen gehört.
Der Begriff "Alkoxy" kann z.B. verzweigte
oder geradkettige Alkoxygruppen, wie Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy,
Butoxy, Isobutoxy, sec-Butoxy, tert-Butoxy, Pentoxy, Hexoxy, Heptoxy
und Octoxy einschließen.
Der Begriff "Alkyl" kann z.B. beliebige
der vorstehend aufgeführten
Gruppen einschließen.
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Jeder
geeignete α-Aminosäurerest
und Derivate davon können
an R7 substituiert sein. Zu Beispielen für solche α-Aminosäurereste
gehören
in der Natur vorkommende Aminosäuren,
wie Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin,
Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin,
Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin. Zu geeigneten Substituentengruppen
und den dadurch gebildeten Verbindungen gehören z.B. die in Tabelle 1 nachstehend
dargestellten.
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Tabelle
1: Repräsentative
Strukturen von neuen Aminoflavonverbindungen
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Dem
Fachmann ist auch klar, dass Verbindungen der vorliegenden Erfindung
durch die Verwendung von wohlbekannten und leicht verfügbaren Reaktionen,
Reagenzien und Arbeitsweisen in pharmazeutisch annehmbare Salze
umgewandelt werden können.
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Wenn
in den Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung jedes
von R1 oder R2 der
Struktur I ein α-Aminosäurerest
ist, ist die Stereochemie von R1 und 2 vorzugsweise L. Zu Beispielen für solche
Verbindungen gehören
5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on
und 5-Amino-2-[4-[[2-amino-5-guanidinopentanoyl]amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on.
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Die
Substitution einer aminhaltigen Komponente an R1 und
R2 verleiht der Verbindung eine hohe Löslichkeit
in Lösungsmitteln
wie Wasser. Eine hohe Wasserlöslichkeit
ist wünschenswert
und günstig.
Außer
der leichten Verabreichung von wasserlöslichen Verbindungen erhöht eine
hohe Wasserlöslichkeit
auch die Absorption der Verbindungen beispielsweise nach einer oralen
Verabreichung der Verbindungen an ein Idividuum oder einen Wirt.
Eine hohe Wasserlöslichkeit
ist auch günstig,
wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff in
der Zusammensetzung zu pharmazeutischen Produkten formuliert werden.
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Überraschenderweise
zeigen die aminhaltigen Komponenten an R1 und
R2 an den Verbindungen der vorliegenden
Erfindung neben den löslichkeitsverbessernden
Eigenschaften auch eine gewisse Dauerhaftigkeit und werden nicht
leicht von der Verbindung abgespalten. Die offensichtliche Persistenz
dieser Substituentengruppen kann auf ihren Beitrag zu der biologischen
Aktivität
der Verbindungen hindeuten, wenngleich der genaue Mechanismus, durch
den diese Gruppen die biologische Aktivität beeinflussen, derzeit nicht
bekannt ist.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von wohlbekannten
und leicht verfügbaren
chemischen Reaktionen, Reagenzien und Arbeitsweisen synthetisiert
werden. Dem Fachmann ist auch klar, dass Verbindungen der vorliegenden
Erfindung, einschließlich
Antitumorderivate und Prodrugs davon durch chemische Modifikationen)
von synthetischen oder in der Natur vorkommenden Verbindungen der
vorliegenden Erfindung unter Verwendung von wohlbekannten und leicht
verfügbaren
Reaktionen, Reagenzien und Arbeitsweisen erhalten werden können.
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Zum
Beispiel kann Verbindung I hergestellt werden, indem zunächst ein
7-substituiertes-5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon mit
einer auf geeignete Weise N-geschützten Aminosäure oder
ihrem reaktiven Derivat in Gegenwart einer Base und/oder eines Kondensationsreagenzes,
wie Carbodiimid, Carbonyldiimidazol und dergleichen in einem inerten
Lösungsmittel
umgesetzt wird. Zu Beispielen für
das reaktive Derivat der auf geeignete Weise N-geschützten Aminosäure gehören ein
Säurechlorid,
ein N-Hydroxysuccinimidester und dergleichen. Als die Base können tertiäre Amine,
wie Triethylamin, Diisopropylethylamin, Pyridin und 4-Dimethylaminopyridin
verwendet werden. Als das inerte Lösungsmittel können Dimethylformamid,
Dichlormethan, Chloroform und dergleichen allein oder in Kombination
miteinander verwendet werden. Als die geeignete N-Schutzgruppe der
Aminosäure
kann eine Butoxycarbonylgruppe, eine Benzyloxycarbonylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe
und dergleichen verwendet werden. Die Reaktion wird bei einer Temperatur
zwischen Raumtemperatur und dem Siedepunkt des Lösungsmittels durchgeführt. Das
resultierende Produkt, wobei R1 bzw. R2 auf geeignete Weise geschützt sind,
kann dann durch Entfernen der Schutzgruppen von dem Produkt durch
Verfahren wie die in Protecting Groups in Organic Synthesis, T.
W. Green, Hrsg., John Wiley & Sons,
Inc. (1981) beschriebenen Verfahren in Verbindung I überführt werden.
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Verbindung
I kann auch hergestellt werden, indem zunächst eine 7-substituierte-5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavonverbindung mit einer
durch die allgemeine Formel HOOC-Y-X wiedergegebenen Säure oder
ihrem reaktiven Derivat, worin X Chlor, Brom oder Iod bedeutet und
Y ein verzweigtes oder geradkettiges C1-20-Alkyl
bedeutet, auf eine Weise umgesetzt wird, die der vorstehend beschriebenen
entspricht. Das resultierende Produkt kann dann mit Natriumazid
in einem inerten Lösungsmittel
umgesetzt werden. Als das inerte Lösungsmittel kann Dimethylformamid,
Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, 1,2-Dimethoxyethan
und dergleichen allein oder in Kombination miteinander verwendet
werden. Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen
50–100°C durchgeführt. Das
Endprodukt kann durch Reduktion der Azidogruppen zu Aminogruppen
durch katalytische Hydrierung oder durch Verwenden von Triphenylphosphin
und Wasser in einem inerten Lösungsmittel
erhalten werden. Als Katalysator kann Palladium auf Holzkohle, Palladiumhydroxid,
Platinoxid und dergleichen verwendet werden. Als das inerte Lösungsmittel
kann Methanol, Ethanol, Propanol, Ethylacetat, Tetrahydrofuran,
1,2-Dimethoxyethan, Toluol, Dimethylformamid, Dimethylacetamid und
dergleichen allein oder in Kombination miteinander verwendet werden.
Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 20–30°C durchgeführt.
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Verbindung
I, wobei R1 H ist, kann auch hergestellt
werden, indem zunächst
eine 7-substituierte-5-Aminotrifluorflavonverbindung, wobei das
4'-Amino mit einer
Allyloxycarbonylgruppe substituiert ist, mit einer auf geeignete
Weise N-geschützten
Aminosäure
oder ihrem reaktiven Derivat auf eine Weise umgesetzt wird, die
der vorstehend beschriebenen entspricht. Das Endprodukt kann erhalten
werden, indem zunächst
die vorstehende Verbindung von der Schutzgruppe befreit wird und
anschließend
die resultierende Verbindung mit Tetrakis(triphenylphosphin)palladium
in Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels in einem inerten
Lösungsmittel
behandelt wird. Als das Reduktionsmittel kann Triethylammoniumformiat,
Pyrrolidin und dergleichen verwendet werden. Als das inerte Lösungsmittel
kann Tetrahydrofuran, 1,2-Dimethoxyethan und dergleichen verwendet
werden. Die Reaktion wird typischerweise bei einer Temperatur zwischen
0°C und
Raumtemperatur durchgeführt.
Die Reihenfolge der vorstehenden Arbeitsweisen kann gemäß anerkannten
Prinzipien und Verfahren im Fachgebiet modifiziert werden.
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Die
neuen Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung (und pharmazeutisch
annehmbare Salze davon) können
in einer geeigneten Zusammensetzung, z.B. einer pharmazeutischen
Zusammensetzung, enthalten sein. Die Zusammensetzung kann durch
Kombinieren von einer oder mehreren Verbindungen der vorliegenden
Erfindung mit einem passenden pharmazeutisch annehmbaren Träger hergestellt
werden und kann zu einer geeigneten Zubereitung formuliert werden.
Zu geeigneten Zubereitungen gehören
z.B. Zubereitungen in fester, halbfester, flüssiger oder gasförmiger Form
wie Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulate, Salben, Lösungen,
Suppositorien, Injektionen, Inhalationsmittel und Aerosole, und
andere Formulierungen, die im Fachgebiet für ihre jeweiligen Verabreichungswege
bekannt sind. In pharmazeutischen Darreichungsformen kann eine Verbindung
der vorliegenden Erfindung allein oder in zweckmäßiger Assoziation sowie in
Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen, einschließlich anderer
Antitumor- oder Krebsmittel verwendet werden.
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Zu
geeigneten Krebsmitteln gehören
z.B. Doxorubicin, Bleomycin, Vincristin, Vinblastin, VP-16, VM-26,
Cisplatin, Procarbazin und Taxol. Alkylierungsmittel, wie BCNU,
CCNU, Methyl-CCNU und DTIC sind ebenfalls geeignet. Antimetaboliten,
wie 5-FU und Methotrexat können
ebenfalls in dem vorliegenden erfinderischen Verfahren verwendet
weiden. Für
weitere Beispiele für
geeignete Krebsmittel siehe Tabelle 1 und 2 von Boyd In: Current
Therapy in Oncology, J. E. Niederhuber, Hrsg., Philadelphia: B.
C. Decker, Inc., Seiten 11–22 (1993).
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Es
kann von jedem geeigneten Träger
Gebrauch gemacht werden. Zu geeigneten Trägern gehören pharmazeutisch oder physiologisch
annehmbare Träger.
Die folgenden Verfahren und Träger
sind nur beispielhaft und sind in keiner Weise beschränkend. Im
Fall von oralen Zubereitungen kann eine Verbindung der vorliegenden
Erfindung allein oder in Kombination mit einer therapeutisch wirksamen
Menge von wenigstens einer anderen Verbindung verabreicht werden.
Zusammensetzungen, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, können
außerdem
wenigstens eine weitere Verbindung, die keine Verbindung der vorliegenden
Erfindung ist, z.B. ein weiteres Krebsmittel enthalten. Der aktive
Wirkstoff bzw. die aktiven Wirkstoffe können, falls dies gewünscht wird,
mit zweckmäßigen Additiven
kombiniert werden, um Tabletten, Pulver, Granulate, Kapseln oder
dergleichen herzustellen.
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Zu
geeigneten Additiven können
z.B. herkömmliche
Additive, wie Lactose, Mannitol, Maisstärke oder Kartoffelstärke gehören. Zu
geeigneten Additiven können
auch Bindemittel, z.B. kristalline Cellulose, Cellulosederivate,
Akaziengummi, Maisstärke
oder Gelatinearten gehören.
Außerdem
können
Zerfallhilfsmittel wie Maisstärke,
Kartoffelstärke
oder Natriumcarboxymethylcellulose und Gleitmittel wie Talk oder
Magnesiumstearat ebenfalls enthalten sein. Fall es gewünscht wird,
können
weitere Additive wie z.B. Verdünnungsmittel,
Puffersubstanzen, Befeuchtungsmittel, Konservierungsmittel und/oder
Aromastoffe und dergleichen in der Zusammensetzung enthalten sein.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch Auflösung, Suspension
oder Emulgierung in einem wässrigen
oder nicht-wässrigen
Lösungsmittel,
wie Pflanzenöl,
synthetischen aliphatischen Säureglyceriden,
Estern von höheren
aliphatischen Säuren
oder Propylenglycol (falls gewünscht
mit herkömmlichen Additiven,
wie Lösungsvermittlern,
isotonischen Mitteln, Suspendiermitteln, Emulgatoren, Stabilisatoren
und Konservierungsmitteln) zu einer Zubereitung zur Injektion formuliert
werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch
zu einer Aerosolformulierung verarbeitet werden, die durch Inhalation
verabreicht werden soll. Solche Aerosolformulierungen können in
unter Druck gesetzte annehmbare Treibmittel wie Dichlordifluormethan,
Propan, Stickstoff und dergleichen eingebracht werden.
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Einheitsdosisformen
für eine
orale Verabreichung wie Sirupe, Elixiere und Suspensionen können bereitgestellt
werden, worin jede Dosiseinheit, z.B. ein Teelöffel, Esslöffel oder eine Tablette eine
vorbestimmte Menge der Zusammensetzung enthält, welche die Verbindung der
vorliegenden Erfindung enthält.
Entsprechend können
Einheitsdosisformen zur Injektion oder intravenösen Verabreichung eine Zusammensetzung
als eine Lösung
in sterilem Wasser, normaler Salzlösung oder einem anderen pharmazeutisch
annehmbaren Träger
umfassen.
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Der
Begriff "Einheitsdosisform", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als
Einheitsdosen für
menschliche und tierische Subjekte geeignet sind, wobei jede Einheit
eine vorbestimmte Menge von wenigstens einer Verbindung oder Verbindungen
der vorliegenden Erfindung (allein oder, falls dies gewünscht wird,
in Kombination mit einem weiteren therapeutischen Mittel) enthält. Die
Einheitsdosis kann durch Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann
bekannt sind, z.B. durch Berech nen der Menge des Wirkstoffs, die
ausreicht, um die gewünschte
Wirkung in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger hervorzurufen.
Die Spezifikationen für
die Einheitsdosisformen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können,
hängen
von der jeweiligen Wirkung, die erzielt werden soll, und der speziellen
Pharmakodynamik ab, die mit der Verbindung bzw. den Verbindungen
in dem einzelnen Wirt verbunden ist.
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Pharmazeutisch
annehmbare Träger,
z.B. Vehikel, Adjuvantien, Exzipienzien oder Verdünnungsmittel sind
dem Fachmann zugänglich
und sind typischerweise im Handel erhältlich. Der Fachmann kann leicht
das zweckmäßige Verfahren
zur Verabreichung für
die genaue Formulierung der Zusammensetzung bestimmen, die verwendet
wird. Eventuell notwendige Anpassungen der Dosis können leicht
vom Fachmann vorgenommen werden, um die Natur oder Schwere des Zustands,
der behandelt wird, zu berücksichtigen.
Anpassungen der Dosis können
auch auf der Grundlage von anderen Faktoren, wie z.B. der körperlichen
Gesundheit insgesamt, dem Geschlecht, dem Alter, der medizinischen
Vorgeschichte des einzelnen Patienten und dergleichen vorgenommen
werden.
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Die
vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung eines Aminoflavons
der Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen des
Wachstums eines Tumors in einem Wirt, einschließlich eines Menschen, vor,
welche das Verabreichen einer das Tumorwachstum hemmenden Menge
einer Aminoflavonverbindung der vorliegenden Erfindung an den Wirt
umfasst. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung schließt auch
die Verabreichung von Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung
(und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon) zusammen mit einem
pharmazeutisch annehmbaren Träger
ein. Ferner schließt
die Verwendung der vorliegenden Erfindung das Verabreichen einer
Aminoflavonverbindung der vorliegenden Erfindung mit einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger
und/oder wenigstens einem weiteren Krebsmittel ein. Es kann jedes
geeignete Krebsmittel in Verbindung mit den Verbindungen der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, wie es vorstehend beschrieben ist.
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Aminoflavonverbindungen
der vorliegenden Erfindung können
dem Wirt verabreicht werden. Wünschenswerterweise
gehören
zu den einem Wirt verabreichten Aminoflavonverbindungen z.B. die
in Tabelle 1 aufgeführten
Aminoflavonverbindungen. Die be vorzugten Aminoflavonverbindungen
zum Verabreichen an einen Wirt sind 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino)]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on, 5-Amino-2-[4-[[2-amino-5-guanidinopentanoyl]amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on,
6,8-Difluor-7-methyl-5-(dimethylamino)acetamido-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on
und 5-Amino-6,8-difluor-7-methyl-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on.
Besonders bevorzugt ist 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino)]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Dimethansulfonat.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auf jedem geeigneten Weg
verabreicht werden, wozu z.B. eine orale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung,
subkutane Verabreichung, intravenöse Verabreichung oder dergleichen
gehören.
Zum Beispiel können
eine oder mehrere Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung
(oder eine Zusammensetzung davon) als eine Lösung, welche sich für eine intravenöse Injektion
oder Infusion eignet, eine Tablette, eine Kapsel oder dergleichen
oder in einer beliebigen anderen geeigneten Zusammensetzung oder
Formulierung, wie sie in dieser Anmeldung beschrieben ist, verabreicht
werden.
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Die "das Tumorwachstum
hemmende Menge" ist
die Dosis, die erforderlich ist, um einen das Tumorwachstum "hemmenden Spiegel" der aktiven Verbindung
in einem einzelnen Patienten zu erzielen. Die das Tumorwachstum
hemmende Menge kann z.B. als die Menge definiert werden, die einem
einzelnen Patienten verabreicht werden muss, um einen das Tumorwachstum
hemmenden Blutspiegel, Gewebespiegel und/oder intrazellulären Spiegel
einer Verbindung der vorliegenden Erfindung zum Bewirken der gewünschten
medizinischen Behandlung zu erzielen.
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Wenn
der wirksame Spiegel als der bevorzugte Endpunkt für die Verabreichung
verwendet wird, kann die tatsächliche
Dosis und das Schema in Abhängigkeit
z.B. von interindividuellen Unterschieden der Pharmakokinetik, der
Arzneimittelverteilung, des Metabolismus und dergleichen variieren.
Der wirksame Spiegel kann auch variieren, wenn eine oder mehrere
Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit anderen Krebsmitteln
verwendet werden. Außerdem
kann der wirksame Spiegel in Abhängigkeit
von der Krankheit variieren, für
welche die Behandlung gewünscht
wird.
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In
dieser Hinsicht können
die Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch
als antibakterielle Wirkstoffe und/oder als Antiöstrogene verwendet werden.
Der Fachmann kann beliebige geeignete im Fachgebiet bekannte Mittel
zum Bestimmen der zweckmäßigen Dosierung
und des wirksamen Spiegels der Verbindung oder Zusammensetzung der
vorliegenden Erfindung auf der Grundlage der Krankheit, für welche
eine Behandlung gewünscht
wird, verwenden.
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In
dem Maß,
wie die Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung als Krebsmittel verwendet werden, kann der wirksame Blutspiegel
durch Analogie auf der Basis des wirksamen Blutspiegels entsprechend der
Anti-Krebs-Aktivität
bestimmt werden. Der wirksame Spiegel kann z.B. als der Spiegel
gewählt
werden, welcher wirksam die Proliferation von Tumorzellen in einem
Screening-Assay hemmt. Entsprechend kann der wirksame Spiegel z.B.
auf der Grundlage des Blut- oder Gewebespiegels in einem Patienten
bestimmt werden, welche einer Konzentration eines therapeutischen
Mittels entspricht, welche das Wachstum von menschlichen Krebsen
in einem Assay wirksam hemmt, welcher eine klinische Vorhersage
einer Anti-Krebs-Aktivität
erlaubt. Ferner kann der wirksame Spiegel z.B. auf der Grundlage
einer Konzentration bestimmt werden, bei der bestimmte Krebsmarker
im Blut eines Patienten durch eine bestimmte Verbindung gehemmt
werden. Alternativ kann der wirksame Spiegel z.B. auf der Grundlage
einer Konzentration bestimmt werden, die das Wachstum des Krebses
eines Patienten wirksam verlangsamt oder anhält, den Krebs eines Patienten
veranlasst, sich zurückzubilden
oder zu verschwinden, einen Patienten für einen bestimmten Krebs asymptomatisch
macht oder das subjektive Empfinden des Zustands eines Krebspatienten
verbessert.
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Der
zur Krebsbekämpfung
wirksame Spiegel kann dann verwendet werden, um den Spiegel näherungsweise
zu ermitteln (z.B. durch Extrapolation) oder sogar zu bestimmen,
welcher klinisch erforderlich ist, um einen das Tumorwachstum hemmenden
Blut-, Gewebe- und/oder intrazellulären Spiegel zum Bewirken der gewünschten
medizinischen Behandlung zu erzielen. Es ist klar, dass die Bestimmung
der therapeutisch wirksamen Menge, die klinisch erforderlich ist,
um das Tumorwachstum wirksam zu hemmen, die Berücksichtigung von anderen Variablen
erfordert, welche den wirksamen Spiegel beeinflussen können. Wenn
eine festgesetzte wirksame Menge als ein bevorzugter Endpunkt für die Dosierung
verwendet wird, können
die tatsächliche
Dosis und das Dosierungsschema für
die Arzneimittelverabreichung für
jeden Patienten in Abhängigkeit
von Faktoren variieren, zu denen z.B. interindividuelle Unterschiede
der Pharmakokinetik, der Arzneimitteldisposition, des Metabolismus
oder andere hier beschriebene Faktoren gehören, welche den wirksamen Spiegel
beeinflussen.
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Der
Fachmann kann leicht die zweckmäßige Dosis,
das zweckmäßige Schema
oder Verfahren zum Verabreichen einer speziellen Formulierung bestimmen,
um den gewünschten
wirksamen Spiegel in einem einzelnen Patienten zu erzielen. Der
Fachmann kann auch leicht einen zweckmäßigen Indikator des wirksamen
Spiegels der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bestimmen und
verwenden. Zum Beispiel kann der wirksame Spiegel durch direkte
Analyse (z.B. analytische Chemie) oder durch indirekte Analyse (z.B.
mit Indikatoren der klinischen Chemie) von geeigneten Patientenproben
(z.B. Blut oder Gewebe) bestimmt werden. Der wirksame Spiegel kann
auch z.B. durch direkte oder indirekte Beobachtungen, wie die Azidität des Urins,
die Änderung
der Knochendichte, die Abnahme des Augendrucks oder durch das Schrumpfen
eines Tumors in einem Krebspatienten bestimmt werden. Es gibt viele
Literaturstellen im Fachgebiet, welche Protokolle beschreiben, die
bei der Verabreichung von aktiven Verbindungen an einen Patienten
verwendet werden, der diese benötigt.
Zum Beispiel sind die bei der Verabreichung von Krebsmitteln an
Patienten verwendeten Protokolle beschrieben, z.B. in Cancer Chemotherapy:
Principles and Practice, Chabner und Collins, Hrsg., J. B. Lippincott,
(1990) (insbesondere Kapitel 2).
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Die
einzigartige, das Tumorwachstum hemmende Aktivität der Verbindungen der vorliegenden
Erfindung ist unter Verwendung des auf menschliche Tumorerkrankungen
gerichteten 60 Zelllinien-Screens des U.S. National Cancer Institute
(NCl) gezeigt worden, welcher die Anti-Krebs-Aktivität von chemischen
Verbindungen genau vorhersagen kann.
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Der
NCl 60 Zelllinien-Screen für
menschliche Tumoren misst die Fähigkeit
einer Verbindung, verschiedene menschliche Krebsarten selektiv abzutöten oder
ihr Wachstum zu hemmen. Im Allgemeinen weisen in dem NCl-Screen
die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine starke Aktivität gegen
bestimmte Typen von menschlichen soliden Tumoren (z.B. nicht-kleinzelliger
Lungenkrebs, Nierenkrebs und Melanom) und resistente Stämme davon
auf. Durch diese Beobachtungen und mit anderen ausführlichen
Ana lysen der charakteristischen Tumorzellen-Reaktionsprofile kann
gezeigt werden, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung
ein einzigartiges charakteristisches Bioaktivitätsprofil haben.
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Die
neuen Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen
neben ihren wünschenswerten
Löslichkeitseigenschaften
auch starke, das Tumorwachstum hemmende Aktivitäten für eine Reihe von menschlichen
Krebsarten, wie etwa denjenigen, die in dem NCl 60 Zelllinien-Screen
getestet wurden. Zum Beispiel wiesen die Verbindungen 1a-d aus Tabelle
1 oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon alle eine Hemmung des
Tumorwachstums in vitro, insbesondere gegen menschliche Brust-,
Eierstock-, Dickdarm- und Nierenkrebszelllinien auf. Sie zeigten
auch eine das Tumorwachstum hemmende Aktivität gegen bestimmte menschliche
Leukämie-,
nicht-kleinzellige Lungenkrebs- und Melanomzelllinien. Siehe 1a–e.
Für eine
weitere Erläuterung
der das Tumorwachstum hemmenden Aktivität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung
siehe Beispiel 16.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen weiterhin die vorliegende Erfindung,
sollten aber natürlich nicht
so aufgefasst werden, als würden
sie auf irgendeine Weise ihren Umfang beschränken. Die Massenspektrendaten
für die
in den folgenden Beispielen beschriebenen Verbindungen wurden entweder
durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie ("ESI-MS") (Beispiele 1–5) oder
durch Massenspektroskopie mit schnellen Atomstrahlen (Fast Atom
Bombardment Mass Spectrometry ("FABMS")) (Beispiele 6–15 und
18–20) bestimmt.
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel zeigt die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Trihydrobromid
(Ia).
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Zu
einer gerührten
Lösung
von N2,N6-(Dicarbobenzyloxy)-L-lysine
(187 mg, 0,45 mmol) in Tetrahydrofuran (6,0 ml) bei 3°C unter Argon
wurde Oxalylchlorid (41 μl,
0,47 mmol) und N,N-Dimethylformamid (10 μl) zugegeben. Nach 15 Minuten
bei 3°C
wurde eine kalte Lösung
von 5,4'-Diamino-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on
(100 mg, 0,31 mmol) in N,N-Dimethylformamid (2,4 ml) zugegeben.
Das Gemisch wurde 15 Minu ten bei 3°C und anschließend 1,5
Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
zwischen EtOAc (75 ml) und Wasser (10 ml) verteilt. Die Schichten
wurden getrennt und die Wasserschicht wurde mit CH2Cl2 (3×100
ml) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde getrocknet (MgSO4), filtriert und anschließend konzentriert,
um das Rohprodukt zu erhalten. Eine Zweitreaktion wurde durchgeführt und
das Rohmaterial vereinigt und durch Säulenchromatografie an Silicagel
(Stufengradientenelution von 1:1 bis 3:2 EtOAc:Hexan) gereinigt,
wobei 91 mg (20%) gereinigtes Produkt (d.h. 5-Amino-4'-[N2,N6-(dicarbobenzyloxy)-L-lysinamido]-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on,
nachstehend "Produkt
1") erhalten wurden.
Weitere Reaktionen wurden durchgeführt, wobei insgesamt 236 mg
entsprechendes Material erhalten wurden.
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Eine
Lösung
von Produkt 1 (90 mg, 0,13 mmol) in Bromwasserstoff, 30% Gew./Gew.
Lösung
in Essigsäure
(5 ml) wurde 2 Stunden bei Umgebungstemperatur unter Argon gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde mit Et2O (40 ml)
verdünnt,
wobei eine Suspension erhalten wurde, und der Feststoff wurde durch
Zentrifugation isoliert. Der Feststoff wurde mit Et2O
(5 × 15
ml) mittels Zentrifugation gewaschen und anschließend über Argon
und danach 5 Stunden im Vakuum bei Umgebungstemperatur getrocknet,
wobei 80 mg (92%) 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Trihydrobromid
erhalten wurden. Weitere Reaktionen wurden durchgeführt, wobei
insgesamt 113 mg entsprechendes Produkt erhalten wurden.
Berechnet
für C22H26F3N4O3Br3·1,3 H2O, C, 36,98; H, 4,03; N, 7,84; Br, 33,54.
Gefunden:
C, 37,06/36,97; H, 4,08/4,13; N, 7,66/7,59; Br, 32,59.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Dimethansulfonat
(Ia).
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Zu
einer gerührten
Lösung
von N2,N6-(Dicarbobenzyloxy)-L-lysin
(1,94 g, 4,68 mmol) in Tetrahydrofuran (40 ml) bei 0°C unter Argon
wurde Oxalylchlorid (412 μl,
4,72 mmol) und N,N-Dimethylformamid (76 μl) zugegeben. Nach 15 Minuten
bei 0°C
wurde eine kalte Lösung
von 5-Amino-2-(4-amino-3-fluorphenyl)-6,8-difluor-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on
(1,0 g, 3,12 mmol) in N,N-Dimethylformamid (20 ml) dazugegeben.
Das Ge misch wurde 15 Minuten bei 0°C und anschließend 30
Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
zwischen EtOAc (1,0 l) und Wasser (1,0 l) verteilt. Die Schichten
wurden getrennt und die organische Schicht wurde getrocknet, filtriert
und anschließend
konzentriert, wobei das Rohprodukt (4,8 g) erhalten wurde. Insgesamt
wurden 10 × 1
g-Chargen des Aminoflavons hergestellt, wobei insgesamt 49,4 g Material
erhalten wurden, welches das Zwischenprodukt 5-Amino-4'-[N2,N6-(dicarbobenzyloxy)-L-lysinamido]-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on
enthält.
Dieses Material wurde an einer Silicagelsäule (3 kg) chromatografiert,
die in EtOAc/Hexan (3:2) gepackt war, und anschließend mit
EtOAc/Hexan/DMF (60:40:1) eluiert. Fraktionen, die reines Produkt
enthielten, wurden vereinigt, anschließend im Vakuum zu einem Rückstand
konzentriert. Dieses Material wurde mit Et2O
(ungefähr
20 ml) verrieben, wobei 2,8 g (13%) gereinigtes Zwischenprodukt
erhalten wurden, das sich für
die Umwandlung eignet.
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Das
Zwischenprodukt (1,50 g, 2,09 mmol) wurde in Methansulfonsäure (100
ml) gelöst.
Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Während dieser
Zeit traten Farbänderungen
auf und schließlich
bildete sich ein fein verteilter Feststoff. Das Reaktionsgemisch
wurde in EtOAc (500 ml) hineingemischt. Die resultierende Lösung wurde
durch Glasfaserpapier geklärt
und anschließend
im Vakuum zu einem Rückstand
konzentriert. Dieses Material wurde mit Et2O
(700 ml) gerührt.
Nach einer kühlen
Aufbewahrung bei –10°C wurde das
Et2O von einem gummiartigen Feststoff dekantiert
und verworfen. Das feste Material wurde in Methanol (300 ml) gelöst, geklärt, im Vakuum
bis zum Trübungspunkt
konzentriert und anschließend in
Et2O (600 ml) hineingemischt. Das ausgefällte Produkt
wurde durch Zentrifugation gesammelt. Die Verfahrensschritte der
Auflösung
in Methanol, der Etherfällung
und der Sammlung durch Zentrifugation wurden wiederholt. Es wurden
insgesamt 3,25 g Zwischenprodukt auf entsprechende Weise verarbeitet,
wobei 2,6 g (90%) 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Dimethansulfonat
erhalten wurden.
Berechnet für C22H23F3NaO3·2CH3SO3H·H2O, C, 43,76; H, 5,05; N, 8,51; S, 9,74.
Gefunden:
C, 43,45; H, 4,89; N, 8,24; S, 9,90.
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Beispiel 3
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-2-[4-[[2-amino-5-guanidinopentanoyl]amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on-Trihydrobromid
(1b).
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Zu
einer gerührten
Lösung
von Nα,NG,NG'-(Tricarbobenzyloxy)-L-arginin
(5,4 g, 9,4 mmol) in Tetrahydrofuran (60 ml) bei 0°C unter Argon
wurde Oxalylchlorid (875 μl,
10,0 mmol) und N,N-Dimethylformamid (50 μl) zugegeben. Nach 15 Minuten
bei 0°C
wurde eine kalte Lösung
von 5,4'-Diamino-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on
(1,0 g, 3,12 mmol) in N,N-Dimethylformamid (30 ml) zugegeben. Das
Gemisch wurde 15 Minuten bei 0°C
und anschließend
1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
zwischen EtOAc (200 ml) und Wasser (200 ml) verteilt. Die Schichten
wurden getrennt und die Wasserschicht wurde mit CH2Cl2 (5 × 100
ml) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde getrocknet
(MgSO4), filtriert und anschließend konzentriert,
wobei das Rohprodukt erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatografie
an Silicagel (Stufengradientenelution von 1:2 bis 1:1 EtOAc:Hexan)
gereinigt, wobei 93 mg (3%) gereinigtes Produkt (d.h. 5-Amino-4'-[Nα,NG,NG'-(tricarbobenzyloxy)-L-argininamido]-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on,
nachstehend "Produkt
2") erhalten wurden.
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Eine
Lösung
von Produkt 2 (90 mg, 0,10 mmol) in Bromwasserstoff, 30% Gew./Gew.
Lösung
in Essigsäure
(5 ml) wurde 24 Stunden bei Umgebungstemperatur unter Argon gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde mit Et2O (40 ml)
verdünnt,
wobei eine Suspension erhalten wurde, und der Feststoff wurde durch
Zentrifugation isoliert. Der Feststoff wurde mit Et2O
(5 × 20
ml) mittels Zentrifugation gewaschen, anschließend über Argon und anschließend 8 Stunden
im Vakuum bei Umgebungstemperatur getrocknet, wobei 36 mg des Endprodukts erhalten
wurden.
C22H23F3N6O3 =
476 (freie Base). Gefunden: 477,2 (M+H)+.
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Beispiel 4
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 6,8-Difluor-7-methyl-5-(dimethylamino)acetamido-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on
(1d).
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Zu
einer gerührten
Lösung
von 5,4'-Diamino-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on (500 mg, 1,56
mmol) und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) (254 μl, 1,70 mmol)
in Tetrahydrofuran (25 ml) unter Argon wurde eine 2,51 mol/l Lösung von
Chloracetylchlorid in Tetrahydrofuran (640 μl, 1,61 mmol) zugegeben. Nach
1 Stunde Rühren
bei Raumtemperatur wurde weiteres DBU (64 μl) und 2,51 mol/l Chloracetylchlorid
(160 μl)
zugegeben. Nach weiteren 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde mehr
DBU (64 μl)
und 2,51 mol/l Chloracetylchlorid (160 μl) zugegeben. Nach 40 Minuten
bei Raumtemperatur wurde ein letztes Aliquot von DBU und Chloracetylchlorid
zugegeben. Nach 15 Minuten zeigte die DSC, dass die Reaktion vollständig abgelaufen war.
Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und der gummiartige Rückstand
wurde mit Tetrahydrofuran (2 × 20 ml)
gewaschen. Das Filtrat und die damit vereinigten Waschlösungen enthielten
das Rohprodukt 5,4'-Bis(chloracetamido)-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on
(nachstehend "Produkt
3").
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Zu
einer gerührten
Lösung
von Produkt 3 in Tetrahydrofuran (65 ml) wurde Dimethylamingas 5
Minuten lang zugegeben, um eine gesättigte Lösung zu erhalten. Das Gemisch
wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, anschließend konzentriert,
wobei ein gelber Feststoff (0,7 g) erhalten wurde. Der Feststoff
wurde in heißem
EtOAc (300 ml) gelöst
und an einem Silicagelkissen gereinigt. Die Produktfraktionen ergaben
einen gelben Feststoff, welcher mit einem Gemisch aus EtOAc (25
ml) und Hexan (100 ml) verrieben und anschließend saugfiltriert wurde. Der
Feststoff wurde mit Hexan (2 × 25
ml) gewaschen und anschließend
6 Stunden im Vakuum bei 40°C
getrocknet, wobei 330 mg (52%) des Endprodukts erhalten wurden.
C24H25F3N4O4 = 490,2. Gefunden:
491,2 (M+H)+.
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Beispiel 5
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-7-methyl-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on
(1c).
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Zu
einer gerührten
Lösung
von 5,4'-Diamino-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on (1,5 g, 4,68 mmol)
und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) (2961 μl, 19,8 mmol)
in Tetrahydrofuran (150 ml) unter Argon wurde eine 2,51 mol/l Lösung von
Chloracetylchlorid in Tetrahydrofuran (7,5 ml, 18,8 mmol) zugegeben.
Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wurden weiteres DBU (1,7 ml) und
2,51 mol/l Chloracetylchlorid (4,5 ml) zugegeben und das Gemisch
wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
filtriert und der gummiartige Rückstand
wurde mit Tetrahydrofuran (2 × 50
ml) gewaschen. Das Filtrat und die damit vereinigten Waschlösungen enthielten
das Rohprodukt 5-Amino-4'-chloracetamido-7-methyl-6,8,3'-trifluor-4H-1-benzopyran-4-on (nachstehend "Produkt 4").
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Zu
einer gerührten
Lösung
von Produkt 4 (ungefähr
2,2 g, 4,68 mmol) in Tetrahydrofuran (250 ml) wurde Dimethylamingas
10 Minuten lang zugegeben, wobei eine gesättigte Lösung erhalten wurde. Das Gemisch wurde
4,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend zur
Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde
an einer Silicagel-Säule
(180 g, 3 × 25
cm), die mit 15:1 EtOAc:MeOH eluiert wurde, gereinigt, wobei ein
Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde mit Hexan (100 ml)
verrieben, saugfiltriert und 6 Stunden im Vakuum bei 40°C getrocknet,
wobei 1,09 g (47%) des Endprodukts erhalten wurden.
C20H18F3N3O3 = 405,1. Gefunden:
406,0 (M+H)+.
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Beispiel 6
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-2-[4-(aminoacetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on
(1e).
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Zu
einer Lösung
von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-(chloracetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(1,00 g, 2,20 mmol) in Dimethylformamid (50 ml) wur de Natriumazid
(715 mg, 11 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur
gerührt.
Wasser wurde zugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch
Filtration gesammelt, wobei 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-(azidoacetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(1,01 g, 100%) erhalten wurde.
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Zu
einer Suspension der vorstehenden Verbindung (1,00 g, 2,17 mmol)
in Methanol (100 ml) wurde 1 mol/l Kaliumcarbonat (10 ml) zugegeben
und das Gemisch wurde 25 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der
pH wurde mit 1 mol/l HCl auf 7 eingestellt. Wasser wurde zugegeben
und die ausgefällten
Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, wobei 5-Amino-2-[4-(azidoacetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on
(764 mg, 84%) erhalten wurde.
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Zu
einer Lösung
der vorstehenden Verbindung (750 mg, 1,79 mmol) in Ethylacetat (300
ml) und Methanol (150 ml) wurde Palladium auf Holzkohle (10%, 350
ml) zugegeben und das Gemisch wurde 1,5 Stunden unter einem Wasserstoffstrom
bei Raumtemperatur gerührt.
Nachdem der Wasserstoff durch Stickstoff ersetzt worden war, wurde
das Gemisch durch ein Celitekissen filtriert. Das Lösungsmittel
wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand
wurde durch Silicagel-Säulenchromatografie
gereinigt, wobei eine freie Base von 1e (460 mg, 65%) erhalten wurde,
welche in ein Hydrochlorid umgewandelt wurde.
C18H14F3N3O4 = 393. Gefunden: 394 (M+H)+.
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Beispiel 7
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-6,8-difluor-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on
(1f).
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Zu
einer Lösung
von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-(chloracetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(2,02 g, 4,44 mmol) in Dimethylformamid (50 ml) wurden Dimethylamin-hydrochlorid (1,81
g, 22,2 mmol) und Diisopropylethylamin (3,90 ml, 22,4 mmol) zugegeben
und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser
wurde dazugegeben und die ausgefällten
Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, wobei Verbindung 1f
(1,97 g, 96%) erhalten wurde.
C22H20F3N3O5 = 463. Gefunden: 464 (M+H)+.
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Beispiel 8
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-2-[4-(dimethylamino)acetamido-3-fluorphenyl]-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on
(1g).
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Zu
einer Suspension von Verbindung 1f (1,97 g, 4,25 mmol) in Methanol
(135 ml) wurde 1 mol/l Natriumhydroxid (15 ml) zugegeben und das
Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben
und die ausgefällten
Kristalle wurden durch Filtration gesammelt. Eine Reinigung durch
Silicagel-Säulenchromatografie
(9:1 Chloroform/Methanol) ergab eine freie Base von 1g (834 mg,
47%), welche in ein Hydrochlorid umgewandelt wurde.
C20H18F3N3O4 = 421. Gefunden:
422 (M+H)+.
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Beispiel 9
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-[[3-(dimethylamino)propionyl]amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(1h).
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Zu
einer Lösung
von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-amino-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(1,51 g, 4,00 mmol) in Dimethylformamid (40 ml) wurden 3-Brompropionsäure (3,06
g, 20,0 mmol) und 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid
(3,83 g, 20,0 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur
45 Minuten gerührt.
Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert.
Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie
(6:1 Chloroform/Acetat) ergab 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-[(3-brompropionyl)amino]-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on (554
mg, 27%).
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Zu
einer Lösung
der vorstehenden Verbindung (500 mg, 0,975 mmol) in Dimethylformamid
(15 ml) wurden Dimethylamin-hydrochlorid (397 mg, 4,87 mmol) und
Diisopropylethylamin (0,85 ml, 4,88 ml) zugegeben und das Gemisch
wurde 1 Stunde bei 50°C
gerührt.
Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert.
Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie
(20:1 Chloroform/Methanol) ergab 1h (442 g, 95%).
C23H22F3N3O5 = 477. Gefunden:
478 (M+H)+.
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Beispiel 10
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-2-[4-[[3-(dimethylamino)propionyl]amino]-3-fluorphenyl]-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on
(1i).
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Zu
einer Suspension von 1h (400 mg, 0,839 mmol) in Methanol (36 ml)
wurde 1 mol/l Natriumhydroxid (4 ml) zugegeben und das Gemisch wurde
20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben
und die ausgefällten
Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, Eine Reinigung durch
Silicagel-Säulenchromatografie
(9:1 Chloroform/Methanol) ergab eine freie Base von 1i (365 mg,
100%), welche in ein Hydrochlorid umgewandelt wurde.
C21H20F3N3O4 = 435. Gefunden:
436 (M+H)+.
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Beispiel 11
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-6,8-difluor-2-[4-[[4-(dimethylamino)butyryl]amino]-3-fluorphenyl]-4H-1-benzopyran-4-on
(1j).
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Zu
einer Lösung
von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-amino-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(500 mg, 1,32 mmol) in Dimethylformamid (15 ml) wurden 4-Dimethylaminobuttersäure-hydrochlorid (3,06
g, 16,9 mmol) und 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid
(3,23 g, 16,9 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 2,5 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt.
Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert.
Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie
(9:1 Chloroform/Methanol) ergab 1j (386 mg, 60%).
C24H24F3N3O5 = 491. Gefunden:
492 (M+H)+.
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Beispiel 12
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-Amino-6,8-difluor-2-[4-[[4-(dimethylamino)butyryl]amino]-3-fluorphenyl]-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on
(1k).
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Zu
einer Suspension von 1j (363 mg, 0,739 mmol) in Methanol (36 ml)
wurde 1 mol/l Natriumhydroxid (4 ml) zugegeben und das Gemisch wurde
20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben
und die ausgefällten
Kristalle wurden durch Filtration gesammelt. Eine Reinigung durch
Silicagel-Säulenchromatografie
ergab eine freie Base von 1 k (299 mg, 69%), welche in ein Hydrochlorid
umgewandelt wurde.
C22H22F3N3O4 =
449. Gefunden: 450 (M+H)+.
-
Beispiel 13
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 5-(Aminoacetamido)-2-(4-amino-3-fluorphenyl)-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on
(1l).
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Zu
einer Lösung
von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-(chloracetamido)-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(1,16 g, 2,00 mmol) in Dimethylformamid (20 ml) wurde Natriumazid
(650 mg, 10,0 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde bei
Raumtemperatur gerührt.
Wasser wurde dazugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch
Filtration gesammelt, wobei 7-[(Allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-(azidoacetamido)-2-[4-(allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(1,01 g, 100%) erhalten wurde.
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Zu
einer Lösung
der vorstehenden Verbindung (877 mg, 1,49 mmol) in Tetrahydrofuran
(30 ml) wurden Triethylammoniumformiat (1,2 ml, 9,1 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0)
(172 mg, 0,15 mmol) unter Argonatmosphäre zugegeben und das Gemisch
wurde 50 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben
und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine Reinigung
durch Silicagel-Säulenchromatografie
(20:1 Chloroform/Methanol) ergab 5-(Azidoacetamido)-2-(4-amino-3-fluorphenyl)-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on
(560 mg, 90%).
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Zu
einer Lösung
der vorstehenden Verbindung (540 mg, 1,30 mmol) in Ethylacetat (150
ml) und Methanol (50 ml) wurde Palladium auf Holzkohle (10%, 250
ml) zugegeben und das Gemisch wurde 2 Stunden unter einem Wasserstoffstrom
bei Raumtemperatur gerührt.
Nachdem der Wasserstoff durch Stickstoff ersetzt worden war, wurde
das Gemisch durch ein Celitekissen filtriert. Das Lösungsmittel
wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand
wurde durch Silicagel-Säulenchromatografie (9:1:1
Chloroform/Methanol/Ammoniak) gereinigt, wobei eine freie Base von
1l (330 mg, 65%) erhalten wurde, welche in ein Hydrochlorid umgewandelt
wurde.
C18H14F3N3O4 =
393. Gefunden: 394 (M+H)+.
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Beispiel 14
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-(4-Amino-3-fluorphenyl)-5-(dimethylamino)acetamido-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on
(1m).
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Zu
einer Lösung
von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-(chloracetamido)-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(2,12 g, 3,65 mmol) in Dimethylformamid (40 ml) wurden Dimethylamin-hydrochlorid
(1,49 g, 18,3 mmol) und Diisopropylethylamin (3,2 ml, 18 mmol) zugegeben
und das Gemisch wurde 2 Stunden bei 50°C gerührt. Wasser wurde dazugegeben
und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert, wobei 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-(dimethylamino)acetamido-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(2,12 g, 99%) erhalten wurde.
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Zu
einer Lösung
der vorstehenden Verbindung (2,12 mg, 3,60 mmol) in Tetrahydrofuran
(50 ml) wurden Triethylammoniumformiat (2,4 ml, 18 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0)
(419 mg, 0,36 mmol) unter einer Argonatmosphäre zugegeben und das Gemisch
wurde bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt. Wasser wurde dazugegeben
und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine Reinigung
durch Silicagel-Säulenchromatografie
(20:1 Chloroform/Methanol) ergab eine freie Base von 1m (1,05 g,
69%), welche in ein Hydrochlorid umgewandelt wurde.
C20H18F3N3O4 = 421. Gefunden:
422 (M+H)+.
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Beispiel 15
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-[4-Amino-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-5-[3-(dimethylamino)propionyl]amino-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on
(1n).
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Zu
einer Lösung
von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-amino-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(1,00 g, 1,90 mmol) in Dimethylformamid (30 ml) wurden 3-Brompropionsäure (3,04
g, 19,9 mmol) und 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (3,80
g, 19,8 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 8 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt.
Wasser wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert,
wobei ein rohes 2-[4-Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-[(3-brompropionyl)amino]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(1,98 g) erhalten wurde.
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Zu
einer Lösung
der vorstehenden Verbindung (1,98 mg) in Dimethylformamid (20 ml)
wurden Dimethylamin-hydrochlorid (807 mg, 9,90 mmol) und Diisopropylethylamin
(1,7 ml, 9,93 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 7 Stunden bei
50°C gerührt. Wasser
wurde dazugegeben und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert.
Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie
(20:1 Chloroform/Methanol) ergab 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-[[3-(dimethylamino)propionyl]amino]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on.
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Zu
einer Lösung
der vorstehenden Verbindung (688 mg, 1,14 mmol) in Tetrahydrofuran
(20 ml) wurden Triethylammoniumformiat (0,75 ml, 5,7 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0)
(132 mg, 0,11 mmol) unter Argonatmosphäre zugegeben und das Gemisch
wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser wurde dazugegeben
und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Eine Reinigung
durch Silicagel-Säulenchromatografie
ergab eine freie Base von 1n (74 mg, 15%), welche in ein Hydrochlorid
umgewandelt wurde.
C21H20F3N3O4 =
435. Gefunden: 436 (M+H)+.
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Beispiel 16
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die das Tumorwachstum hemmende Aktivität der neuen
Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung, speziell die
Aktivität,
welche 5-Amino-6,8-difluor-2-[3-fluor-4-[(L-lysyl)amino]phenyl]-7-methyl-4H-1-benzopyran-4-on
(Verbindung 1a in Tabelle 1) aufweist.
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Wie
vorstehend erwähnt,
wurden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in dem NCl 60
Zelllinien-Screen getestet. Der NCl 60 Zelllinien-Primärscreen
auf menschliche Tumoren stellt ein Mittel bereit, durch welches
natürliche
Ausgangsmaterialien von Verbindungen identifiziert werden können. Der
NCl-Screen wurde in den Jahren 1985–1990 unter der Leitung, genauen
Prüfung
und Aufsicht von mehreren international zusammengesetzten und namhaften
unabhängigen
(nicht-NCl) Beratungs- und Prüfungsgruppen
entworfen und implementiert, zu denen die NCl Division of Cancer
Treatment's Board
of Scientific Counselors, ein Ad Hoc Expert Review Committee davon,
der National Cancer Advisory Board und das President's Cancer Panel gehören. Siehe
Boyd, In: Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening,
Clinical Trials and Approval, Teicher, B. A., Hrsg., Totowa, N.
J.: Humana Press, Inc., Seiten 23–42 (1997). Wenngleich der
NCl-Screen erst seit 1990 eingesetzt wird, hat er bereits zur Entdeckung,
Entwicklung und klinischen Verwendung von wichtigen neuen Krebsarzneimitteln
bei menschlichen Krebspatienten geführt. Siehe z.B. Weinstein et
al., Science, 275, 343-349
(1997); Grever und Chabner, In: Cancer: Principles und Practice
von Oncology, 5. Auflage, DeVita et al., Hrsg., Philadelphia: Lippincott-Raven,
Seiten 385–394
(1997).
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Der
NCl-Screen besteht aus einer Gruppe von 60 verschiedenen menschlichen
Tumorzelllinien, gegen welche Verbindungen über einen definierten Bereich
von Konzentrationen getestet werden, um den relativen Grad der Wachstumshemmung
oder Cytotoxizität
gegen jede Zelllinie zu bestimmen. Der Aufbau und die Durchführung des
Screens ist so, dass für
jede getestete Verbindung sowohl die absoluten als auch die relativen
Empfindlichkeiten von einzelnen Zelllinien, aus denen der Screen
zusammengesetzt ist, ausreichend reproduzierbar sind, dass ein charakteristisches
Profil oder "Fingerabdruck" der zellulären Reaktion
erzeugt wird. Verbindungen, die in dem NCl-Screen aktiv sind, weisen
ausgeprägte
unterschiedliche, das Tumorwachstum hemmende und/oder zytotoxische
Effekte auf die verschiedenen Zelllinien auf, aus denen die 60 Zelllinien-Gruppe
zusammengesetzt ist. Der Grad der unterschiedlichen Reaktion zwischen
den am meisten und am wenigsten empfindlichen Linien kann typischerweise
relativ klein sein (z.B. 2-10-fach), oder gelegentlich 3–4 Größenordnungen
betragen. Außerdem
können
die Zelllinien in Reaktion auf eine bestimmte Verbindung sehr heterogen
sein oder sie können
vergleichsweise homogen sein, wobei nur relativ wenige Linien eine
größere oder
geringere Empfindlichkeit als der Durchschnitt aufweisen. Ungeachtet
der Größe des Unterschieds
oder des Grades der Heterogenität
der Reaktion der Zelllinien-Gruppe ist es die Reproduzierbarkeit
des Reaktions "Fingerabdrucks", welche für die darin
enthaltene nützliche
Information wichtig ist.
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Eine
ausführliche
Beschreibung des Screening-Assays ist z.B. in Monks et al., J. Natl.
Cancer Inst., 83, 757–766
(1991); Skehan et al., J.Natl. Cancer Inst., 82, 1107–1112 (1990);
und Boyd und Paull, Drug Dev. Res., 34, 484–488 (1995) veröffentlicht.
Die Identitäten,
Ausgangsmaterialien, Herleitung, morphologischen und immunocytochemischen
Kennzeichen und Verfahren zur Aufrechterhaltung der Zelllinien,
aus denen sich die NCl 60 Zelllinien-Gruppe zusammensetzt, sind
z.B. in Boyd, In: Cancer: Principles and Practice of Oncology Updates,
DeVita et al., Hrsg., Philadelphia: Lippincott, Seiten 1–12 (1989);
Stinson et al., Anticancer Res., 12, 1034–1035 (1992) ausführlich beschrieben.
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In
dem Screening-Assay wird jedes Mittel über einen breiten Konzentrationsbereich
gegen jede Zelllinie in der Gruppe getestet. Alle Linien werden
am Tag 0 auf eine Reihe von Standard 96-Napf-Mikrotiterplatten inokuliert,
gefolgt von einer 24-stündigen
Inkubation in Abwesenheit der Testverbindung. Die eingesetzten Inokulationsdichten
hängen
von der jeweiligen Zelllinie und ihren Wachstumseigenschaften ab.
Die verwendeten Inokulationsdichten sind wie in Monks et al., J.
Natl. Cancer Inst., 83, 757–766
(1991); und Boyd und Paull, Drug Dev. Res., 34, 91–109 (1995)
veröffentlicht.
Testverbindungen werden in fünf
10-fachen Verdünnungen bewertet.
Im Anschluss an eine 48-stündige
Inkubation mit der Testverbindung werden die Zellen durch das Sulforhodamin
B-Verfahren getestet, wie es in Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst.,
82, 1107–1112
(1990); Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83, 757–766 (1991);
und Rubinstein et al., J. Natl. Cancer Inst., 82, 1112–1118 (1990)
beschrieben ist. Optische Dichten werden an automatischen Plattenlesegeräten gemessen, gefolgt
von einer computergestützten
Datenerfassung, Verarbeitung, Speicherung und Verfügbarkeit
zur Anzeige und Analyse.
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Jeder
erfolgreiche Test einer Verbindung erzeugt 60 Dosis-Reaktions-Kurven,
welche in dem NCl-Screening-Datenbericht als eine Reihe von zusammengesetzten
Objekten ausgedruckt werden, aus denen sich die Tumor-Typ-Untergruppen
zusammensetzen. Daten für
(eine) beliebige einzelne Zelllinie(n), welche die Qualitätskontrollkriterien
nicht erfüllen
oder anderweitig Mängel
aufweisen für
(eine) beliebige Zelllinie(n), die nicht erfolgreich getestet wurde(n),
werden aus der weiteren Analyse ausgeschlossen und aus dem Screening-Bericht
entfernt.
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Die
Bedeutung und Berechnung von Reaktionsparametern, GI50,
TGI und LC50, und die Konstruktion und Verwendung
von "Mean-Graphs" wird kurz wie folgt
zusammengefasst. Der 50% Wachstumshemmungsparameter (GI50)
ist die Konzentration des Testarzneimittels, bei dem 100×(T-T0)/(C-T0)=50=PG ("prozentuales Wachstum"). Die optische Dichte
des Testnapfs nach dem 48-stündigen
Kontakt mit dem Arzneimittel ist T; die optische Dichte zum Zeitpunkt
Null ist T0; und die optische Dichte der
Kontrolle ist C. Das PG ist ein T/C-artiger Parameter, welcher Werte
von +100 bis –100
aufweisen kann. Während
das GI50 als ein wachstumshemmend wirksamer
Spiegel bzw. ein wachstumshemmendes Wirkungsniveau angesehen werden
kann, bedeutet das TGI eine "vollständige Wachstumshemmung" oder einen cytostatisch
wirksamen Spiegel bzw. ein cytostatisches Wirkungsniveau. Das TGI
ist die Arzneimittelkonzentration, bei der 100×(T-T0)/(C-T)=O=PG.
Die LC50 ist die tödliche Konzentration, "Nettozellabtötung" oder der Cytotoxizitätsparameter.
Es ist die Konzentration, bei der 100×(T-T0)/T0=-50=PG. Die optische Dichte der Kontrolle
wird nicht bei der Berechnung der LC50 verwendet.
Für eine
ausführliche
Beschreibung der Reaktionsparameter und der Konstruktion und Verwendung von
Mean-Graphs, siehe Boyd et al., In: Cytotoxic Anticancer Drugs:
Models And Concepts for Drug Discovery and Development, Valeriote
et al., Hrsg., Amsterdam: Kluwer Academic Publishers, Seiten 11–34 (1992).
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Ein
Mean-Graph ist ein Muster, das durch Auftragen von positiven und
negativen Werten, die als "Delta" bezeichnet werden,
erhalten wird, die aus einem Satz von GI50,
TGI oder LC50-Konzentrationen erzeugt werden,
die für
eine bestimmte, gegen jede Zelllinie in dem NCl in-vitro-Screen
getestete Verbindung erhalten werden. Die Deltas werden aus den
GI50-, TGI- und LC50-Daten
durch eine dreistufige Berechnung erzeugt. Zum Beispiel wird der
GI50-Wert für jede Zelllinie, die erfolgreich
gegen eine bestimmte Verbindung getestet wurde, in ihren log10GI50-Wert umgewandelt.
Der mittlere Gruppen-log10GI50-Wert wird
durch Bilden des Mittelwerts aus den einzelnen log10GI50-Werten erhalten. Jeder log10GI50-Wert wird dann von dem Gruppenmittelwert abgezogen,
um das entsprechende Delta zu erzeugen.
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Um
den Mean-Graph zu konstruieren, werden die Deltas horizontal in
Bezug auf eine senkrechte Linie aufgetragen, welche den berechneten
mittleren Gruppen-GI50 wiedergibt. Die negativen
Deltas werden auf der rechten Seite der Mittelwertbezugslinie aufge tragen,
wodurch sie proportional Zelllinien wiedergeben, die empfindlicher
sind als der berechnete Durchschnitt. Umgekehrt werden die positiven
Deltas auf der linken Seite der Bezugslinie aufgetragen, wo sie
die weniger empfindlichen Zelllinien für das bestimmte Mittel wiedergeben.
So zeigt z.B. ein Balken, der 3 Einheiten auf der rechten Seite
der senkrechten Bezugslinie in einem GI50 Mean-Graph
herausragt, an, dass die GI50-Konzentration
für diese
Zelllinie 1000-fach geringer ist als die gruppengemittelte GI50-Konzentration. Die TGI- und LC50 Mean-Graphs werden entsprechend hergestellt
und interpretiert.
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Drei
weitere Zahlen sind im unteren Teil von jedem der drei jeweiligen
Mean-Graphs abgedruckt. Diese Zahlen sind das MG-MID, das Delta
und der Bereich. Das MG-MID ist der berechnete mittlere Gruppen-GI50, TGI und LC50-Wert.
Das Delta ist die Anzahl von log10-Einheiten,
um die das Delta der empfindlichsten Linie(n) der Gruppe sich von
dem Delta der am wenigsten empfindlichen Linie(n) unterscheidet
bzw. unterscheiden.
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Repräsentative
Mean-Graphs für
verschiedene Verbindungen der vorliegenden Erfindung, welche die Ergebnisse
des Screens zeigen, sind in den 1a–e abgebildet.
Um die Verbindungen zu screenen, wurden zunächst Stammlösungen der Verbindungen in
Dimethylsulfoxid bei 400× der
gewünschten
höchsten Test-Endkonzentrationen
hergestellt und bei –70°C bis zum
Gebrauch aufbewahrt. Die in diesem Beispiel untersuchten höchsten Test-Endkonzentrationen
schwankten zwischen 10–4 und 10–6 molar.
Zur Zeit des Screenings wurde ein Aliquot der aufgetauten Stammlösung mit
vollständigem
Medium, das 50 μg/ml
Gentamycin enthielt, verdünnt,
so dass eine Konzentration von 2× der gewünschten höchsten Test-Endkonzentration
erhalten wurde. Anschließend
wurden weitere vier 10-fach Reihenverdünnungen durchgeführt, um
insgesamt fünf
Konzentrationen bereitzustellen, die einen 4-log10-Konzentrationsbereich
umspannen. 100 μl
Aliquots von diesen Zwischenverdünnungen
wurden sofort zu den geeigneten Mikrotiternäpfen zugegeben, welche jeweils bereits
die geeigneten Anzahlen und Typen von Zellen in 100 μl Kulturmedium
enthielten, was zu den gewünschten
fünf Endkonzentrationen
führte.
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Die
verwendeten 60 Zelllinien und die entsprechenden Inokulationsdichten
waren wie in Boyd und Paull, Drug Dev. Res., 34, 91–109 (1995);
Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83, 757–766 (1991) beschrieben. Im
Anschluss an die Zugaben der Verbindung wurden die Platten 48 Stunden
bei 37°C
unter einer 5% CO2/Luft-Atmosphäre und 100%
Feuchtigkeit inkubiert. Anschließend wurden adhärente Zellen
(alle Linien mit Ausnahme der Leukämiezellen) durch vorsichtige
Zugabe von kalter Trichloressigsäure
(50 μl von
50% Gew./Vol.) in situ fixiert und 60 Minuten bei 4°C inkubiert.
Die Überstände wurden
verworfen und die Platten wurden fünfmal mit entionisiertem Wasser
gewaschen und an der Luft getrocknet. Sulforhodamin B-Lösung wurde
zu jeder Platte zugegeben, gefolgt von einer weiteren Inkubation
während
10 Minuten bei Raumtemperatur. Überschüssiger ungebundener
Farbstoff wurde anschließend
durch 5-maliges Waschen mit 1% Essigsäure, gefolgt von Lufttrocknung,
entfernt. Die gebundene Färbung
in jedem Napf wurde durch Zugabe von 100 μl von 10 mmol/l ungepufferter
Tris-Base gelöst;
darauf folgte eine Bestimmung der optischen Dichten an einem automatischen
Plattenlesegerät.
Für Suspensionszellkulturen
(die Leukämiezellen)
war das Verfahren das gleiche mit der Ausnahme, dass am Ende des
Arzneimittel-Inkubationszeitraums die abgesetzten Zellen in situ
an die Böden
der Mikrotiternäpfe
durch vorsichtige Zugabe von 50 μl
von 80% Trichloressigsäure
fixiert wurden. Geeignete Kontrollnäpfe wurden in das Testplattenformat
aufgenommen, um eine Subtraktion der optischen Hintergrunddichten,
Arzneimittel-Blindprobenkorrekturen und eine Bestimmung der Zelldichten
zum Zeitpunkt 0 (dem Zeitpunkt, zu dem die Verbindungen zugegeben
wurden) zu ermöglichen.
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Wie
z.B. aus 1B hervorgeht, wies die Verbindung
1a eine das Tumorwachstum hemmende Aktivität gegen mehrere menschliche
Krebszelllinien, insbesondere gegen Brust- (z.B. MCF7), Eierstock-
(z.B. OVCAR-5), Nieren- (z.B. CAKI-1) und Dickdarm- (z.B. SW-620) Krebszelllinien
auf.
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Beispiel 17
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die wünschenswerten
Löslichkeitseigenschaften
der Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung. In nachstehender
Tabelle 2 sind die Wasserlöslichkeit
der Verbindungen 1a-d von Tabelle 1 bei verschiedenem pH mit einem
Citrat- oder Phosphatpuffer, wie angegeben, dargelegt. Die Löslichkeit
wurde durch Sichtprüfung
bei einer festgesetzten Konzentration von 5 mg/ml bestimmt.
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Tabelle
2: Löslichkeitsbewertung
von Aminoflavonverbindungen der vorliegenden Erfindung durch Sichtprüfung
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Die
Daten in Tabelle 2 zeigen, dass die Verbindungen 1a, b und d bei
pH 3 vollständig
löslich
waren. Verbindung 1d war auch bei pH 5 vollständig löslich. Wenngleich bei höheren pH-Werten
die meisten der Verbindungen eine verringerte Löslichkeit aufwiesen, bleiben
sie stärker
wasserlöslich
als einige andere 5,4'-Diaminoflavone,
wie 5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon.
Siehe Akama et al., J. Med. Chem., 41, 2056–2067 (1998) (wobei angemerkt
wird, dass die Wasserlöslichkeit
von 5,4'-Diamino-6,8,3'-trifluorflavon weniger
als 0,2 μg/ml beträgt).
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Beispiel 18
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-[4-(chloracetamido)-3-fluorphenyl]-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on.
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Zu
einer Lösung
von 7-(Acetoxymethyl)-5-amino-2-(4-amino-3-fluorphenyl)-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(3,20 g) in Dimethylformamid (60 ml) wurden Monochloressigsäure (1,60
g) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid
(3,23 g) zugegeben und das Gemisch wurde 22 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt.
Wasser wurde dazugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch
Filtration gesammelt, wobei das Endprodukt erhalten wurde.
C20H14 35CIF3N2O5 =
454. Gefunden: 455 (M+H)+.
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Beispiel 19
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-amino-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on.
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Zu
einer Lösung
von 5-Amino-2-(4-amino-3-fluorphenyl)-6,8-difluor-7-(hydroxymethyl)-4H-1-benzopyran-4-on
(1,01 g) in Pyridin (30 ml) wurde Allylchlorformiat (3,2 ml) bei
0°C zugegeben
und das Gemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Wasser
wurde dazugegeben und die ausgefällten
Kristalle wurden durch Filtration gesammelt. Eine Reinigung durch
Silicagel-Säulenchromatografie
(Chloroform) ergab das Endprodukt.
C24H19F3N2O7 = 504. Gefunden: 505 (M+H)+.
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Beispiel 20
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl]-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-(chloracetamido)-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on.
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Zu
einer Lösung
von 2-[4-(Allyloxycarbonyl)amino-3-fluorphenyl)-7-[(allyloxycarbonyl)oxy]methyl-5-amino-6,8-difluor-4H-1-benzopyran-4-on
(2,02 g) in Dimethylformamid (40 ml) wurden Monochloressigsäure (1,90
g) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid
(3,84 g) zugegeben und das Gemisch wurde 8 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt.
Wasser wurde dazugegeben und die ausgefällten Kristalle wurden durch
Filtration gesammelt. Eine Reinigung durch Silicagel-Säulenchromatografie
(9,1 Chloroform/Ethylacetat) ergab das Endprodukt.
C26H20 35CIF3N2O8 =
580. Gefunden: 581 (M+H)+.
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Alle
hier zitierten Literaturstellen einschließlich der Patente, Patentanmeldungen
und Veröffentlichungen
werden hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme in diese Anmeldung
aufgenommen.
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Wenngleich
diese Erfindung mit einer Betonung auf bevorzugten Ausführungsformen
beschrieben wurde, ist dem Fachmann klar, dass Abwandlungen der
bevorzugten Aus führungsformen
verwendet werden können
und dass es beabsichtigt ist, dass die Erfindung anders als in dieser
Anmeldung speziell beschrieben durchgeführt werden kann. Entsprechend
schließt
diese Erfindung alle Modifikationen ein, die innerhalb des Umfangs
der Erfindung liegen, wie er durch die folgenden Ansprüche definiert
ist.