DE60013266T2

DE60013266T2 - Steroidnitrate zur behandlung von oxidativen schädigungen und endothelialer dysfunktion

Info

Publication number: DE60013266T2
Application number: DE60013266T
Authority: DE
Inventors: Piero Del Soldato
Original assignee: Nicox SA
Current assignee: Nicox SA
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2020-04-12
Also published as: US6909007B1; KR20060123788A; PT1169337E; NZ514572A; EP1475386A2; ITMI990751A1; IL145633A0; HUP0201872A2; US7186708B2; CN1916013A; PL350775A1; KR100744701B1; AU2004200263B2; IT1311922B1; PL199579B1; EP1169337B1; AU3820100A; HUP0201872A3; CA2370446A1; EP1475386A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Steroidverbindungen zur systemischen Verwendung und zur nicht-systemischen Verwendung und auf deren Zusammensetzungen, die bei Krankheitsbildern des oxidativen Stresses und/oder Endoltheldysfunktionen zu verwenden sind. Spezifischerweise bezieht sie sich auf Verbindungen mit einer Steroidstruktur, die antiinflammatorische, immundepressive und angiostatische Aktivität (die sogenannten antiinflammatorischen Steroide) oder gastrointestinale Aktivität haben.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen therapeutisch nützliche Resultate bei der Behandlung von Krankheitsbildern, bei denen die Steroidprodukte im allgemeinen hinsichtlich einer besseren Tolerierbarkeit und/oder Wirksamkeit mit größerem Nutzen verwendet werden.
Mit oxidativem Stress ist die Bildung von freien Radikalen oder radikalischen Verbindungen gemeint, die sowohl eine Schädigung der Zelle sowie des umgebenden Gewebes verursachen (Pathophysiology: The biuological basis for disease in adults and children, McCance & Huether 1998, Seiten 48–54).
Mit Endothelialdysfunktionen sind solche gemeint, die das Gefäßendothel betreffen. Die Schädigung des Gefäßendothels ist als eines von solchen wichtigen Events bekannt, die eine Reihe pathologischer Prozesse hervorrufen, welche verschiedene Organe und Körperapparate beeinträchtigen, wie es im folgenden beschrieben wird (Pathophysiology: The biological basis for disease in adults and children, McCance & Huether 1998, Seite 1025).
Wie bekannt ist, stehen oxidativer Stress und/oder Endothelialdysfunktionen mit verschiedenen Pathologien in Verbindung, was später beschrieben wird. Der oxidative Stress kann auch durch Toxizität einer großen Vielzahl von Arzneimitteln verursacht werden, was deren Leistungsfähigkeit deutlich beeinträchtigt.
Diese pathologischen Events haben einen chronischen, schwächenden Charakter und sind bei älteren Personen sehr häufig typisch. Wie bereits gesagt wurde, zeigen die verwendeten Arzneimittel bei diesen pathologischen Zuständen eine deutlich verschlechterte Leistungsfähigkeit.
Beispiele für pathologische Situationen, die durch den oxidativen Stress und/oder durch die Endothelialdysfunktionen verursacht werden oder bei älteren Personen vorkommen, sind die folgenden:

– Für das kardiovaskuläre System: myokardiale und vaskuläre Ischämie im allgemeinen, Bluthochdruck, Schlaganfall, Arteriosklerose, usw.
– Für das Bindegewebe: rheumatoide Arthritis und damit verbundene inflammatorische Krankheiten, usw.
– Für das Lungensystem: Asthma und damit verbundene inflammatorische Krankheiten, usw.
– Für das gastrointestinale System: ulzeröse und nicht-ulzeröse Dyspepsie, Entzündungen des Darms, usw.
– Für das Zentralnervensystem: Alzheimer-Krankheit, usw.
– Für das urogenitale System: Impotenz, Inkontinenz.
– Für das Hautsystem: Ekzeme, Neurodermitis, Akne.
– Infektionskrankheiten im allgemeinen (Ref.: Schwarz-KB, Brady "Oxidative stress during viral infection: A review" Free radical Biol. Med. 21/5, 641–649, 1996).

Ferner kann der Alterungsprozess als ein wahres Krankheitsbild angesehen werden (Ref.: Pathophysiology: The biological basis for disease in adults and children, Seiten 71–77).
Wenn die bekannten Arzneimittel Patienten verabreicht werden, welche Pathologien haben, die mit oxidativem Stress und/oder Endothelialdysfunktionen assoziiert sind, zeigen diese eine geringere Wirksamkeit und/oder eine höhere Toxizität.
Dies trifft z. B. für Steroide zu.
Die Arzneimittelforschung ist auf das Auffinden neuer Moleküle gerichtet, die einen verbesserten therapeutischen Index (Wirksamkeit/Toxizitäts-Verhältnis) oder ein geringeres Risiko/Nutzen-Verhältnis auch für pathologische Zustände, wie die oben genannten, haben, wobei der therapeutische Index für eine ganze Reihe von Arzneimitteln gesenkt werden soll. Tatsächlich zeigen viele Arzneimittel bei den oben genannten Krankheitsbildern des oxidativen Stresses und/oder der Endothelialdysfunktionen eine niedrigere Aktivität und/oder eine höhere Toxizität.
Es ist wohl bekannt, dass Steroide bei der Therapie inflammatorischer Krankheiten die pharmakologische Intervention erster Wahl darstellen. Diese Arzneimittelklasse, für die z. B. Hydrocortison, Cortison, Prednison, Prednisolon, Fludrocortison, Desoxycorticosteron, Metilprednisolon, Triamcino-lon, Paramethason, Betamethason, Dexamethason, Triamcinolonacetonid, Fluocinolon-acetonid, Beclomethason, Acetoxypregnelon, usw., genannt werden können, zeigt deutliche pharmako-toxikologische Wirkungen auf verschiedene Organe und aus diesem Grund verursachen sowohl ihre klinische Verwendung als auch ihr Absetzen eine Reihe von Nebenwirkungen, von denen einige sehr ernst sind. Siehe z. B. Goodman & Gilman, "The pharmaceutical Basis of Therapeutics", 9. Ausg., Seiten 1459–1465, 1996.
Unter diesen toxischen Effekten können die genannt werden, die das Knochengewebe beeinträchtigen, was zu einem veränderten Zellmetabolismus und hohem Auftreten von Osteoporose führt; solche, die das kardiovaskuläre System beeinträchtigen, was zu Bluthochdruck führt; solche, die den gastrointestinalen Apparat beeinträchtigen, was zu Magenschädigungen führt.
Siehe z. B. Martindale "The extrapharmacopoeia", 30. Auflage, Seiten 712–723, 1993.
Zu der Klasse von Steroidarzneimitteln gehören auch Gallensäuren, die bei der Therapie hepatischer Krankheiten und bei Gallenkoliken eingesetzt wurden. Ursodesoxycholsäure wird auch bei einigen hepatischen Dysfunktionen (Leberzirrhose, die ihren Ursprung in der Galle hat, usw.) verwendet. Ihre Tolerierbarkeit wird in Gegenwart gastrointestinaler Komplikationen (chronische Leberschädigung, peptisches Ulkus, Darmentzündung, usw.) stark verschlechtert. Auch im Fall von Gallensäuren beeinträchtigt der oxidative Stress die Arzneimittelleistungsfähigkeit deutlich: sowohl die Leistungsfähigkeit wie auch die Tolerierbarkeit von Chenodesoxycholsäure und Ursodesoxycholsäure werden signifikant verringert. Es wurde insbesondere festgestellt, dass die unerwünschten Wirkungen auf die Leber verstärkt wurden. Unter den Steroidverbindungen können auch Östrogene zur Behandlung von Dislipidämien, Hormonstörungen, zur Behandlung von Tumoren des weiblichen Geschlechtsapparats genannt werden. Auch diese Steroide zeigen Nebenwirkungen, wie sie oben erwähnt wurden, insbesondere auf die Leber.
Nach dem oben genannten Stand der Technik scheint es fast unmöglich, therapeutische Aktivität von Nebenwirkungen zu trennen; siehe Goodman et al., oben genannt, Seite 1474.
Die Steroidverbindungen unterscheiden sich unter dem chemischen pharmakologischen und biochemischen Gesichtspunkt vollständig von den antiinflammortischen Nicht-Steroidverbindungen, da der pharmakotoxikologische Wirkmechanismus von antiinflammatorischen Nicht-Steroidprodukten auf der Inhibierung einer oder mehrerer der Cyclooxygenasen (COX) basiert, während Steroide COX nicht beeinflussen und komplexere pharmako-toxikologische Wirkmechanismen haben, die noch nicht vollständig geklärt sind.
In der Tat ist es gut bekannt, dass diese zwei Gruppen von Arzneimitteln in den Pharmakopoen in verschiedenen Klassen klassifiziert sind.
Es erwachte der Bedarf, verfügbare Steroide zu haben, die eine verbesserte therapeutische Leistungsfähigkeit haben, d. h. denen sowohl eine geringere Toxizität als auch/oder eine höhere Wirksamkeit eigen ist, so dass sie Patienten, die Krankheitsbilder des oxidativen Stresses und/oder Endothelialdysfunktionen haben, verabreicht werden könnten, ohne dass sie die Nachteile der Arzneimittel des Standes der Technik zeigen.
Es wurde nun überraschenderweise und unerwartet gefunden, dass die vorstehend genannten technischen Probleme, die sich bei der Verabreichung von Steroidarzneimitteln an Patienten, die durch oxidativen Stress und/oder Endothelialdysfunktionen beeinträchtigt sind, oder an ältere Personen im allgemeinen zeigen, durch eine neue Klasse von Arzneimittel gelöst werden, wie sie im folgenden beschrieben werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Steroidverbindungen oder ein Salz davon mit der folgenden allgemeinen Formel: A-B-C-N(O)₂ (I)worin:
A = R-, worin R ein Rest eines Steroidarzneimittels, wie er unten definiert wird, ist;
B = -T_B-X₂-T_BI-, worin
T_B und T_BI gleich oder unterschiedlich sind;
T_B = O, S, NH;
T_BI = (CO) oder O;
X₂ eine zweiwertige Brückenbildungsgruppe, z. B. die entsprechende Vorstufe von B ist, die die Formel Z-T_B-X₂-T_BI-Z' hat, worin Z, Z' unabhängig H oder OH sind, ausgewählt aus den folgenden Verbindungen

C der zweiwertige Rest -T_C-Y- ist, worin
T_C für (CO) steht, wenn T_BI Oist,
T_C für O steht, wenn T_BI (CO) ist
Y die folgenden Bedeutungen hat:
– eine lineare oder verzweigte C₁–C₂₀, vorzugsweise C₁–C₆-Alkylenoxygruppe oder ein Cycloalkylen, das 5 bis 7 Kohlenstoffatome hat, wobei ein Kohlenstoffatom oder mehrere Kohlenstoffatome im Cycloalkylenring durch Heteroatome ersetzt sein kann/können, der Ring Seitenketten des R'-Typs haben kann, wobei R' lineares oder verzweigtes C₁–C₂₀ ist;
oder
worin n₃ eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist und n_3' eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist;
worin R_1f = H, CH₃ und nf' eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist;
R die folgende Formel hat:
worin ein Wasserstoff in Position 3 durch ein OH ersetzt ist und ein Wasserstoff in Position 7 durch ein OH ersetzt ist;
R und R' für CH₃ stehen;
R'' für -CH(CH₃)-CH₂-CH₂-CO- steht.
Bevorzugte Verbindungen der Formel (I) sind solche, in denen das Vorstufensteroid ausgewählt ist aus: Ursodesoxycholsäure, Chenodesoxycholsäure.
Am stärksten bevorzugte Verbindungen der Formel (I) sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
3-[4-[(3α,5β,7β)-3,7-dihydroxycolan-24-öloxy]-3-methoxyphenyl]-2-propensäure-4-nitroxybutylester;
3-[4-[(3α,5β,7α)-3,7-dihydroxycolan-24-öloxy]-3-methoxyphenyl]-2-propensäure-4-nitroxybutylester.
Die Vorstufe von B, Z-TB-X2-TBI-Z', worin Z und Z' unabhängig H oder OH sind, entspricht Test 4 oder 5, wobei:
– Test 4 der folgende ist: Er ist eine analytische Bestimmung, die durchgeführt wird, indem Portionen von Methanollösungen der Vorstufe von B mit Konzentrationen von 10^–4 M zu einer Methanollösung von DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl-freies Radikal) gegeben werden; nachdem die Lösung bei Raumtemperatur unter Ausschluss von Licht für 30 min gehalten worden war, wird die Extinktion der Testlösung und einer Lösung, die nur DPPH in der gleichen Menge wie die Testlösung enthält, bei der Wellenlänge von 517 nm abgelesen; dann wird die Inhibierung, die durch die Vorstufe gegenüber einer Radikalerzeugung durch DPPH induziert wird, als Prozentanteil mit Hilfe der folgenden Formel errechnet: (1 – As/Ac)X100worin A_s und A_c jeweils die Extinktionswerte der Lösung, die die Testverbindung + DPPH enthält, und die der Lösung, die nur DPPH enthält, sind; nach diesem Test ist das Akzeptanzkriterium für die Verbindungen das folgende: Test 4 wird durch Vorstufenverbindungen von B bestanden, wenn die prozentuale Inhibierung, wie sie oben definiert ist, 50% oder höher ist;
– Test 5 ist der folgende: Er ist eine analytische Bestimmung, die durchgeführt wird, indem Aliquots von Methanollösungen der Vorstufe von B, wie sie oben definiert ist, mit 10–4 M zu einer Lösung gegeben werden, die durch Vermischen einer 2 mM-Lösung von Desoxyribose in Wasser mit 100 mM Phosphatpuffer und 1 mM des Salzes Fe^II(NH₄)₂(SO₄)₂ gebildet wird, gegeben werden; nachdem die Lösung für 1 h bei 37°C konstant gehalten worden war, wurden Aliquots von wässrigen Lösungen von Trichloressigsäure, 2,8%, und Thiobarbitursäure, 0,5 M, in dieser Reihenfolge zugesetzt, es wird für 15 min bei 100°C erwärmt und die Extinktion der getesteten Lösungen wird dann bei 532 nm abgelesen; die Inhibierung, die durch die Vorstufe von B bezüglich einer Radikalproduktion durch Fe^II induziert wurde, wird als Prozentwert mittels der folgenden Formel errechnet: (1 – As/Ac)X100 worin A_s und A_c die Extinktionswerte der Lösung, die die getestete Verbindung und das Eisensalz enthält, und die der Lösung, die nur das Eisensalz enthält, sind; die Verbindung besteht Test 5, wenn die prozentuale Inhibierung, wie sie oben definiert ist, für die Vorstufe von B, wie sie oben definiert ist, 50% oder höher ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) können in die entsprechenden Salze übergeführt werden. Ein Weg zur Bildung von Salzen ist z. B. der folgende: Wenn in dem Molekül ein Stickstoffatom, das ausreichend basisch ist, um in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril, Tetrahydrofuran, ein Salz zu bilden, vorliegt, wird es mit einer äquimolaren Menge der entsprechenden organischen oder anorganischen Säure umgesetzt.
Beispiele für organische Säuren sind: Oxalsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure.
Beispiele für anorganische Säuren sind: Salpetersäure, Salzsäure, Schwefelsäure, Phopshorsäure.
Unerwarteterweise haben die erfindungsgemäßen Produkte der Formel (I) im Vergleich zu den Vorstufensteroiden einen verbesserten therapeutischen Index bei Krankheitsbildern des oxidativen Stresses. Zur Erläuterung werden die oben beschriebenen Tests auf die folgenden Verbindungen angewendet (siehe die Tabellen, die der Beschreibung angefügt sind):
Test 4 (Test für die Vorstufe von B, Ref.-Tabelle III)
N-Acetylcystein inhibiert die Radikalbildung aus DPPH um 100%; es besteht daher Test 4 und kann als Vorstufe von B eingesetzt werden.
4-Thiazolidincarbonsäure inhibiert die Radikalbildung aus DPPH nicht, sie kann daher Test 4 nicht bestehen: sie kann als Vorstufe von B verwendet werden, wenn sie Test 5 besteht.
Test 5 (Test für die Vorstufe von B)
4-Thiazolidincarbonsäure besteht Test 5, da die Inhibierung 100 ist. Daher kann die Verbindung als Vorstufe von B in Formel (I) verwendet werden.
Die Verbindungen der Erfindung können bei denselben therapeutischen Indikationen des Vorstufenarzneimittels mit den oben genannten Vorzügen verwendet werden.
Die Verbindungen der Formel (I) werden durch Syntheseverfahren hergestellt, die nachfolgend noch beschrieben werden.
Die Auswahl der Reaktionen für jedes Verfahren hängt von der reaktiven Gruppe ab, die in dem Steroidmolekül, in der Vorstufenverbindung von B und in der Vorstufenverbindung von C vorhanden ist.
Die Reaktionen werden nach gut bekannten Verfahren des Standes der Technik durchgeführt, die es ermöglichen, Bindungen zwischen dem Steroid, der Vorstufenverbindung von B und der Vorstufenverbindung von C, wie sie oben definiert sind, zu erhalten.
Wenn die reaktive Funktion des Steroids (z. B. -COOH, -OH) in eine kovalente Bindung, z. B. vom Ester-, Amid-, Ethertyp, involviert ist, kann diese Funktion mit dem bekannten Verfahren des Standes der Technik wieder hergestellt werden.
Im Folgenden werden einige Syntheseschemata zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung beschrieben:
A) Synthese der Verbindungen der Formel (I).
1. Synthese der Verbindung, die durch Reaktion zwischen dem Steroid und der Vorstufenverbindung von B erhalten wird.
1a. Wenn das Steroid eine Carboxylfunktion (allgemeine Formel: R-COOH) enthält und die funktionelle Gruppe der Vorstufenverbindung von B, die selbst an die Carboxylgruppe bindet, die Formel XZ hat, wobei X wie oben definiert ist und Z = H, hängen die durchgeführten Reaktionen von der Natur der zweiten reaktiven Gruppe ab, die in der Vorstufenverbindung von B vorhanden ist.
1a.1 Wenn die zweite reaktive Gruppe, die in der Vorstufenverbindung von B vorliegt, eine Carboxylgruppe ist, erwartet das allgemeine Syntheseschema die anfängliche Bildung des Acylhalogenids des R-COHal-Steroids (Hal = Cl, Br) und die nachfolgende Reaktion mit der HX-Gruppe der Vorstufenverbindung von B: RCOOH → RCOHal + H-X₂-COOH → R-T_B-X₂-COOH (IA.1)X₂, T_B sind wie oben definiert.
Wenn in den zwei Reaktionsverbindungen weitere funktionelle Gruppen COOH und/oder HX vorliegen, müssen sie vor der Reaktion nach Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, geschützt werden; derartige sind z. B. in der Veröffentlichung von Th. W. Greene: "Protective groups in organic Synthesis", Harward University Press, 1980 beschrieben.
Das Acylhalogenid RCOHal wird nach den bekannten Verfahren des Standes der Technik, z. B. durch Thionyl- oder Oxalylchlorid, p^III- oder P^V- Halogenide, in unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmitteln, wie z. B. Toluol, Chloroform, DMF, usw., hergestellt.
Wenn die Gruppe HX der Vorstufenverbindung von B NH₂ oder OH oder SH ist, wird das Steroid der Formel R-COOH spezifischerweise zuerst in das entsprechende Acylhalogenid RCOHal, wie es oben genannt wurde, umgewandelt und dann mit der HX-Gruppe der Vorstufenverbindung von B in Gegenwart einer organischen Base, z. B. Triethylamin, Pyridin, usw., unter Verwendung eines bei den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittels, z. B. Toluol, Tetrahydrofuran, usw., bei einer Temperatur im Bereich von 0°C bis 25°C umgesetzt.
Alternativ zu der vorherigen Synthese kann das Steroid der Formel R-COOH mit einem Agens, das die Carboxylgruppe aktiviert, ausgewählt aus N,N-Carbonyldiimidazol (CDI), N-Hydroxybenzotriazol und Dicyclohexylcarbodiimid, in einem Lösungsmittel, wie z. B. DMF, THF, Chloroform, usw., bei einer Temperatur im Bereich von –5°C bis 50°C behandelt werden; die erhaltene Verbindung wird dann in situ mit der reaktiven Funktion der Vorstufenverbindung von B zum Erhalt der Verbindung der Formel (IA.1) umgesetzt. 1a.2 Wenn die Vorstufenverbindung von B zwei funktionelle Gruppen XZ, die gleich oder voneinander verschieden sind, enthält, wobei X wie oben definiert ist und Z = H, wird das Steroid mit der Formel R-COOH zunächst mit einem Agens, das die Carboxylgruppe aktiviert, wie es oben in 1a.1 beschrieben ist, behandelt und dann mit der Vorstufenverbindung von B, nachdem eine der zwei reaktiven HX-Gruppen, z. B. mit Acetyl oder tert-Butyloxycarbonyl, geschützt worden ist, was die anfängliche Funktion am Ende der Synthese wieder herstellt, behandelt. Das Schema ist das folgende:
worin X, T_B, X₂ wie oben definiert sind und G eine Schutzgruppe der HX-Funktion ist.
2. Nitroxyderivatsynthese
2a1. Wenn die am Ende des vorherigen Schritts 1a. erhaltene Verbindung die Formel (IA.1) hat, kann die Säure in das entsprechende Natriumsalz umgewandelt werden und man kann dann den bekannten Verfahren des Standes der Technik zur Herstellung der Endverbindung folgen, beispielsweise nach einem der vorliegenden Syntheseschemata arbeiten:
worin T_B, X₂, T_BI, T_C wie oben definiert sind, R₄ aus Cl, Br ausgewählt ist, Y wie oben definiert ist, X₁ das freie Radikal Y aus dem Sauerstoffatom ist, R₃ Cl, Br, Iod, OH ist. Wenn R₃ = OH ist, wird die Verbindung der Formel (1A.1b) einer Halogenierung, z. B. mit PBr₃, PCl₅, SOCl₂, PPh₃ + I₂, unterworfen und dann in organischem Lösungsmittel, z. B. Acetonitril, Tetrahydrofuran, mit AgNO₃ umgesetzt. Wenn R₃ Cl, Br, Iod ist, wird die Verbindung der Formel (1A.1b) direkt mit AgNO₃ umgesetzt, wie es oben beschrieben wurde.
worin R₅ = OH oder NHR_1C, R_1C, R₃ und die anderen Symbole wie oben definiert sind.
Wenn X₁ ein lineares C₄-Alkyl ist, wird die entsprechende Säure R-T_B-X₂-COOH mit Triphenylphosphin in Gegenwart eines Halogenierungsmittels, z. B. CBr₄ oder N-Bromsuccinimid, in Tetrahydrofuran umgesetzt, wobei die Verbindung (1A.1c), worin R₃ = Br ist, erhalten wird.
2a.2 Wenn die am Ende des vorherigen Schrittes 1a. erhaltene Verbindung die Formel (IA.2) hat, wird das entsprechende Nitroxyderivat durch Behandeln einer Halogencarbonsäure der Formel Hal-X₁-COOH, worin X₁ wie oben definiert ist, zuerst durch Behandeln mit einem Agens, das die Carboxylgruppe aktiviert, wie es in 1A.1 beschrieben ist, und dann mit der Verbindung der Formel (IA.2), wodurch ein Halogenderivat erhalten wird, welches isoliert und dann in einem organischen Lösungsmittel gelöst wird (siehe Paragraph 2a.1) und mit Silbernitrat behandelt wird, erhalten. Das Gesamtreaktionsschema ist das folgende:
worin T_B, X₂, T_BI, T_C, Y wie oben definiert sind.
Alternativ kann das Halogenid Hal-X₁-COCl verwendet werden, wobei Hal vorzugsweise Brom ist, welches dann mit der Verbindung der Formel (IA.2) reagieren gelassen wird.
1b. Wenn die reaktive Funktion des Steroids -OH (allgemeine Formel: R-OH) ist, können die zwei funktionellen Gruppen, die an der Vorstufenverbindung von B vorhanden sind, die folgenden sein:
1b.1 Eine Carboxylgruppe, die mit der Steroid-OH-Funktion reagiert, und eine HX-Gruppe, wobei die letztere eine reaktive Gruppe der Vorstufenverbindung von B gleich der funktionellen Gruppe des Steroids sein kann oder von dieser verschieden sein kann. Die Formel der Vorstufenverbindung von B gehört zum H-X-X₂-COOH-Typ, worin X und X₂ wie oben definiert sind.
Die H-X-Funktion der Vorstufenverbindung von B wird nach bekannten Verfahren des Standes der Technik geschützt und das Carboxyl wird, wie es oben beschrieben ist, nach dem folgenden Schema umgesetzt:
Am Ende der Reaktion wird die HX-Funktion der Vorstufenverbindung von B wieder hergestellt.
1b.2 Wenn die Vorstufenverbindung von B zwei Carboxylgruppen enthält, wird sie mit einer äquimolaren Menge eines Agens, das die Carboxylgruppe aktiviert, unter den vorher in 1a.1 beschriebenen Bedingungen behandelt und dann mit der reaktiven OH-Funktion des Steroidmoleküls umgesetzt. Mögliche andere reaktive Funktionen des HX-Typs, die in den zwei Verbindungen vorliegen, müssen sorgfältig geschützt werden, wie es vorstehend beschrieben ist. Schließlich wird eine Verbindung der Formel R-T_B-X₂-COOH (1B.2) erhalten.
2b. Nitroxyderivat-Synthese
2b.1 Unter Erhalt des endgültigen Nitroxyderivats, ausgehend von der Verbindung der Formel R-T_B-X₂-X-H (1B.1), erhalten am Ende der in 1b.1 beschriebenen Synthese, wird die Verbindung (1B.1) mit einer Halogensäure der Formel Hal-X₁-COOH, die wie vorstehend in Paragraph 1a.1 beschrieben, be handelt worden war, oder mit dem entsprechenden Halogensäurechlorid umgesetzt, die resultierende Verbindung wird in einem organischen Lösungsmittel, z. B. Acetonitril oder Tetrahydrofuran, gelöst und mit Silbernitrat umgesetzt.
2b.2 Unter Erhalt des endgültigen Nitroxyderivats, ausgehend von der Verbindung der Formel R-T_B-X₂-COOH (1B.2), die am Ende der in 1b.2 beschriebenen Synthese erhalten wurde, wird die Säure in das entsprechende Natriumsalz umgewandelt, dieses wird mit einer R₄-X₁-R₃-Verbindung umgesetzt, die vorher in der Reaktion A. im Schema von Paragraph 2a.1 definiert wurde und nach dem darin beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wodurch das endgültige Nitroxyderivat erhalten wird. Wenn X₁ ein lineares C₄-Alkyl ist, dann wird alternativ die Säure (1B.2) mit Triphenylphosphin in Gegenwart eines Halogenierungsmittels, z. B. CBr₄ oder N-Bromsuccinimid, in Tetrahydrofuran umgesetzt und die resultierende Verbindung, die in einem organischen Lösungsmittel, z. B. Acetonitril, Tetrahydrofuran, gelöst ist, wird mit Silbernitrat umgesetzt.
2b.3 Alternativ zu dem Syntheseverfahren gemäß 1b.1 und 2b.1 ist es möglich, in einem ersten Schritt die HX-Funktion der Vorstufenverbindung von B HX-X₂-COOH mit dem Acylchlorid einer Halogensäure der Formel Hal-X₁-CO-Cl, worin Hal vorzugsweise Br ist, umzusetzen und anschließend die Carboxylfunktion der so erhaltenen Verbindung dem Steroid der Formel R-OH umzusetzen. Im dritten und letzten Schritt wird die Hal-Gruppe durch -ONO₂ nach dem in 2b.1 beschriebenen Verfahren ersetzt. Das Reaktionsschema ist das folgende:
worin T_C, T_BI, T_B, X₂, X₁, Y wie oben definiert sind.
Im vorstehenden Schema kann die Nitrierung alternativ an der Säureverbindung der Formel (2B.3) durchgeführt werden.
Die Zielverbindungen der vorliegenden Erfindung werden zusammen mit üblichen Exzipienzien zu den entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen zur parenteralen, oralen und topischen Verwendung gemäß Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, formuliert; siehe z. B. den Band "Remington's Pharmaceutical Sciences, Ausgabe 15a".
Die Menge der Wirksubstanz, auf Molbasis, ist in diesen Formulierungen dieselbe oder weniger als die, die an entsprechendem Vorstufenarzneimittel verwendet wird.
Die täglich verabreichbaren Dosen sind die von Vorstufenarzneimitteln oder niedriger. Die täglichen Dosen können in Publikationen auf dem Fachgebiet gefunden werden, beispielsweise in "Physician's Desk reference".
Die folgenden Beispiele haben den Zweck, die Erfindung zu erläutern und sind nicht als für dieselbe beschränkend anzusehen.
Beispiel 1
Herstellung von 3-[4-[(3α,5β,7β)-3,7-Dihydroxycolan-24-öloxy]-3-methoxyphenyl]-2-propensäure-4-nitroxybutylester
worin das Vorstufensteroid Ursodesoxycholsäure der Formel (XL) ist, die Vorstufe von B Ferulasäure der Formel (DII) ist:
a) Synthese des 3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propensäure-4-brombutylester
Zu einer Lösung von 3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propensäure (10 g, 51,5 mmol) in THF (400 ml) werden Triphenylphosphin (2,7 g, 10,3 mmol) und Tetrabromkohlenstoff (34,16 g, 10,3 mmol) gegeben und die Lösung wird für 48 h unter Rühren mit einem Magnetrührer bei Raumtemperatur belassen. Der Feststoff wird filtriert und dann bei reduziertem Druck eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt wird durch Chromatographie an Silikagel unter Elution mit n-Hexan/Ethylacetat, 7/3, gereinigt. Es werden 9 g 3-(9-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propensäure-4-brombutylester erhalten. Fp. = 86 bis 98°C.
b) Synthese des 3-[4-[(3α,5β,7β)-3,7-Dihydroxycolan-24-öloxy]-3-methoxyphenyl]-2-propensäure-4-brombutylester
Zu einer Lösung von (3α,5β,7β)-3,7-Dihydroxycolan-24-säure (2,9 g, 7,38 mmol), gelöst in Chloroform (25 ml) und Dimethylacetamid (25 ml), wird 3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propensäure-4-brombutylester (2,73 g, 8,28 mmol) unter Rühren gegeben. Dieser Lösung, die bei 0°C gekühlt wird und unter Rühren erhalten wird, werden N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (2 g, 9,7 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (100 mg, 0,81 mmol) gegeben. Nach 1 Stunde wird das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt, nach 24 Stunden wird das Präzipitat filtriert, das Lösungsmittel wird bei verringertem Druck verdampft. Der Rückstand wird mit Ethylacetat (150 ml) behandelt und mit Wasser (3 × 100 ml) gewaschen. Nachdem die organische Phase mit Natriumsulfat wasserfrei gemacht worden ist, wird das Lösungsmittel verdampft. Das erhaltene Rohprodukt wird durch Chromatographie an einer Silikagelsäule gereinigt, wobei mit n-Hexan/Ethylacetat, 1/9, eluiert wird. Es werden 2,5 g 3-[4-[(3α,5β,7β)-3,7-Dihydroxycolan-24-öloxy]-3-methoxyphenyl]-2-propensäure-4-nitroxybutylester erhalten.
c) Synthese des 3-[4-[(3α,5β,7β)-3,7-Dihydroxycolan-24-öloxy]-3-methoxyphenyl]-2-propensäure-4-nitroxybutylester
Zu einer Lösung von 3-[4-[(3α,5β,7β)-3,7-Dihydroxycolan-24-öloxy]-3-methoxyphenyl]-2-propensäure-4-brombutylester (2,3 g, 3,27 mmol) in Acetonitril (20 ml) und Tetrahydrofuran (5 ml) wird Silbernitrat (0,84 g, 4,94 mmol) unter Rühren gegeben und das Gemisch wird unter Rühren mit einem Magnetrührer für 6 h auf 80°C erwärmt. Wenn die Reaktion vorüber ist, wird das Präzipitat filtriert und das Lösungsmittel verdampft. Das erhaltene Rohprodukt wird durch Chromatographie an einer Silikagelsäule unter Elution mit Methylenchlorid/Ethylacetat, 3/7, gereinigt. Es werden 1,5 g 3-[4-[(3α,5β,7β)-3,7-Dihydroxycolan-24-öloxy]-3-methoxyphenyl]-2-propensäure-4-nitroxybutylester erhalten. Gesamtausbeute 32%.
Elementaranalyse
errechnet: C 66,55% H 8,08% N 2,04%
gefunden: C 66,59% H 8,14% N 1,99%
Beispiel 2
Herstellung von 3-[4-[(3α,5β,7α)-3,7-Dihydroxycolan-24-öloxy]-3-methoxyphenyl]-2-propensäure-4-nitroxybutylester
worin das Vorstufensteroid Chenodesoxycholsäure der Formel (XLI) ist, und die B-Vorstufe Ferulasäure der Formel (DII) ist:
Die Verbindung wird nach dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren hergestellt. Gesamtausbeute 28%.
Elementaranalyse
errechnet: C 66,55% H 8,08% N 2,04%
gefunden: C 66,64% H 8,13% N 1,94%
Pharmakologische Tests
Beispiel
Akute Toxizität
Die akute Toxizität wurde beurteilt, indem an eine Gruppe aus 10 Ratten, die 20 g wogen, eine Einzeldosis jeder der getesteten Verbindungen in einer wässrigen Suspension von 2% G/V Carboxymethylcellulose durch eine Kanüle per os verabreicht wurde.
Die Tiere wurden für 14 Tage unter Beobachtung gehalten. In keinem Tier der Gruppe traten selbst nach Verabreichung einer Dosis von 100 mg pro kg keine toxischen Symptome auf.
Beispiel F1
Experimentelles in vivo-Modell mit N^w-Nitro-L-argininmethylester (L-NAME): Wirkung der Vorstufensteroide und der entsprechenden erfindungsgemäßen Verbindungen auf die durch L-NAME induzierte Endothelialfunktion.
Das entwickelte experimentelle Modell entspricht J. Clin. Investigation 90, 278–281, 1992.
Die Endothelialdysfunktion wird beurteilt, indem die hepatische Schädigung (GPT-Erhöhung) und die Schädigung des vaskulären Endothels oder die kardiovaskuläre Schädigung (Bluthochdruck), die durch L-NAME-Verabreichung induziert wird, bestimmt werden.
Die Tiere (Long Evans-Ratten, durchschnittliches Gewicht 350–450 g) werden in Gruppen eingeteilt, wie es nachfolgend beschrieben wird. Die Gruppe, die L-NAME erhält, wird für 4 Wochen mit der Verbindung, die in einer Konzentration von 400 mg/l in Trinkwasser gelöst ist, behandelt. Die folgenden Gruppen (10 Tiere pro Gruppe) sind wie folgt gebildet:
A) Kontrollgruppen

1. Gruppe: Behandlung: nur Träger (physiologische Lösung),
2. Gruppe: Behandlung: Träger + L-NAME,

B) Gruppen, die mit dem Arzneimittel behandelt wurden

3. Gruppe: Behandlung: Träger + Arzneimittel
4. Gruppe: Behandlung: Träger + Arzneimittel + L-NAME.

Die in dem Test durchgemusterten Arzneimittel sind Chenodesoxycholsäure, Ursodesoxycholsäure und die entsprechenden Derivate gemäß der Erfindung.
In den Rattengruppen, die mit Ursodesoxycholsäure bzw. Chenodesoxycholsäure und den entsprechenden Verbindungen gemäß der Erfindung behandelt wurden, wird die GPT bestimmt.
Jedes Arzneimittel wird auf intraperitonealem Weg einmal am Tag über 4 Wochen verabreicht.
Am Ende der 9 Wochen wird der Zugang zu Wasser verhindert und nach 24 Stunden werden die Tiere getötet.
Die hepatische Schädigung wird durch Beurteilung der Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT-Erhöhung) nach dem Töten bestimmt.
Die Resultate sind in Tabelle II angegeben. Die % Blutdruck- und GPT-Werte werden auf den entsprechenden Wert bezogen, der bei Tiere der ersten Kontrollgruppe gefunden wird.
Die erhaltenen Resultate zeigen, dass die Steroid-Vorstufen eine hepatische Schädigung verursachen (Ursodesoxycholsäure und Chenodesoxycholsäure).
GPT-Werte der behandelten Ratten sind sowohl im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen, die mit dem Arzneimittel in Abwesenheit von L-NAME behandelt wurden, als auch mit den Kontrollen, die mit L-NAME behandelt wurden, höher. Die erfindungsgemäßen Produkte werden im Vergleich zu den entsprechenden Vorstufen selbst bei Tieren, die nicht mit L-NAME vorbehandelt waren, besser toleriert.
Beispiel F2
Test 4
Inhibierung der Radikalproduktion aus DPPH durch einige Substanzen, die zur Herstellung der Vorstufen von B oder B1 verwendet werden.
Das Verfahren basiert auf einem kolorimetrischen Test, in dem DPPH (2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl) als die Verbindung, die Radikale bildet, verwendet wird (M. S. Nenseter et al., Atheroscler. Thromb. 15, 1338–1344, 1995).
Lösungen der getesteten Substanzen mit einer Endkonzentration von 100 μM in Methanol werden zuerst hergestellt. 0,1 ml jeder dieser Lösungen werden zu 1 ml-Aliquots einer 0,1 M Methanollösung von DPPH gegeben und dann wird das Endvolumen auf 1,5 ml gebracht. Nach Lagerung der Lösungen unter Ausschluss von Licht bei Raumtemperatur für 30 min wird die Extinktion bei der Wellenlänge von 517 nm abgelesen. Die Extinktionsabnahme bezüglich der Extinktion einer Lösung, die dieselbe Konzentration an DPPH enthält, wird bestimmt.
Die Wirksamkeit der Testverbindung zur Inhibierung der Erzeugung von Radikalen, auch als Antiradikalaktivität bezeichnet, wird durch die folgende Formel ausgedrückt: (1 – A2/Ac)X100worin A_s und A_c jeweils die Extinktionswerte der Lösung, die die Testverbindung zusammen mit DPPH enthält, und der Testlösung, die nur DPPH enthält, sind.
Die Verbindung, die als Vorstufe von B oder B₁ gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, besteht Test 4, wenn sie die Radikalbildung aus DPPH zu einem Prozentsatz hemmt, der gleich 50% oder höher ist.
In Tabelle III werden die Resultate angegeben, die in diesem Test mit den folgenden Verbindungen erhalten werden: N-Acetylcystein, Cystein, Ferulasäure, (L)-Carnosin, Gentisinsäure, 4-Thiazolidincarbonsäure und 2-Oxo-4-thiazolidincarbonsäure.
Tabelle III zeigt das Folgende:
– N-Acetylcystein, Cystein, Ferulasäure, (L)-Carnosin, Gentisinsäure bestehen Test 4, da sie die Erzeugung von Radikalen, die durch DPPH induziert werden, zu einem Grad von über 50% inhibieren. Daher können sie als Vorstufen der Verbindung B in der Synthese gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
– 4-Thiazolidincarbonsäure und die 2-Oxo-4-thiazolidincarbonsäure bestehen Test 4 nicht, da sie eine Radikalerzeugung aus DPPH nicht inhibieren. Daher können sie als Vorstufen von B oder B₁ verwendet werden, wenn sie Test 5 bestehen.
Beispiel F3
Test 5
Inhibierung der Radikalerzeugung aus Fe^II aus Verbindungen, die als Vorstufen von B, B₁ oder C = -T_c-Y-H verwendet werden.
0,1 ml-Aliquots von 10-⁴ M methanolischen Lösungen von 4-Thiazolidincarbonsäure und 2-Oxo-4-thiazolidincarbonsäure werden zu Teströhrchen gegeben, die eine wässrige Lösung enthalten, welche durch Vermischen von 0,2 ml 2 mM Desoxyribose, 0,4 ml Phosphatpuffer, pH 7,4, 100 mM und 0,1 ml 1 mM Fe^II(NH₄)₂(SO₄)₂ in 2 mM HCl gebildet wurde. Die Teströhrchen werden dann für 1 h bei einer Temperatur von 37°C gehalten. Dann wird in jedes Teströhrchen 0,5 ml einer 2,8%igen Lösung von Trichloressigsäure in Wasser und 0,5 ml einer wässrigen 0,1 M Thiobarbitursäurelösung in dieser Reihenfolge gegeben. Es wird eine Blindprobe hergestellt, indem die obigen 0,1 ml Aliquots der methanolischen Lösungen der Testverbindung durch 0,1 ml Methanol ersetzt werden. Die Teströhrchen werden verschlossen und in einem Ölbad mit 100°C für 15 min erwärmt. Es entwickelt sich eine pinkfarbene Färbung, deren Intensität proportional zur Desoxyribosemenge ist, welche einen radikalischen oxidativen Abbau durchgemacht hat. Die Lösungen werden auf Raumtemperatur gekühlt, und ihre Extinktionen bei 532 nm werden gegen die Blindprobe gelesen.
Die Inhibierung, die durch die Vorstufe von B oder B₁ oder C = -Tc-Y-H (worin die freie Valenz gesättigt ist, wie oben definiert wurde) im Vergleich zur Radikalerzeugung aus Fe^II induziert wird, wird mit Hilfe der folgenden Formel als Prozentwert bestimmt: (1 – As/Ac)X100worin A_s und A_c jeweils die Extinktionswerte der Lösung, die die getestete Verbindung + das Eisensalz enthält, und der Lösung, die nur das Eisensalz enthält, sind.
Die Resultate sind in Tabelle IV angegeben, die zeigt, dass beide Säuren den Test 5 bestehen, da sie die Radikalerzeugung aus Fe^II zu einem Prozentsatz von über 50% inhibieren. Daher können sowohl 4-Thiazolidincarbonsäure als auch 2-Oxo-4-thiazolidincarbonsäure als Vorstufen von B, B₁ oder C = -Tc-Y-H zum Erhalt der Verbindung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Beispiel F5
Beispiel F1 wurde mit drei Rattengruppen wiederholt (jede Gruppe mit 10 Tieren), wobei eine Kontrollgruppe kein L-NAME erhielt und zwei Gruppen L-NAME erhielten, und zwar i.p. wie folgt verabreicht:

a. Kontrollgruppe (erhielt kein L-NAME): der Träger (physiologische Lösung),
b. erste Gruppe, die L-NAME erhält (Gruppe d – Vergleichsgruppe), und zwar gleichzeitig verabreicht mit 100 mg/kg (0,25 mmol/kg) Ursodesoxycholsäure + 49,5 mg/kg (0,25 mmol/kg) Ferulasäure in dem selben oben genannten Träger,
c. zweite Gruppe, die L-NAME erhält (Gruppe e), verabreicht mit 175 mg/kg (0,25 mmol/kg) des erfindungsgemäßen Ursodesoxycholsäurederivats (Referenzbeispiel 1) in dem selben oben genannten Träger.

In diesem Experiment wurde die hepatische Tolerierbarkeit, d.h. der Anstieg der GPT (hepatische Schädigung) in den Tiergruppen d und e bestimmt und als Prozentwerte bezüglich der Kontrollgruppe a, die als 100% gesetzt wurde, ausgedrückt.
Die Resultate sind in Tabelle VI angegeben und zeigen, dass das der Gruppe d (Vergleichsgruppe) verabreichte Gemisch bei den Tieren eine höhere GPT-Zunahme induzierte als die erfindungsgemäße Verbindung (Gruppe e). Tabelle II
Tabelle III
Tabelle IV
Tabelle VI

Claims

Steroidverbindung oder ein Salz davon mit der folgenden allgemeinen Formel: A-B-C-N(O)₂ (I),worin: A = R-, worin R ein Rest eines Steroidarzneimittels, wie er unten definiert wird, ist; B = -TB-X₂-T_BI-, worin T_B und T_BI gleich oder unterschiedlich sind; T_B = O, S, NH; T_BI = (CO) oder O; X₂ eine zweiwertige Brückenbildungsgruppe, z. B. die entsprechende Vorstufe von B, ist, die die Formel Z-T_B-X₂-T_BI-Z' hat, worin Z, Z' unabhängig H oder OH sind, ausgewählt aus den folgenden Verbindungen:

C der zweiwertige Rest -T_c-Y- ist, worin T_c für (CO) steht, wenn T_BI 0 ist, T_c für O steht, wenn T_BI (CO) ist; Y die folgenden Bedeutungen hat: – eine lineare oder verzweigte C₁–C₂₀-Alkylenoxygruppe oder ein Cycloalkylen, das 5 bis 7 Kohlenstoffatome hat, wobei ein Kohlenstoffatom oder mehrere Kohlenstoffatome im Cycloalkylenring durch Heteroatome ersetzt sein kann/können, der Ring Seitenketten des R'-Typs haben kann, wobei R' lineares oder verzweigtes C₁–C₂₀- ist; oder
worin n₃ eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist und n₃, eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist;
worin R_1f = H, CH₃ und nf' eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist; R die folgende Formel hat:
worin ein Wasserstoff in Position 3 durch ein OH ersetzt ist und ein Wasserstoff in Position 7 durch ein OH ersetzt ist; R und R' für CH₃ stehen; R'' für -CH(CH₃)-CH₂-CH₂-CO- steht.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y eine lineare oder verzweigte Alkylenoxygruppe ist.
Verbindungen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Vorstufensteroid aus Ursodesoxycholsäure, Chenodesoxycholsäure ausgewählt ist.
Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 3-[4-[(3α,5β,7β)-3,7-Dihydroxycolan-24-öloxy]-3-methoxyphenyl]-2-propensäure-4-nitroxybutylester; 3-[4-[(3α,5β,7α)-3,7-Dihydroxycolan-24-öloxy)-3-methoxyphenyl]-2-propensäure-4-nitroxybutylester.
Verbindungen oder Salze nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung von Verbindungen und Salzen nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von oxidativem Stress.
Pharmazeutische Formulierung, die als Wirkstoff die Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 4 oder deren Salze enthält.