ES2226805T3

ES2226805T3 - Esterpodes nitrados para el tratamiento de las alteraciones causadas por oxidantes y el disfuncionamiento endotelial.

Info

Publication number: ES2226805T3
Application number: ES00917075T
Authority: ES
Inventors: Piero Del Soldato
Original assignee: Nicox SA
Current assignee: Nicox SA
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2020-04-11
Also published as: AU766798B2; US20070142342A1; AU3820100A; PT1169337E; AU2004200263A1; MXPA01010212A; SI1169337T1; DE60013266D1; JP2002542162A; TR200102929T2; CA2586538C; KR20010108489A; EP1475386A3; RU2240325C2; CA2586538A1; EP1169337A2; EP1169337B1; HUP0201872A2; IT1311922B1; PL350775A1

Abstract

Un compuesto esteroideo o una sal del mismo que tiene la siguiente fórmula general: A - B - C - N(O)2 (I) en la que: A = R-, donde R es un radical de fármaco esteroideo como se ha definido previamente en este documento, B = -TB-X2-TBI- donde, TB y TBI son iguales o diferentes; TB = O, S, NH; TBI = (CO) u O; X2 es un grupo de enlace bivalente tal como el precursor correspondiente de B, de fórmula Z-TB-X2-TBI-Z¿ en donde Z, Z¿ son independientemente H u OH, se seleccionan entre los siguientes compuestos: C es el radical bivalente -Tc-Y- donde Tc es (CO) cuando TBI es 0, Tc es 0 cuando TBI es (CO); Y tiene los siguiente significados: - un grupo alquilenoxi C1-C20 lineal o ramificado o un cicloalquileno con 5 a 7 átomos de carbono, en el anillo cicloalquilénico uno o más átomos de carbono pueden sustituirse con heteroátomos, el anillo puede tener cadenas laterales de tipo R¿, siendo R¿ un C1-C20 lineal o ramificado o donde n3 es un entero de 0 a 3 y n3 es un número entero de 1 a 3. donde R1f =H, CH3, y nf¿ es un número entero de 1 a 6; R tiene la siguiente fórmula: en la que un hidrógeno de la posición 3 se sustituye con un OH y un hidrógeno en la posición 7 se sustituye con un OH; R y R¿ son CH3; R¿¿ es -CH(CH3)-CH2-CH2-CO-.

Description

Esteroides nitrados para el tratamiento de las alteraciones causadas por oxidantes y el disfuncionamiento endotelial.

Compuestos farmacéuticos.

La presente invención se refiere a nuevos compuestos esteroideos para uso sistémico y a sus composiciones, para su uso en afecciones de estrés oxidativo y/o disfunciones endoteliales. Específicamente, se refiere a compuestos con una estructura esteroidea que tienen actividad antiinflamatoria, inmunodepresora y angiostática (los denominados esteroides antiinflamatorios), o actividad gastrointestinal.

Los compuestos de acuerdo con la presente invención resultan terapéuticamente útiles en el tratamiento de afecciones mórbidas en las que los productos esteroideos se usan generalmente con mayor beneficio, en términos de mejor tolerabilidad y/o eficacia.

El término estrés oxidativo significa la generación de radicales libres o compuestos radicálicos, que causan lesión de la célula y del tejido circundante (Pathophysiology: the biological basis for disease in adults and children, McCance & Huether 1998, páginas 48-54).

Disfunciones endoteliales son aquellas que están relacionadas con el endotelio vascular. El daño en el endotelio vascular se conoce por ser uno de los sucesos importantes que pueden provocar una serie de procesos patológicos que afectan a distintos órganos y aparatos del cuerpo, como se describe a continuación en este documento (Pathophysiology: the biological basis for disease in adults and children, McCance & Huether 1998, página 1025).

Como se conoce, el estrés oxidativo y/o las disfunciones endoteliales están asociados a distintas patologías como se describe a continuación en este documento. El estrés oxidativo puede estar provocado también por la toxicidad de una amplia diversidad de fármacos, lo que afecta de forma significativa a su rendimiento.

Dichos eventos patológicos tienen un carácter crónico, debilitante y son habitualmente típicos de los ancianos. Como se ha indicado anteriormente, los fármacos usados en dichas afecciones patológicas muestran un rendimiento notablemente reducido.

Algunos ejemplos de situaciones causadas por el estrés oxidativo y/o por disfunciones endoteliales, o presentes en ancianos, son las siguientes:

- En el sistema cardiovascular: isquemia del miocardio y vascular en general, hipertensión, apoplejía, arterioesclerosis, etc.

- En el tejido conectivo: artritis reumatoide y enfermedades inflamatorias relacionadas, etc.

- En el sistema pulmonar: asma y enfermedades inflamatorias relacionadas, etc.

- En el sistema gastrointestinal: dispepsias ulcerosas y no ulcerosas, enfermedades inflamatorias intestinales, etc.

- En el sistema nervioso central: enfermedad de Alzheimer, etc.

- En el sistema urogenital: impotencia, incontinencia.

- En el sistema cutáneo: eczema, neurodermatitis, acné.

- Las enfermedades infecciosas en general (ref.: Schwarz-KB Brady "Oxidative stress during viral infection: A review" Free radical Biol. Med. 21/5, 641-649 1996).

Además, el proceso de envejecimiento puede considerarse como una afección patológica (ref. Pathophysiology: the biological basis for disease in adults and children, páginas 71-77).

Cuando se administran fármacos conocidos a pacientes que tienen patologías asociadas con estrés oxidativo y/o disfunciones endoteliales, muestran una menor eficacia y/o mayor toxicidad.

Esto sucede por ejemplo con esteroides.

La investigación sobre fármacos se dirige al descubrimiento de nuevas moléculas con un mejor índice terapéutico (relación eficacia/toxicidad) o una menor relación riesgo/beneficio, también para afecciones patológicas como las mencionadas anteriormente, en las que se reduce el índice terapéutico de un gran número de fármacos. De hecho, en las afecciones mencionadas anteriormente de estrés oxidativo y/o disfunciones endoteliales, muchos fármacos muestran una menor actividad y/o una mayor toxicidad.

Se conoce que los esteroides representan la primera opción de intervención farmacológica en la terapia de enfermedades inflamatorias. Esta clase de fármacos, entre los que se pueden mencionar la hidrocortisona, cortisona, prednisona, prednisolona, fludrocortisona, desoxicorticoesterona, metilprednisolona, triamcinolona, parametasona, betametasona, dexametasona, acetonida de triamcinolona, acetonita de fluocinolona, beclometasona, acetoxipregnelona, etc., provoca efectos farmaco-toxicológicos destacables en distintos órganos y, por esta razón, su uso clínico y su interrupción provoca una serie de efectos secundarios, algunos de los cuales son muy graves. Véase, por ejemplo, Goodman & Gilman "The pharmaceutical Basis of Therapeutics" 9º ed., páginas 1459-1465, 1996.

Entre dichos efectos tóxicos pueden mencionarse aquellos que afectan al tejido óseo que conducen a un metabolismo celular alterado y una alta incidencia de osteoporosis; aquellos que afectan al sistema cardiovascular, generando una respuesta de hipertensión; aquellos que afectan al aparato gastrointestinal provocando lesiones gástricas.

Véase, por ejemplo, Martindale "The extrapharmacopeia", 30º ed., páginas 712-723, 1993.

Los ácidos biliares también pertenecen a la clase de fármacos esteroideos y se han usado en la terapia de trastornos hepáticos y en cólicos bililares. El ácido ursodesoxicólico también se usa en algunas disfunciones hepáticas (cirrosis hepática de origen biliar, etc.). Su tolerabilidad empeora fuertemente en presencia de complicaciones gastrointestinales (lesión hepática crónica, úlcera péptica, inflamación intestinal, etc.). En el caso de ácidos biliares, el estrés oxidativo también afecta de forma significativa el rendimiento del fármaco: se reducen significativamente la eficacia y la tolerabilidad del ácido quenodesoxicólico y ursodesoxicólico. En particular, se exageran los efectos no deseados sobre el hígado. Entre los compuestos esteroideos también pueden mencionarse los estrógenos para el tratamiento de dislipidemias, trastornos hormonales, tratamiento de tumores en el aparato femenino. Dichos esteroides también muestran efectos secundarios como los mencionados anteriormente, en particular a nivel hepático.

De acuerdo con la técnica anterior mencionada previamente parece casi imposible separar la actividad terapéutica de los efectos secundarios, véase Goodman y col., mencionado anteriormente, en pág. 1474.

Los compuestos esteroideos son completamente diferentes de los compuestos antiinflamatorios no esteroideos desde el punto de vista farmacológico y bioquímico, ya que el mecanismo de acción fármaco-toxicológico de los productos antiinflamatorios no esteroideos se basa en la inhibición de una o más ciclooxigenasas (COX), mientras que los esteroides no influyen sobre la COX y tienen unos mecanismos de acción farmaco-toxicológicos más complejos que todavía no comprenden completamente.

De hecho, se conoce que estos dos grupos de fármacos se clasifican en distintas clases en las farmacopeas.

Se apreciaba la necesidad de disponer de esteroides con un mejor rendimiento terapéutico, es decir, provistos de una menor toxicidad y/o mayor eficacia, de forma que pudiesen administrarse a pacientes en condiciones mórbidas de estrés oxidativo y/o disfunciones endoteliales sin mostrar las desventajas de los fármacos de la técnica anterior.

Ahora se ha descubierto sorprendente e inesperadamente que los problemas técnicos mencionados anteriormente mostrados en la administración de fármacos esteroideos a pacientes afectados por estrés oxidativo y/o disfunciones endoteliales, o a pacientes ancianos en general, se solucionan con una nueva clase de fármacos como se describe a continuación en este documento.

La presente invención se refiere a compuestos esteroideos o una sal de los mismos que tienen la siguiente fórmula general:

(I)A - B - C - N(O)2

en la que:

A = R-, donde R es un radical de fármaco esteroideo como se ha definido previamente en este documento,

B = -TB-X2-TBI- donde,

TB y TBI son iguales o diferentes;

TB = O, S, NH;

TBI = (CO) u O;

X2 es un grupo de enlace bivalente tal como el precursor correspondiente de B, de fórmula Z-TB-X2-TBI-Z' en donde Z, Z' son independientemente H u OH, se seleccionan entre los siguientes compuestos:

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C es el radical bivalente -T_{c}-Y- donde

T_{c} es (CI) cuando T_{BI} es 0, Tc es 0 cuando T_{BI} es (CO);

Y tiene los siguiente significados:

- un grupo alquilenoxi C_{1}-C_{20} lineal o ramificado, preferiblemente C_{1}-C_{6}, o un cicloalquileno con 5 a 7 átomos de carbono, en el anillo cicloalquilénico uno o más átomos de carbono pueden sustituirse con heteroátomos, el anillo puede tener cadenas laterales de tipo R', siendo R' un C_{1}-C_{20} lineal o ramificado o

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donde n_{3} es un número entero de 0 a 3 y n_{3} es un número entero de 1 a 3,

--

--- (

\delm{C}{\delm{\para}{R _{1f} }}

H --- CH_{2} --- O)_{nf'} --- ;

--

--- (CH_{2} ---

\delm{C}{\delm{\para}{R _{1f} }}

H --- O)_{nf'} ---

donde R_{1f} = H, CH_{3}, y nf' es un número entero de 1 a 6;

R tiene la siguiente fórmula:

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en la que un hidrógeno de la posición 3 se sustituye con un OH y un hidrógeno en la posición 7 se sustituye con un OH;

R y R' son CH_{3};

R'' es -CH(CH_{3})-CH_{2}-CH_{2}-CO-.

Los compuestos preferidos de fórmula (I) son aquellos en los que el precursor esteroide se selecciona entre: ácido ursodesoxicólico y ácido quenodesoxicólico.

Los compuestos más preferidos de fórmula (I) se seleccionan entre el grupo compuesto por:

éster 4-nitroxibutílico del ácido 3-[4-[(3\alpha,5\beta,7\beta)-3,7-dihidroxicolan-24-oiloxi]-3-metoxifenil]-2-propenoico;

éster 4-nitroxibutílico del ácido 3-[4-[(3\alpha,5\beta,7\alpha)-3,7-dihidroxicolan-24-oiloxi]-3-metoxifenil]-2-propenoico.

El precursor de B, Z-TB-X2-TBI-Z' en el que Z y Z' son independientemente H u OH, cumple los ensayos 4 ó 5.

siendo el ensayo 4 el siguiente: es una determinación analítica realizada añadiendo porciones de soluciones de metanol del precursor de B a concentraciones 10-4 M, a una solución en metanol de DPPH (2,2-difenil-1-picril)hidracilo - radical libre); después de haber mantenido la solución a temperatura ambiente alejada de la luz durante 30 minutos, se lee la absorbancia a longitud de onda 517 nm de la solución de ensayo y la de una solución que contiene solo DPPH en la misma cantidad que en la solución del ensayo; y después se calcula la inhibición inducida por el precursor de la producción de radical por DPPH en forma de porcentaje por medio de la siguiente fórmula:

(1 - A_{s}/A_{c}) \ X \ 100

en la que A_{s} y A_{c} son respectivamente los valores de absorbancia de la solución que contiene el compuesto de prueba + DPPH y la de la solución que contiene solo DPPH; el criterio de aceptación de los compuestos de acuerdo con esta prueba es el siguiente: el ensayo 4 es superado por los compuestos precursores B si el porcentaje de inhibición como se ha definido anteriormente es mayor o igual que 50%;

- siendo el ensayo 5 el siguiente: es una determinación analítica realizada añadiendo alícuotas de soluciones de metanol 10^{-4}M del precursor B, como se ha definido anteriormente, a una solución formada mezclando una solución 2 mM de desoxiribosa en agua con 100 mM de tampón fosfato y 1 mM de la sal Fe^{II} (NH_{4})_{2}(SO_{4})_{2}; después de haber termofijado la solución a 37ºC durante una hora, se añaden alícuotas de soluciones acuosas de ácido tricloroacético al 2,8% y de ácido tiobarbitúrico 0,5M, en orden, y se efectúa un calentamiento a 100ºC durante 15 minutos y después se lee la absorbancia de las soluciones ensayadas a 532 nm; la inhibición inducida por el precursor de B con respecto a la producción de radical de Fe^{II} se calcula en forma de porcentaje por medio de la siguiente fórmula:

(1 - A_{s}/A_{c}) \ X \ 100

en la que A_{s} y A_{c} son respectivamente los valores de absorbancia de la solución que contiene el compuesto de ensayo y la sal de hierro y la de la solución que contiene solo la sal de hierro; el compuesto supera el ensayo 5 cuando el porcentaje de inhibición como se ha definido anteriormente es mayor o igual que 50%;

Los compuestos de acuerdo con la presente invención de fórmula (I) pueden transformarse en las sales correspondientes. Por ejemplo, una forma de formar sales es la siguiente: cuando en la molécula hay presente un átomo de nitrógeno suficientemente básico para ser salificado, en disolvente orgánico tal como por ejemplo acetonitrilo o tetrahidrofurano, se hace reaccionar con una cantidad equimolar del correspondiente ácido orgánico o inorgánico.

Algunos ejemplos de ácidos orgánicos son: ácido oxálico, tartárico, maleico, succínico, cítrico.

Algunos ejemplos de ácidos inorgánicos son: ácido nítrico, clorhídrico, sulfúrico, fosfórico.

Inesperadamente, los productos de la invención de fórmula (I) en condiciones de estrés oxidativo tienen un mejor índice terapéutico en comparación con los esteroides precursores.

Para propósitos ilustrativos, los ensayos mencionados anteriormente se refieren a los siguientes compuestos (véase las tablas adjuntas a la descripción).

Ensayo 4

(Ensayo para el precursor de B, ref. Tabla III)

La N-acetilcisteína inhibe el 100% de la producción radicálica de DPPH, por lo tanto supera el ensayo 4 y puede usarse como precursor de B.

El ácido 4-tiazolidincarboxílico no inhibe la producción radicálica de DPPH, por lo tanto no supera el ensayo 4: puede usarse como precursor de B si supera el ensayo 5.

Ensayo 5

(Ensayo para el precursor de B)

El ácido 4-tiazolidincarboxílico cumple el ensayo 5 ya que la inhibición es de 100%. Por lo tanto, el compuesto puede usarse como precursor de B en la fórmula (I).

Los compuestos de la invención pueden usarse con las mismas indicaciones terapéuticas del fármaco precursor con las ventajas mencionadas anteriormente.

Los compuestos de fórmula (I) se preparan con métodos de síntesis mencionados anteriormente en este documento.

La selección de la reacción en cada método depende del grupo reactivo presente en la molécula esteroide, en el compuesto precursor de B y en el compuesto precursor de C.

Las reacciones se realizan con métodos conocidos en la técnica anterior que permiten obtener enlaces entre el esteroide, el compuesto precursor de B y el compuesto precursor de C como se ha definido anteriormente.

Cuando la función reactiva del esteroide (por ejemplo -COOH, -OH) está implicada en un enlace covalente, por ejemplo de tipo éster, amida o éter, dicha función puede recuperarse con los métodos conocidos en la técnica anterior.

A continuación se presentan algunos esquemas de síntesis para obtener compuestos de la invención:

A) Síntesis de compuestos de fórmula (I) 1. Síntesis del compuesto obtenido por reacción entre el esteroide el compuesto precursor de B

1a. Cuando el esteroide contiene una función carboxílica (fórmula general: R-COOH) y el grupo funcional del compuesto precursor de B que se une a la función carboxílica tiene la fórmula XZ, siendo X como se ha definido anteriormente y Z = H, las reacciones efectuadas dependen de la naturaleza del segundo grupo reactivo presente en el compuesto precursor de B.

1a.1 Cuando el segundo grupo reactivo presente en el compuesto precursor de B es un grupo carboxílico, el esquema general de síntesis espera la formación inicial del haluro de acilo del esteroide R-COHal (Hal = Cl, Br) y la reacción posterior con el grupo HX del compuesto precursor de B:

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siendo X_{2} y T_{B} como se han definido anteriormente.

Cuando en los dos compuestos de reacción hay presentes otros grupos funcionales COOH y/o HX, deben protegerse antes de la reacción de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica anterior; por ejemplo, como los descritos en la publicación de Th. W. Greene: "Protective groups in organic synthesis", Harvard University Press, 1980.

El haluro de acilo RCOHal se prepara de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica anterior, por ejemplo, con cloruro de tionilo u oxalilo, haluros de P^{III} o P^{IV} en disolventes inertes en las condiciones de reacción tales como por ejemplo tolueno, cloroformo, DMF, etc.

Específicamente, cuando el grupo HX del compuesto precursor de B es NH_{2} u OH o SH, el esteroide de fórmula R-COOH se transforma primero en el haluro de acilo RCOHal correspondiente como se ha mencionado anteriormente y después se hace reaccionar con el grupo HX del compuesto precursor de B en presencia de una base orgánica tal como trietilamina, piridina, etc. usando un disolvente inerte en las condiciones de reacción tal como tolueno, tetrahidrofurano, etc. a una temperatura en el intervalo de 0ºC-25ºC.

Alternativamente a la síntesis previa, el esteroide de fórmula R-COOH puede tratarse con un agente que activa el grupo carboxilo seleccionado entre N,N'-carbonildiimidazol (CDI), N-hidroxibenzotriazol y diciclohexilcarbodiimida en un disolvente tal como, por ejemplo, DMF, THF, cloroformo, etc. a una temperatura en el intervalo de -5ºC - 50ºC y el compuesto obtenido se hace reaccionar in situ con la función reactiva del compuesto precursor de B para obtener el compuesto de fórmula (IA.1).

1a.2 Cuando el compuesto precursor de B contiene dos grupos funcionales XZ, iguales o diferentes entre sí, siendo X como se ha definido anteriormente y Z = H, el esteroide de fórmula R-COOH se trata primero con un agente que activa el grupo carboxilo, como se ha descrito anteriormente en 1a.1 y después con el compuesto precursor de B, después de haber protegido uno de los dos grupos reactivos HX, por ejemplo, con acetilo o terc-butoxicarbonilo, se recupera la función inicial al final de la síntesis. El esquema es el siguiente:

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donde X, T_{B}, X_{2} son como se han definido anteriormente y G es un grupo protector de la función HX.

2. Síntesis del nitroxiderivado

2a.1 Cuando el compuesto obtenido al final de la etapa previa 1a. tiene fórmula (IA.1), el ácido puede transformarse en la correspondiente sal sódica y después se pueden seguir los métodos de la técnica anterior para preparar el compuesto final, por ejemplo, de acuerdo con uno de los siguientes esquemas de reacción:

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donde T_{B}, X_{2}, T_{BI}, T_{c} son como se han definido anteriormente, R_{4} se selecciona entre Cl, Br, Y es como se ha definido anteriormente, X_{2} es el radical libre Y del átomo de oxígeno, R_{3} es Cl, Br, Yodo, OH. Si R_{3} = OH el compuesto de fórmula (1A.1b) se somete a halogenación, por ejemplo con PBr_{3}, PCl_{5}, SOCl_{2}, PPh_{3} + I_{2} y después se hace reaccionar con AgNO_{3} en un disolvente inorgánico tal como acetonitrilo, tetrahidrofurano. Si R_{3} es Cl, Br, Yodo, el compuesto de fórmula (1A.1b) reacciona directamente con AgNO_{3} como se ha mencionado anteriormente.

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donde R_{5} = OH o NHR_{1C}, R_{1C}, R_{3} siendo los demás símbolos como se han definido anteriormente.

Cuando X_{1} es un alquilo C_{4} lineal, el ácido R-T_{b}-X_{2}-COOH correspondiente se hace reaccionar con trifenilfosfina en presencia de un agente halogenante tal como CBr_{4} o N-bromosuccinimida en tetrahidrofurano obteniendo el compuesto (1A.1c) en el que R_{3} = Br.

2a.2 Cuando el compuesto obtenido al final de la etapa anterior 1a tiene fórmula (IA.2), el nitroxiderivado correspondiente se obtiene tratando un ácido halógeno-carboxílico de fórmula Hal-X_{1}-COOH, siendo X_{1} como se ha definido anteriormente, primero con un agente que activa el grupo carboxílico como se describe en 1A.1 y después con el compuesto de fórmula (IA.2), obteniendo un derivado halógeno, que se aísla y después se disuelve en un disolvente orgánico (ref. párrafo 2a.1) y se trata con nitrato de plata. El esquema de reacción global es el siguiente:

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donde T_{B}, X_{2}, T_{BI},T_{c} e Y son como se han definido anteriormente.

Como alternativa, puede usarse el haluro Hal-X_{1}COCl, donde Hal es preferiblemente bromo, que se hace reaccionar con el compuesto de fórmula (IA.2).

1b. Cuando la función reactiva del esteroide es -OH (fórmula general: R-OH), los dos grupos funcionales presentes en el compuesto precursor de B pueden ser los siguientes:

1b.1 Un grupo carboxílico, que reacciona con la función esteroide OH y un grupo HX, siendo el último grupo reactivo del compuesto precursor B igual o diferente del grupo funcional esteroide. La fórmula del compuesto precursor de B es del tipo H-X-X_{2}-COOH, donde X y X_{2} son como se han definido anteriormente.

La función H-X- del compuesto precursor de B se protege de acuerdo con los métodos de la técnica anterior y el carboxilo se hace reaccionar, como se ha mencionado anteriormente, de acuerdo con el siguiente esquema:

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Al final de la reacción se recupera la función HX del compuesto precursor de B.

1b.2 Cuando el compuesto precursor de B contiene dos grupos carboxílicos, se trata con una cantidad equimolar de un agente que activa el grupo carboxilo en las condiciones descritas previamente en 1a.1 y después se hace reaccionar con la función reactiva OH de la molécula esteroide. Otras posibles funciones reactivas de tipo HX presentes en los dos compuestos deben protegerse cuidadosamente como se ha mencionado previamente. Finalmente se obtiene un compuesto de fórmula R-T_{B}-X_{2}-COOH (1B.2).

2b. Síntesis del nitroxiderivado

2b.1 Para obtener el nitroxiderivado final partiendo del compuesto de fórmula R-T_{b}-X_{2}-X-H (1B.1), obtenido al final de la síntesis descrita en 1b.1, el compuesto (1B.1) se hace reaccionar con un halogenácido de fórmula Hal-X_{1}-COOH que se ha tratado como se ha descrito previamente en el párrafo 1a.1 o con el correspondiente cloruro de halogenácido, el compuesto resultante se disuelven en disolvente orgánico, por ejemplo acetonitrilo o tetrahidrofurano y reacciona con nitrato de plata.

2b.2 Para obtener el nitroxiderivado final partiendo del compuesto de fórmula R-T_{3}-X_{2}-COOH (1B.2), obtenido al final de la síntesis descrita en 1b.2, el ácido se transforma en la correspondiente sal sódica, se hace reaccionar con un compuesto de fórmula R_{4}-X_{2}-R_{3}, definido previamente en el esquema de reacción A del párrafo 2a.1, obteniendo de acuerdo con el mismo proceso mencionado el nitroxiderivado final. Como alternativa, cuando X_{2} es un alquilo lineal C_{4}, el ácido (1B.2) se hace reaccionar con trifenil-fosfina en presencia de un agente halogenante tal como CBr_{4} o N-bromosuccinimida en tetrahidrofurano y el compuesto resultante se disuelve en un disolvente orgánico por ejemplo acetonitrilo, tetrahidrofurano, se hace reaccionar con nitrato de plata.

2b.3 Como alternativa al proceso de síntesis de acuerdo con 1b.1 y 2b.1, es posible hacer reaccionar en una primera etapa la función HX del compuesto precursor de B HX-X_{2}-COOH con el cloruro de acilo de un halogenácido de fórmula Hal-X_{1}-CO-Cl donde Hal es preferiblemente Br y posteriormente la función carboxílica del compuesto así obtenido con el esteroide de fórmula R-OH. En la tercera y última etapa, el grupo Hal se sustituye con -ONO_{2} de acuerdo con el proceso descrito en 2b.1. El esquema de reacción es el siguiente:

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donde T_{c}, T_{BI}, T_{3}, X_{2}, X_{1}, Y son como se han definido anteriormente.

En el esquema anterior, la nitración puede realizarse alternativamente sobre el compuesto ácido de fórmula (2B.3).

Los compuestos objeto de la presente invención se formulan en las correspondientes composiciones farmacéuticas para uso parenteral, oral y tópico de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, junto con los excipientes habituales; véase, por ejemplo, el volumen "Remington's Pharmaceutical Sciences 15a Ed.".

La cantidad en base molar de principio activo en estas formulaciones es la misma, o menor, en comparación con la usada con el fármaco precursor correspondiente.

Las dosis diarias administrables son las de los fármacos precursores o en su caso menores. Las dosis diarias pueden encontrarse en las publicaciones del campo, tales como por ejemplo "Physician's Desk Reference".

Los siguientes ejemplos tienen el propósito de ilustrar la invención y no deben considerarse como limitantes de la misma.

Ejemplo 1 Preparación de éster 4-nitroxibutílico del ácido 3-[4-[(3\alpha,5\beta,7\beta)-3,7-dihidroxicolan-24-oiloxi]-3-metoxifenil]-2-propenoico

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donde el esteroide precursor es ácido ursodesoxicólico de fórmula (XL), el precursor de B es ácido ferúlico de fórmula (DII):

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a) Síntesis del éster 4-bromobutílico del ácido 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-2-propenoico

A una solución de ácido 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-2-propenoico (10 g, 51,5 mmoles) en THF (400 ml), se le añaden trifenilfosfina (2,7 g, 10,3 mmoles) y tetrabromuro de carbono (34,16 g, 10,3 mmoles) y la solución se deja a temperatura ambiente, con agitación magnética, durante 48 horas. El sólido se filtra y después se evapora a presión reducida. El producto bruto obtenido se purifica por cromatografía en gel de sílice eluyendo con n-hexano/acetato de etilo 7/3. Se obtienen 9 g de éster 4-bromobutílico del ácido 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-2-propenoico. Pf = 86-89ºC.

b) Síntesis del éster 4-bromobutílico del ácido 3-[4-[(3\alpha,5\beta,7\beta)-3,7-dihidroxicolan-24-oiloxi]-3-metoxifenil]-2-propenoico

A una solución de ácido (3\alpha,5\beta,7\beta)-3,7-dehidroxicolan-24-oico (2,9 g, 7,38 mmoles) disuelto en cloroformo (25 ml) y dimetilacetamida (25 ml), se le añade éster 4-bromobutílico del ácido 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-2-propenoico (2,73 g, 8,28 mmoles) con agitación. A la solución refrigerada a 0ºC, mantenida con agitación, se le añaden N,N'-diciclohexilcarbodiimida (2 g, 9,7 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (100 mg, 0,81 moles). Después de 1 hora, la mezcla se calienta a temperatura ambiente, después de 24 horas el precipitado se filtra, el disolvente se evapora a presión reducida. El residuo se trata con acetato de etilo (150 ml) y se lava con agua (3 x 100 ml). Después de secar la fase orgánica con sulfato sódico, el disolvente se evapora. El producto en bruto obtenido se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con n-hexano/acetato de etilo 1/9. Se obtienen 2,5 g de éster 4-bromobutílico del ácido 3-[4-[(3\alpha,5\beta,7\beta)-3,7-dihidroxicolan-24-oiloxi]-3-metoxifenil]-2-propenoico

c) Síntesis del éster 4-nitroxibutílico del ácido 3-[4-[(3\alpha,5\beta,7\beta)-3,7-dihidroxicolan-24-oiloxi]-3-metoxifenil]-2-propenoico

A una solución de éster 4-bromobutílico del ácido 3-[4-[(3\alpha,5\beta,7\beta)-3,7-dihidroxicolan-24-oiloxi]-3-metoxifenil]-2-propenoico (2,3 g, 3,27 mmoles) en acetonitrilo (20 ml) y tetrahidrofurano (5 ml) se le añade nitrato de plata (0,85 g, 4,49 mmoles) con agitación y la mezcla se calienta a 80ºC con agitación magnética durante 6 horas. Cuando la reacción finaliza, el precipitado se filtra y el disolvente se evapora. El producto bruto obtenido se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno/acetato de etilo 3/7. Se obtienen 1,5 g de éster 4-nitroxibutílico del ácido 3-[4-[(3\alpha,5\beta,7\beta)-3,7-dihidroxicolan-24-oiloxi]-3-metoxifenil]-2-propenoico. Rendimiento total 32%.

Análisis Elemental
Calculado	C	66,55%	H	8,08%	N	2,04%
Encontrado	C	66,59%	H	8,14%	N	1,99%

Ejemplo 2 Preparación de éster 4-nitroxibutílico del ácido 3-[4-[(3\alpha,5\beta,7\alpha)-3,7-dihidroxicolan-24-oiloxi]-3-metoxifenil]-2-propenoico

21

donde el esteroide precursor es ácido quenodesoxicólico de fórmula (XLI) y el precursor de B es ácido ferúlico de fórmula (DII):

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El compuesto se prepara siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Rendimiento total 28%.

Análisis Elemental
Calculado	C	66,55%	H	8,08%	N	2,04%
Encontrado	C	66,64%	H	8,13%	N	1,94%

Ensayos farmacológicos Ejemplo Toxicidad Aguda

La toxicidad aguda se ha evaluado administrando a un grupo de 10 ratas con un peso de 20 g una única dosis de cada uno de los compuestos ensayados, mediante cánula, por os en una suspensión acuosa de carboximetilcelulosa al 2% p/v.

Los animales se mantienen en observación durante 14 días. En ningún animal del grupo aparecieron síntomas tóxicos ni siquiera después de una administración de una dosis de 100 mg/kg.

Ejemplo F1

Modelo experimental in vivo con N^{w}-nitro-L-arginina-metil éster (L-NAME): efecto de los esteroides precursores y de los compuestos correspondientes de acuerdo con la presente invención sobre la disfunción endotelial inducida con L-NAME.

El modelo experimental adoptado corresponde a J. Clin. Investigation 90, 278-281, 1992.

La disfunción endotelial se evalúa determinando la lesión hepática (aumento GPT) y la lesión del endotelio vascular o cardiovascular (hipertensión sanguínea) inducida por la administración de L-NAME.

Los animales (ratas Long Evans, peso medio 350-350 g) se dividen en grupos como se describe a continuación. El grupo que recibe L-NAME se trata durante 4 semanas con dicho compuesto disuelto a una concentración de 400 mg/litro en el agua para beber. Se constituyen los siguientes grupos (10 animales por grupo):

A) Grupos de control:

1º grupo: tratamiento: solo vehículo (solución fisiológica),

2º grupo: tratamiento: vehículo + L-NAME

B) Grupos tratados con el fármaco:

3º grupo: tratamiento: vehículo + fármaco

4º grupo: tratamiento: vehículo + fármaco + L-NAME.

Los fármacos seleccionados en el ensayo son ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico y los correspondientes derivados de acuerdo con la presente invención.

En aquellos grupos de ratas tratadas, respectivamente, con ácido ursodesoxicólico y ácido quenodesoxicólico y con los correspondientes compuestos de acuerdo con la presente invención, se determina la GPT.

Cada fármaco se administra por vía intraperitoneal una vez al día durante 4 semanas.

Al final de las cuatro semanas se evita el acceso al agua y después 24 horas los animales se sacrifican.

El daño hepático se determina mediante la evaluación de la transaminasa glutámica-pirúvica (aumento de GPT) después del sacrificio.

Los resultados se proporcionan en la Tabla II. El porcentaje de presión sanguínea y los valores de GPT hacen referencia al valor correspondiente encontrado en los animales del primer grupo de control.

Los resultados obtenidos muestran que los precursores esteroideos causan daño hepático (ácido ursodesoxicólico y ácido quenodesoxicólico).

Las GPT de las ratas tratadas son mayores comparadas con los grupos correspondientes tratados con fármaco en ausencia de L-NAME y con los controles tratados con L-NAME. Los productos de la invención a su vez se toleran mejor en comparación con los precursores correspondientes, incluso en animales no pretratados con L-NAME.

Ejemplo F2

Ensayo 4

Inhibición de la producción de radical de DPPH de algunas sustancias usadas para preparar los precursores de B o B1

El método se basa en un ensayo colorimétrico en el cual se usa DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidracilo) como radicales que forman compuesto (M.S. Nenseter y col., Atheroscler. Thromb. 15, 1338-1344, 1995).

Se preparan inicialmente soluciones en metanol de las sustancias ensayadas a una concentración final de 100 \muM. Se añaden 0,1 ml de cada una de estas soluciones a alícuotas de 1 ml de una solución de metanol 0,1M de DPPH y después se lleva el volumen final hasta 1,5 ml. Después de haber almacenado las soluciones a temperatura ambiente alejadas de la luz durante 30 minutos, se lee la absorbancia a una longitud de onda de 517 nm. Se determina la reducción de la absorbancia con respecto a la absorbancia de una solución que contiene la misma concentración de DPPH.

La eficacia del compuesto de prueba para inhibir la producción de radicales, o dicho de otra forma la actividad antiradical, se expresa mediante la siguiente fórmula:

(1 -A_{s}/A_{c}) \ X \ 100

en la que A_{s} y A_{c} son respectivamente los valores de absorbancia de la solución que contiene el compuesto de prueba + DPPH y la de la solución que contiene solo DPPH.

El compuesto que será usado como precursor de B o B_{1} de acuerdo con la presente invención supera el ensayo 4 si inhibe la producción de radical de DPPH en un porcentaje igual o mayor que 50%.

En la Tabla III se proporcionan los resultados obtenidos en dicho ensayo con los siguientes compuestos: N-acetilcisteína, cisteína, ácido ferúlico, (L)-carnosina, ácido gentísico, ácido 4-tiazolidin-carboxílico y ácido 2-oxo-4-tiazolidincarboxílico.

La Tabla III muestra los siguientes resultados:

- La N-acetilcisteína, cisteína, ácido ferúlico, (L)-carnosina, y el ácido gentísico superan el ensayo 4 ya que inhiben la producción de radicales inducida por DPPH en un porcentaje mayor de 50%. Por lo tanto pueden usarse como precursores del compuesto B en la síntesis de los compuestos de acuerdo con la presente invención.

- El ácido 4-tiazolidin-carboxílico y el ácido 2-oxo-4-tiazolidincarboxílico no superan el ensayo 4 ya que no inhiben la producción de radical de DPPH. Por lo tanto pueden usarse como precursores de B o B_{1} si superan el ensayo 5.

Ejemplo F3

Ensayo 5

Inhibición de la producción de radicales de Fe^{II} de compuesto usados como precursores de B, B_{1}, o C = -T_{c}-Y-H

Se añaden alícuotas de 0,1 ml de soluciones metanólicas 10^{-4} M de ácido 4-tiazolidin carboxílico y ácido 2-oxo-4-tiazolidin carboxílico a tubos de ensayo que contienen una solución acuosa formada mezclando 0,2 ml de desoxiribosa 2 mM, 0,4 ml de tampón fosfato pH 7,4 100 mM y 0,1 ml de Fe^{II} (NH_{4})_{2}(SO_{4})_{2} en HCl 2 mM. Los tubos de ensayo se mantienen a una temperatura de 37ºC durante una hora. Después se añaden a cada tubo 0,5 ml de una solución al 2,8% en ácido tricloroacético en agua y 0,5 ml de una solución acuosa 0,1M de ácido tiobarbitúrico en ese orden. Se constituye un blanco de referencia sustituyendo los alícuotas de 0,1 ml anteriores de las soluciones metanólicas del compuesto de prueba con 0,1 ml de metanol. Los tubos se cierran y se calientan en un baño de aceite a 100ºC durante 15 minutos. Se desarrolla una coloración rosa cuya intensidad es proporcional a la cantidad de desoxiribosa que experimenta degradación oxidativa radicálica. Los soluciones se enfrían a temperatura ambiente y se leen sus absorbancias a 532 nm frente al blanco.

La inhibición inducida por el precursor de B o B_{2} o C = -T_{c}-Y-H (donde la valencia libre se satura como se ha definido anteriormente) con respecto a la producción de radical de Fe^{II} se determina en forma de porcentaje por medio de la siguiente fórmula:

(1 -A_{s}/A_{c}) \ X \ 100

en la que A_{s} y A_{c} son respectivamente los valores de absorbancia de la solución que contiene el compuesto ensayado + sal de hierro y la de la solución que contiene solo sal de hierro.

Los resultados se presentan en la Tabla IV, que muestra que ambos ácidos superan el ensayo 5 ya que inhiben la producción de radical de Fe^{II} en un porcentaje mayor de 50%. Por lo tanto, el ácido 4-tiazolidin carboxílico y el ácido 2-oxo-4-tiazolidin carboxílico pueden usarse como precursores de B, B_{1}, C = -T_{c}-Y-H para obtener compuestos de la presente invención.

Ejemplo F5

El ejemplo F1 se repitió con tres grupos de ratas (cada grupo de diez animales), un grupo de control que no recibe L-NAME y dos grupos que reciben L-NAME y se les administra i.p. como se indica a continuación:

a. grupo de control (no recibe L-NAME): vehículo (solución fisiológica),

b. 1^{er} grupo que recibe L-NAME (grupo d - comparativa) administrado al mismo tiempo con 100 mg/kg (0,25 mmoles/kg) de ácido ursodesoxicólico * 49,5 mg/kg (0,25 mmoles/kg) de ácido ferúlico en el mismo vehículo.

c. 2º grupo que recibe L-NAME (grupo e) administrado con 175 mg/kg (0,25 mmoles/kg) del derivado ursodesoxicólico de acuerdo con la invención (ref. ej. 1) en el mismo vehículo anterior.

En este experimento se determinó la tolerabilidad hepática, es decir, el aumento de GPT (daño hepático) en los animales de los grupos d y e y se expresó en forma de porcentajes asumiendo que los del grupo de control a son el 100%

Los resultados se presentan en la Tabla IV y muestran que la mezcla administrada al grupo d (comparativa), indujo en los animales un mayor aumento de GPT que el compuesto de la invención (grupo e).

TABLA II

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TABLA III

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TABLA IV

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TABLA VI

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Claims

1. Un compuesto esteroideo o una sal del mismo que tiene la siguiente fórmula general:

(I)A - B - C - N(O)_{2}

en la que:

B = -T_{B}-X_{2}-T_{BI}- donde,

T_{B} y T_{BI} son iguales o diferentes;

T_{B} = O, S, NH;

T_{BI} = (CO) u O;

X_{2} es un grupo de enlace bivalente tal como el precursor correspondiente de B, de fórmula Z-T_{B}-X_{2}-T_{BI}-Z' en donde Z, Z' son independientemente H u OH, se seleccionan entre los siguientes compuestos:

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C es el radical bivalente -T_{c}-Y- donde

T_{c} es (CO) cuando T_{BI} es 0, T_{c} es 0 cuando T_{BI} es (CO);

Y tiene los siguiente significados:

- un grupo alquilenoxi C_{1}-C_{20} lineal o ramificado o un cicloalquileno con 5 a 7 átomos de carbono, en el anillo cicloalquilénico uno o más átomos de carbono pueden sustituirse con heteroátomos, el anillo puede tener cadenas laterales de tipo R', siendo R' un C_{1}-C_{20} lineal o ramificado o

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donde n_{3} es un entero de 0 a 3 y n_{3} es un número entero de 1 a 3.

--

--- (

\delm{C}{\delm{\para}{R _{1f} }}

H --- CH_{2} --- O)_{nf'} --- ;

--

--- (CH_{2} ---

\delm{C}{\delm{\para}{R _{1f} }}

H --- O)_{nf'} ---

donde R_{1f} = H, CH_{3}, y nf' es un número entero de 1 a 6;

R tiene la siguiente fórmula:

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R y R' son CH_{3};

R'' es -CH(CH_{3})-CH_{2}-CH_{2}-CO-.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que Y es un grupo alquileniloxi C_{1}-C_{6} lineal o ramificado.

3. Los compuestos de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 en los que el precursor esteroide se selecciona entre: ácido ursodesoxicólico, ácido quenodesoxicólico.

4. Un compuesto seleccionado entre el grupo compuesto por:

5. Compuestos o sales de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 para usar como un medicamento.

6. El uso de compuestos o sales de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 para la preparación de fármacos para el tratamiento del estrés oxidativo.

7. Una formulación farmacéutica que contiene como principio activo los compuestos de las reivindicaciones 1-4 o sus sales.