DE60004904T2

DE60004904T2 - Verfahren zur Herstellung von Polyguluronsäuren

Info

Publication number: DE60004904T2
Application number: DE2000604904
Authority: DE
Inventors: A. William Suwa-shi Marritt
Original assignee: Seiko Epson Corp
Current assignee: Seiko Epson Corp
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2020-02-25
Also published as: EP1035136B1; JP2000248001A; DE60004904D1; EP1035136A1; US6586589B1; ATE248862T1; JP4186294B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von Polyguluronsäuren, die einen Polymerisationsgrad von weniger als 20 aufweisen und im Wesentlichen frei von einer Mannuronsäureverunreingung sind.
Stand der Technik
Von Polyguluronsäuren wird wegen ihrer hohen Affinität für Calciumionen erwartet, dass sie als Kesselsteinverhütungsmittel und Mittel zum Entfernen von Kesselsteinablagerungen brauchbar sind. Die biologische Abbaubarkeit von Polyguluronsäuren macht sie im Hinblick auf die Umweltverträglichkeit und die Abfallbeseitigung besonders wertvoll. Außerdem sind Polyguluronsäurederivate, in denen ein hydrophobes Polymer an das reduzierende Ende der Polyguluronsäure kovalent gebunden ist, als Dispergiermittel in wässrigen Tintenzusammensetzungen mit dispergierten Pigmenten zur Verwendung beim Tintenstrahldrucken brauchbar. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Polyguluronsäuren mit niedrigen Polymerisationsgraden eine das Wurzelwachstum fördernde Aktivität bei Gerste aufweisen (M. Natsume et al., "Isolation and Characterization of Alginatederived Oligosaccharides with Root-Growth Promoting Activities", Carbohydrate Research, 258, 187–197 (1994)). Es wurde auch gezeigt, dass sie eine die Keimung und das Schösslingswachstum fördernde Aktivität in ungeschältem Reis und Tabakkallus aufweisen (Y. Yonemoto et al., "Promotion of Germination and Shoot Elongation of Some Plants by Alginate Oligomers Prepared with Bacterial Alginate Lyase", Journal of Fermentation and Bioengineering, 75, 68–70 (1993)). Auf der Grundlage von Untersuchungen von anderen Polyuronsäuren könnte man auch erwarten, dass Polyguluronsäuren mit niedrigem Molekulargewicht antivirale, antitumorale und die Pflanzenabwehr stimulierende Aktivitäten aufweisen.
Alginsäuren, aus denen Polyguluronsäuren erhalten werden können, sind unverzweigte Polymere von 1 → 4 verknüpfter α-L-Guluronsäure (G) und β-D-Mannuronsäure (M) mit variierenden Anteilen und variierender Sequenz. Eine typische Struktur eines Alginsäuremoleküls kann schematisch wie folgt wiedergegeben werden:
Wie man aus der vorstehenden Struktur ersehen kann, ist die Verteilung von Monomeren in Alginaten nicht statistisch und es gibt keine regelmäßige Wiederholungseinheit. Alginsäuren werden am besten als Blockcopolymere beschrieben, in denen es Polyguluronsäuresequenzen (G-Blöcke), Polymannuronsäuresequenzen (M-Blöcke) und Sequenzen, die statistische Anordnungen sowohl von Guluronsäure als auch von Mannuronsäure enthalten, (MG-Blöcke) gibt.
Es ist wohlbekannt, dass Alginate, welche Salze von Alginsäure sind, hydrolysiert werden können und dass die Hydrolyseprodukte in zwei überwiegend homopolymere Fraktionen, Polyguluronsäure und Polymannuronsäure aufgetrennt werden können. Das am häufigsten zitierte Verfahren für die Herstellung des Natriumsalzes von Polyguluronsäure ist ein heterogenes saures Hydrolyseverfahren, das in A. Haug et al., "Studies on the Sequence of Uronic Acid Residues in Alginic Acid", Acta Chemica Scandinavica, 21, 691–704 (1967) offenbart ist. Die darin beschriebene saure Hydrolyse erfordert, dass ein Teil Natriumalginat in zwanzig Teilen 0,3 M Chlorwasserstoffsäurelösung suspendiert wird. Da Alginsäure in der stark sauren Lösung unlöslich ist, ist die Hydrolyse eine heterogene Reaktion. Das heterogene Gemisch wird 10+ Stunden auf 100°C erwärmt und anschließend wird der Feststoff durch Zentrifugation oder Filtration von der sauren Lösung abgetrennt. Nachdem der gesammelte Feststoff durch Neutralisieren mit verdünnter Natriumhydroxidlösung in Wasser gelöst ist, werden zwanzig Teile 0,3 M Chlorwasserstoffsäurelösung zu der Lösung zugegeben, was zu einer Wiederausfällung der teilweise hydrolysierten Alginsäure führt. Das resultierende heterogene Gemisch wird weitere 10+ Stunden auf 100°C erwärmt und der Feststoff wird erneut durch Zentrifugation oder Filtration von der sauren Lösung abgetrennt. Der gesammelte Feststoff wird durch Neutralisieren mit verdünnter Natriumhydroxidlösung in Wasser gelöst und anschließend werden Natriumchlorid und Wasser zugegeben, um eine Lösung zu erhalten, welche 0,5 Gew.-% Alginsäuresalz und 0,1 M Natriumchlorid enthält. Ein annähernd gleiches Volumen von 0,025 M Chlorwasserstoffsäurelösung wird zu der Alginsäuresalzlösung zugegeben, bis ein pH-Wert von 2,85 erhalten wird. Der ausgefällte Feststoff wird durch Zentrifugation oder Filtration von der sauren Lösung abgetrennt. Der isolierte Feststoff wird durch Neutralisieren mit verdünnter Natriumhydroxidlösung in Wasser gelöst und anschließend mit überschüssigem Ethanol ausgefällt. Der ausgefällte Feststoff wird mit Ethanol gewaschen, mit Ether gewaschen und getrocknet. Das Natriumsalz der Polyguluronsäure, die durch dieses heterogene saure Hydrolyseverfahren hergestellt wird, hat einen mittleren Polymerisationsgrad zwischen 15 und 20. Der Mannuronsäuregehalt liegt zwischen 5 und 15% und die Produktausbeute liegt zwischen 15 und 20%.
Im Laufe des ersten Schrittes der heterogenen sauren Hydrolyse gehen ungefähr 30% des Alginats in Lösung. Weitere 15% des ursprünglichen Alginats gehen im Laufe des zweiten Schrittes in Lösung. Die unlösliche Fraktion, welche nach den beiden Schritten isoliert wird, enthält sowohl Polyguluronsäure als auch Polymannuronsäure. Bei der Ansäuerung der verdünnten Lösung, die sowohl Natriumsalze von Polyguluronsäure als auch von Polymannuronsäure enthält, wird Polyguluronsäure selektiv ausgefällt.
Wenngleich das heterogene saure Hydrolyseverfahren von A. Haug et al. für die Herstellung von Polyguluronsäure im Labormaßstab brauchbar ist, wäre es schwierig, es in einem größeren Maßstab wie etwa dem, welcher in einer industriellen Produktion verwendet werden würde, durchzuführen. Dies liegt daran, dass in dem Trennschritt dieses Verfahrens die Konzentration von Alginsäure nur sehr verdünnte 0,25 Gew.-% beträgt. Außerdem weist das Verfahren mehrere Schritte auf und ist kompliziert.
In der gleichen Literaturstelle, welche das heterogene saure Hydrolyseverfahren beschreibt, wird auch über ein homogenes saures Hydrolyseverfahren berichtet. In diesem Verfahren wird eine 1 Gew.-%ige Natriumalginatlösung mit einem gleichen Volumen einer 0,025 M Citratpufferlösung vermischt, so dass eine kombinierte Lösung mit einem pH-Wert von 3,6 erhalten wird. Die Lösung wird 5+ Stunden refluxiert. Wenngleich ein Verfahren zum Isolieren von Polyguluronsäuren nicht beschrieben wird, kann vermutlich ein Verfahren verwendet werden, das demjenigen entspricht, das in dem heterogenen sauren Hydrolyseverfahren verwendet wird.
Wenngleich das homogene saure Hydrolyseverfahren von A. Haug et al. für die Herstellung von Polyguluronsäure im Labormaßstab brauchbar sein mag, wäre es ebenfalls schwierig, es in einem größeren Maßstab durchzuführen. In diesem Verfahren beträgt die Konzentration von Natriumalginat in dem Hydrolyseschritt nur sehr verdünnte 0,5 Gew.-%. Wenngleich man sich leicht vorstellen kann, die Konzentration von Natriumalginat zu erhöhen, kann dies in der Praxis nicht durchgeführt werden. Bei Konzentrationen, die etwas größer als 0,5 Gew.-% sind, bleibt Natriumalginat nicht während der gesamten Hydrolysereaktion in dem Bereich von pH-Werten löslich, bei denen die saure Hydrolyse durchgeführt wird. Die Spezies, welche im Laufe der Hydrolyse ausfallen, sind unvollständig hydrolysiert und wenngleich sie an Guluronsäure reich sind, enthalten sie signifikante Mengen an Mannuronsäure. Außerdem weisen die unvollständig hydrolysierten Spezies Polymerisationsgrade von mehr als 20 auf. Da die Bedingungen der homogenen sauren Hydrolyse milder sind als die vorstehend beschriebenen Bedingungen in dem heterogenen sauren Hydrolyseverfahren, werden die unvollständig hydrolysierten Spezies nach dem Ausfällen aus der Lösung nicht weiter hydrolysiert.
Ein weiteres Mittel zum Erhalten von Hydrolyseprodukten von Alginsäure, die ein niedriges Molekulargewicht aufweisen, ist in einer veröffentlichten Untersuchung der hydrolytischen Abbaubarkeit von teilweise dicarboxylierter Alginsäure offenbart ("Biodegradability, Hydrolytic Degradability, and Builder Performance in Detergent Formulations of Partially Dicarboxylated Alginic Acid", Journal of Environmental Polymer Degradation 4, 113–121 (1996)). In dieser Publikation wird teilweise dicarboxylierte Alginsäure hergestellt und anschließend zu Produkten mit niedrigem Molekulargewicht hydrolysiert. Die Hydrolyseprodukte wurden nur durch Gelpermeationschromatographie charakterisiert und somit ist ihre tatsächliche Identität unbekannt. Man kann jedoch vernünftigerweise annehmen, dass die Produkte Gemische aus den homopolymeren Fraktionen, Polyguluronsäuren und Polymannuronsäuren waren. Wenn man die Polyguluronsäuren aus diesen Gemischen isolieren wollte, könnte vermutlich ein Verfahren verwendet werden, das demjenigen entspricht, das in dem heterogenen sauren Hydrolyseverfahren von A. Haug et al. verwendet wird.
Die vorstehend beschriebenen Hydrolyseprodukte von dicarboxylierter Alginsäure, die ein niedriges Molekulargewicht aufweisen, wurden erhalten durch Verwenden eines dreistufigen Verfahrens, das von Alginsäure ausgeht. In dem ersten Schritt wurde Algin säure zu einer teilweise diformylierten Alginsäure oxidiert, wobei eine weniger als stöchiometrische Menge an Natriumperiodat als Oxidationsmittel verwendet wurde. Das Produkt wurde isoliert und durch Dialyse gereinigt. In dem zweiten Schritt wurde die teilweise diformylierte Alginsäure zu teilweise dicarboxylierter Alginsäure oxidiert, wobei ein Überschuss an Natriumchlorit als das Oxidationsmittel verwendet wurde. Wiederum wurde das Produkt isoliert und durch Dialyse gereinigt. In dem dritten Schritt wurde die teilweise dicarboxylierte Alginsäure in einer Pufferlösung gelöst, die einen pH-Wert von 4 aufwies, und für Zeiträume bis zu 30 Tagen bei 30°C inkubiert. Genau die gleichen ersten zwei Oxidationsschritte wurden auch in "An Apparent ⁴C₁ → ¹C₄ Conformational Transition in Periodate-Oxidized Alginate, Induced by Changes in pH and lonic Strength: The Anomeric Effect in Glycuronans," Carbohydrate Research, 71, C9-C12 (1979) beschrieben. In dieser Publikation wurde wässriges Brom anstelle von Natriumchlorit in dem zweiten Oxidationsschritt verwendet.
Wenngleich das vorstehend beschriebene dreistufige Verfahren, in welchem teilweise dicarboxylierte Alginsäure ein Zwischenprodukt ist, für die Herstellung von Polyguluronsäure im Labormaßstab brauchbar sein mag, ist es für eine industrielle Produktion nicht optimal, da das Verfahren mehrere Schritte umfasst und kompliziert ist. Außerdem erfordert es zwei verschiedene Oxidationsmittel.
Problem, das von der Erfindung gelöst werden soll
Somit besteht ein Bedarf für ein Verfahren zum Herstellen von Polyguluronsäuren, welches in großtechnischem Maßstab durchgeführt werden kann. Speziell besteht ein Bedarf für ein Hydrolyseverfahren, in welchem die Konzentration von Alginsäure oder einem Alginatsalz während des gesamten Verfahrens größer als 5 Gew.-% ist.
Mittel zum Lösen des Problems
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein praktisches Verfahren zum Herstellen von Polyguluronsäuren bereit zu stellen, die einen Polymerisationsgrad von weniger als 20 aufweisen und im Wesentlichen frei von einer Mannuronsäureverunreinigung sind.
Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat festgestellt, dass Periodsäure, H₅IO₆, und Periodatsalze, welche Natriumperiodat (Metaperiodat), NaIO₄, Natriumparaperiodat, Na₃H₂IO₆, und Kaliumperiodat, KIO₄, einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind, die Oxidation von konzentrierten Lösungen von Alginsäure bewirken, so dass Zwischenprodukte erhalten werden, welche leicht hydrolysiert werden. Es wurde festgestellt, dass freies lod, und nicht lodate, zu dem hauptsächlichen iodhaltigen Produkt der Oxidationsreaktion gemacht werden kann. Die eigentliche Bedeutung dieser Feststellung ist, dass mehrere Oxidationsschritte durch ein Oxidationsmittel bewirkt werden. Es wurde auch festgestellt, dass Lösungen von Alginsäure mit 5 Gew.-% oder mehr zum Zweck der Periodatoxidation dadurch erhalten werden können, dass man z. B. Lithiumhydroxid zum Neutralisieren der Alginsäure verwendet. Diese kombinierten Feststellungen bilden die Grundlage der vorliegenden Erfindung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen von Polyguluronsäuren bereit gestellt, die einen Polymerisationsgrad von weniger als 20 aufweisen und im Wesentlichen frei von einer Mannuronsäureverunreinigung sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Auflösen von Alginsäure in Wasser durch Neutralisation mit einem Alkalimetallhydroxid, um eine saure Lösung zu erhalten, die 5 Gew.-% oder mehr Alginsäure enthält; (b) Oxidieren der Alginsäure durch die Zugabe einer weniger als stöchiometrischen Menge von Periodsäure oder einem Periodatsalz zu der Lösung; (c) vollständiges oder nahezu vollständiges Durchführen der Oxidationsreaktion, so dass sich freies lod von dem Reaktionsgemisch absondert; (d) Abtrennen des freien Iods von dem Reaktionsgemisch; (e) Ansäuern und Erwärmen des Reaktionsgemisches derart, dass Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht einschließlich Polyguluronsäuren erhalten werden; (f) Einstellen des pH's des Reaktionsgemisches derart, dass Polyguluronsäuren selektiv ausgefällt werden; und (g) Abtrennen der Polyguluronsäuren von dem Reaktionsgemisch.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den Ansprüchen angegeben.
Ausführungsform der Erfindung
Ein praktisches Verfahren zum Herstellen von Polyguluronsäuren, die einen Polymerisationsgrad von weniger als 20 aufweisen und im Wesentlichen frei von einer Mannuronsäureverunreinigung sind, ist hier beschrieben. Im Wesentlichen frei von Mannuronsäure ist definiert als weniger als oder gleich 8 Gew.-% und mehr bevorzugt weniger als oder gleich 5 Gew.-%.
Wie vorstehend erwähnt, wurde ein dreistufiges Verfahren, in welchem Natriumperiodat in einem Schritt verwendet wurde, für die Herstellung von Hydrolyseprodukten von Alginsäure, die ein niedriges Molekulargewicht aufweisen, beschrieben. In dem Schritt, in welchem Natriumperiodat als Oxidationsmittel verwendet wurde, wurden vicinale Glycole in der Alginsäure oxidativ gespalten, mit damit einhergehender Bildung von Carbonylverbindungen. Das resultierende Alginsäureoxidationsprodukt wurde isoliert und als teilweise diformylierte Alginsäure charakterisiert. Auf der Grundlage der Stöchiometrie dieser Oxidationsreaktion ist Natriumiodat das iodhaltige Produkt. In dem vorstehenden zweiten Oxidationsschritt wurde die teilweise diformylierte Alginsäure oxidiert, wobei entweder Natriumchlorit oder wässriges Brom verwendet wurde. In diesem Schritt wurden einige oder alle der Carbonylfunktionalitäten zu Carbonsäurefunktionalitäten oxidiert. Das resultierende Alginsäureoxidationsprodukt wurde isoliert und als teilweise dicarboxylierte Alginsäure charakterisiert.
Ohne auf eine Theorie festgelegt werden zu wollen, wird angenommen, dass in der vorliegenden Erfindung die vorstehenden zwei getrennten Oxidationsschritte durch nur ein Oxidationsmittel, Periodsäure oder ein Periodatsalz, bewirkt werden. Dieser Schluss beruht auf der Beobachtung, dass freies lod und nicht lodat das hauptsächliche iodhaltige Produkt unter den Bedingungen der vorliegenden Erfindung ist. Wiederum ohne auf eine Theorie festgelegt werden zu wollen, wird angenommen, dass die zwei Oxidationsreaktionen gemäß den folgenden stöchiometrischen Gleichungen erfolgen, in welchen Natriumperiodat als das Oxidationsmittel verwendet wird. Entsprechende Gleichungen können für Periodsäure oder andere Periodatsalze geschrieben werden. -CHOH-CHOH- + NaIO₄ → 2[-CHO] + NaIO₃ 2[-CHO] + NaIO₃ + 2/5 H₂O → 2[-COOH] + 2/5 I₂ + 4/5 NaOH + 1/5 NaIO₃ Das Natruimiodat, welches ein Produkt der ersten Oxidation ist, wird weiter zu lod reduziert, was zur Bildung von teilweise dicarboxylierter Alginsäure führt. Auf der Grundlage dieser Gleichungen wird nicht das gesamte lodat in der zweiten Oxidation verbraucht.
Selbst wenn die Reaktionschemie von Periodsäure oder Periodatsalzen mit Alginsäure nicht genau so stattfindet, wie es vorstehend beschrieben ist, ist die Brauchbarkeit von Periodsäure oder Periodatsalzen zum Oxidieren von Alginsäure zu Zwischenprodukten, welche leicht hydrolysiert werden, der springende Punkt der vorliegenden Erfindung. Diese leicht hydrolysierbaren Zwischenprodukte werden erhalten, wenn die Oxidationsreaktion vollständig durchgeführt wird, so dass sich eine unveränderliche Menge an freiem lod von dem Reaktionsgemisch absondert.
Die Alginsäure, die als Ausgangsmaterial in vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, kann eine beliebige im Handel erhältliche Alginsäure sein. Da jedoch Polyguluronsäuren das angestrebte Produkt sind, ist eine Alginsäure, welche reich an Guluronsäure ist, bevorzugt. Alginsäuren, die aus den Meeresalgen Laminaria hyperborea und Lessonia flavicans extrahiert werden, sind besonders reich an Guluronsäure und weisen Guluronsäure zu Mannuronsäureverhältnisse von ungefähr zwei zu eins auf. Um die Viskosität der Hydrolyselösung relativ niedrig zu halten, ist eine Alginsäure mit einem niedrigen mittleren Molekulargewicht als Ausgangsmaterial bevorzugt. In der vorliegenden Erfindung ist eine Alginsäure mit einem Molekulargewicht von weniger als oder gleich 50000 g/mol bevorzugt. Ein bevorzugtes Ausgangsmaterial ist "Ultra Low Viscosity Alginic Acid", welche von Kibun Food Kemifa erhältlich ist.
Ein weiterer wichtiger Punkt der vorliegenden Erfindung ist, dass Lösungen von Alginsäure mit 5 Gew.-% oder mehr zum Zweck der Periodatoxidation dadurch erhalten werden können, dass man ein Alkalimetallhydroxid wie Lithiumhydroxid zum Neutralisieren der Alginsäure verwendet. Für Alginsäuren, die reich an Guluronsäure sind, als Ausgangsmaterial können konzentrierte Lösungen nur erhalten werden, wenn Lithiumhydroxid zum Neutralisieren der Alginsäure verwendet wird. Für Alginsäuren, die nicht so reich an Guluronsäure sind (und somit zum Erhalten von Polyguluronsäuren nicht so wünschenswert sind), als Ausgangsmaterial können andere Alkalimetallhydroxide wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Rubidiumhydroxid und Cäsiumhydroxid verwendet werden. Ungeachtet der Zusammensetzung der Alginsäure als Ausgangsmaterial ist jedoch eine Neutralisation mit Lithiumhydroxid im Stande, eine Lösung zu ergeben, die konzentrierter ist als diejenigen, die unter Verwendung anderer Alkalimetallhydroxide erhalten werden. Aufgrund seiner leichten Handhabung ist Lithiumhydroxidmonohydrat die bevorzugte feste Form von Lithiumhydroxid zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
Organische Basen wie Amine können ebenfalls zum Neutralisieren von Alginsäure verwendet werden, so dass konzentrierte Lösungen erhalten werden. Organische Basen sind jedoch in der vorliegenden Erfindung nicht brauchbar, da die protonierten organischen Basen, welche sich aus der Neutralisation ergeben, durch Periodsäure und Periodatsalze leicht oxidiert werden. Da das Ziel der Oxidation die Alginsäure und nicht eine protonierte organische Base ist, wäre eine konkurrierende Oxidation zwischen der Alginsäure und einer protonierten organischen Base nicht wünschenswert und verschwenderisch, wenn organische Basen zum Neutralisieren von Alginsäure verwendet würden.
Als der erste Schritt in der vorliegenden Erfindung wird die Alginsäure durch Neutralisation z. B. mit Lithiumhydroxid in Wasser gelöst, um eine Lösung zu ergeben, die 5 Gew.-% oder mehr Alginsäure enthält. Die Menge an Lithiumhydroxid, die bei der Neutralisation verwendet wird, ist die Menge, welche zu einer Lösung führt, die einen pH-Wert aufweist, der größer als oder gleich 3,8 und kleiner als oder gleich 5,0 ist. Für handelsübliche Alginsäurequalitäten enthält die resultierende Lösung in diesem pH-Bereich im Allgemeinen kleine Mengen an unlöslichen Verunreinigungen. Falls es für notwendig erachtet wird, können diese Verunreinigungen vor der Zugabe von Periodsäure oder Periodatsalzen durch Filtration leicht entfernt werden. Bei pH-Werten von weniger als 3,8 löst sich nicht die ganze Alginsäure auf. Bei pH-Werten, die größer als 5,0 sind, ist die Oxidationsreaktion von Periodsäure oder Periodatsalzen mit Alginsäure, welche zur Bildung von freiem lod als das iodhaltige Produkt führt, unannehmbar langsam. Für "Ultra Low Viscosity Alginic Acid" von Kibun Food Kemifa ergibt eine Neutralisation mit 77 mol% Lithiumhydroxidmonohydrat eine Lösung mit einem pH-Wert von ungefähr 4,1.
In dem nächsten Schritt wird die Alginsäure durch die Zugabe einer weniger als stöchiometrischen Menge von Periodsäure oder einem Periodatsalz oxidiert. Periodsäure hat die folgende Molekülformel: H₅IO₆. Zu Periodatsalzen gehören Natriumperiodat (Metaperiodat), NaIO₄, Natriumparaperiodat, Na₃H₂IO₆, und Kaliumperiodat, KIO₄, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Die weniger als stöchiometrische Menge von Periodsäure oder einem Periodatsalz der vorliegenden Erfindung ist größer als 5 mol% und kleiner als 50 mol%. Für stöchiometrische Werte, die kleiner als 5 mol% sind, weisen die durch saure Hydrolyse erhaltenen Polyguluronsäuren mittlere Polymerisationsgrade von 20 oder mehr auf. Für stöchiometrische Werte, die größer als 50 mol% sind, ist die Ausbeute an Polyguluronsäuren unannehmbar schlecht, in der Regel weniger als 5%. Die Periodsäure oder Periodatsalze können als Feststoffe oder wässrige Lösungen zugegeben werden, wobei Feststoffe bevorzugt sind. Ein kräftiges Rühren und Kühlen der Alginsäurelösung wird während der Zugabe und der anschließenden anfänglichen Reaktion der Periodsäure oder der Periodatsalze empfohlen. Das Kühlen ist wichtig, da die erste Oxidationsreaktion exotherm ist.
In dem nächsten Schritt wird die Oxidationsreaktion vollständig durchgeführt, so dass sich freies lod von dem Reaktionsgemisch absondert. Wenn das Reaktionsgemisch nach der Beendigung der exothermen ersten Oxidation auf Umgebungstemperatur aufwärmen gelassen wird, beginnt lod auszufallen. Das einfachste Mittel zum Vorantreiben dieser Reaktion derart, dass sich eine unveränderliche Menge an freiem lod von dem Reaktionsgemisch absondert, ist das Erwärmen des Reaktionsgemisches. Da festes lod einen hohen Dampfdruck aufweist, wird das Erwärmen am besten entweder in einem geschlossenen System oder in einem entlüfteten System durchgeführt, in welchem das entlüftete lod durch eine iodspezifische Wäscherlösung geleitet wird. Die Temperatur des erwärmten Reaktionsgemisches liegt vorzugsweise über 40°C, um eine vernünftig schnelle Umwandlung des bzw. der intermediären Oxidationsmittels) in freies lod zu erhalten. Wenngleich der Erfinder der vorliegenden Erfindung potentielle Katalysatoren, welche die Umwandlung des bzw. der intermediären Oxidationsmittels) in freies lod beschleunigen können, nicht untersucht hat, fällt die Zugabe eines Katalysators gewiss unter den Umfang dieser Erfindung.
Nachdem die Reaktion vollständig durchgeführt wurde, wird das freie lod durch herkömmliche Verfahren von dem Reaktionsgemisch abgetrennt. Zu solchen Verfahren gehören eine Filtration, Zentrifugieren und eine Wasserdampfdestillation. Ein Reini gungs- und Rückgewinnungsverfahren zum Recyclieren von lod zu Periodsäure oder Periodatsalzen ist in US 3,607,694 , US 3,681,213 und US 3,703,508 offenbart.
In dem nächsten Schritt wird das Reaktionsgemisch angesäuert und erwärmt, so dass die oxidierten Zwischenprodukte zu Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht hydrolysiert werden, wozu Polyguluronsäuren gehören. Wie bereits erwähnt, ist die Leichtigkeit der Hydrolyse der oxidierten Zwischenprodukte ein springender Punkt der vorliegenden Erfindung. Während des Erwärmens oder vor dem Erwärmen wird das Reaktionsgemisch auf einen pH-Wert angesäuert, der kleiner als oder gleich 3,5 ist. Bei pH-Werten, die größer als 3,5 sind, ist die Hydrolyse unannehmbar langsam. In dem pH-Bereich, der größer als oder gleich ungefähr 3,2 und kleiner als oder gleich 3,5 ist, ist die saure Hydrolysereaktion homogen. Bei pH-Werten, die kleiner als ungefähr 3,2 sind, ist die saure Hydrolysereaktion heterogen. Im Allgemeinen sind niedrigere pH-Werte im Hinblick auf die Erhöhung der Geschwindigkeit der sauren Hydrolysereaktion bevorzugt.
In diesem Schritt wird das angesäuerte Reaktionsgemisch auf eine Temperatur, die größer als oder gleich 80°C ist, für einen Zeitraum erwärmt, der ausreicht, um die Zwischenprodukte zu Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht zu hydrolysieren, wozu Polyguluronsäuren gehören. Wenngleich Temperaturen von weniger als 80°C verwendet werden können, wird die Hydrolysegeschwindigkeit entsprechend langsamer sein. Die Hydrolyse kann in Druckgefäßen durchgeführt werden, so dass Temperaturen verwendet werden können, die größer sind als der Siedepunkt von Wasser bei Atmosphärendruck. Im Allgemeinen ist eine Temperatur von weniger als ungefähr 120°C bevorzugt, weil eine Zersetzung der Polysaccharidprodukte in Konkurrenz zu der Hydrolysereaktion bei Temperaturen, die größer als ungefähr 120°C sind, erheblich ist. Dieser Hydrolyseschritt kann unter einer Umgebungsatmosphäre oder einer inerten Atmosphäre durchgeführt werden, wobei eine inerte Atmosphäre bevorzugt ist, da die Luftoxidation der Produkte minimiert wird. Eine inerte Atmosphäre aus Stickstoff hoher Reinheit ist unter Kostengesichtspunkten bevorzugt.
Der Zeitraum, welcher ausreicht, um die Zwischenprodukte zu Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht zu hydrolysieren, wozu Polyguluronsäuren gehören, hängt von mehreren Faktoren ab. Ein Faktor ist die Temperatur des angesäuerten Reaktionsgemi sches. Ein zweiter Faktor ist die Anfangskonzentration des Ausgangsmaterials Alginsäure. Ein dritter Faktor ist die Menge von Periodsäure oder einem Periodatsalz, bezogen auf die Menge des Ausgangsmaterials Alginsäure, welche zum Oxidieren der Alginsäure verwendet wird. Wie vorstehend erwähnt, ist ein vierter Faktor der pH-Wert des angesäuerten Reaktionsgemisches. Um die Vollständigkeit der Hydrolysereaktion zu bestimmen, kann eine Reihe von analytischen Methoden verwendet werden. In der Regel werden Aliquots des angesäuerten Reaktionsgemisches in periodischen Abständen entnommen und die Polyguluronfraktion wird isoliert. Diese Fraktion kann dann durch eine Reihe von Methoden analysiert werden, wozu ¹H-NMR- und Gelpermeationschromatographie gehören.
Nachdem die Hydrolyse als vollständig angesehen wird, wird das angesäuerte Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur gekühlt und der pH des Reaktionsgemisches wird so eingestellt, so dass Polyguluronsäuren selektiv ausgefällt werden. Polyguluronsäuren werden durch Einstellen des pH's des Reaktionsgemisches auf einen Wert, der größer als oder gleich 3,0 und kleiner als oder gleich 3,4 ist, selektiv ausgefällt. Die angegebenen pK_a-Werte von Polyguluronsäure und Polymannuronsäure sind 3,65 bzw. 3,38. Auf der Grundlage dieser Differenz führt die Einstellung des pH's des Reaktionsgemisches derart, dass ein pH-Wert in dem beanspruchten Bereich der vorliegenden Erfindung erhalten wird, zu einer selektiven Ausfällung von Polyguluronsäure gegenüber Polymannuronsäure, welche in Lösung bleibt. Es kann jede wasserlösliche Säure oder Base in der vorliegenden Erfindung zum Einstellen des pH's verwendet werden. Säuren sind vorzugsweise nicht-oxidierende anorganische Säuren, für die Chlorwasserstoffsäure ein Beispiel ist. Eine bevorzugte Base ist eine wässrige Lösung von Lithiumhydroxidmonohydrat.
Nach der selektiven Ausfällung werden die Polyguluronsäuren durch herkömmliche Verfahren abgetrennt. Zu solchen Verfahren gehören eine Filtration und eine Zentrifugation. Das Produkt kann anschließend mit angesäuertem Wasser und/oder einer wässrigen Alkohollösung gewaschen werden und anschließend durch herkömmliche Verfahren getrocknet werden.
Die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Polyguluronsäuren weisen Polymerisationsgrade von weniger als 20 auf und enthalten weniger als 8 Mannuronsäure, bestimmt durch ¹H-NMR. Eine Probe für die NMR-Analyse wird durch Auflösen der Polyguluronsäure in Deuteriumoxid (D₂O) durch Neutralisation mit einer Lösung von Natriumdeuteroxid (NaOD) in Deuteriumoxid hergestellt. Bei 90°C treten die H-1-Peaks (im Inneren) von Guluronsäure und Mannuronsäure in Polyuronsäuren bei 5,05 ppm bzw. 4,67 ~ 4,70 ppm, bezogen auf den internen Vergleichsstandard Natrium-3-(trimethylsilyl)propionat-d₄ auf. Aus den integrierten Flächen dieser zwei Peaks kann die Menge der Mannuronsäureverunreinigung in dem Polyguluronsäureprodukt berechnet werden. Bei 90°C treten die H-1-Peaks (am reduzierenden Ende) der α- und β-Anomere von Polyguluronsäure und Polymannuronsäure bei 5,21 ppm bzw. 4,84 ~ 4,89 ppm, bezogen auf den internen Vergleichsstandard Natrium-3-(trimethylsilyl)propionat-d₄ auf. Aus einem Vergleich der kombinierten integrierten Flächen der α- und β-Anomerpeaks mit den kombinierten integrierten Flächen aller H-1-Peaks (α-Anomerenpeak, β-Anomerenpeak, H-1-Peak im Inneren von Guluronsäure und H-1-Peak im Inneren von Mannuronsäure) kann der Polymerisationsgrad des Polyguluronsäureproduktes berechnet werden.
Ausführungsform
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende spezifische Beispiel weiter erläutert.
Alle Arbeitsgänge erfolgten in einem gut entlüfteten Abzug.
HERSTELLUNG VON POLYGULURONSÄURE
150 g Alginsäure (Ultra Low Viscosity Alginic Acid; Kibun Food Kemifa; Japan) wurden in 600 ml entionisiertem Wasser in einem 1000 ml-Becherglas aufgeschlämmt. Zu dieser Aufschlämmung wurden 27,65 g Lithiumhydroxidmonohydrat zugegeben, während die Aufschlämmung mit einem darüber angebrachten mechanischen Rührer gerührt wurde. Die Alginsäure löste sich auf, wobei eine Lösung mit einem pH-Wert von ungefähr 4,1 erhalten wurde. Entionisiertes Wasser wurde zugegeben, um ein Gesamtvolumen der Lösung von 750 ml zu ergeben. Anschließend wurde die Lösung in einem Eisbad auf eine Temperatur von weniger als 5°C gekühlt. Während die gekühlte Lösung unter Verwendung des mechanischen Rührers kräftig gerührt wurde, wurden 43,75 g Natriumperiodat schnell zugegeben. Nachdem die gekühlte Lösung 1 Stunde kräftig gerührt worden war, wurde das Eisbad entfernt und die gerührte Lösung wurde auf Umgebungstemperatur aufwärmen gelassen. Anschließend wurden 8 g konzentrierte Chlorwasserstoffsäurelösung unter Rühren zugegeben. Das Becherglas wurde abgedeckt und beiseite gestellt, um 12 Stunden zu stehen. Während dieses Zeitraums setzte sich etwas festes lod am Boden des Becherglases ab. Das Reaktionsgemisch wurde in einen dickwandigen, mit einem Deckel versehenen 2 I-PFA-Behälter überführt. Die Gewinde an der Öffnung des Behälters wurden mit Teflonband umwickelt und der Deckel wurde dicht verschlossen. Der verschlossene Behälter wurde unter Verwendung eines Bleigewichtes 8 Stunden in ein Wasserbad mit 70°C eingetaucht. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der verschlossene Behälter geöffnet und das Gemisch wurde durch einen Bogen von #4 Whatman-Filterpapier filtriert. Das lod, welches sich auf dem Filterpapier ansammelte, wurde durch Standardverfahren entsorgt. Das Filtrat wurde in einen Rundkolben überführt, an dem ein Rückflusskühler angebracht wurde. Nach der Zugabe von 2 ml n-Octylalkohol zu der Lösung wurde das Gemisch magnetisch gerührt und 2 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Während das Gemisch weiterhin gerührt wurde und refluxierte, wurde konzentrierte Chlorwasserstoffsäure nach und nach durch den Rückflusskühler zugegeben, bis der pH des Gemisches einen Wert von 1,0 erreichte. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von Hydrion Microfine pH-Testpapier mit einem Bereich von 0,8 bis 2,0 abgeschätzt. Diese Zugabe von Säure führte zu der Ausfällung eines gebrochen weißen Feststoffs. Das Gemisch wurde weitere 7 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Nachdem das Gemisch auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen wurde, wurde der Feststoff durch Vakuumfiltration gesammelt, wobei eine Glasfritte mit feiner Porosität (Porengröße: 16–40 Mikrometer) verwendet wurde. Der feuchte Feststoff wurde zusammen mit ungefähr 600 ml entionisiertem Wasser in ein 1 l-Becherglas überführt. Während die Aufschlämmung gerührt wurde, wurde Triethylamin nach und nach zugegeben, bis sich der gesamte Feststoff auflöste. Der pH der resultierenden Lösung betrug ungefähr 7, bestimmt unter Verwendung von Microfine pH-Testpapier mit einem Bereich von 5,5 bis 8,0. Die resultierende Lösung wurde durch einen Bogen von #2 Whatman-Filterpapier filtriert. Anschließend wurde 6 N Chlorwasserstoffsäure nach und nach zu der Lösung zugegeben, welche die Polyguluronsäuren und Polymannuronsäuren mit niedrigem Molekulargewicht enthielt, bis der pH des Gemisches einen Wert von 3,1 erreichte, was unter Verwendung von Microfine pH-Testpapier mit einem Bereich von 1,3 bis 4,4 bestimmt wurde. Der Feststoff, welcher ausfiel, wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, wobei eine Glasfritte mit feiner Porosität (Porengröße: 16–40 Mikro meter) verwendet wurde. Der feuchte Feststoff wurde zusammen mit ungefähr 250 ml entionisiertem Wasser in ein 1 l-Becherglas überführt. Während die Aufschlämmung gerührt wurde, wurden 500 ml 95%iges Ethanol allmählich unter Rühren zugegeben. Nach 1 Stunde Rühren wurde der Feststoff durch Vakuumfiltration gesammelt, wobei eine Glasfritte mit feiner Porosität (Porengröße: 16–40 Mikrometer) verwendet wurde. Der Feststoff wurde mit mehreren Portionen von 95%igem Ethanol gewaschen und anschließend zum Lufttrocknen beiseite gestellt. Schließlich wurde der Feststoff unter Vakuum bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet. Die Produktausbeute betrug 17 g. Ungefähr 10 mg einer Probe wurden in 0,4 ml Deuteriumoxid gelöst durch die Zugabe einer kleinen Menge an Natriumdeuteroxid in Deuteriumoxid, wobei eine Mikrospritze verwendet wurde. Das ¹H-NMR-Spektrum wurde bei 80°C gemessen und die Peaks, die dem H-1-Peak (im Inneren) von Guluronsäure in Polyuronsäuren, dem H-1-Peak (im Inneren) von Mannuronsäure in Polyguluronsäuren, dem H-1-Peak (am reduzierenden Ende) der α-Anomere und dem H-1-Peak (am reduzierenden Ende) der β-Anomere entsprechen, wurden integriert. Die Integrationswerte sind in der nachstehend gezeigten Tabelle angegeben. Dieser Bereich des Spektrums ist in 1 gezeigt.
Tabelle 1
Die Menge der Mannuronsäureverunreinigung in dem Polyguluronsäureprodukt wurde aus den Integrationswerten für die H-1-Peaks (im Inneren von Guluronsäure und Mannuronsäure berechnet. Die Berechnung ist wie folgt:
Mannuronsäureverunreinigung (%) = 100 × 257/(257 + 3952) = 6,1
Der Polymerisationsgrad des Polyguluronsäureproduktes wurde aus den kombinierten integrierten Flächen der α- und β-Anomerenpeaks und den kombinierten integrierten Flächen aller H-1-Peaks (α-Anomerenpeak, β-Anomerenpeak, H-1-Peak im Inneren von Guluronsäure und H-1-Peak im Inneren von Mannuronsäure) berechnet. Die Berechnung ist wie folgt: Polymerisationsgrad = (257 + 3952 + 218 + 71)/(218 + 71) = 15,6
1 ist das ¹NMR-Spektrum der Polyguluronsäureprobe, das bei 80°C gemessen wird. Der Bereich des Spektrums, der in dieser Figur gezeigt wird, schließt die folgenden Peaks ein: den H-1-Peak (im Inneren) von Guluronsäure in Polyuronsäuren, den H-1-Peak (im Inneren) von Mannuronsäure in Polyuronsäuren, den H-1-Peak (am reduzierenden Ende) der α-Anomere und den H-1-Peak (am reduzierenden Ende) der β-Anomere.

Claims

Verfahren zum Herstellen von Polyguluronsäuren, die einen Polymerisationsgrad von weniger als 20 aufweisen und im Wesentlichen frei von einer Mannuronsäureverunreinigung sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Auflösen von Alginsäure in Wasser durch Neutralisation mit einem Alkalimetallhydroxid, um eine saure Lösung zu erhalten, die 5 Gew.-% oder mehr Alginsäure enthält; (b) Oxidieren der Alginsäure durch die Zugabe einer weniger als stöchiometrischen Menge von Periodsäure oder einem Periodatsalz zu der Lösung; (c) vollständiges oder nahezu vollständiges Durchführen der Oxidationsreaktion, so dass sich freies lod von dem Reaktionsgemisch absondert; (d) Abtrennen des freien Iods von dem Reaktionsgemisch; (e) Ansäuern und Erwärmen des Reaktionsgemisches derart, dass Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht einschließlich Polyguluronsäuren erhalten werden; (f) Einstellen des pH's des Reaktionsgemisches derart, dass Polyguluronsäuren selektiv ausgefällt werden; und (g) Abtrennen der Polyguluronsäuren von dem Reaktionsgemisch.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Alkalimetallhydroxid Lithiumhydroxid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die saure Lösung, die durch Neutralisieren von Alginsäure mit Lithiumhydroxid erhalten wird, einen pH-Wert aufweist, der größer als oder gleich 3,8 und kleiner als oder gleich 5,0 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die weniger als stöchiometrische Menge von Periodsäure oder einem Periodatsalz mehr als 5 mol% und weniger als 50 mol% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Periodatsalz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Natriumperiodat (NaIO₄), Natriumparaperiodat (Na₃H₂IO₆) und Kaliumperiodat (KIO₄).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oxidationsreaktion durch Erwärmen des Reaktionsgemisches vollständig durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reaktionsgemisch derart angesäuert wird, dass es einen pH-Wert von weniger als oder gleich 3,5 hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das angesäuerte Reaktionsgemisch auf eine Temperatur von mehr als oder gleich 80°C erwärmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Polyguluronsäuren durch Einstellen des pH's des Reaktionsgemisches auf einen Wert von mehr als oder gleich 3,0 und weniger als oder gleich 3,4 selektiv ausgefällt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Alginsäure ein Molekulargewicht von weniger als oder gleich 50000 g/mol aufweist.