DE4427617A1 - Verfahren zur Gewinnung von Zellinhaltsstoffen aus halophilen und osmophilen sowie halo- und osmotoleranten Mikroorganismen - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Inhaltsstoffen aus Zellen, vorzugsweise aus halophilen/osmophilen bzw. halotoleranten und osmotoleranten Mikroorganismen, sowie nach dem Verfahren gewinnbare Ectoine und/oder Ectoin-Derivate, wie z. B S,S-α-Amino-β-hydroxyectoin und deren Anwendung als Schutzstoffe. Mikroorganismen, die hohe Konzentrationen an Salzen oder anderen gelösten Stoffen benötigen oder tolerieren reagieren auf den hohen osmotischen Wert des umgebenden Mediums durch Synthese oder Akkumulation niedermolekularer Substanzen im Cytoplasma. Das der Erfindung zugrunde liegende Problem beruht auf der mit der Gewinnung einhergehenden Abtrennung hoher Konzentrationen an Medienbestandteilen (Salze, Zucker), aber auch anderer unerwünschter Komponenten wie z. B. komplexe Stoffe des Mediums und biogene Produkte, denn

• 1) Extrakte aus Zellpellets (nach klassischen Verfahren) enthalten neben den Zellinhaltsstoffen große Mengen Salz bzw. andere externe Osmotika,
• 2) die Anwesenheit gelöster Stoffe aus dem Medium sowie essentieller Komplexstoffe oder biogener Substanzen erschwert die Aufreinigung des gewünschten Produktes,
• 3) natürliche (nur partiell gereinigte) Rohextrakte, die mit Medienkomponenten (s. o.) vermischt sind, sind für den direkten Einsatz als Schutzstoff-Gemische nicht geeignet.

Das beschriebene Verfahren soll erreichen, daß die Zellen von Medienbestandteilen befreit werden, ohne daß die von den Zellen akkumulierten Inhaltsstoffe als Folge der Abtrennung verloren gehen. Dabei ist zu bedenken, daß viele Organismen auf eine Verdünnung des Mediums (Waschen) mit Abgabe der Substanzen ins Medium reagieren bzw. platzen, wenn entsprechende Transportsysteme fehlen.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß eine Reihe von Mikroorganismen (vorzugsweise Vertreter der Firmicutes) nicht in der Lage sind, akkumulierte Substanzen ins Medium abzugeben, und trotzdem bei entsprechend schonendem Verdünnungsstreß nicht lysieren sondern diese Substanzen im Cytoplasma zurückhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Inhaltsstoffen aus Zellen geht davon aus, daß die Zellen in einem ersten Zustand gewachsen sind, bevor sie in einen zweiten Zustand überführt werden, aus dem dann die Gewinnung von Inhaltsstoffen möglich ist. Der zweite Zustand unterscheidet sich von ersterem dadurch, daß Bestandteile des Wachstumsmediums, die in diesem hoch konzentriert sind, um die Synthese und Akkumulation der Inhaltsstoffe zu induzieren (z. B. Salze, Zucker), aber auch andere Stoffe, die die Aufreinigung erschweren (z. B. Komplexstoffe, Proteine etc.), entfernt worden sind, ohne daß die Konzentration der Inhaltsstoffe dadurch entscheidend beeinflußt wird. Die Veränderung in der Umgebung der Zellen im ersten Zustand kann beispielsweise durch Veränderung der Konzentration gelöster Stoffe im Kultivierungsmedium erreicht werden. Eine Möglichkeit, diese Veränderung hervorzurufen, ist die Variation der osmotischen Bedingungen im Kultivierungs­ medium, also jenen Bedingungen, welche die Synthese von Inhaltsstoffen ausgelöst haben. Aufgrund der Tatsache, daß Zellen, die einem solchen Verdünnungsstreß ausgesetzt werden, unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht zerstört werden und ihre Inhaltsstoffe nicht ins umgebende Medium abgeben, können die gewünschten Inhaltsstoffe gewonnen werden, ohne daß die die Synthese/Akkumulation dieser Inhaltsstoffe verursachenden Faktoren noch vorhanden sind.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Vorhabens liegt in der Gewinnung einer von Medienbestandteilen befreiten Zellmasse, aus der streßinduzierte Inhaltsstoffe in relativ reiner Form mit einfachen Methoden extrahiert werden können. Außerdem ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren den Einsatz roher (nur partiell gereinigter) Zellextrakte als Stabilisierungsmittel für Enzyme und anderer Biomoleküle. Denkbar ist beispielsweise die Durchführung einer wenig zeitaufwendigen Extraktion (z. B. mit Alkoholen oder Alkohol-Wasser-Gemischen) oder der Einsatz von extraktiven 2-Phasen-Systemen (z. B. Chloroform-Wasser). Alternativ ist eine reversible Permeabilisierung der Zellmembranen denkbar. Hierdurch wird die Zerstörung zellulärer Strukturen verhindert und die Option, den Prozeß zyklisch zu gestalten, bleibt erhalten. Zu den permeabilisierenden Substanzen, die eingesetzt werden können, zählen porenbildende und/oder diffusionsfördernde Peptid- und Depsipeptidantibiotika wie Valinomycin, Polymyxin, Gramicidin, Nisin sowie Detergenzien wie z. B. Natriumdodecylsulfat, Triton X, Cetyltrimethylammoniumbromid.

Beispiele für die gewinnbaren Inhaltsstoffe sind die von halo-/osmophilen bzw. Halo-/osmotoleranten Bakterien in Anpassung an hohe Salinitäten synthetisierten niedermolekularen Osmotika (kompatible Solute). Diese Inhaltsstoffe können native Enzyme stabilisieren und z. B. als Hitze, Gefrier- und Trocknungsschutzsubstanzen, aber auch als generelle Stabilisierungsmittel für Biomoleküle in wäßrigen Lösungen und organischen Lösungsmitteln sowie zur Stabilisierung gegen denaturierende Bedingungen eingesetzt werden.

Als Biomoleküle kommen beispielsweise Proteine, andere Biopolymere sowie komplexe Strukturen (wie z. B. Nukleinsäuren, Ribosomen, Membranen etc.) in Frage. Als denaturierende Einwirkungen sind physikalische Faktoren (wie z. B. Druck, Temperatur, UV- und ionisierende Strahlung, Scherkräfte etc.), pH-Wert und denaturierende Reagenzien wie organische Lösungsmittel, Salze, Tenside, Harnstoff, Guanidiniumchlorid und andere Verbindungen zu nennen.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit liegt in der Stabilisierung prokaryontischer und eukaryontischer Zellen, Organellen und Organen während einer Langzeitlagerung, vorstellbar als Additive zu Flüssigkulturen oder getrockneten Präparaten zur Konservierung lebender Kulturen, beispielsweise auch für die Erstellung von Referenzmaterial mit konstantem Lebendtiter, für die Lagerfähigkeit von Starterkulturen und mit Mikroorganismen "beimpftem" Saatgut, sowie für den Gebrauch zur Konservierung in Stammsammlungen.

Die Extraktion und Reinigung niedermolekularer Schutzstoffe aus den gewaschenen Zellmaterialien wird durch das Verfahren wesentlich vereinfacht. Außerdem ermöglicht die in-vivo Entfernung der streßinduzierenden Medienbestandteile und anderer verunreinigender Begleitsubstanzen entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren den direkten Einsatz der extrahierten Inhaltsstoffe ("Solut-Cocktails") in den oben erwähnten Applikationen. Dies ist unter Einsatz herkömmlicher Verfahren bisher nicht möglich, weil die Anwesenheit von Medienbestandteilen in den Extrakten die Schutzwirkung beeinträchtigt. Das beschriebene Verfahren stellt somit eine kostengünstige und schnell durchführbare Methode zur Gewinnung größerer Mengen an Schutzstoffen und stabilisierenden Zellextrakten dar.

Als Zellen, die dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen werden können, kommen insbesondere solche mit einer festen Zellwand in Betracht, z. B. aus der Gruppe der Firmicutes: Actinomyceten, coryneforme Bakterien, Mycobakterien, Brevibakterien, Corynebakterien, Vertreter aus der Gruppe der Bacilli und nahestehender Organismen, wie z. B. der Gattungen Marinococcus, Planococcus, Sporosarcina. Im diesem Falle macht sich das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil zunutze, daß viele Gram-positive Mikroorganismen bei einem Verdünnungsstreß, gleichbedeutend mit dem Entfernen streßinduzierender Medienbestandteile, einen großen Teil der organischen Osmotika weiterhin intrazellulär zurückhalten und während eines längeren Zeitraums nicht ausscheiden oder metabolisieren, diese somit nicht verlorengehen.

Vorteilhaft für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Kultivierung eines geeigneten Mikroorganismus in einem Fermenter. Dabei wird eine hohe Zelldichte, gleichbedeutend mit einer hohen Produktausbeute, (z. B. Hochzelldichte-Fermentation) angestrebt, ist aber für den Einsatz des Verfahrens nicht zwingend erforderlich. Im Anschluß an die Kultivierung werden die Zellen von einer Umgebung mit einer Osmolarität von 1 Osmol und höher in eine Umgebung möglichst geringer Osmolarität überführt. Dies kann z. B. durch Zentrifugation der höherosmolaren Kultur und anschließender Suspendierung des Zellpellets in demineralisiertem Wasser erfolgen, alternativ aber auch durch Medienaustausch mittels einer Querstromfiltrationsanlage oder durch Waschen auf einem Filter. Das Austauschmedium bzw. die Waschlösung kann zur Vermeidung extremen Verdünnungsstresses dabei aus einem flüchtigen Puffer (z. B. Ammoniumacetat, Triethylammoniumbicarbonat) bestehen, oder aber auch Stoffe enthalten, die selbst auf Biomoleküle stabilisierend wirken (z. B. Ammoniumsulfat, kompatible Solute). Um diesen Schritt möglichst schonend zu gestalten, sollte die Temperatur des Austauschmediums (der Waschlösung) möglichst der Kultivierungstemperatur der Zellen entsprechen. Zusätzlich ist auf die Vermeidung physikalischer Kräfte (z. B. Scherkräfte) während des Waschschrittes zu achten. Nach einem abschließenden erneuten Separationsschritt erhält man eine Zellpaste, aus der z. B. nach einer anschließenden Gefriertrocknung direkt für Stabilisierungszwecke verwendbare Inhaltsstoffe (oder "Solute-Cocktails") gewonnen werden können. Die Separation der Zellen vom Austauschmedium sollte ebenfalls schonend durchgeführt werden.

Als extrahierbare Naturstoffe kommen insbesondere Osmotika der folgenden Substanzklassen in Betracht: Ectoine, insbesondere Ectoin und Hydroxyectoin; Aminosäuren, insbesondere Prolin, Glutamat, Glutamin sowie Derivate von Aminosäuren, insbesondere N-acetylierte und N-carbamoylierte Formen der Diaminosäuren Lysin, Ornithin und Diaminobuttersäure; Carbonsäureamide und Derivate wie z. B. N-Carbamoylglutaminamid, N-Acetylglutaminylglutaminamid oder Pyroglutamatamid; Betaine, insbesondere Prolinbetain, Glycinbetain und Carnitin; Zucker und ihre Derivate, beispielsweise Trehalose und Saccharose; Polyole; Peptide und Proteine. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Kombination mit anderen Substanzen als Schutzstoffe Verwendung finden. Im Falle von partiell gereinigten Zellextrakten liegen Vertreter der genannten Substanzklassen zusätzlich im Gemisch mit weiteren nicht genauer definierten Zellinhaltsstoffen vor.

Insbesondere wird von Marinococcus-Arten, Nocardiopsis-Arten, Brevibacterium linens und Brevibacterium iodinum das optisch aktive S,S-α-Amino-β-hydroxyectoin gebildet (Fig. 1).

Diese Substanz ist beispielsweise neben anderen Ectoinderivaten zur Protektion von biologischen Wirkstoffen gegen Einfrieren, hohe Temperaturen und Trocknen einsetzbar (Lippert & Galinski, 1992). Außerdem können Ectoin und Ectoinderivate als Schutzstoff bei der Konservierung getrockneter Zellen Verwendung finden (Louis, Trüper & Galinski 1994). Weitere, bisher nicht veröffentliche Anwendungen, beziehen sich auf den Einsatz von Zellinhaltsstoffen (insbesondere Ectoin und Hydroxyectoin) sowie rohen Zellextrakten zur Stabilisierung von Biomolekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren u. a. in wäßrigen und organischen Lösungsmitteln sowie in Gegenwart denaturierender Agenzien wie Harnstoff, Guanidiniumchlorid, Salzen, Tensiden etc.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, eine von Medienbestandteilen befreite Biomasse zu gewinnen, die als Ausgangsmaterial für weitere Reinigungsschritte bzw. für die Gewinnung einer rohen (bzw. partiell gereinigten) Extraktlösung dienen kann, die unmittelbar für die genannten Stabilisierungszwecke Verwendung findet. Ein typischer Verfahrensablauf zur Gewinnung von Hydroxyectoin am Beispiel einer Marinococcus-Art (Stamm M52) wird im folgenden beschrieben.

Verfahrensbeispiel zur Gewinnung von Hydroxyectoin mit Marinococcus-Stamm M52 (A) Bioreaktor

Zum Einsatz kommt ein Biostat M-Glasreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 1.5 l (B. Braun, Melsungen). Die Prozeßsteuerung sowie die Erfassung von Meßdaten erfolgt mit Hilfe eines Fermenterleitsystems der Fa. Münzer & Diehl (Overath).

Folgende Kultivierungsparameter werden während des Verfahrens gesteuert und aufgezeichnet:

• - pH-Wert: 7.5
• - Kultivierungstemperatur: 35°C
• - Sauerstoffpartialdruck: 40%. Die Regulation dieses Parameters erfolgt über die Rührerdrehzahl (minimale Drehzahl: 100 U/min, maximale Drehzahl: 1200 U/min)

(B) Weitere Geräte

• - Trübungsmeßgerät AS 82 und Trübungsmeßsonde AF 44 S (IMA, Neu-Isenburg) zur On-line Bestimmung sehr hoher Zelldichten.
• - Membranpumpe FE 211 (B. Braun, Melsungen). Die Pumpe wird über das Fermenterleitsystem angesteuert und dient der exponentiellen Zugabe einer Fütterungslösung.
• - Leitfähigkeitsmeßgerät LF 537 und Leitfähigkeitsmeßsonde Tetracon 96 (WTW, Weilheim) zur Bestimmung der Salinität vor und nach einem hypoosmotischen Schock.
• - Querstromfiltrationsanlage der Fa. FILTRON (Minisette Sanitary Cell System) mit drei Filtrationskassetten SS994C02 (Porengröße 0.16 µm, Filterfläche 2100 cm²). Die Anlage dient der Abtrennung der Zellen vom Kultivierungsmedium.

(C) Lösungen: alle Angaben in g/l

• - FP10-Medium: NaCl (90), Meersalz (10), NH₄Cl (2), K₂HPO₄ (0.5), Glucose x H₂O (10), flüssiger Fischpepton S490 der Fa. Primex, Norwegen (14.7, entspricht einer Trockenmasse von 10 g/l), MnSO₄-Stammlösung (0.5 ml, entsprechend 500 g/l).
• - Zufütterungslösung: NaCl (100), Glucose x H₂O (495), NH₄Cl (79.5), K₂HPO₄ (65), MnSO₄-Stammlösung (20 ml). Die Zufütterungslösung wurde sterilfiltriert (Membranfilter der Fa. Schleicher und Schuell, Porengröße 0.2 µm).

(D) Batch-Kultivierung

Der für die Produktion des Enzymschutzstoffes Hydroxyectoin geeignete Marinococcus- Stamm M52 wird im FP10-Medium angezogen, bis die zugegebene Glucose verbraucht ist. Das Trockengewicht zum Ende der Batch-Phase beträgt ca. 6 g/l.

(E) Hochzelldichtekultivierung

Die Kultivierung des Stamms M52 zu hohen Zelldichten wird durch exponentiell ansteigende Zugabe der Zufütterungslösung erreicht. Das Fütterungsprofil kann nach Keller & Dunn (1978) berechnet werden. Die spezifischen Wachstumsraten µ können empirisch ermittelt werden und im Laufe der Kultivierung so verändert werden, daß eine optimale Versorgung der Kultur mit der C-Quelle Glucose erreicht wird. Eine schnelle Abschätzung der im Medium vorhandenen Glucosemenge ist mittels Glucoseteststäbchen der Fa. Boehringer möglich.

Fig. 2 zeigt den Verlauf einer Hochzelldichtekultivierung mit dem Stamm M52. Nach ca. 100 h beträgt das Trockengewicht ca. 35 g/l. Um eine Erhöhung der Endbiomasse zu erreichen kann das alte Kultivierungsmedium durch neues Medium ausgetauscht werden (Pfeil 1). Hierzu wird die Kultur mit Hilfe der Querstromfiltrationseinheit auf ein fünftel des ursprünglichen Volumens konzentriert. In einem nächsten Schritt erfolgt die Zugabe des neuen FP10-Mediums, bis das ursprüngliche Kulturvolumen wieder erreicht ist. Die Zugabe der Zufütterungslösung wird anschließend erneut gestartet. Nach einer Gesamtkultivierungsdauer von 130 h beträgt das Naßgewicht der Kultur ca. 200 g, was einer Trockenmasse von 50-60 g/l entspricht.

(F) Hypoosmotischer Schock

Die hochdichte Kultur wird in einem nächsten Schritt einem hypoosmotischen Schock (Pfeil 2 in Fig. 2) ausgesetzt, um das im Medium vorhandene Salz sowie Medien­ bestandteile (Reste der komplexen Medienbestandteile etc.) zu entfernen. Zur Vorgehensweise bestehen zwei Möglichkeiten:

• (1) Konzentrierung der Zellkultur mittels Querstromfiltrationsanlage auf ca. ein viertel bis ein fünftel des Ausgangsvolumens, gefolgt von der Zugabe demineralisierten Wassers in einem Zeitraum von ca. 5 min, bis das ursprüngliche Ausgangsvolumen wieder erreicht ist. Nach Bestimmung der Restsalinität werden die Zellen mittels Zentrifugation vom Medium abgetrennt und erneut mit demineralisiertem Wasser gewaschen. Nach einem abschließenden Zentrifugationsschritt erhält man ein gewaschenes und von Salzen des Mediums befreites Zellpellet. Fig. 3 vergleicht die Salinität des Mediums (⚫) mit der Konzentration des Enzymschutzstoffes Hydroxyectoin () im Cytoplasma des Stamms M52. Zeitpunkt 1 zeigt die Hydroxyectoin- und Salzkonzentration vor dem hypoosmotischen Schock, Zeitpunkt 2 nach dem ersten Waschschritt und Zeitpunkt 3 nach dem zweiten Waschschritt mit demineralisiertem Wasser.
• (2) direkte Ernte der Zellen mittels Zentrifugation oder in einem Westfalia-Separator und anschließende Zugabe demineralisierten Wassers zur Entfernung von Medienbestandteilen und gelösten Salzen im Zwischenzellwasser des Stamms M52.

(G) Gewinnung von Enzymschutzstoffen aus gewaschenem Zellmaterial

Das gewonnene Zellpellet wird bei 30°C gefriergetrocknet. Kleinere Mengen an Schutzstoffen werden wie folgt gewonnen. Chloroform und Wasser werden in gleicher Menge dem zu extrahierenden Zellmaterial zugegeben (jeweils 1.5 ml zu 1 g gefriergetrockneter Biomasse) und für 15 min geschüttelt. Nach Zentrifugation (10 min, 8000 g) kann die wäßrige Oberphase direkt zur Stabilisierung biologischer Strukturen verwendet werden ("Solut-Cocktails"). Fig. 4 zeigt ein Fließdiagramm des Gesamtprozesses (Fermentation, hypoosmotischer Schock und Gewinnung von "Solut-Cocktails".

Größere Mengen an Schutzstoffen werden wie folgt gewonnen. Extraktion des gefriergetrockneten Zellmaterials (50-200 g) mit Methanol (Soxhlet-Extraktion) und anschließende Entfernung von Proteinen und Lipiden mittels präparativer Chloroform/Wasser-Extraktion. Zur Gewinnung von Hydroxyectoin wird die wäßrige Oberphase im Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingeengt. Die geringere Löslichkeit der Substanz in Methanol macht man sich insofern zunutze, indem der trockene Extrakt mehrfach in einem geringen Volumen dieses Lösungsmittels gelöst wird. Hydroxyectoin fällt dann als weißes Pulver aus und kann nach Dekantierung des die Verunreinigungen enthaltenden Methanols bei ca. 50°C getrocknet werden.

Literatur

Keller R, Dunn IJ (1978) Fed-batch microbial culture: models, errors and applications. J Appl Chem Biotechnol 57: 508-514
Lippert K, Galinski EA (1992) Enzyme stabilization by ectoine-type compatible solutes: protection against heating, freezing and drying. Appl Microbiol Biotechnol 37: 61-65
Louis P, Trüper HG, Galinski EA (1994) Survival of Escherichia coli during drying and storage in the presence of compatibie solutes. Appl Microbiol Biotechnol (in press).

Claims (13)

1. Verfahren zur Gewinnung von Inhaltsstoffen aus halophilen/osmophilen und halotoleranten/osmotoleranten Zellen , wobei die Zellen von einem ersten Zustand, der sich durch eine hohe Konzentration gelöster Stoffe auszeichnet (hoher osmotischer Druck) in einen zweiten Zustand überführt werden, der nur geringe Konzentrationen gelöster Stoffe (geringer osmotischer Druck) enthält. Dabei erfolgt die Veränderung der Konzentration gelöster Stoffe im Medium so, daß die Zellen die im Cytoplasma synthetisierten und/oder akkumulierten Schutzstoffe größtenteils im Zellinnern zurückhalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Änderung einer hohen Konzentration gelöster Stoffe (hoher osmotischer Druck) dadurch erfolgt, daß die Zellen mit Wasser, flüchtigen Puffern (z . B. Ammoniumacetat oder Triethylammoniumhydrogencarbonat) oder Lösungen stabilisierender Substanzen (z. B. Ammoniumsulfat, kompatible Solute) unter Vermeidung mechanischer Streßeinwirkungen gewaschen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die Inhaltsstoffe durch Extraktion, zum Beispiel durch Chloroform/Wasser-Extraktion, gewonnen werden können.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei eine Gewinnung der Inhaltsstoffe durch eine reversible Permeabilisierung der Zellwände nach der Entfernung gelöster Stoffe aus dem Kultivierungsmedium erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei eine reversible Permeabilisierung eine zyklische Prozeßführung erlaubt.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-5, wobei die Zellen Mikroorganismen sind, die einen hohen intrazellulären osmotischen Druck tolerieren, wie z. B. Bakterien mit einer stabilen/festen Zellwand.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Zellen Gram-positive Mikroorganismen sind, wie z. B. Actinomyceten, coryneforme Bakterien, Mycobacterien, Brevibakterien, Corynebakterien, Mitglieder der Gattungen Bacillus, Marinococcus, Planococcus und Sporosarcina.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen von einer Umgebung mit einer Osmolarität von 1 Osmol und höher in eine Umgebung möglichst geringer Osmolarität überführt werden.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1-8, wobei die gewonnenen Inhaltsstoffe in Form roher (partiell gereinigter) Zellextrakte direkt zur Stabilisierung biologischer Strukturen (z. B. Enzyme, Nukleinsäuren, Biomembranen, ganze Zellen) eingesetzt werden können.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die zur Stabilisierung biologischer Strukturen gewinnbaren Inhaltsstoffe zu den folgenden Stoffklassen gehören: Aminosäuren (wie z. B. Glutamat, Glutamin, Prolin und deren Homologe wie Pipecolinsäure); Derivate von Diaminosäuren (wie z. B. acetylierte und carbamoylierte Derivate von Lysin, Ornithin und Diaminobuttersäure); Carbonsäureamide und Derivate (wie z. B. Nα-Carbamoyl-L-Glutamin-1-Amid, N-Acetylglutaminyl- Glutaminamid, Pyroglutamatamid), Ectoine und Derivate (wie z. B. Ectoin und Hydroxyectoin); Betaine (Glycinbetain, Prolinbetain, Carnitin); Zucker (Trehalose, Saccharose); Polyole.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei Osmotika wie Ectoin und Hydroxyectoin aus Marinococcus-Arten gewonnen werden.

12. Verwendung der Extrakte nach Anspruch 9 und der Substanzen nach Anspruch 10 zur Stabilisierung von Biomolekülen in wäßrigen Lösungen, organischen Lösungsmitteln und Gemischen derselben, sowie zur Stabilisierung von Biomolekülen gegen denaturierende Einwirkungen.

13. Verwendung der Extrakte nach Anspruch 9 und der Substanzen nach Anspruch 10 zur Konservierung von lebenden Mikroorganismen oder Zellkulturen in flüssiger, gefrorener und getrockneter Form, z. B. zur Präparation von Referenzmaterial mit konstantem Lebendtiter, zur Verbesserung der Lagerfähigkeit von Starterkulturen und mit Mikroorganismen belegtem Saatgut, sowie zur Konservierung von Mikroorganismen und Zellkulturen in Stammsammlungen.