DE4407699C2

DE4407699C2 - Enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cephalosporin C in Glutaryl-7-aminocephalosporansäure

Info

Publication number: DE4407699C2
Application number: DE4407699A
Authority: DE
Inventors: Kenji Matsuyama; Satoshi Soga
Original assignee: Asahi Kasei Chemicals Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Olon SpA
Priority date: 1993-03-08
Filing date: 1994-03-08
Publication date: 2003-12-18
Anticipated expiration: 2014-03-09
Also published as: ITMI940418A0; GB9404103D0; GB2275925B; ITMI940418A1; FR2702493B1; ATA47694A; ES2097080A1; JPH06315396A; ES2097080B1; FR2702493A1; GB2275925A; IT1269301B; DE4407699A1; AT401269B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes enzyma tisches Oxidationsverfahren zur Überführung von Cephalosporin C in Glutaryl-7-aminocephalosporansäure (kurz: Glutaryl-7-ACA) un ter Verwendung einer D-Aminosäureoxidase-haltigen Mischung (kurz: DAO-haltige Mischung). Insbesondere ist die Esterase aktivität in der DAO-haltigen Mischung beim erfindungsgemäßen Verfahren selektiv herabgesetzt.

Glutaryl-7-ACA ist ein Zwischenprodukt für die Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure (kurz: 7-ACA) aus Cephalosporin C. Cephalosporin C reagiert mit D-Aminosäureoxidase (kurz: DAO) unter Bildung von α-Ketoadipoyl-7-aminocephalosporansäure (kurz: α-Ketoadipoyl-7-ACA), bei dem es sich um ein wärmeinstabiles Zwischenprodukt handelt, und Wasserstoffperoxid; danach wird die gebildete α-Ketoadipoyl-7-ACA durch das Wasserstoffperoxid unter Bildung von Glutaryl-7-ACA oxidiert. Im Hinblick auf höhere Ausbeuten an Glutaryl-7-ACA sind verschiedene enzymatische Ver fahren zur Umwandlung von Cephalosporin C in Glutaryl-7-ACA un ter Verwendung von DAO aus Trigonopsis variabilis (kurz: T variabilis) entwickelt worden. Beispielsweise beschreiben US-A-3 821 209, JP-A-35 119/1980 und 15 635/1984 enzymatische Oxidationsverfahren, die in Gegenwart von Katalaseinhibitoren durchgeführt werden, beispielsweise von anorganischen Aziden und Perborat und einem Überschuß an Wasserstoffperoxid, um eine Zer setzung des Wasserstoffperoxids durch Katalase zu vermeiden. US 3 801 458 beschreibt eine enzymatische Oxidation von Cephalosporin C unter Verwendung aktivierter Zellen von T. variabilis mit einem Katalaseinhibitor unter Verwendung von Natriumazid, um gute Ausbeuten an Glutaryl-7-ACA vorzusehen. EP 0 409 521 A1 beschreibt ein Verfahren zur Inaktivierung von Kata lase in Gegenwart von DAO, indem man die Enzyme mit einer wäs serigen basischen Lösung eines pH-Werts von etwa 11 bis 12 vor der enzymatischen Oxidation von Cephalosporin C zu Glutaryl-7- ACA behandelt.

Diese Verfahren sind jedoch insofern nachteilig, weil die Aus beute durch die Esterase von T. variabilis reduziert wird und die Qualität durch Verunreinigungen beeinträchtigt wird, bei spielsweise Katalaseinhibitoren, wenn sie in wirtschaftlicher Weise im technischen Maßstab durchgeführt werden. Esterase ist ein Enzym, das Cephalosporin C, Glutaryl-7-ACA und α- Ketoadipoyl-7-ACA als Zwischenprodukt in ihre 3-desacetyl-Formen überführt. Diese Desacetylderivate reduzieren nicht nur die Aus beute an Glutaryl-7-ACA, sondern mindern auch die Qualität der Glutaryl-7-ACA als Verunreinigungen. Um daher die Ausbeute und Qualität von Glutaryl-7-ACA zu verbessern, ist es sehr wichtig, die Esteraseaktivität zu inaktivieren oder zu inhibieren.

EP-A-0 409 521 beschreibt ferner ein Verfahren zur Inaktivierung von Esteraseaktivität, bei dem man Zellen von T. variabilis mit Aceton/Wasser behandelt, um die Bildung von Desacetyl-cepha losporin C und Desacetyl-glutaryl-7-ACA zu vermeiden. Diese be kannten Verfahren erfordern jedoch komplizierte und schwierige Stufen zur Acetonentfernung. Es besteht daher ein großes Bedürf nis für ein einfaches und wirkungsvolleres Verfahren zur Inakti vierung von Esterase, das im technischen Maßstab anwendbar ist.

In der WO 90/12110 A1 wird ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephalosporansäure aus Cephalosporin C unter Verwendung einer Mutante von Trigonopsis variabilis mit einer gegenüber dem Wildtyp erhöhten D-Aminosäureoxidase- Aktivität beschrieben.

Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß Patentanspruch 1 ein verbessertes enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cephalosporin C zu Glutaryl-7-ACA enthaltend den Schritt des Inkontaktbringens einer wässrigen Lösung von Cephalosporin C mit einer D-Aminosäureoxidase enthaltenden Mischung in Gegenwart von Sauerstoff, wobei die D-Aminosäureoxidase enthaltende Mischung ein Esterase/D-Aminosäureoxidase-Aktivitätsverhältnis von 5% oder weniger aufweist und vom Stamm Trigonopsis variabilis EL-17 (FERM BP-4467) erhalten wird. Ferner betrifft die Erfindung gemäß Patentanspruch 3 ein enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cephalosporin C zu Glutaryl-7-aminocephalosporan säure, enthaltend den Schritt des Inkontaktbringens einer wäss rigen Lösung von Cephalosporin C mit einer D-Aminosäureoxidase enthaltenden Mischung in Gegenwart von Sauerstoff, wobei die D- Aminosäureoxidase enthaltende Mischung ein Esterase/D-Amino säureoxidase-Aktivitätsverhältnis von 5% oder weniger aufweist und durch Inkontaktbringen von teilzerkleinerten Zellen, per meabilisierten Zellen oder zellfreien Extrakten von Trigonopsis variabilis mit einer Cu-Verbindung bei einer Cu-Konzentration im Bereich von 10 bis 2000 ppm erhalten wird.

Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine ausgezeichnete Ausbeute an Glutaryl-7-ACA in hoher Qualität erhalten werden. Das Verfahren gemäß der Erfindung sieht einfache und sichere Stufen vor, so daß es im technischen Maßstab anwendbar ist.

Unter Cephalosporin C gemäß der Erfindung wird eine wässerige Lösung von Cephalosporin C-Pulver oder eine Cephalosporin C-Fer mentationsbrühe verstanden, bei der die Zellen und Feststoffe entfernt worden sind. Cephalosporin C wird dadurch gebildet, daß man Zellen von Achremonium chrysogenum in einem Kulturmedium mit einem Gehalt an 2% Saccharose, 3% Maisstärke, 5% Rüben molasse, 6% entfettete Sojabohnen (defacted soybean bzw. deffated soybean), 3% Methyloleat, 0,5% Calciumcarbonat, 1,25 % Calciumsulfat und 0,8% Ammoniumacetat oder in einem Nährfermentationsmedium kultiviert.

Die DAO-haltige Mischung, die erfindungsgemäß verwendet wird, umfaßt DAO, beispielsweise teilgereinigte DAO und rohe DAO, und zeigt 5% oder weniger Esteraseaktivität auf Basis der DAO-Akti vität. Die DAO-haltige Mischung kann in beliebiger Form ver wendet werden, beispielsweise als intakte Zellen, teilzer kleinerte Zellen, permeabilisierte Zellen, zellfreie Extrakte und/oder immobilisiertes Enzym. Teilzerkleinerte Zellen, permea bilisierte Zellen, zellfreie Extrakte und immobilisiertes Enzym sind bevorzugt. Sie werden nach bekannten Methoden erhalten.

DAO leitet sich von T. variabilis gemäß der Erfindung ab. Insbesondere wird eine Mutante mit Katalasemangel, beispielsweise der T. variabilis-Stamm KC-103 (hinterlegt im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology unter FERM BP-4359) verwendet, um restliche α-Ketoadipoyl-7-ACA zu vermeiden.

Erfindungsgemäß wird die DAO-haltige Mischung, deren Esteraseak tivität 5% oder weniger der DAO-Aktivität beträgt, gemäß Patentanspruch 3 dadurch erhalten, daß man die Mischung mit einer Cu-Verbindung in Berührung bringt. Die Esteraseaktivität in der DAO-haltigen Mischung wird selektiv dadurch reduziert, daß man die Mischung mit der Cu-Verbindung in einer Konzentra tion von 10 bis 2000 ppm (auf Basis der Gesamtmenge der wässerigen Lösung oder Suspension der DAO-haltigen Mischung) bei 5 bis 25°C 2 bis 24 h lang in Berüh rung bringt. Um die Esterase zu inaktivieren, ohne die DAO-Akti vität zu beeinträchtigen, ist es bevorzugt, daß die Konzentra tion der Cu-Verbindung 10 bis 400 ppm beträgt. Die Esteraseakti vität kann durch diese Behandlung auf die Hälfte oder mehr herabgesetzt werden. Wenn also die DAO-haltige Mischung vom T. variabilis-Stamm KC-103 mit einem Aktivitätsverhältnis Esterase/DAO von 9,1% erhalten wird, kann das Aktivitätsver hältnis auf 4,5% oder weniger reduziert werden.

Erfindungsgemäß wird die Cu-Verbindung mit der DAO-haltigen Mi schung vor dem enzymatischen Oxidationsvorgang in Berührung ge bracht, und zwar bevor Cephalosporin C zugegeben wird. Alterna tiv kann die Cu-Verbindung mit der DAO-haltigen Mischung während des enzymatischen Oxidationsvorganges in Berührung gebracht wer den, und zwar wird sie zur Reaktionsmischung zugegeben, die Cephalosporin C und die DAO-haltige Mischung enthält. In diesem Fall beträgt die Konzentration der Cu-Verbindung 10 bis 2000 ppm auf Basis der Reaktionsmischung. Ein Beispiel für eine Cu-Ver bindung, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist CuSO₄.

Erfindungsgemäß wird die DAO-haltige Mischung, deren Esterase aktivität 5% oder weniger der DAO-Aktivität beträgt, auch von der Mutante Trigonopsis variabilis EL-17 erhalten, die ein Esterase/DAO-Aktivitätsverhältnis von 5% oder weniger zeigt, und die dadurch erhalten wird, daß man einen Mikroorganismus, der DAO bilden kann, mit UV-Licht, Röntgenstrahlen oder einem Mutagen behandelt.

Eine derartige Mutante wird folgendermaßen erhalten. Ein Aus gangsstamm (parent strain), der DAO bilden kann, wird mit UV- Licht, Röntgenstrahlen oder einem Mutagen, beispielsweise N- methyl-N'-nitro-N-nitrosoganisin (kurz: NTG) behandelt und da nach einem Fermentationsmedium kultiviert. Ein Stamm, der eine reduzierte Esteraseaktivität zeigt, wird durch Vermessen der Esteraseaktivität selektiert.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß als Ausgangsstamm eine Mu tante mit Katalasemangel oder eine negative Mutante verwendet wird, um die Bildung von Nebenprodukten zu vermeiden. Ein Bei spiel für eine derartige Mutante ist der T. variabilis-Stamm EL- 17 (hinterlegt bei National Institut of Bioscience and Human- Technologiy, Agency of Industrial Sience and Technology unter FERM BP-4467). Er wird dadurch erhalten, daß man den T. variabi lis-Stamm KC-103 (vergleiche oben) mit NTG behandelt. Die Mu tante besitzt 3,0% der Esteraseaktivität auf Basis der DAG-Ak tivität.

Gegenstand der Erfindung ist auch Trigonopsis variabilis-Stamm EL-17.

Die Esteraseaktivität wird folgendermaßen gemessen. Eine Enzym probe wird zu einem 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5) mit einem Ge halt an 2 g Glutaryl-7-ACA/l zugegeben, wonach man bei 25°C 30 min lang umsetzt. Man gibt Methylalkohol in der selben Menge wie die Reaktionsmischung zu, um die Reaktion abzubrechen. Die Reak tionslösung wird einer HPLC unterworfen, um die Menge an gebil deter desacetylierter Glutaryl-7-ACA zu bestimmen.

Die DAG-Aktivität wird folgendermaßen gemessen. Es wird eine En zymprobe zu einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) mit einem Gehalt an 10 g Cephalosporin C/l zugegeben, wonach man bei 25°C 15 min umsetzt. Methylalkohol in derselben Menge wie die Reaktionsmi schung wird zugegeben, um die Reaktion abzubrechen. Die Reakti onslösung wird einer HPLC unterworfen, um die Menge an gebilde ter Glutaryl-7-ACA und α-Ketoadipoyl-7-ACA zu bestimmen.

Wenn eine DAO-haltige Mischung mit einer Cu-Verbindung während des enzymatischen Oxidationsvorgangs in Berührung gebracht wird, wird die Gesamtmenge an Desacetyl-cephalosporin C und Desacetyl glutaryl-7-ACA vor und nach dem enzymatischen Oxidationsvorgang gemessen. Die erhöhte Menge an Desacetylderivaten auf Basis der Ausgangsmenge von Cephalosporin C wird als ein Aktivitätsver hältnis von Esterase/DAO angesehen.

Die enzymatische Oxidation wird im allgemeinen ausgeführt indem man Sauerstoff durch die Reaktionslösung bei 20 bis 30°C durch bläst. Die Reaktionsdauer hängt von der Konzentration an Cepha losporin C, der Menge und Aktivität der DAO-haltigen Mischung und der Reaktionstemperatur ab. Wenn die Menge an gebildeter Glutaryl-7-ACA ein Maximum erreicht hat, das beispielsweise durch HPLC oder durch TLC ermittelbar ist, kann die Reaktion ab gebrochen werden. Die Reaktion ist im allgemeinen in 30 min bis 4 h vollständig. Um die Menge an verbliebener α-Ketoadipoyl-7- ACA zu reduzieren, kann Wasserstoffperoxid zur Reaktionsmischung zugegeben werden.

Glutaryl-7-ACA wird von der erhaltenen Reaktionsmischung nach bekannten Methoden isoliert.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Nachstehend wird die Erfindung detaillierter anhand von Beispie len erläutert.

Beispiel 1

Man ließ den T. variabilis-Stamm KC-103 in einem Medium mit einem Gehalt an 2% Glukose, 2% Maiswasser und 0,2% DL-Methio nin bei 25°C 60 h lang stehen. Man gab 0,3 ml Toluol zu 60 ml der Fermentationsbrühe, die 6 g feuchte Zellen umfaßte, und mischte bei 25°C 2 h lang, um die Zellen zu permeabilisieren.

Man gab 23,6 mg CuSO₄.5H₂O zur erhaltenen Fermentationsbrühe der permeabilisierten Zellen zu und ließ bei Raumtemperatur 2 h ste hen. Man gab eine geeignete Menge einer Enzymprobe der Cu-halti gen Fermentationsbrühe zu 0,2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) mit einem Gehalt an 2 g Glutaryl-7-ACA/l hinzu. Die Reaktion wurde bei 25°C 30 min lang ausgeführt und durch Zugabe von Me thylalkohol in einer Menge abgebrochen, die der Menge der Reaktionsmischung entsprach, und danach einer HPLC unterworfen. Desacetylierte Glutaryl-7-ACA, die bei der Reaktion gebildet wurde, wurde nicht ermittelt, was anzeigte, daß die Esterase in der Enzymprobe ausreichend inaktiviert worden war.

Man löste 10 g Cephalosporin C-Pulver in 1000 ml Wasser und stellte den pH auf 7,5 ein. Die erhaltene Cephalosporin C-Lösung wurde mit der erhaltenen Cu-haltigen Brühe gemischt und danach bei 20°C etwa 180 min lang umgesetzt, wobei man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung blies. Die Ausbeute an Glutaryl-7- ACA betrug 93,2%.

Beispiel 2

Man erhielt eine Fermentationsbrühe von permeabilisierten Zellen des T. variabilis-Stammes KC-103, dessen Esteraseaktivität inak tiviert worden war, nach derselben Methode wie in Beispiel 1.

Man stellte eine A. chrysogenum-Fermentationsbrühe mit einem Ge halt an 8,5 g Cephalosporin C/l auf pH 2,5 ein und entfernte da nach die Zellen. Der pH der Brühe wurde auf 7,5 eingestellt. Man mischte 1200 ml der erhaltenen Brühe mit 60 ml der erhaltenen T. variabilis-Fermentationsbrühe. Während man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung blies und 23,9 ml 3,5-proz. Wasserstoffperoxid kontinuierlich zur Reaktionsmischung zugab, wurde die Reaktion bei 20°C etwa 240 min lang durchgeführt. Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA betrug 92,8%.

Beispiel 3

Man erhielt eine Fermentationsbrühe permeabilisierter Zellen des T. variabilis-Stammes KC-103 nach derselben Methode wie in Bei spiel 1.

Man löste 10 g Cephalosporin C-Pulver in 1000 ml Wasser und stellte den pH auf 7,5 ein. Die erhaltene Cephalosporin C-Lösung wurde mit 60 ml der erhaltenen T. variabilis-Fermentationsbrühe gemischt. Danach gab man 0,5 g CuSO₄.5H₂O zur resultierenden Mi schung zu. Die Reaktion lief bei 20°C etwa 180 min lang ab, während man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung durchblies. Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA betrug 92,2%. Die erhöhte Ge samtmenge an desacetyliertem Cephalosporin C und des desacety lierter Glutaryl-7-ACA betrug 1% oder weniger auf Basis der Menge an Cephalosporin C.

Beispiel 4

Man erhielt eine Fermentationsbrühe permeabilisierter Zellen des T. variabilis-Stammes KC-103 nach derselben Methode wie in Bei spiel 1. Man mischte 60 ml der T. variabilis-Fermentationsbrühe und 1200 ml der A. chrysogenum-Fermentationsbrühe mit einem Ge halt an Cephalosporin C, die man nach derselben Methode wie in Beispiel 2 erhalten hat.

Man gab 0,5 g CuSO₄.5H₂O zur resultierenden Mischung zu und setzte sie danach bei 20°C etwa 240 min lang um, während man Sauerstoff durchblies und 23,9 ml 3,5-proz. Wasserstoffperoxid kontinuierlich zur Reaktionsmischung zugab. Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA betrug 92,0%. Die erhöhte Gesamtmenge an des acetyliertem Cephalosporin C und desacetylierter Glutaryl-7-ACA betrug 1% oder weniger auf Basis der Menge an Cephalosporin C.

Beispiel 5

Man erhielt 400 ml einer T. variabilis-Fermentationsbrühe mit einem Gehalt an 40 g feuchten Zellen nach derselben Methode wie in Beispiel 1 und behandelte mit 2,0 ml Toluol nach derselben Methode wie in Beispiel 1.

Man gab 157,3 mg CuSO₄.5H₂O zur erhaltenen Brühe zu und ließ die resultierende Mischung bei Raumtemperatur 2 h lang stehen. Man maß die Esteraseaktivität einer Enzymprobe der erhaltenen Cu- haltigen Brühe nach derselben Methode wie in Beispiel 1. Die Esterase der Enzymprobe war ausreichend inaktiviert.

Man löste 10 g Cephalosporin C-Pulver in 1000 ml Wasser und stellte den pH auf 7,5 ein. Die erhaltene Lösung mischte man mit 400 ml der erhaltenen T. variabilis-Fermentationsbrühe. Man führte die Reaktion bei 20°C etwa 30 min lang durch, wobei man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung blies. Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA betrug 99,0%.

Beispiel 6

Man mischte 400 ml einer Fermentationsbrühe permeabilisierter Zellen des T. variabilis-Stammes KC-103, die man nach derselben Methode wie in Beispiel 1 erhielt, und 1000 ml einer wässerigen Cephalosporin C-Lösung, die man nach derselben Methode wie in Beispiel 1 erhielt.

Man gab 0,66 g CuSO₄.5H₂O zur erhaltenen Reaktionsmischung zu und führte die Reaktion bei 20°C etwa 30 min lang durch, wäh rend man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung blies.

Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA betrug 98,1%. Die erhöhte Ge samtmenge an desacetyliertem Cephalosporin C und desacetylierter Glutaryl-7-ACA betrug 1% oder weniger auf Basis der Menge an Cephalosporin C.

Beispiel 7

Man ließ den T. variabilis-Stamm EL-17 in einem Medium mit einem Gehalt an 2% Glukose, 2% Maiswasser und 0,2% DL-Methionin bei 25°C 60 h lang wachsen. Man gab 0,2 ml Toluol zu 25 ml der Fermentationsbrühe mit einem Gehalt an 2,5 g feuchten Zellen und mischte bei 25°C 2 h lang, um die Zellen zu permeabilisieren.

Man gab eine geeignete Menge einer Enzymprobe der Fermentations brühe zu einem 0,2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) mit einem Ge halt an 2 g Glutaryl-7-ACA/l und ließ bei 25°C 30 min lang rea gieren. Man brach die Reaktion ab, indem man Methylalkohol in einer Menge zugab, die der der Reaktionsmischung entsprach und unterwarf sie danach einer HPLC. Das Verhältnis der Esterase aktivität zur DAO-Aktivität wurde auf 1/3 des Werts des Aus gangsstammes reduziert, d. h. 3,0%.

Man löste 10 g Cephalosporin C-Pulver in 1000 ml Wasser und stellte den pH auf 7,5 ein. Die erhaltene Cephalosporin C-Lösung mischte man mit der erhaltenen Fermentationsbrühe permeabili sierter Zellen und ließ die Mischung bei 20°C etwa 180 min lang reagieren, wobei man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung durchblies. Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA betrug 92,6%.

Beispiel 8

Man erhielt eine Fermentationsbrühe permeabilisierter Zellen des T. variabilis-Stammes EL-17 nach derselben Methode wie in Bei spiel 7.

Eine A. chrysogenum-Fermentationsbrühe mit einem Gehalt an 9 g Cephalosporin C/l stellte man auf pH 2,5 ein und entfernte die Zellen. Der pH wurde auf 7,5 mit 6 N NaOH eingestellt. Man mischte 6 m³ der erhaltenen Brühe mit 60 l der erhaltenen T. variabilis-Fermentationsbrühe. Während man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung blies und 13 l 35-proz. Wasserstoffperoxid kontinuierlich zur Reaktionsmischung zugab, führte man die Reak tion bei 20°C etwa 220 min lang durch. Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA betrug 92,2%.

Beispiel 9

Man mischte 125 ml einer Fermentationsbrühe permeabilisierter Zellen des T. variabilis-Stammes EL-17, die man nach derselben Methode wie in Beispiel 7 erhalten hat, und 1000 ml einer wässe rigen Cephalosporin C-Lösung, die man nach derselben Methode wie in Beispiel 1 erhalten hatte. Die Mischung wurde danach bei 20 °C etwa 30 min lang umgesetzt, wobei man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung durchblies. Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA be trug 96,2%.

Vergleichsbeispiel

60 ml einer Fermentationsbrühe permeabilisierter Zellen des T. variabilis-Stammes KC-103, die man nach derselben Methode wie in Beispiel 1 erhalten hatte, und 1000 ml einer wässerigen Cepha losporin C-Lösung, die man nach derselben Methode wie in Bei spiel 1 erhalten hatte, wurden gemischt. Man setzte die Mischung danach bei 20°C etwa 180 min lang um, wobei man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung durchblies. Die Ausbeute an Gluta ryl-7-ACA betrug 83,9%.

Claims

1. Enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cepha losporin C zu Glutaryl-7-aminocephalosporansäure, enthaltend den Schritt des Inkontaktbringens einer wässrigen Lösung von Cephalosporin C mit einer D-Aminosäureoxidase enthaltenden Mischung in Gegenwart von Sauerstoff, wobei die D-Aminosäure oxidase enthaltende Mischung ein Esterase/D-Aminosäure oxidase-Aktivitätsverhältnis von 5% oder weniger aufweist und vom Stamm Trigonopsis variabilis EL-17 (FERM BP-4467) erhalten wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die D-Aminosäureoxidase enthaltende Mischung aus teilzerkleinerten Zellen, permeabi lisierten Zellen, davon erhaltenen zellfreien Extrakten oder immobilisierten Enzymen des Stamms Trigonopsis variabilis EL-17 (FERM BP-4467) besteht.

3. Enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cepha losporin C zu Glutaryl-7-aminocephalosporansäure, enthaltend den Schritt des Inkontaktbringens einer wässrigen Lösung von Cephalosporin C mit einer D-Aminosäureoxidase enthaltenden Mischung in Gegenwart von Sauerstoff, wobei die D-Aminosäure oxidase enthaltende Mischung ein Esterase/D-Aminosäure oxidase-Aktivitätsverhältnis von 5% oder weniger aufweist und durch Inkontaktbringen von teilzerkleinerten Zellen, permeabilisierten Zellen oder zellfreien Extrakten von Trigonopsis variabilis mit einer Cu-Verbindung bei einer Cu- Konzentration im Bereich von 10 bis 2000 ppm erhalten wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die D-Aminosäureoxidase enthaltende Mischung vor oder während dem enzymatischen Oxi dationsprozeß mit der Cu-Verbindung in Kontakt gebracht wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die D-Aminosäureoxidase enthaltende Mischung von einer Katalase-negativen Mutante von Trigonopsis variabilis erhalten wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die D-Aminosäureoxidase enthaltende Mischung vom Trigonopsis variabilis-Stamm KC-103 (FERM BP-4359) erhalten wird.

7. Trigonopsis variabilis-Stamm EL-17 (FERM BP-4467).