DE4407699C2 - Enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cephalosporin C in Glutaryl-7-aminocephalosporansäure - Google Patents
Enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cephalosporin C in Glutaryl-7-aminocephalosporansäureInfo
- Publication number
- DE4407699C2 DE4407699C2 DE4407699A DE4407699A DE4407699C2 DE 4407699 C2 DE4407699 C2 DE 4407699C2 DE 4407699 A DE4407699 A DE 4407699A DE 4407699 A DE4407699 A DE 4407699A DE 4407699 C2 DE4407699 C2 DE 4407699C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- amino acid
- cephalosporin
- glutaryl
- mixture
- aca
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
- C12N9/0024—D-Amino acid oxidase (1.4.3.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
- C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes enzyma
tisches Oxidationsverfahren zur Überführung von Cephalosporin C
in Glutaryl-7-aminocephalosporansäure (kurz: Glutaryl-7-ACA) un
ter Verwendung einer D-Aminosäureoxidase-haltigen Mischung
(kurz: DAO-haltige Mischung). Insbesondere ist die Esterase
aktivität in der DAO-haltigen Mischung beim erfindungsgemäßen
Verfahren selektiv herabgesetzt.
Glutaryl-7-ACA ist ein Zwischenprodukt für die Herstellung von
7-Aminocephalosporansäure (kurz: 7-ACA) aus Cephalosporin C.
Cephalosporin C reagiert mit D-Aminosäureoxidase (kurz: DAO)
unter Bildung von α-Ketoadipoyl-7-aminocephalosporansäure (kurz:
α-Ketoadipoyl-7-ACA), bei dem es sich um ein wärmeinstabiles
Zwischenprodukt handelt, und Wasserstoffperoxid; danach wird die
gebildete α-Ketoadipoyl-7-ACA durch das Wasserstoffperoxid unter
Bildung von Glutaryl-7-ACA oxidiert. Im Hinblick auf höhere
Ausbeuten an Glutaryl-7-ACA sind verschiedene enzymatische Ver
fahren zur Umwandlung von Cephalosporin C in Glutaryl-7-ACA un
ter Verwendung von DAO aus Trigonopsis variabilis (kurz: T
variabilis) entwickelt worden. Beispielsweise beschreiben
US-A-3 821 209, JP-A-35 119/1980 und 15 635/1984 enzymatische
Oxidationsverfahren, die in Gegenwart von Katalaseinhibitoren
durchgeführt werden, beispielsweise von anorganischen Aziden und
Perborat und einem Überschuß an Wasserstoffperoxid, um eine Zer
setzung des Wasserstoffperoxids durch Katalase zu vermeiden. US
3 801 458 beschreibt eine enzymatische Oxidation von
Cephalosporin C unter Verwendung aktivierter Zellen von T.
variabilis mit einem Katalaseinhibitor unter Verwendung von
Natriumazid, um gute Ausbeuten an Glutaryl-7-ACA vorzusehen. EP
0 409 521 A1 beschreibt ein Verfahren zur Inaktivierung von Kata
lase in Gegenwart von DAO, indem man die Enzyme mit einer wäs
serigen basischen Lösung eines pH-Werts von etwa 11 bis 12 vor
der enzymatischen Oxidation von Cephalosporin C zu Glutaryl-7-
ACA behandelt.
Diese Verfahren sind jedoch insofern nachteilig, weil die Aus
beute durch die Esterase von T. variabilis reduziert wird und
die Qualität durch Verunreinigungen beeinträchtigt wird, bei
spielsweise Katalaseinhibitoren, wenn sie in wirtschaftlicher
Weise im technischen Maßstab durchgeführt werden. Esterase ist
ein Enzym, das Cephalosporin C, Glutaryl-7-ACA und α-
Ketoadipoyl-7-ACA als Zwischenprodukt in ihre 3-desacetyl-Formen
überführt. Diese Desacetylderivate reduzieren nicht nur die Aus
beute an Glutaryl-7-ACA, sondern mindern auch die Qualität der
Glutaryl-7-ACA als Verunreinigungen. Um daher die Ausbeute und
Qualität von Glutaryl-7-ACA zu verbessern, ist es sehr wichtig,
die Esteraseaktivität zu inaktivieren oder zu inhibieren.
EP-A-0 409 521 beschreibt ferner ein Verfahren zur Inaktivierung
von Esteraseaktivität, bei dem man Zellen von T. variabilis mit
Aceton/Wasser behandelt, um die Bildung von Desacetyl-cepha
losporin C und Desacetyl-glutaryl-7-ACA zu vermeiden. Diese be
kannten Verfahren erfordern jedoch komplizierte und schwierige
Stufen zur Acetonentfernung. Es besteht daher ein großes Bedürf
nis für ein einfaches und wirkungsvolleres Verfahren zur Inakti
vierung von Esterase, das im technischen Maßstab anwendbar ist.
In der WO 90/12110 A1 wird ein enzymatisches Verfahren zur
Herstellung von 7-Amino-cephalosporansäure aus Cephalosporin C
unter Verwendung einer Mutante von Trigonopsis variabilis mit
einer gegenüber dem Wildtyp erhöhten D-Aminosäureoxidase-
Aktivität beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß Patentanspruch 1 ein
verbessertes enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von
Cephalosporin C zu Glutaryl-7-ACA enthaltend den Schritt des
Inkontaktbringens einer wässrigen Lösung von Cephalosporin C mit
einer D-Aminosäureoxidase enthaltenden Mischung in Gegenwart von
Sauerstoff, wobei die D-Aminosäureoxidase enthaltende Mischung
ein Esterase/D-Aminosäureoxidase-Aktivitätsverhältnis von 5%
oder weniger aufweist und vom Stamm Trigonopsis variabilis EL-17
(FERM BP-4467) erhalten wird. Ferner betrifft die Erfindung
gemäß Patentanspruch 3 ein enzymatisches Oxidationsverfahren zur
Umsetzung von Cephalosporin C zu Glutaryl-7-aminocephalosporan
säure, enthaltend den Schritt des Inkontaktbringens einer wäss
rigen Lösung von Cephalosporin C mit einer D-Aminosäureoxidase
enthaltenden Mischung in Gegenwart von Sauerstoff, wobei die D-
Aminosäureoxidase enthaltende Mischung ein Esterase/D-Amino
säureoxidase-Aktivitätsverhältnis von 5% oder weniger aufweist
und durch Inkontaktbringen von teilzerkleinerten Zellen, per
meabilisierten Zellen oder zellfreien Extrakten von Trigonopsis
variabilis mit einer Cu-Verbindung bei einer Cu-Konzentration im
Bereich von 10 bis 2000 ppm erhalten wird.
Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine
ausgezeichnete Ausbeute an Glutaryl-7-ACA in hoher Qualität
erhalten werden. Das Verfahren gemäß der Erfindung sieht
einfache und sichere Stufen vor, so daß es im technischen
Maßstab anwendbar ist.
Unter Cephalosporin C gemäß der Erfindung wird eine wässerige
Lösung von Cephalosporin C-Pulver oder eine Cephalosporin C-Fer
mentationsbrühe verstanden, bei der die Zellen und Feststoffe
entfernt worden sind. Cephalosporin C wird dadurch gebildet, daß
man Zellen von Achremonium chrysogenum in einem Kulturmedium mit
einem Gehalt an 2% Saccharose, 3% Maisstärke, 5% Rüben
molasse, 6% entfettete Sojabohnen (defacted soybean bzw.
deffated soybean), 3% Methyloleat, 0,5% Calciumcarbonat, 1,25
% Calciumsulfat und 0,8% Ammoniumacetat oder in einem
Nährfermentationsmedium kultiviert.
Die DAO-haltige Mischung, die erfindungsgemäß verwendet wird,
umfaßt DAO, beispielsweise teilgereinigte DAO und rohe DAO, und
zeigt 5% oder weniger Esteraseaktivität auf Basis der DAO-Akti
vität. Die DAO-haltige Mischung kann in beliebiger Form ver
wendet werden, beispielsweise als intakte Zellen, teilzer
kleinerte Zellen, permeabilisierte Zellen, zellfreie Extrakte
und/oder immobilisiertes Enzym. Teilzerkleinerte Zellen, permea
bilisierte Zellen, zellfreie Extrakte und immobilisiertes Enzym
sind bevorzugt. Sie werden nach bekannten Methoden erhalten.
DAO leitet sich von T. variabilis gemäß der Erfindung ab.
Insbesondere wird eine Mutante mit Katalasemangel,
beispielsweise der T. variabilis-Stamm KC-103 (hinterlegt im
National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of
Industrial Science and Technology unter FERM BP-4359) verwendet,
um restliche α-Ketoadipoyl-7-ACA zu vermeiden.
Erfindungsgemäß wird die DAO-haltige Mischung, deren Esteraseak
tivität 5% oder weniger der DAO-Aktivität beträgt, gemäß
Patentanspruch 3 dadurch erhalten, daß man die Mischung mit
einer Cu-Verbindung in Berührung bringt. Die Esteraseaktivität
in der DAO-haltigen Mischung wird selektiv dadurch reduziert,
daß man die Mischung mit der Cu-Verbindung in einer Konzentra
tion von 10 bis 2000 ppm (auf
Basis der Gesamtmenge der wässerigen Lösung oder Suspension der
DAO-haltigen Mischung) bei 5 bis 25°C 2 bis 24 h lang in Berüh
rung bringt. Um die Esterase zu inaktivieren, ohne die DAO-Akti
vität zu beeinträchtigen, ist es bevorzugt, daß die Konzentra
tion der Cu-Verbindung 10 bis 400 ppm beträgt. Die Esteraseakti
vität kann durch diese Behandlung auf die Hälfte oder mehr
herabgesetzt werden. Wenn also die DAO-haltige Mischung vom T.
variabilis-Stamm KC-103 mit einem Aktivitätsverhältnis
Esterase/DAO von 9,1% erhalten wird, kann das Aktivitätsver
hältnis auf 4,5% oder weniger reduziert werden.
Erfindungsgemäß wird die Cu-Verbindung mit der DAO-haltigen Mi
schung vor dem enzymatischen Oxidationsvorgang in Berührung ge
bracht, und zwar bevor Cephalosporin C zugegeben wird. Alterna
tiv kann die Cu-Verbindung mit der DAO-haltigen Mischung während
des enzymatischen Oxidationsvorganges in Berührung gebracht wer
den, und zwar wird sie zur Reaktionsmischung zugegeben, die
Cephalosporin C und die DAO-haltige Mischung enthält. In diesem
Fall beträgt die Konzentration der Cu-Verbindung 10 bis 2000 ppm
auf Basis der Reaktionsmischung. Ein Beispiel für eine Cu-Ver
bindung, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist CuSO4.
Erfindungsgemäß wird die DAO-haltige Mischung, deren Esterase
aktivität 5% oder weniger der DAO-Aktivität beträgt, auch von
der Mutante Trigonopsis variabilis EL-17 erhalten, die ein
Esterase/DAO-Aktivitätsverhältnis von 5% oder weniger zeigt,
und die dadurch erhalten wird, daß man einen Mikroorganismus,
der DAO bilden kann, mit UV-Licht, Röntgenstrahlen oder einem
Mutagen behandelt.
Eine derartige Mutante wird folgendermaßen erhalten. Ein Aus
gangsstamm (parent strain), der DAO bilden kann, wird mit UV-
Licht, Röntgenstrahlen oder einem Mutagen, beispielsweise N-
methyl-N'-nitro-N-nitrosoganisin (kurz: NTG) behandelt und da
nach einem Fermentationsmedium kultiviert. Ein Stamm, der eine
reduzierte Esteraseaktivität zeigt, wird durch Vermessen der
Esteraseaktivität selektiert.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß als Ausgangsstamm eine Mu
tante mit Katalasemangel oder eine negative Mutante verwendet
wird, um die Bildung von Nebenprodukten zu vermeiden. Ein Bei
spiel für eine derartige Mutante ist der T. variabilis-Stamm EL-
17 (hinterlegt bei National Institut of Bioscience and Human-
Technologiy, Agency of Industrial Sience and Technology unter
FERM BP-4467). Er wird dadurch erhalten, daß man den T. variabi
lis-Stamm KC-103 (vergleiche oben) mit NTG behandelt. Die Mu
tante besitzt 3,0% der Esteraseaktivität auf Basis der DAG-Ak
tivität.
Gegenstand der Erfindung ist auch Trigonopsis variabilis-Stamm
EL-17.
Die Esteraseaktivität wird folgendermaßen gemessen. Eine Enzym
probe wird zu einem 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5) mit einem Ge
halt an 2 g Glutaryl-7-ACA/l zugegeben, wonach man bei 25°C 30 min
lang umsetzt. Man gibt Methylalkohol in der selben Menge wie
die Reaktionsmischung zu, um die Reaktion abzubrechen. Die Reak
tionslösung wird einer HPLC unterworfen, um die Menge an gebil
deter desacetylierter Glutaryl-7-ACA zu bestimmen.
Die DAG-Aktivität wird folgendermaßen gemessen. Es wird eine En
zymprobe zu einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) mit einem Gehalt
an 10 g Cephalosporin C/l zugegeben, wonach man bei 25°C 15 min
umsetzt. Methylalkohol in derselben Menge wie die Reaktionsmi
schung wird zugegeben, um die Reaktion abzubrechen. Die Reakti
onslösung wird einer HPLC unterworfen, um die Menge an gebilde
ter Glutaryl-7-ACA und α-Ketoadipoyl-7-ACA zu bestimmen.
Wenn eine DAO-haltige Mischung mit einer Cu-Verbindung während
des enzymatischen Oxidationsvorgangs in Berührung gebracht wird,
wird die Gesamtmenge an Desacetyl-cephalosporin C und Desacetyl
glutaryl-7-ACA vor und nach dem enzymatischen Oxidationsvorgang
gemessen. Die erhöhte Menge an Desacetylderivaten auf Basis der
Ausgangsmenge von Cephalosporin C wird als ein Aktivitätsver
hältnis von Esterase/DAO angesehen.
Die enzymatische Oxidation wird im allgemeinen ausgeführt indem
man Sauerstoff durch die Reaktionslösung bei 20 bis 30°C durch
bläst. Die Reaktionsdauer hängt von der Konzentration an Cepha
losporin C, der Menge und Aktivität der DAO-haltigen Mischung
und der Reaktionstemperatur ab. Wenn die Menge an gebildeter
Glutaryl-7-ACA ein Maximum erreicht hat, das beispielsweise
durch HPLC oder durch TLC ermittelbar ist, kann die Reaktion ab
gebrochen werden. Die Reaktion ist im allgemeinen in 30 min bis
4 h vollständig. Um die Menge an verbliebener α-Ketoadipoyl-7-
ACA zu reduzieren, kann Wasserstoffperoxid zur Reaktionsmischung
zugegeben werden.
Glutaryl-7-ACA wird von der erhaltenen Reaktionsmischung nach
bekannten Methoden isoliert.
Nachstehend wird die Erfindung detaillierter anhand von Beispie
len erläutert.
Man ließ den T. variabilis-Stamm KC-103 in einem Medium mit
einem Gehalt an 2% Glukose, 2% Maiswasser und 0,2% DL-Methio
nin bei 25°C 60 h lang stehen. Man gab 0,3 ml Toluol zu 60 ml
der Fermentationsbrühe, die 6 g feuchte Zellen umfaßte, und
mischte bei 25°C 2 h lang, um die Zellen zu permeabilisieren.
Man gab 23,6 mg CuSO4.5H2O zur erhaltenen Fermentationsbrühe der
permeabilisierten Zellen zu und ließ bei Raumtemperatur 2 h ste
hen. Man gab eine geeignete Menge einer Enzymprobe der Cu-halti
gen Fermentationsbrühe zu 0,2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5)
mit einem Gehalt an 2 g Glutaryl-7-ACA/l hinzu. Die Reaktion
wurde bei 25°C 30 min lang ausgeführt und durch Zugabe von Me
thylalkohol in einer Menge abgebrochen, die der Menge der Reaktionsmischung
entsprach, und danach einer HPLC unterworfen.
Desacetylierte Glutaryl-7-ACA, die bei der Reaktion gebildet
wurde, wurde nicht ermittelt, was anzeigte, daß die Esterase in
der Enzymprobe ausreichend inaktiviert worden war.
Man löste 10 g Cephalosporin C-Pulver in 1000 ml Wasser und
stellte den pH auf 7,5 ein. Die erhaltene Cephalosporin C-Lösung
wurde mit der erhaltenen Cu-haltigen Brühe gemischt und danach
bei 20°C etwa 180 min lang umgesetzt, wobei man Sauerstoff
durch die Reaktionsmischung blies. Die Ausbeute an Glutaryl-7-
ACA betrug 93,2%.
Man erhielt eine Fermentationsbrühe von permeabilisierten Zellen
des T. variabilis-Stammes KC-103, dessen Esteraseaktivität inak
tiviert worden war, nach derselben Methode wie in Beispiel 1.
Man stellte eine A. chrysogenum-Fermentationsbrühe mit einem Ge
halt an 8,5 g Cephalosporin C/l auf pH 2,5 ein und entfernte da
nach die Zellen. Der pH der Brühe wurde auf 7,5 eingestellt. Man
mischte 1200 ml der erhaltenen Brühe mit 60 ml der erhaltenen T.
variabilis-Fermentationsbrühe. Während man Sauerstoff durch die
Reaktionsmischung blies und 23,9 ml 3,5-proz. Wasserstoffperoxid
kontinuierlich zur Reaktionsmischung zugab, wurde die Reaktion
bei 20°C etwa 240 min lang durchgeführt. Die Ausbeute an
Glutaryl-7-ACA betrug 92,8%.
Man erhielt eine Fermentationsbrühe permeabilisierter Zellen des
T. variabilis-Stammes KC-103 nach derselben Methode wie in Bei
spiel 1.
Man löste 10 g Cephalosporin C-Pulver in 1000 ml Wasser und
stellte den pH auf 7,5 ein. Die erhaltene Cephalosporin C-Lösung
wurde mit 60 ml der erhaltenen T. variabilis-Fermentationsbrühe
gemischt. Danach gab man 0,5 g CuSO4.5H2O zur resultierenden Mi
schung zu. Die Reaktion lief bei 20°C etwa 180 min lang ab,
während man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung durchblies.
Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA betrug 92,2%. Die erhöhte Ge
samtmenge an desacetyliertem Cephalosporin C und des desacety
lierter Glutaryl-7-ACA betrug 1% oder weniger auf Basis der
Menge an Cephalosporin C.
Man erhielt eine Fermentationsbrühe permeabilisierter Zellen des
T. variabilis-Stammes KC-103 nach derselben Methode wie in Bei
spiel 1. Man mischte 60 ml der T. variabilis-Fermentationsbrühe
und 1200 ml der A. chrysogenum-Fermentationsbrühe mit einem Ge
halt an Cephalosporin C, die man nach derselben Methode wie in
Beispiel 2 erhalten hat.
Man gab 0,5 g CuSO4.5H2O zur resultierenden Mischung zu und
setzte sie danach bei 20°C etwa 240 min lang um, während man
Sauerstoff durchblies und 23,9 ml 3,5-proz. Wasserstoffperoxid
kontinuierlich zur Reaktionsmischung zugab. Die Ausbeute an
Glutaryl-7-ACA betrug 92,0%. Die erhöhte Gesamtmenge an des
acetyliertem Cephalosporin C und desacetylierter Glutaryl-7-ACA
betrug 1% oder weniger auf Basis der Menge an Cephalosporin C.
Man erhielt 400 ml einer T. variabilis-Fermentationsbrühe mit
einem Gehalt an 40 g feuchten Zellen nach derselben Methode wie
in Beispiel 1 und behandelte mit 2,0 ml Toluol nach derselben
Methode wie in Beispiel 1.
Man gab 157,3 mg CuSO4.5H2O zur erhaltenen Brühe zu und ließ die
resultierende Mischung bei Raumtemperatur 2 h lang stehen. Man
maß die Esteraseaktivität einer Enzymprobe der erhaltenen Cu-
haltigen Brühe nach derselben Methode wie in Beispiel 1. Die
Esterase der Enzymprobe war ausreichend inaktiviert.
Man löste 10 g Cephalosporin C-Pulver in 1000 ml Wasser und
stellte den pH auf 7,5 ein. Die erhaltene Lösung mischte man mit
400 ml der erhaltenen T. variabilis-Fermentationsbrühe. Man
führte die Reaktion bei 20°C etwa 30 min lang durch, wobei man
Sauerstoff durch die Reaktionsmischung blies. Die Ausbeute an
Glutaryl-7-ACA betrug 99,0%.
Man mischte 400 ml einer Fermentationsbrühe permeabilisierter
Zellen des T. variabilis-Stammes KC-103, die man nach derselben
Methode wie in Beispiel 1 erhielt, und 1000 ml einer wässerigen
Cephalosporin C-Lösung, die man nach derselben Methode wie in
Beispiel 1 erhielt.
Man gab 0,66 g CuSO4.5H2O zur erhaltenen Reaktionsmischung zu
und führte die Reaktion bei 20°C etwa 30 min lang durch, wäh
rend man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung blies.
Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA betrug 98,1%. Die erhöhte Ge
samtmenge an desacetyliertem Cephalosporin C und desacetylierter
Glutaryl-7-ACA betrug 1% oder weniger auf Basis der Menge an
Cephalosporin C.
Man ließ den T. variabilis-Stamm EL-17 in einem Medium mit einem
Gehalt an 2% Glukose, 2% Maiswasser und 0,2% DL-Methionin bei
25°C 60 h lang wachsen. Man gab 0,2 ml Toluol zu 25 ml der Fermentationsbrühe
mit einem Gehalt an 2,5 g feuchten Zellen und
mischte bei 25°C 2 h lang, um die Zellen zu permeabilisieren.
Man gab eine geeignete Menge einer Enzymprobe der Fermentations
brühe zu einem 0,2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) mit einem Ge
halt an 2 g Glutaryl-7-ACA/l und ließ bei 25°C 30 min lang rea
gieren. Man brach die Reaktion ab, indem man Methylalkohol in
einer Menge zugab, die der der Reaktionsmischung entsprach und
unterwarf sie danach einer HPLC. Das Verhältnis der Esterase
aktivität zur DAO-Aktivität wurde auf 1/3 des Werts des Aus
gangsstammes reduziert, d. h. 3,0%.
Man löste 10 g Cephalosporin C-Pulver in 1000 ml Wasser und
stellte den pH auf 7,5 ein. Die erhaltene Cephalosporin C-Lösung
mischte man mit der erhaltenen Fermentationsbrühe permeabili
sierter Zellen und ließ die Mischung bei 20°C etwa 180 min lang
reagieren, wobei man Sauerstoff durch die Reaktionsmischung
durchblies. Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA betrug 92,6%.
Man erhielt eine Fermentationsbrühe permeabilisierter Zellen des
T. variabilis-Stammes EL-17 nach derselben Methode wie in Bei
spiel 7.
Eine A. chrysogenum-Fermentationsbrühe mit einem Gehalt an 9 g
Cephalosporin C/l stellte man auf pH 2,5 ein und entfernte die
Zellen. Der pH wurde auf 7,5 mit 6 N NaOH eingestellt. Man
mischte 6 m3 der erhaltenen Brühe mit 60 l der erhaltenen T.
variabilis-Fermentationsbrühe. Während man Sauerstoff durch die
Reaktionsmischung blies und 13 l 35-proz. Wasserstoffperoxid
kontinuierlich zur Reaktionsmischung zugab, führte man die Reak
tion bei 20°C etwa 220 min lang durch. Die Ausbeute an
Glutaryl-7-ACA betrug 92,2%.
Man mischte 125 ml einer Fermentationsbrühe permeabilisierter
Zellen des T. variabilis-Stammes EL-17, die man nach derselben
Methode wie in Beispiel 7 erhalten hat, und 1000 ml einer wässe
rigen Cephalosporin C-Lösung, die man nach derselben Methode wie
in Beispiel 1 erhalten hatte. Die Mischung wurde danach bei 20
°C etwa 30 min lang umgesetzt, wobei man Sauerstoff durch die
Reaktionsmischung durchblies. Die Ausbeute an Glutaryl-7-ACA be
trug 96,2%.
60 ml einer Fermentationsbrühe permeabilisierter Zellen des T.
variabilis-Stammes KC-103, die man nach derselben Methode wie in
Beispiel 1 erhalten hatte, und 1000 ml einer wässerigen Cepha
losporin C-Lösung, die man nach derselben Methode wie in Bei
spiel 1 erhalten hatte, wurden gemischt. Man setzte die Mischung
danach bei 20°C etwa 180 min lang um, wobei man Sauerstoff
durch die Reaktionsmischung durchblies. Die Ausbeute an Gluta
ryl-7-ACA betrug 83,9%.
Claims (7)
1. Enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cepha
losporin C zu Glutaryl-7-aminocephalosporansäure, enthaltend
den Schritt des Inkontaktbringens einer wässrigen Lösung von
Cephalosporin C mit einer D-Aminosäureoxidase enthaltenden
Mischung in Gegenwart von Sauerstoff, wobei die D-Aminosäure
oxidase enthaltende Mischung ein Esterase/D-Aminosäure
oxidase-Aktivitätsverhältnis von 5% oder weniger aufweist
und vom Stamm Trigonopsis variabilis EL-17 (FERM BP-4467)
erhalten wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die D-Aminosäureoxidase
enthaltende Mischung aus teilzerkleinerten Zellen, permeabi
lisierten Zellen, davon erhaltenen zellfreien Extrakten oder
immobilisierten Enzymen des Stamms Trigonopsis variabilis
EL-17 (FERM BP-4467) besteht.
3. Enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cepha
losporin C zu Glutaryl-7-aminocephalosporansäure, enthaltend
den Schritt des Inkontaktbringens einer wässrigen Lösung von
Cephalosporin C mit einer D-Aminosäureoxidase enthaltenden
Mischung in Gegenwart von Sauerstoff, wobei die D-Aminosäure
oxidase enthaltende Mischung ein Esterase/D-Aminosäure
oxidase-Aktivitätsverhältnis von 5% oder weniger aufweist
und durch Inkontaktbringen von teilzerkleinerten Zellen,
permeabilisierten Zellen oder zellfreien Extrakten von
Trigonopsis variabilis mit einer Cu-Verbindung bei einer Cu-
Konzentration im Bereich von 10 bis 2000 ppm erhalten wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die D-Aminosäureoxidase
enthaltende Mischung vor oder während dem enzymatischen Oxi
dationsprozeß mit der Cu-Verbindung in Kontakt gebracht wird.
5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die D-Aminosäureoxidase
enthaltende Mischung von einer Katalase-negativen Mutante von
Trigonopsis variabilis erhalten wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die D-Aminosäureoxidase
enthaltende Mischung vom Trigonopsis variabilis-Stamm KC-103
(FERM BP-4359) erhalten wird.
7. Trigonopsis variabilis-Stamm EL-17 (FERM BP-4467).
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7072793 | 1993-03-08 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4407699A1 DE4407699A1 (de) | 1994-09-15 |
DE4407699C2 true DE4407699C2 (de) | 2003-12-18 |
Family
ID=13439867
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE4407699A Expired - Fee Related DE4407699C2 (de) | 1993-03-08 | 1994-03-08 | Enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cephalosporin C in Glutaryl-7-aminocephalosporansäure |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH06315396A (de) |
AT (1) | AT401269B (de) |
DE (1) | DE4407699C2 (de) |
ES (1) | ES2097080B1 (de) |
FR (1) | FR2702493B1 (de) |
GB (1) | GB2275925B (de) |
IT (1) | IT1269301B (de) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1515679A (zh) * | 1997-09-09 | 2004-07-28 | ���������ﻯѧ����˾ | 不含酯酶的酶 |
WO2020147005A1 (en) | 2019-01-15 | 2020-07-23 | The Procter & Gamble Company | Multilayer dissolvable solid article with apertures or holes |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990012110A1 (en) * | 1989-04-04 | 1990-10-18 | Biopure Corporation | Enzymatic production of 7-amino cephalosporanic acid |
EP0409521A2 (de) * | 1989-07-19 | 1991-01-23 | Eli Lilly And Company | Enzymatische Oxidation von Ceph C zu Glutaryl-7-Aminocephalosporansäure |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1272769A (en) * | 1968-08-02 | 1972-05-03 | Glaxo Lab Ltd | Improvements in or relating to cephalosporin derivatives |
GB1385685A (en) * | 1971-04-21 | 1975-02-26 | Glaxo Lab Ltd | Cephalosporin derivatives |
DE4028119C1 (de) * | 1990-09-05 | 1991-12-05 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | |
IT1252308B (it) * | 1990-12-21 | 1995-06-08 | Antibioticos Spa | Procedimento enzimatico per la produzione di acido 7- amminocefalosporanico e derivati |
CA2100987C (en) * | 1992-07-27 | 1999-06-15 | Kaoru Furuya | A transformant capable of producing d-amino acid oxidase |
-
1994
- 1994-03-03 ES ES09400434A patent/ES2097080B1/es not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-03 GB GB9404103A patent/GB2275925B/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-04 JP JP6058297A patent/JPH06315396A/ja not_active Withdrawn
- 1994-03-07 AT AT0047694A patent/AT401269B/de not_active IP Right Cessation
- 1994-03-07 FR FR9402599A patent/FR2702493B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-08 DE DE4407699A patent/DE4407699C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-08 IT ITMI940418A patent/IT1269301B/it active IP Right Grant
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990012110A1 (en) * | 1989-04-04 | 1990-10-18 | Biopure Corporation | Enzymatic production of 7-amino cephalosporanic acid |
EP0409521A2 (de) * | 1989-07-19 | 1991-01-23 | Eli Lilly And Company | Enzymatische Oxidation von Ceph C zu Glutaryl-7-Aminocephalosporansäure |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB9404103D0 (en) | 1994-04-20 |
AT401269B (de) | 1996-07-25 |
GB2275925A (en) | 1994-09-14 |
GB2275925B (en) | 1996-08-14 |
ITMI940418A1 (it) | 1995-09-08 |
JPH06315396A (ja) | 1994-11-15 |
FR2702493A1 (fr) | 1994-09-16 |
ES2097080A1 (es) | 1997-03-16 |
IT1269301B (it) | 1997-03-26 |
FR2702493B1 (fr) | 1996-02-02 |
ES2097080B1 (es) | 1997-11-16 |
ITMI940418A0 (it) | 1994-03-08 |
DE4407699A1 (de) | 1994-09-15 |
ATA47694A (de) | 1995-12-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3424440C2 (de) | ||
DE69019967T2 (de) | Enzymatisches verfahren zur herstellung von 7-aminocephalosporansäure. | |
DE4407699C2 (de) | Enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cephalosporin C in Glutaryl-7-aminocephalosporansäure | |
DE69022909T2 (de) | Enzymatische Oxidation von Ceph C zu Glutaryl-7-Aminocephalosporansäure. | |
DE3027380C2 (de) | ||
DE4028119C1 (de) | ||
DE2757980C2 (de) | ||
DE2406833C3 (de) | Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Glucoseisomeraseenzympräparates und seine Verwendung | |
DD157564A5 (de) | Verfahren zur bildung des enzyms alpha-galactoxidase und zur hydrolyse von raffinose unter verwendung dieses enzyms | |
DE3600563C2 (de) | ||
DE2527068A1 (de) | Verfahren zur herstellung von cholesterinesterase | |
DE69131286T2 (de) | L-Gulono-Gamma-Lacton Dehydrogenase | |
DE69212713T2 (de) | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Cephalosporinderivaten | |
EP0024345B1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Cholesterinesterase | |
EP0040430B1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Glucosedehydrogenase und hierfür geeignete Mikroorganismen | |
DE3247703A1 (de) | Verfahren zur herstellung von l-threonin | |
EP0492495A2 (de) | Immobilisierte D-Aminosäureoxidase und dessen Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln | |
DE3025424C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Galactoseoxidase | |
AT408448B (de) | Enzymatisches oxydationsverfahren zur umsetzung von cephalosporin c in glutaryl-7-aminocephalosporansäure | |
DE1952012C3 (de) | Biotechnisches Verfahren zur Herstellung alkalischer Protease | |
DE3505353C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Serin | |
EP0114630A2 (de) | Permeabilisiertes Schimmelpilzmycel mit intaktem immobilisiertem Glucoseoxidase-Katalasesystem sowie dessen Herstellung und Anwendung | |
EP0089640B1 (de) | L(+)-Tartrat-Dehydrogenase, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verfahren und Reagens zur Bestimmung von L(+)-Tartrat und D(+)-Malat | |
DE3510963C2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Coenzyms in reduzierter Form | |
AT408449B (de) | Enzymatisches hydrolyseverfahren zur umsetzung von glutaryl-7-aminocephalosporansäure zu 7-aminocephalosporansäure |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: ASAHI KASEI K.K., OSAKA, JP |
|
8304 | Grant after examination procedure | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: ASAHI KASEI PHARMA CORP., TOKIO/TOKYO, JP |
|
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: ANTIBIOTICOS S.P.A., RODANO, IT |
|
R119 | Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee |
Effective date: 20121002 |