AT408448B - Enzymatisches oxydationsverfahren zur umsetzung von cephalosporin c in glutaryl-7-aminocephalosporansäure - Google Patents

Description

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   Die vorliegende Erfindung beschreibt ein verbessertes   enzymatisches   Verfahren zur Oxidation von Cephalosporin C (= Ceph C) zu   Glutaryl-7-aminocephalosporansäure   (= Gl-7-ACA). Dabei wird Ceph C in wässriger Lösung von einer   D-Aminosäureoxidase-haltigen Mischung   (= DAO- haltige Mischung) zu GI-7-ACA umgesetzt. Die DAO-haltige Mischung wird aus Trigonopsis variabilis (= T. variabilis) bereitet, wobei die eingesetzte DAO-Mischung durch das beschriebene Verfahren von störender   O-Acetyl-Cephalosporin-C-Esteraseaktivität   (= Esteraseaktivität) befreit werden, ohne dass dabei die   Da-haze   Mischung an Oxidaseaktivität verliert. 



   GI-7-ACA ist ein Zwischenprodukt zur Herstellung der   7-Aminocephalosporansäure   (= 7-ACA) aus Ceph C.   D-Aminosäureoxidase   katalysiert die Umsetzung von Ceph C mit Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid und der thermisch instabilen a-Ketoadipoyl-7-ACA, welche durch Wasserstoffperoxid zu GI-7-ACA und CO2 oxidiert wird. 



   In verschiedenen Verfahren wurde bisher die Ausbeute der GI-7-ACA-Bildung mit T.   variabilis   verbessert. So kann durch Minderung der Katalaseaktivität das Wasserstoffperoxid der Oxidasereaktion erhalten werden. Dadurch verläuft die Oxidation des Zwischenproduktes   o : -Ketoadipoyl-7-   ACA vollständiger. EP 409 521, US 3 801 458 A, US 3 821 209 A und AT 401 269 B offenbaren eine solche Katalase-Inhibierung durch Laugenbehandlung, Inkubation bei   50 C,   Zugabe von Azid, Ascorbat oder   3-Amino-1, 2, 3-triazol.   Darüberhinaus wird das durch die Katalase verbrauchte Wasserstoffperoxid nachdosiert (JP 52 125 696 A, JP 55 035 119 A und DE 40 28 119 A).

   Schliesslich wird in EP 583 817 die Verwendung katalasefreie Mutanten genannt, die gleichzeitig mehrere Kopien der chromo-somalen DNA zur Steigerung der Oxidaseleistung enthalten. 



   Eine weitere wichtige unerwünschte Nebenreaktion ist die Deacetylierung zu den 3-Hydroxymethylderivaten des Ceph C und der GI-7-ACA (nachfolgend steht DA für Deacetyl) Zum Teil läuft diese Reaktion nicht-enzymatisch und kann daher durch geeignete Wahl allgemeiner Reaktionsparameter beeinflusst werden. Daneben enthalten die DAO-haltige Mischungen aber auch eine Esteraseaktivität, deren selektive Inhibition zu einer bedeutenden Steigerung der Produktqualität und Ausbeute führt. 



   EP 409 521 offenbart die Desaktivierung der Esterase durch Aceton. Dabei werden Zellen von T variabilis in 20%iger wässriger Acetonlösung bei Raumtemperatur inkubiert. Die Esteraseaktivitat nimmt dabei auf unter 90% der Ausgangsaktivität ab und die eingesetzten Zellen werden zugleich permeabilisiert. Durch die Erzeugung von Mehrfachkopien der   chromosomalen   DNA in der Zelle wird in EP 583 817 das Verhältnis von DAO- zu Esteraseaktivität soweit begünstigt, dass die Nebenproduktbildung durch die Esterase an Bedeutung stark abnimmt.

   Schliesslich offenbart AT 401 269 ein Verfahren zur nahezu vollständigen Inaktivierung der Esteraseaktivität permeabilisierter Zellen durch Inkubation bei Raumtemperatur in 1, 5 mM   CuSO-Lösung.   Weiters wird in diesem Patent aufgezeigt, dass durch mutagene Agenzien,   Röntgen- oder UV-Bestrahlung Zellen   erzeugt werden können, weiche zwar DAO-Aktivität zeigen, aber frei von Esteraseaktivität sind. Bei Lee et. al, Biotechnol. Letters 16, 467-472 (1994) wird dagegen an DAO in zellfreie Extrakt von Rhodosporidium toruloides die Esteraseaktivität durch rasches Abkühlen und Erwärmen zwischen 0 und   550C   gesenkt.

   Der dort ebenfalls beschriebene Versuch, die Esteraseaktivität durch Imidazol bzw.   Phenylmethylsulfonsäurefluorid (im   folgenden PMSF genannt) zu inhibieren, wird aber wegen der starken Verluste an   DAO-Aktivitat   und der geringen Wirkung auf die Esteraseaktivität verworfen. 



   Mit den genannten Methoden verbinden sich einige Nachteile, die ihren Einsatz erschweren. 



  So ist Aceton ein leichtbrennbares Losungsmittel, das zudem aus dem Zellbrei nach Abschluss der Inaktivierung mit hohem Aufwand entfernt werden muss. Zudem ist die mit Aceton erreichte Beseitigung der Esteraseaktivität nicht vollständig. Die weiters genannte Verwendung genetisch veranderter Organismen beinhaltet dagegen die komplizierte Erzeugung geeigneter Stämme und verbindet sich zudem mit dem Risiko der genetischen Instabilität der gewonnenen Organismen. Allein der Einsatz von CUS04 zur Inhibition der Esteraseaktivität erscheint als eine einfach zu realisierende Methode. Dennoch ist die Wirkung des CUS04 auf die Esteraseaktivität nicht hinreichend, und wegen des Schwermetalls Kupfer ist die Abwasserbeseitigung problematisch. 



   Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Ceph C in GI-7-ACA, wobei eine wässrige Lösung von Ceph C mit einer DAOhaltigen Mischung in Kontakt gebracht wird und wobei die   DAO-haltige   Mischung frei von Esteraseaktivität ist Die Inhibierung der   Esteraseaktivität   wird dabei durch die Inkubation von Immobili- 

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 sierten bzw. nicht immobilisierten permeabilislerten oder teilweise zerstörten Zellen, zellfreie
Extrakten und teilweise aufgereinigten zellfreie Extrakten mit   Phenylmethansulfonsaurefluorid   (= PMSF) in wässriger Lösung erreicht. Die Esteraseaktivität wird dabei überraschenderweise voll- ständig zerstört, ohne dass die Oxidaseaktivität beeinträchtigt wird.

   PMSF ist bekanntlich ein irre- versibler Inhibitor von Serin-Hydrolasen. Seine Wirkung beruht auf der Sulfonylierung des Serins im katalytischen Zentrum des Enzyms. Das PMSF wird als geringe Menge in ethanolischer Lösung vergleichsweise geringen Volumens eingesetzt. Im Laufe der Inkubation wird überschüssiges
PMSF   rückstandslos   in die unbedenkliche   Phenylmethansulfonsäure   umgesetzt, und das Lösungs- mittel Ethanol verbleibt in der DAO-haltigen Mischung, da es die weiteren Prozessschritte nicht stört. 



   Die vorliegende Erfindung liefert durch die einfache und vollständige Inhibierung der Estera- seaktivität mittels PMSF-Inkubation der DAO-haltigen Mischung sehr gute GI-7-ACA-Ausbeuten   hoher Qualität.    



   Nach der vorliegenden Erfindung wird Ceph C als wässrige Lösung von   Ceph-C-Natriumsalz   oder als Ceph-C-haltige Fermentationsbrühe, worin Zellen und Feststoff beseitigt sind, verwendet. 



   Bevorzugt wird die   DAO-haltige   Mischung aus T.   variabilis-Zellen   gewonnen, die durch eine Inku- bation bei Raumtemperatur und alkalische Einwirkung von ihrer Katalaseaktivität befreit worden sind. Nach der   1-10%gen   Zugabe von ethanolischer PMSF-Lösung (10 g PMSF/1000   ml Ethanol)   in die neutral gepufferte   DAO-haltige   Mischung wird dann die Esteraseaktivität vollständig und irreversibel inhibiert. Die   1% ige   Zugabe der PMSF-Lösung wird dabei bevorzugt, aber auch höhere
PMSF-Konzentrationen haben keinen Einfluss auf die Oxidaseaktivität. 



   Die so gewonnene DAO-haltige Mischung wird dann in einer wässrigen Reaktionslösung mit Ceph C suspendiert, in die Luft oder Sauerstoff unter Druck oder drucklos eingeblasen wird. Die
Reaktion kann im neutralen Bereich bei 10-30 C durchgeführt werden. Ihr Verlauf wird mit HPLC verfolgt, sodass bei Erreichen einer zufriedenstellenden   GI-7-ACA-Ausbeute   die Reaktion abgebrochen werden kann. Die gewonnene GI-7-ACA kann durch übliche Methoden gereinigt oder aber direkt zur weiteren Verarbeitung als Lösung eingesetzt werden. 



   Die Oxidaseaktivität wird mit Ceph C als Substrat gemessen.   0. 5-2   g der DAO-haltigen
Mischung (Zellen sollen vorher permeabilisiert werden) werden in einer 20 mM Ceph C pH 8. 0 bei   25 C   unter Sauerstoffstrom mit einem Rührer suspendiert. Die Zunahme an GI-7-ACA wird mit HPLC gemessen. 



   In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang aber in keiner Weise einschranken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. 



   Beispiel 1   (Zellsuspension) :   
Zellen von T. variabilis ATCC 58536 werden aus einer Fermentationsbrühe durch Zentrifugation abgeerntet (Kubicek-Pranz,   E. M.   et   al.,   Formation of D-amino acid oxidase in the yeast Trigonopsis   variabilis.   Can. J.   Microbiot 1985,   31, pp 624-628). 10 g des gewonnenen Zellpellets (530 U Oxidase) werden im Volumen von 50 ml mit Wasser suspendiert und anschliessend für 90 Minuten bei pH 11 (Natronlauge) und Raumtemperatur inkubiert (490 U Oxidase = 100 %). Danach wird der pH mit Phosphorsäure wieder auf   7. 0 gestellt.

   In   diese Lösung werden nun 500   11   einer   ethanolischen   Lösung mit 10 mg PMSF/ml Ethanol gegeben, und bei Raumtemperatur 3 Stunden inkubiert (450 U Oxidase = 92 %).   10g   Ceph C werden in 1000 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung auf 7. 5 gestellt. Die PMSF-behandelte T.   variabilis-Suspension   wird dazugegeben und die Mischung unter Sauerstoffbelüftung 180 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die danach erreichte GI-7-ACA-Menge entspricht 91% der Ceph-C-Ausgangsmenge. Die Summe der Desacetylierungsprodukte ist mit 3% bezogen auf die Ceph-C-Ausgangsmenge identisch mit der Anfangsmenge. 



   Beim entsprechenden Parallelexperiment ohne PMSF-Einsatz wird dagegen nur eine GI-7ACA-Menge erreicht, die 88% der Ceph-C-Ausgangsmenge entspricht, und die Summe der Desacetylierungsprodukte beträgt 6% der Ceph-C-Ausgangsmenge. 



   Beispiel 2   (Zeilhomocienat) :   

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 bei pH 11 (Natronlauge) und Raumtemperatur inkubiert. Die so erhaltene Zellsuspension wird homogenisiert (385 U Oxidase = 100 %) und dann auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 mit PMSF behandelt (372 U Oxidase = 96 %). Der so erhaltene Zellextrakt wird wie in Beispiel 1 mit Ceph C umgesetzt. Die danach erreichte GI-7-ACA-Menge entspricht 93% der Ceph-C-Ausgangsmenge. 



  Die Summe der Desacetylierungsprodukte verhält sich wie in Beispiel 1. 



   Beim entsprechenden Parallelexperiment ohne PMSF-Einsatz wird dagegen nur eine GI-7ACA-Menge erreicht, die 89% der Ceph-C-Ausgangsmenge entspricht, und die Summe der Desacetylierungsprodukte beträgt 7% der Ceph-C-Ausgangsmenge. 



   Beispiel 3   (Zellimmobilisat) :   
Zellen von T. variabilis ATCC 58536 werden aus einer Fermentationsbrühe durch Zentrifugation abgeerntet (Kubicek-Pranz,   E. M.   et al., Formation of D-amino acid oxidase in the yeast Trigonopsis   variabilis.   Can. J.   Microbial   1985,31, pp 624-628). 10 g des gewonnenen Zell pellets (530 U Oxidase) werden im Volumen von 50 ml mit Wasser und 2 g Polyethylenimin (Molmasse   600.     000-1, 000. 000)   suspendiert und   anschliessend   für 90 Minuten bei pH 11 (Natronlauge) und Raumtemperatur inkubiert. Danach wird der pH mit Phosphorsäure wieder auf 8. 5 gestellt und die Lösung mit 50   ml   Toluol so gerührt, dass eine stabile Emulsion feiner Tröpfchen entsteht.

   Durch Zugabe von 8 ml   25%iger   Glutardialdehydlösung erstarren die Tröpfchen zu festen sphärischen Partikel. Dieses Zellimmobilisat wird mit Wasser gewaschen (290 U Oxidase   = 100   %). Das Immobilisat wird dann in 50 ml 20 mM Phosphatpuffer pH 7. 0 suspendiert, wie unter Beispiel 1 beschrieben mit 500   J. 11   PMSF-Lösung versetzt und 180 Minuten inkubiert. Die Gesamtaktivität beträgt 305 U Oxidase (= 105 %). Der so gewonnene Katalysator wird dann wie unter Beispiel 1 beschrieben in Ceph-C-Lösung eingesetzt. Die danach erreichte GI-7-ACA-Menge entspricht 92% der Ceph-CAusgangsmenge. Die Summe der Desacetylierungsprodukte bleibt wie in Beispiel 1 unverändert. 



   Beim entsprechenden   Parallelexperiment   ohne PMSF-Einsatz wird dagegen nur eine GI-7ACA-Menge erreicht, die 89% der Ceph-C-Ausgangsmenge entspricht, und die Summe der Desacetylierungsprodukte beträgt 7% der Ceph-C-Ausgangsmenge. 



   PATENTANSPRÜCHE : 
1. Enzymatisches Oxidationsverfahren zur Umsetzung von Cephalosporin C in Glutaryl-7- aminocephalosporansäure, wobei eine wässrige Lösung von Cephalosporin C mit einer   D-Aminosäureoxidase-haltigen   Mischung in Kontakt gebracht wird, dadurch gekennzeich- net, dass die D-Aminosäureoxidase-haltige Mischung durch Zusatz von Phenylmethansul- fonsäurefluorid irreversibel von   O-Acetyl-Cephalosporin-C-i-steraseaktivität   befreit worden ist.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Inhibierung der Esteraseak- tivität der D-Aminosäureoxidase-haltigen Mischung bei Phenylmethansulfonsäurefluorid- Konzentrationen von 5-10000 ppm durchgeführt wird.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die D-Aminosäureoxidase- haltige Mischung aus immobilisierten oder nicht immobilisierten Zellen oder immobilisierten und nicht immobilisierten zellfreie Extrakten oder teilweise aufgereinigten Zellextrakten erhalten wird.

   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die D-AminosÅaureoxidase- haltige Mischung aus permeabilisierten und nicht permeabilisierten Zellen erhalten wird.

   5 Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die D-Amino- säureoxidase-haltige Mischung durch die Inkubation mit Phenylmethansulfonsäurefluorid vor oder während des Oxidationsverfahrens irreversibel die 0-Acetyl-Cephalosporin-C- Esteraseaktivität verliert.