KR20030076721A - 무 에스테라제 효소 - Google Patents

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KR20030076721A
KR20030076721A KR10-2003-7011416A KR20037011416A KR20030076721A KR 20030076721 A KR20030076721 A KR 20030076721A KR 20037011416 A KR20037011416 A KR 20037011416A KR 20030076721 A KR20030076721 A KR 20030076721A
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Abstract

에스테라제 활성 및 D-아미노산 옥시다아제 활성을 갖고(갖거나) 에스테라제 활성 및 글루타릴아실라아제 활성을 갖는 혼합물에 있어서, 페닐메틸술포닐 플루오라이드; 효소 활성을 가진 미생물을 1급 아민 또는 2급 아민을 함유하는 폴리머로 처리함으로써 얻을 수 있는 구형의 입자 중에서 고정화된 생체 촉매, 물과 이상계를 형성할 수 있는 유기 용매와 이기능성 시약의 처리에 의해, D-아미노산 옥시다아제 활성의 존재하에 또는 글루타릴아실라아제 활성의 존재하에 존재하는 에스테라제 활성을 감소시키는 방법; 및 7-아미노세팔로스포란산, 7-아미노-3-히드록시메틸-3-세펨-4-카르복실산 및 세팔로스포린 항생제의 생산에 있어서 상기 방법 및 생체촉매들의 용도.

Description

무 에스테라제 효소{Esterase free enzymes}
본 발명은 효소의 제조, 예컨대 7-아미노세팔로스포란산(7-ACA)의 효소적으로 촉매화된 생산에 있어서 유용한 에스테라제 활성의 억제 방법; 및 예컨대 7-ACA 및(또는) 7-아미노-3-히드록시메틸-3-세펨-4-카르복실산 생산에 유용한 효소 제제의 생산에 관한 것이다.
7-ACA는 예를 들면 제약학상 활성인 세팔로스포린 항생제의 생산에 있어서 매우 중요한 중간체로서, 예를 들면 7-ACA는 고리 시스템의 7번 위치의 아민 그룹, 예컨대 세팔로스포린 항생제의 생산에 있어서 중요한 그룹으로 알려지거나 이들의 생산을 위한 중간체에 있어서 중요한 그룹으로서 알려진 그룹에서 아실화되어, 예를 들면 세포탁심, 세프포독심(프록세틸), 세팔로글리신 등의 고리 시스템의 3번 위치에서 메틸아세톡시 그룹을 갖는 7-아미노아실화 세팔로스포린을 얻을 수 있고; 다른 세팔로스포린 항생제 또는 7-ACA로부터 유도될수 있는 이들의 생산을 위한 중간체의 생산에 있어서 매우 중요한 중간체이며; 추가로 고리 시스템의 3번 위치의 메틸아세톡시 그룹을 반응시킴으로서 아세톡시메틸 그룹과는 상이한 그룹, 예컨대세팔로스포린 항생제의 생산에 있어서 중요한 그룹으로 알려지거나 이들의 생산을 위한 중간체에 있어서 중요한 그룹으로서 알려진 그룹으로 치환된 3-치환 세팔로스포린을 얻고; 예를 들면, 아세톡시 그룹의 친핵성 치환 또는 예를 들면, 메틸아세톡시 그룹의 탈아세틸화에 의해 히드록시메틸 그룹(예컨대, HACA)를 얻고; 예들 들면 고리 시스템의 3 번 위치에서, 예컨대 히드록시 그룹의 친핵성 치환에 의해 얻은 히드록시메틸 그룹을 추가로 반응시키거나; 또는 히드록시 메틸 그룹의 히드록시 관능기를 제거하거나 또는 고리 시스템의 3 번 위치에서 히드록시메틸 그룹을 제거하고; 필요에 따라 고리 시스템의 4 번 위치에서 카르복실기를, 예컨대 세팔로스포린 항생제의 생산에 있어서 중요한 그룹으로 알려지거나 이들의 생산을 위한 중간체에 있어서 중요한 그룹으로서 알려진 그룹에 의해 에스테르화시키고; 필요에 따라 그러한 반응에서 얻어진 세팔로스포린 화합물의 염 및(또는) 용매를 예컨대 통상의 방법에 의해 형성할 수 있다. 7-ACA 및 HACA는 예를 들면 세팔로스포린 C(Ceph C)로부터 고리 시스템의 7 번 위치에서 아민 그룹의 탈아실화 및 고리 시스템의 3 번 위치에서 메틸아세톡시 그룹의 탈아세틸화에 의해 각각 효소적으로 얻어질 수도 있다. 효소적 Ceph C 데아실화에 유용한 효소는 D-아미노산 옥시다아제(DAO)로서 이것은 Ceph C의 산화적 탈아미노화(desamination)를 촉매화하여 중간체 α-케토아디포일-7-아미노세팔로스포란산(KA-7-ACA)를 경유하여 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산(Gl-7-ACA)를 형성한다. Gl-7-ACA는 예컨대 글루타릴아실라제(GAC)에 의해 가수분해시켜 글루타르산 및 7-ACA를 얻을 수 있다. 미생물 세포 등의 효소 제제를 포함하는 DAO 및 GAC는 추가로 에스테라제 활성을 함유하는것으로 알려져 있다. 세팔로스포린의 고리 구조의 3 번 위치에서 측쇄의 바람직하지 못한 데아실화는 예를 들면 효소적으로 촉매화된 Ceph C 데아실화에서 에스테라제 활성의 존재에 기인하여 일어날 수도 있으며, 예컨대 Ceph C 및 Gl-7-ACA의 3-히드록시메틸 유도체가 형성될 수 있다. 이것은 7-ACA 품질 및 수율에서 중대한 감소를 초래할 수도 있다. 아세톤 또는 CuSO4처리에 의한 DAO 활성의 존재하에 존재하는 에스테라제 활성을 감소시키기 위한 종래의 기술은 에스테라제 활성을 불완전하게 감소시킬 수 있다.
놀랍게도 본 발명자들은 DAO 활성의 존재하에서 에스테라제 활성 또는 GAC 활성의 존재하에서 에스테라제 활성을 가진 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF)로 처리하면 에스테라제 활성이 상당히, 예컨대 실질적으로 완전하게 감소되는 반면, DAO 또는 GAC 활성은 각각 높게, 예컨대 실질적으로 변화되지 않고 남아있음을 밝견하였다. 이러한 발견은 본 발명에 따라 예컨대 세린 술포닐 화에 의한 세린 함유 단백질의 비가역적 억제제로서 알려진 PMSF가 예를 들면 DAO 또는 GAC 활성에 실질적인 영향을 미침이 없이 DAO 활성의 존재하에 또는 GAC 활성의 존재하에 존재하는 에스테라제 활성을 선택적으로 감소시키기 때문에 놀라운 것이고, 더욱 더 놀라운 것은 예컨대 아실라아제 및 에스테라제의 유사한 기능 및 구조로 인하여 GAC 활성의 존재하에 존재하는 에스테라제 활성의 PMSF에 의한 선택적 및 효과적 억제에 있다.
일면에 있어서, 본 발명은 에스테라제 활성 및 D-아미노산 옥시다아제 활성 및(또는) 글루타릴아실라아제 활성을 가진 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하는 것을 포함하는, 예컨대 여기서 D-아미노산 옥시다아제 활성 또는 글루타릴아실라아제 활성이 남아있는, 예컨대 페닐메틸술포닐 플루오라이드의 처리후에도 실질적으로 처리전과 동일한 것인, 예컨대 미생물 세포 또는 그의 무세포 추출물 중에 존재하는 에스테라제 활성 및 D-아미노산 옥시다아제 활성 및(또는) 글루타릴아실라아제 활성을 가진 혼합물 중에서 D-아미노산 옥시다아제 활성의 존재 또는 글루타릴아실라아제 활성의 존재하에 존재하는 에스테라제 활성을 감소, 예컨대 실질적으로 제거하는 방법을 제공한다. 대표적으로 D-아미노산 옥시다아제 활성은 원래의 값의 91% 이상, 글루타릴아실라아제 활성의 경우에는 원래의 값의 97% 이상 까지도 남아있다.
본 발명의 방법은 다음과 같이 수행할 수 있다:
DAO 활성을 생성하는 공지의 및 예를 들면 상업적으로 입수 가능한 미생물은 예를 들면 트리고놉시스(Trigonopsis), 아스페르길루스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium), 바람직하게는 트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis) 미생물을 포함한다. GAC 활성을 생성하는 공지의 및 예를 들면 상업적으로 입수 가능한 미생물은 예를 들면 슈도모나스(Pseudomonas), 아크로모박터 (Acromobacter), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 예컨대 형질전환체, 즉 예를 들면 통상의 방법에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체 미생물을 포함한다.DAO 활성 또는 GAC 활성 및 에스테라제 활성을 가진 혼합물은 예컨대 상업적으로 또는 통상의 방법에 의해 얻을 수 있고 예를 들면 무세포 추출물, 예컨대 고정화 형태 또는 예를 들면 통상의 방법에 따라 발효 브로쓰로부터 얻을 수 있는 등의 예컨대 부분 정제된 또는 비정제된 세포 및(또는) 삼출 또는 비삼출된 세포 및 (또는) 부분적으로 파괴된 또는 온전한 세포 및(또는) 고정화 또는 비고정화 세포의 형태 등의 미생물 세포의 형태, 바람직하게는 무세포 추출물, 예컨대 고정화된 형태로 얻을 수 있다. 예를 들면 미생물 세포들은 예컨대 발효 브로쓰로부터 수확하여 그대로, 예컨대 습윤 상태, 예컨대 발효 브로쓰의 원심분리후 단리할 수 있거나, 또는 세포들은 예를 들면 통상의 방법으로, 예컨대 세포를 균질화하여 발효 브로쓰로부터 단리하기 전후에 더 처리하여 예를 들면 부분적으로 파괴된 세포를 얻고 및(또는) 세포 또는 그의 단편을 삼출시켜 삼출 세포 또는 세포 분획을 얻고, 및(또는) 세포 또는 세포 분획을 정제하여 예를 들면 부분 정제된 세포 및(또는) 세포 분획 및(또는) 무세포(예컨대, 세포 플로쿨레이션(flocculation)에 의한) 추출물을 얻고 및(또는) 세포 또는 무세포 추출물을 고정화시켜 고정화 및(또는) 고정화된 세포 단편 및(또는) 고정화된 세포 추출물을 얻을 수 있다. 예컨대 고정화는 통상의 방법으로, 예를 들면 후술하는 실시예에 따라서 유퍼깃(EupergitR) 등의 아크릴산(고정화) 비드의 존재하에 또는 이온 교환 수지, 예컨대 렐라이트 디아니온(Relite DianionR)의 존재하에서; 또는 예컨대 후술하는 본 발명의 다른 일면에 따라서 수행할 수 있다.
미생물 세포는 예를 들면 발효 브로쓰로부터 단리한 후 물 또는 완충액 중에 세포를 재현탁시킴으로써 얻을 수 있는 완충액을 가한, 수용성 세포 현탁액의 형태로 사용할 수 있거나 또는 무세포 추출물의 경우에는 무세포 추출물의 수용액을 사용할 수 있다. 현탁액 또는 용액의 pH는 거의 중성, 예컨대 7.0 등의 6.5 내지 8.5의 pH가 좋으며, 7.0 주위가 적절하다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서, 에스테라제 및 DAO 활성을 갖는 혼합물은 예컨대 DAO, 에스테라제 및 카탈라아제 활성을 가지는 수용성 세포 혼합물을 염기성 매질 중에서, 예컨대 가성 소다 용액 존재 하에, 예컨대 pH 10 내지 11과 같은 pH 9 내지 11.5에서 처리함으로써 얻을 수 있는, 예를 들면 천연 카탈라아제 활성이 예를 들면 실질적으로 없을 수도 있다.
에스테라제 활성 및 DAO 활성을 갖는 혼합물 또는 에스테라제 및 GAC 활성을 갖는 혼합물은 예를 들면 적절한 온도, 예컨대 실온에서 적절한 시간 동안, 예컨대 1 내지 5, 예 2.5 내지 4 시간 이상 동안 PMSF, 예컨대 적절한 농도 범위, 예를 들면 1% 내지 10% PMSF 등의 0.5 내지 25%의 농도의 PMSF 용액을 적절한 용매, 예컨대 (C1-4)알칸올 등의 알코올, 예, 에탄올 중에서 처리할 수 있다. 예컨대 세포 현탁액 100 리터 당 PMSF 용액 1000 ml, 예컨대 상기 나타낸 바의 농도 범위의 양은, 예컨대 출발 혼합물 중에 존재하는 DAO 또는 GAC 활성을을 실질적으로 감소시킴이 없이 바람직하지 못한 에스테라제 활성을 실질적으로 완전히 그리고 비가역적으로 제거하는데 충분할 것이다. 에스테라제 활성의 제거는 PMSF-처리된 DAO 또는 GAC함유 혼합물을 사용하여 Ceph C로부터의 Gl-7-ACA 또는 7-ACA 반응에서 얻어지는 탈아세틸화 생성물의 측정에 의해 결정될 수 있다. 비교를 위해 반응은 비교할만한 조건하에서 비-PMSF-처리된 DAO 또는 GAC 함유 혼합물을 수행할 수 있다.
DAO 또는 GAC 활성이 높고, 즉 실질적으로 PMSF 처리전과 동일하고 에스테라제 활성이 예컨대 실질적으로 완전히 제거된 혼합물을 얻을 수 있다. 본 발명에 따라 얻을 수 있는 혼합물은 예를 들면 예컨대 Ceph C로 부터 7-ACA의 생산에 있어서 유용하다. 얻어지는 7-ACA의 수율 및 순도는 PMSF 처리된 DAO 및(또는) GAC 활성이 비교할만한 반응 조건하에서 비-PMSF 처리된 DAO 및(또는) GAC 활성과 비교하여 사용하였을 때 개선될 수 있다. 따라서, 예를 들면 본 발명에 따른 에스테라제 활성의 제거는 DAO 또는 GAG 반응 동안 에스테라제 활성에 기인하는 3-탈아세틸화 부산물을 덜, 예컨대 실질적으로는 거의 생성하지 않는 결과를 초래한다. 본 발명의 공정에 의해 얻을 수 있는 Gl-7-ACA 또는 7-ACA에서 3-탈아세틸화 부산물의 바람직하지 못한 양은 예컨대 실질적으로는 출발물질로서 사용된 Ceph C에서와 같다(대표적으로는 3% 출발 활성을 나타내는 공정에서 1% 이내인 반면 PMSF를 사용하지 않는 경우 이는 6%까지 올라간다).
또다른 일면에 있어서 본 발명은
i) 에스테라제 활성 및 D-아미노산 옥시다아제 활성을 갖는 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하여, 예컨대 에스테르 활성이 실질적으로 없고, 예컨대 PMSF 처리 전과 실질적으로 동일한 D-아미노산 옥시다아제 활성을 갖는 혼합물을 얻는 단계,
ii) 세팔로스포린 C를 상기 단계 i)에서 얻은 혼합물과 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 얻고, 필요시 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 단리하는 단계를 포함하는,
글루타릴-7-아미노세팔로스포란산의 생산 방법을 제공한다.
또다른 일면에 있어서 본 발명은
i) 에스테라제 활성 및 D-아미노산 옥시다아제 활성을 갖는 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하여, 예컨대 에스테르 활성이 실질적으로 없고, 예컨대 PMSF 처리 전과 실질적으로 동일한 D-아미노산 옥시다아제 활성을 갖는 혼합물을 얻는 단계,
ii) 세팔로스포린 C를 상기 단계 i)에서 얻은 혼합물과 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 얻는 단계, 및
iii) 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 7-아미노세팔로스포란산으로 전환시키고, 필요시 7-아미노세팔로스포란산을 단리하는 단계를 포함하는,
7-아미노세팔로스포란산의 생산 방법을 제공한다.
글루타릴-7-아미노세팔로스포란산의 7-아미노세팔로스포란산으로의 전환은 통상의 방법, 예컨대 화학적으로 또는 효소적으로 또는 본 발명의 명세서에 기술된 바의 다른 일면에 따라서 수행할 수 있다.
또다른 일면에 있어서 본 발명은
i) 에스테라제 활성 및 D-아미노산 옥시다아제 활성을 갖는 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하여, 예컨대 에스테르 활성이 실질적으로 없고, 예컨대 PMSF 처리 전과 실질적으로 동일한 D-아미노산 옥시다아제 활성을 갖는 혼합물을 얻는 단계,
ii) 세팔로스포린 C를 상기 단계 i)에서 얻은 혼합물과 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 얻는 단계;
iii) 에스테라제 활성 및 글루타릴아실라아제 활성을 갖는 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하여, 예컨대 에스테르 활성이 실질적으로 없고, 예컨대 PMSF 처리 전과 실질적으로 동일한 D-아미노산 옥시다아제 활성을 갖는 혼합물을 얻는 단계,
iv) 단계 ii)에서 얻은 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 단계 iii)에서 얻은 혼합물과 반응시켜 7-아미노세팔로스포란산을 얻고 필요시 단계 ii)에서 얻은 7-아미노세팔로스포란산을 단리하는 단계를 포함하는,
7-아미노세팔로스포란산의 생산 방법을 제공한다.
Ceph C로부터 7-ACA를 얻는 본 발명의 방법은 다음과 같이 수행할 수 있다:
출발 물질 Ceph C는 예컨대 유리 형태 또는 염 형태의 Ceph C의 수현탁액 또는 용액의 형태일 수 있으며; 예컨대 Ceph C는 예컨대 세포 및 고상물이 예컨대 통상적인 방식으로 제거된 발효 브로스를 함유하는 Ceph C의 형태이거나 또는 예컨대 나트륨 염 형태의 Ceph C 염의 형태일 수 있다. Ceph C의 현탁액 또는 용액은 본 발명에 따라 PMSF로 전처리된, 예컨대 상기한 바의 형태의 DAO를 갖는 혼합물로 처리할 수 있으며, 예를 들면 미생물 세포 수현탁액 또는 무세포 추출물을, 산소를 현탁액 또는 용액 중에, 예를 들면 산소 가스의 형태로 또는 공기의 형태로, 또는이들의 혼합물의 형태로 필요시 가압하에 도입시키면서, Ceph C의 현탁 수용액 또는 용액(또는 그 반대)에 첨가할 수 있다.
이 반응은 적절한 pH, 예컨대 중성 근처의 pH, 예를 들면 7.0 내지 7.5 등의 6.5 내지 8.0의 pH에서, 적절한 온도, 예컨대 10 ℃ 내지 30 ℃, 예를 들면 실온에서 수행할 수 있다. DAO 활성의 양, 예컨대 Ceph C의 양에 비한 DAO 활성을 갖는 무세포 추출물의 현탁액의 양은 사용된 세포 현탁액 중에 존재하는 DAO 활성 및 반응시킬 Ceph C의 양에 의존하며 결정적인 것은 아니고; 단기 반응 시간에 필요한 양은, 예를 들면 통상적인 방법, 에컨대 HPLC 결정에 의해 정규 시간 간격 동안 혼합물 중에 형성된 Gl-7-ACA의 양의 결정에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
얻은 Gl-7-ACA는 예를 들면 통상의 방법에 의해 단리 및 정제할 수 있거나 또는 그대로 추가의 처리 공정, 예컨대 7-ACA의 생산에 사용할 수 있다.
옥시다아제 활성은 다음과 같이 결정할 수 있다: 삼출 세포의 형태에 있어서 DOA 활성을 가지는 혼합물 0.2 내지 5g을 교반하에 약 20 mM Ceph C 용액 중에서 pH 8.0에서, 25 ℃에서 산소 기류를 혼합물 중에 도입시켜 산소 포화시키면서 현탁시킨다. Gl-7-ACA 및 KA-7-ACA의 증가는 HPLC에 의해 결정한다. "1 U 옥시다아제"의 활성은 상기 조건하에서 1μmol/min Gl-7-ACA 및 KA-7-ACA의 형성에 대응한다.
예를 들면, 본 발명에 따라 얻을 수 있거나 얻어진 Gl-7-ACA의 수용액 또는 현탁액은 본 발명에 따라 PSMF로 전처리한 GAC 활성을 가지는 혼합물과 접촉시키고, 예를 들면, 수용액, 예컨대 완충액 첨가 세포 현탁액 또는 무세포 추출물을 Gl-7-ACA의 수현탁액 또는 용액에 첨가할 수 있다(또는 그 반대). 이 반응은 적절한 pH, 예컨대 8.2 주변과 같은 7.5 내지 8.5 사이의 pH를 포함하는 약간 염기성인 pH에서, 적절한 온도, 예컨대 10 ℃ 내지 30 ℃, 예를 들면 실온에서 수행할 수 있다. Gl-7-ACA의 양에 대한 GAC의 활성의 양은 세포 현탁액 또는 사용된 무세포 추출물에 존재하는 GAC 활성 및 반응시킬 Gl-7-ACA의 양에 의존하며, 결정적인 것은 아니고; 단기 반응 시간에 필요한 양은 예를 들면 통상적인 방법, 에컨대 HPLC 결정에 의해 정규 시간 간격 동안 혼합물 중에 형성된 7-ACA의 양의 결정에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
GAC 활성은 다음과 같이 결정할 수 있다: GAC 활성을 가지는 혼합물 0.5 내지 2g을 교반하에 5 mM 인산염을 함유한 2% 수용성 Gl-7-ACA 용액 중에서 pH 8.0에서, 37 ℃에서 현탁시킨다. pH를 수산화 나트륨 수용액 100 mM을 첨가함으로써 8.0으로 유지시킨다. 사용된 수산화 나트륨의 양을 결정하고 이는 Gl-7-ACA로 부터 형성된 글루타르산 또는 7-ACA의 양에 각각 대응한다. "1 U 아실라아제"의 활성은 상기 조건하에서 1μmol/min 글루타르산 또는 7-ACA의 형성에 대응한다.
얻은 7-ACA는 예를 들면 통상의 방법에 의해 단리 및 정제할 수 있거나 또는 그대로 추가의 처리 공정, 예컨대 7-ACA의 반응에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 7-ACA는 고순도일 수 있으며, 예를 들면 얻은 7-ACA 소량의 3-데아실화 생성물을 포함할 수 있으며 고 순도로 얻을 수 있는데; 예를 들면 비전처리된 DOA 활성 및(또는) 비전처리된 GAC 활성이 비교할만한 반응 조건하에서 사용되는 공정에서보다 더 높은 수율로 얻을 수 있다.
예컨대, 미생물 세포를 포함하는 효소는 고정화시킬 수 있는 것으로 알려져있다. 미생물 세포를 포함하는 고정화 효소는 예를 들면 용이한 회수 및 재사용의 가능성으로 인하여 유용할 수 있다. 고정화 미생물 세포를 생산하기 위한 공지의 방법은 결점을 가질 수도 있으며, 예컨대 낮은 효소 안정성 및(또는) 낮은 특이적 효소 활성을 갖는 고정화 세포가 얻어질 수 있고/또는 고정화 공정이 복잡할 수 있다. 놀랍게도 효소 활성, 예를 들면 DAO 또는 GAC 활성을 갖는 미생물 세포에 대한 간단한 고정화 공정이 발견되기에 이르렀으며 여기서 고정화 세포는 안정되고 높은 특이성을 가진 효소 활성을 함유하는 고체 구형의 입자의 형태로 얻을 수 있다.
또다른 일면에 있어서, 본 발명은
i) 미생물 세포를 1급 아민 또는 2급 아민을 함유하는 폴리머로 처리하고,
ii) 물과 이상계를 형성할 수 있는 유기 용매를 미생물 세포의 혼합물과 접촉시키고, 예컨대 미생물 세포의 혼합물을 물과 이상계(two-phase system)를 형성할 수 있는 용매에 첨가하고,
iii) 단계 ii)에서 얻은 혼합물을 이관능성 시약으로 처리하고; 얻은 구형 입자를 단리하는 단계를 포함하고;
예를 들면, 추가로 미생물 세포를 i) 또는 ii) 단계를 수행하기 전에 이관능성 시약으로 전처리하고; 및/또는
수혼화성 용매를 구형의 입자를 단리하기 전에 단계 iii)에서 얻은 혼합물에 첨가하고; 및(또는)
고체를 단계 i) 에서 얻은 혼합물에 첨가하거나 또는 단계 i)을 수행하기전에 미생물 세포에 첨가하는 단계를 포함하는,
구형의 입자를 예컨대 고체의 형태로 효소 활성을 가진 미생물 세포로부터 제조하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 통상 생물 촉매로서 표시되는 효소적 활성을 갖는 미생물 세포를 고정화시키는데 유용하다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 미생물은 세균, 효모, 균류 및 방선균 등의 모든 종류의 미생물, 예를 들면 트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis) 등의 트리고놉시스(Trigonopsis), 아그로박테리움 라디오박터 (Agrobacterium radiobacter) 등의 아그로박테리움(Agrobacterium), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis) 등의 로도툴라(Rhodotula), 플레우로투스 오스트레아투스(Pleuorotus ostreatus) 등의 플레우로투스(Pleuorotus), 아스페르길루스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium), 슈도모나스(Pseudomonas), 아크로모박터(Achromobacter), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 등의 바실러스(Bacillus), 스키조사카로마이세스 프롬베(Schizosaccharomyces prombe) 등의 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces); 또는 효소적 활성을 지닌 대장균 형질전환체 등의 형질전환체를 포함한다. 효소 활성은 모든 형태의 효소 활성, 예컨대 하이드롤라아제, 아이소머라제, 라이아제(lyase), 데카르복실라아제, 옥시리덕타아제 활성 등을 포함한다. 효소적 활성을 가진 미생물 세포의 예 로는 예컨대 플레우로투스, 예를 들면 페니실린-V 아실라아제 활성을 가진 플레우로투스 오스트레아투스 세포, 아그로박테리움, 예를 들면 히단토이나아제 및(또는) N-데카르바모일라아제 활성을 가진 아그로박테리움 라디오박터 세포, 로도토룰라, 예를 들면 에스테라제 및(또는) 옥시다아제 활성을 가진 로도토룰라 글루티니스 세포, 트리고놉시스, 예를 들면 DAO 활성을 지닌 트리고놉시스 바리아빌리스, 스키조사카로마이세스, 예를 들면 GAC 활성을 지닌 스키조사카로마이세스 프롬베; 및 형질전환 세포, 예를 들면 GAC 및(또는) 에스테라제 활성을 갖는 대장균 세포를 포함한다.
본 발명의 방법은 예를 들면 Ceph C로부터 출발하여 7-ACA 또는 HACA 생산에 유용한 고정화 미생물 세포, 예를 들면 에스테라제(및/또는 데아세틸라아제) 활성의 존재하에 예를 들면 DAO 활성을 가지는 세포 및(또는) 에스테라제(및/또는 데아세틸라아제) 활성의 존재하에 GAC 활성을 가지는 세포의 생산에 특히 관심이 있다.
본 발명에 따른 방법은 다음과 같이 수행할 수 있다:
효소 활성을 가진 미생물 세포는 예를 들면 통상의 방법에 따라 발효 브로쓰로부터 얻을 수 있다. 미생물 세포는 임의의 형태, 예를 들면 부분 정제된 또는 비정제된 세포 및(또는) 삼출 또는 비삼출된 세포 및 (또는) 부분적으로 파괴된 또는 온전한 세포일 수 있다. 예를 들면 미생물 세포들은 예컨대 발효 브로쓰로부터 수확하여 그대로, 예컨대 습윤 상태, 예컨대 발효 브로쓰의 원심분리후 단리할 수 있거나 또는 세포들은 예를 들면 통상의 방법으로, 예컨대 세포를 균질화하여 발효 브로쓰로부터 단리하기 전후에 더 처리하여 예를 들면 부분적으로 파괴된 세포를 얻고 및(또는) 세포 또는 그의 단편을 삼출시켜 삼출 세포 또는 세포 분획을 얻고, 및(또는) 세포 또는 세포 분획을 정제하여 예를 들면 부분 정제된 세포 및(또는) 세포 분획을 얻는다.
미생물 세포에 있어서 바람직하지 못한 효소 활성은 세포의 고정화 전에, 예를 들면 통상의 방법에 의해 제거할 수 있다. 예를 들면 트리고놉시스, 예컨대 트리고놉시스 바리아빌스에서 촉매 활성은 예를 들면 염기성 pH, 예를 들면 9 내지 12의 pH 하에서, 예를 들면 가성 소다 용액을 예컨대 미생물 세포 단독의 혼합물 또는 1급 및(또는) 2급 아민을 함유하는 폴리머의 존재하에서, 임의로 첨가제, 예를 들면 β-머캅토에탄올, 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산(EDTA) 등의 첨가제의 존재하에서 미생물 세포의 혼합물에 일정 시간 동안, 예컨대 15분 이상 첨가함으로써 제거할 수 있다.
본 발명에 따르면, 미생물 세포는 이관능성 시약으로 전처리할 수 있다. 본 발명에서 사용된 이관능성 시약은 1급 및(또는) 2급 아민 그룹과 반응할 수 있는 적어도 2개의 반응성 그룹을 가진 것으로, 예를 들면 글루타르알데히드, 디메틸 피멜리미데이트, 에피클로로히드린, N,N'-카르보닐디이미다졸, 1,4-부탄디올-1-디클리시딜에테르, 말레산 무수물, 디사이클로헥실카르보디이미드, 헥사메틸렌디이소시아네이트, 바람직하게는 글루타르알데히드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 세포의 전처리는 발효 브로쓰에서 또는 미생물 세포의 단리 후에, 바람직하게는 발효 브로쓰에서 수행할 수 있다. 예를 들면, 이기능성 시약은 미생물 세포 현탁액에 예컨대 용해된 형태로 첨가될 수 있으며, 예컨대 글루타르알데히드는 수용액으로, 예를 들면 10% 내지 30% 수용액으로 사용할 수 있으며 첨가후 얻어진 혼합물은 일정 시간 동안, 예컨대 30분 내지 수 시간, 예를 들면 30 분 내지 5 시간 동안 교반시킬 수 있다. 세포의 양에 대한 이관능성 시약의 양은 중요하지 않다; 예를 들면 건조 세포 중량의 100 g 당 이관능성 시약 예컨대 0.1g 내지 100g, 예를 들면 5g내지 50 g을 편리하게 사용할 수 있고; 예컨대 글루타르알데히드가 이관능성 시약으로 사용될 경우 25% 수용액의 0.5g 내지 200 g, 예를 들면 1g 내지 100g이 적절할 수 있다. 이관능성 시약으로 전처리한 다음 세포들을 통상의 방법으로 수확하고 단리하여, 예를 들면 미세여과 및(또는) 원심분리에 의해 농축시키고 찬 곳, 예를 들면 냉동 상태로 저장한다. 추가의 사용을 위해, 냉동 세포를 해동하고 용수로 세척하고, 필요시 미세여과 등의 통상의 방법으로 농축시킨다.
예를 들면 상기한 바와 같이 전처리한 미생물 세포는 예컨대 완충액 첨가한, 수용성 세포 현탁액의 형태로, 예컨대 6.0 내지 10.0의 pH, 예를 들면 8.0 또는 8.0 주위에서 예컨대 발효 브로쓰로부터 단리한 후 물 중에 세포를 재현탁시키고, 임의로 추가의 처리하여 사용할 수 있다. 필요에 따라, 첨가제, 예를 들면 β-머캅토에탄올, 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산(EDTA)을 현탁액에 예를 들면 통상의 양으로 첨가할 수 있다. 얻어진 현탁액에 바람직하게는 수용성인, 폴리에틸렌 이민 및 폴리비닐아민 등의 1급 및(또는) 2급 아민을 함유하는 폴리머, 예컨대 600,000 내지 1,000,000의 분자량을 가지는 예를 들면 10% 내지 50% 수용액 중의 폴리에틸렌 이민을 첨가한다. 1급 및(또는) 2급 아민을 함유하는 폴리머는 예를 들면 상업상 입수 가능하거나 또는 예를 들면 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 건조 세포 질량에 대한 1급 및(또는) 2급 아민을 함유하는 폴리머의 양은 중요하지 않으며, 예를 들면 건조 미생물 세포 중량 100g 당 1g 내지 100g, 예를 들면 5g 내지 70g의 양, 예컨대 10g 내지 50g을 포함한다.
세포/폴리머 혼합물은 물과 이상계를 형성할 수 있는 유기 용매와 접촉시키며, 예를 들면 세포/폴리머 혼합물은 물과 이상계를 형성할 수 있는 유기 용매에 도입시킨다. 적절한 유기 용매는 예를 들면 트리알킬 포스페이트, 예 트리부틸 포스페이트, 예컨대 n-트리부틸 포스페이트, 알칸, 예를 들면 n-헥산, n-헵탄, 방향족 탄화수소, 예컨대 톨루엔, 천연 또는 합성 오일, 예컨대 대두유, 실리콘 오일, 디젤 오일, 방향족 또는 지방족, 예컨대 (C3-8)알킬, 예를 들면 (C4-6)알킬, 예, 모노- 또는 디-카르복실산 알킬, 예컨대 (C1-8)알킬, 예를 들면 (C1-4)알킬을 포함하며 글루타르산, 숙신산, 아디프산 디메틸- 또는 디에틸에스테르, 벤조산 또는 프탈산 에틸-, 부틸-, 디부틸- 또는 디이소부틸에스테르 및 아니스 알코올, 바람직하게는 트리아킬 포스페이트를 포함한다. 유기 용매의 양은 미생물 현탁액이 유기 용매 중에 예를 들면 라미나, 용매로의 교반에 의해 분산되도록 하는 양으로; 건조 세포 중량 g 당, 예를 들면 1 ml 내지 100 ml, 예컨대 3 ml 내지 50 ml의 용매를 편리하게 사용할 수 있다.
세포, 폴리머 및 유기 용매를 함유하는 혼합물은 일정 시간 동안, 예를 들면 균질한 현탁액이 얻어질 때까지 교반시키고, 예를들면 글루타르알데히드, 에피클로로히드린, N,N'-카르보디이미다졸, 1,4-부탄디올-디클리시딜에테르, 말레산 무수물, 디시클로헥실카르보디이미드, 헥사메틸렌디이소시아네이트, 바람직하게는 글루타르알데히드를 포함하는 이관능성 시약으로 처리한다. 이관능성 시약의 양은 중요하지 않으며, 건조 세포 중량 100 g 당 이관능성 시약 예컨대 0.5g 내지 100g의 양을 포함하며, 예를 들면 이관능성 시약으로서 글루타르알데히드를 사용하는 경우에25% 수용액 약 1g 내지 200g을 편리하게 사용할 수 있다. 이관능성 시약을 세포를 함유하는 혼합물에 첨가할 때, 폴리머 및 유기 용매 가교가 시작되며 예를 들면 수분 내에 종결되고, 예컨대 사용된 용매 혼합물 중의 미생물 세포의 고체 구형 입자의 현탁액이 얻어질 수 있다. 필요에 따라, 얻어진 현탁액은 수혼화성이고 효소 활성에 관련하여 무해한, 예컨대 효소 활성에 관련하여 비-손상성일 수 있는 예를 들면 알코올류, 케톤류, 폴리에틸렌글리콜류, 글리세롤, 바람직하게는 글리세롤인 유기 용매와 접촉시킬 수 있으며, 예를 들면 얻어진 세포 현탁액을 유기 용매 중에 도입시키거나 또는 용매를 얻어진 세포 현탁액에 첨가할 수도 있다. 수혼화성 유기용매의 양은 중요하지 않으며 반응 혼합물 중에서 액체-액체 이상계를 형성하기에 충분한 양을 포함하며, 예를 들면 건조 세포 중량 100 g 당 편리하게는 예를 들면 100 g 내지 5000g 이상, 예컨대 500g 내지 5000g의 수혼화성 유기 용매를 사용할 수 있다. 예컨대 즉시 상분리는 용매와 세포 현탁액의 접촉시 일어날 수 있다. 형성된, 예컨대 고상 구형의 세포 입자는 얻어진 저부 수용액상에 존재할 수 있다. 예컨대 물과 이상계를 형성할 수 있는 유기 용매를 주로 함유하는 상부 상은 용이하게 분리할 수 있으며, 예컨대 하층과 실질적으로 완전하게 분리하여 예를 들면 추가의 고정화 공정에 재사용할 수 있다. 얻어진 구형 세포 입자는 고상 형일 수 있으며, 예를 들면 통상의 방법에 의해, 예컨대 현탁액을 천공된 저면을 가진 용기를 통해 따름, 원심분리 및 여과에 의해 유기-혼화성-용매로부터 단리될 수 있다. 단리된 구형 입자는 예를 들면 용수로 세척한 용매 잔류물이 없는 것일 수 있다.
가교에 앞서, 예를 들면 이관능성 시약의 첨가 전에, 예컨대 물과 이상계를형성할 수 있는 용매의 첨가전에, 예컨대 산화 알루미늄, 활성 탄소, 벤토나이트 등을 포함하는 고체를 세포의 혼합물에 첨가할 수 있다. 고체의 양은 중요하지 않으며; 편리하게는 건조 세포 중량 100g 당 5g 내지 200g, 예를 들면 50g 내지 150g의 양을 사용할 수 있다. 물과 이상계를 형성할 수 있는 용매 중에 현탁 및 이관능성 시약을 상기 혼합물에 첨가한 가교 후, 구형의 세포 입자를 얻을 수 있으며 이것은 특히 분리하기 용이하며 바람직한 좁은 크기-분포-범위 및 뛰어난 기계적 안정성을 갖는다.
본 발명에 따라 얻어지는 생체촉매, 예컨대 고상형의 예컨대 구형 미생물 세포 입자는 나중에 사용할 목적으로, 예컨대 적절한 완충액 또는 예컨대 동결형 또는 동결건조 형태로 저장할 수 있다.
본 발명에 따라 얻을 수 있는 예컨대 얻어진 효소 활성을 함유한 미생물 세포를 함유한 구형 입자는 신규하다.
또다른 일면에 있어서, 본 발명은
i) 효소 활성을 갖는 미생물 세포를 1급 아민 또는 2급 아민을 함유하는 폴리머로 처리하고,
ii) 물과 이상계를 형성할 수 있는 유기 용매를 미생물 세포의 혼합물과 접촉시키고, 예컨대 단계 i)을 수행한 후, 예컨대 미생물 세포의 혼합물을 물과 이상계를 형성할 수 있는 용매에 첨가하고,
iii) 단계 ii)에서 얻은 혼합물을 이관능성 시약으로 처리하고; 얻은 구형 입자를 단리하는 단계를 포함하고;
예를 들면 미생물 세포를 i) 또는 ii) 단계를 수행하기 전에 이관능성 시약으로 전처리하고; 및/또는
수혼화성 용매를 구형의 입자를 단리하기 전에 단계 iii)에서 얻은 혼합물에 첨가하고; 및(또는)
고체를 단계 i) 에서 얻은 혼합물에 첨가하거나 또는 단계 i)을 수행하기 전에 미생물 세포에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는,
공정으로 부터 얻을 수 있는, 예컨대 얻어진 효소 활성을 함유하는 예컨대 고상형의 미생물 세포를 포함하는 구형 입자를 제공한다.
예컨대 본 발명의 방법에 따라 얻어진 효소 활성을 갖는 고상의 구형 입자, 예컨대 DAO 활성을 가지고 , 예를 들면 PMSF로 (전)처리되고 예컨대 고상의 구형 입자, 예를 들면 GAC 활성을 가지고, 예컨대 PMSF로 (전)처리된 구형 입자는 7-ACA 및(또는) Gl-7-ACA 및(또는) HACA의 생산에 유용할 수 있다.
또다른 일면에 있어서 본 발명은
i) D-아미노산 옥시다아제 활성을 갖는 미생물 세포를 1급 아민 또는 2급 아민을 함유하는 폴리머로 처리하고,
ii) 물과 이상계를 형성할 수 있는 유기 용매를 미생물 세포의 혼합물과 접촉시키고, 예컨대 단계 i) 을 수행한 후, 예컨대 미생물 세포의 혼합물을 물과 이상계를 형성할 수 있는 용매에 첨가하고,
iii) 단계 ii)에서 얻은 혼합물을 이관능성 시약으로 처리하고; 얻은 구형 입자를 단리하고, 필요시 D-아미노산 옥시다아제 활성의 존재하에서 에스테라제 활성을 가지는 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로, 예컨대 단계 iii) 전에, 예컨대 단계 i) 전에 처리하거나; 또는 D-아미노산 옥시다아제 활성의 존재하에서 에스테라제 활성을 갖는 단계 iii)에서 얻어진 구형의 입자를 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하고,
iv) 세팔로스포린 C를 단계 iii)에서 얻은 구형의 입자와 반응시켜 7-아미노세팔로스포란산을 얻고, 필요시 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 단리하고; 필요시 예컨대 단계 iv)에서 얻은 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 7-아미노세팔로스포란산으로 전환시키는 단계를 포함하는 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산의 제조 방법을 제공한다.
또다른 일면에 있어서 본 발명은 세팔로스포린 C 를 단계 iii)에서 얻을 수 있는 구형의 입자와 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 얻고, 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 단리하는 단계를 포함하는 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
단계 iv) 에서 얻은 글루타릴-7-세팔로스포란산을 7-아미노세팔로스포란산으로 전환하는 것은 예를 들어 통상의 방법, 화학적으로 또는 효소적으로 또는 본 발명의 다른 일면에 따라, 예컨대 본 발명에 따라 상기한 바와 같이 얻을 수 있거나 또는 얻어진 GAC 활성을 가지는 구형의 입자를 사용하여 수행한다. 본 발명에 따를 경우 구형의 입자는 데아세틸라아제 활성의 존재하에 DAO 효소 활성을 갖는 것 및(또는) 데아세틸라아제 활성의 존재하에 GAC 활성을 갖는 것을 사용하며, HACA는 Ceph C 또는 Gl-7-ACA와의 반응에서 얻어진다.
추가의 일면에 있어서 본 발명은 세팔로스포린 C 또는 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산으로부터 7-아미노-3-히드록시메틸-3-세펨-4-카르복실산의 생산에 있어서 본 발명에 따른 구형 입자의 생산 방법의 용도 및 본 발명에 따라 생산된 구형 입자의 용도를 제공한다.
본 발명에 따라 생성된 7-ACA 또는 HACA는 예를 들면, 상기한 바와 같이
-고리 시스템의 7 번 위치에서 아민 그룹을 아실화시키고,
-고리 시스템의 3 번 위치에서 아세톡시메틸 그룹을 추가로 반응시키고,
-고리 시스템의 4 번 위치에서 카르복시 그룹을 에스테르화시키고,
-염 및(또는) 용매 형성에 의한 세팔로스포린의 생산에 있어서 중간체, 예컨대 세팔로스포닌 항생체 또는 그의 생산에 있어서 유용한 다른 중간체로서 유용하다.
또다른 일면에 있어서 본 발명은
i) 글루타릴아실라아제 활성을 갖는 미생물 세포를 1급 아민 또는 2급 아민을 함유하는 폴리머로 처리하고,
ii) 물과 이상계를 형성할 수 있는 유기 용매를 미생물 세포의 혼합물과 접촉시키고,
iii) 단계 ii)에서 얻은 혼합물을 이관능성 시약으로 처리하고; 얻은 구형 입자를 단리하고,
iv) 필요시 글루타릴아실라아제 활성의 존재하에서 에스테라제 활성을 가지는 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로, 예컨대 단계 iii) 전에, 예컨대 단계i) 전에 처리하거나; 또는 글루타릴아실라아제 활성의 존재하에서 에스테라제 활성을 갖는 단계 iii)에서 얻어진 구형의 입자를 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하고,
v) 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 단계 iii) 또는 단계 iv)에서 얻은 구형의 입자와 반응시켜 7-아미노세팔로스포란산을 얻고; 필요시 얻어진 7-아미노세팔로스포란산을 단리하는 단계를 포함하는 7-아미노세팔로스포란산의 제조 방법을 제공한다.
또다른 일면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라 생성된 7-아미노세팔로스포란산 또는 7-아미노-3-히드록시-3-세펨-4-카르복실산, 예컨대 7-아미노세팔로스포란산을 중간체로서 사용하는 것인 세팔로스포린, 예컨대 세팔로스포린 항생제 또는 그의 생산에 있어서 중간체의 제조 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 바의 "실질적으로"는 원래 값의 95% 이상, 예컨대 96%, 97% 또는 적절한 경우 원래의 값의 5% 이하, 예컨대 4%, 3%를 의미한다.
다음의 실시예에 있어서 모든 온도는 섭씨 온도를 나타낸다.
다음의 약어들을 사용하였다.
7-ACA: 7-아미노세팔로스포란산
Ceph C: 세팔로스포린 C
DAO: D-아미노산 옥시다아제
GAG: 글루타릴아실라아제
GDA: 글루타르알데히드
Gl-7-ACA: 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산
KA-7-ACA: α-케토아디포일-7-아미노세팔로스포란산
PEI: 폴리에틸렌 이민
PMSF: 페닐메틸술포닐 플루오라이드
TBP: n-트리부틸 포스페이트
"1 U 옥시다아제"의 활성은 pH 8 및 25℃에서 산소 포화된 20 mM Ceph C 수용액 중에서 1μmol/min Gl-7-ACA 및 KA-7-ACA의 형성에 대응한다.
"1 U 아실라아제"의 활성은 pH 8 및 37℃에서 2% Gl-7-ACA 수용액 중에서 1μmol/min 글루타르산 또는 7-ACA의 형성에 대응한다.
실시예 1
실질적으로 에스테라제 활성이 없는 DAO 활성을 갖는 혼합물을 얻기 위한 일반적 방법
물 중에서 에스테라제 활성 및 DAO 활성을 갖는 수용성 발효 브로쓰로부터, 세포 펠릿을 통상의 방법에 따라 수확된 세포로부터 얻고(참조, Kubicek-Pranz, E.M. et al., J. Microbiol. 1985, 31, pp 624-628), 얻은 세포 펠릿 10g을 물 50ml 중에 현탁시키고 약 11의 pH에서 약 90 분 동안 실온에서 가성 소다로 처리하여 효소 활성을 제거하였다. 혼합물의 pH를 인산을 첨가하여 약 7로 조정하였다.
얻은 혼합물에 PMSF 10mg/ml 에탄올을 함유하는 에탄올성 용액 500 ㎕을 첨가하고 얻은 혼합물을 실온에서 약 3 시간 동안 인큐베이션시켰다. 얻어진 세포 현탁액은 DAO 활성을 요하는 반응에서 그대로 사용될 수 있다.
세포 펠릿의 DAO 활성: 530 U 옥시다아제
가성 소다 처리후 DAO 활성: 490 U 옥시다아제
PMSF 처리후 DAO 활성: 450 U 옥시다아제(=PMSF 처리 전의 활성의 92%)
실시예 2
상기 실시예 1에서 얻은 DAO 활성을 갖는 PMSF-처리된 세포 현탁액을 물 1000 ml 중의 Ceph C의 용액에 첨가하고 얻어진 용액의 pH를 7.5로 조정하였다. 얻어진 혼합물을 혼합물 중에 산소를 도입시키면서 실온에서 약 180 분 동안 교반하였다.
Gl-7-ACA의 수율: 91%
출발 Ceph C 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Ceph C에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Ceph C에 대하여 3%
실시예 2를 PMSF 처리 없이 DAO 활성을 사용하여 반복하였다.
Gl-7-ACA의 수율: 88%
출발 Ceph C 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Ceph C에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Ceph C에 대하여 6%
실시예 3
실시예 1에 기재된 바와 같이 얻은 세포 현탁액을 PMSF 처리 전에 균질화시키고(균질화된 세포에서 DAO 활성: 385 U 옥시다아제) 얻어진 균질화된 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 PMSF로 처리하였다(균질화되고 PMSF 처리된 세포에서 DAO 활성: PMSF 처리전 활성의 96%에 해당하는 372 U 옥시다아제). 얻은 세포 현탁액을 실시예 1에 기재된 바와 같이 Ceph C와 반응시켰다.
Gl-7-ACA의 수율: 93%
출발 Ceph C 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Ceph C에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Ceph C에 대하여 3%
실시예 3을 PMSF 처리 없이 DAO 활성을 사용하여 반복하였다.
Gl-7-ACA의 수율: 89%
출발 Ceph C 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Ceph C에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Ceph C에 대하여 7%
실시예 4
가성 소다를 처리하기 전에 실시예 1에 기재된 바와 같이 얻은 세포 펠릿 10g을 물 50 ml 중에 현탁시키고, 폴리에틸렌 이민(분자량 600,000 - 1,000,000) 2g을 얻은 현탁액에 첨가하고 얻은 혼합물을 pH 11(가성 소다 용액을 첨가하여 조절함)에서 90 분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 얻은 혼합물의 pH를 인산을 첨가하여 8.5로 조정하고 얻은 현탁액을 톨루엔 50 ml로 교반시켰다. 용매 중의 미세 물방울 형상의 세포 입자의 에멀젼을 얻고 여기에 25% GDA 용액 8 ml을 첨가하였다. 미세 물방물 형상의 세포 입자는 고화하여 고상 구형의 입자를 형성하였다. 이 고상 구형의 입자를 단리하고 용수로 세척하였다.
구형 입자 중의 DAO의 활성: 290 U 옥시다아제
얻어진 고상의 구형 입자를 pH 7.0의 20 mM 인산염 완충액 50 ml 중에 현탁시키고, 실시예 1에 기재된 바와 유사하게 PMSF 용액 500 ㎕와 혼합하고 얻어진 혼합물을 180 분 동안 인큐베이션시켰다. PMSF 처리된 고상 구형의 입자에서 DAO 활성: 305 U 옥시다아제.
얻어진 고상의 PMSF 처리된 구형 입자를 실시예 2에 기재된 바와 유사하게 Ceph C 반응에 사용하였다.
Gl-7-ACA의 수율: 92%
출발 Ceph C 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Ceph C에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Ceph C에 대하여 3%
실시예 4를 PMSF 처리 없이 고상 구형의 입자들을 사용하여 반복하였다.
Gl-7-ACA의 수율: 89%
출발 Ceph C 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Ceph C에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Ceph C에 대하여 7%
실시예 5
발효 브로쓰로부터 단리한 재조합 대장균 균주, 예 CCM 4229(GAC 활성: 720 U 아실라아제)의 습윤 세포 펠릿 10g을 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 50ml 중에 세척하고 재현탁시켰다. 얻어진 현탁액에 10 mg PMSF/ml을 함유하는 에탄올성 용액 0.5 ml을 첨가하고, 얻은 혼합물을 실온에서 약 3 시간 동안 교반시켰다.
GAC 활성: 708 U 아실라아제(PMSF 처리전의 활성의 98%)
Gl-7-ACA 10 g을 물 1000 ml 중에 용해시키고, pH를 8.2로 조정하였다. 상기한 바와 같이 얻은 PMSF 처리된 대장균 현탁액을 첨가하고 혼합물을 pH를 약 8.0 - 8.2로 유지하면서 약 180 분 동안 12 ℃에서 교반시켰다.
7-ACA의 수율: 93%
출발 Gl-7-ACA 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Gl-7-ACA에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Gl-7-ACA에 대하여 3%
실시예 5를 PMSF 처리 없이 GAC 활성을 사용하여 반복하였다.
Gl-7-ACA의 수율: 90%
출발 Gl-7-ACA 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Gl-7-ACA에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Gl-7-ACA에 대하여 7%
실시예 6
재조합 대장균 균주, 예 CCM 4229(GAC 활성: 720 U 아실라아제)의 습윤 세척 세포 펠릿 10g을 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 50ml 중에 세척하고 700 바아의 압력하에서 균질화시켰다. 균질화된 세포(GAC 활성: 752 U 아실라아제)를 실시예 5에 기재된 바와 같이 에탄올성 PMSF와 혼합하였다. PMSF 처리된 세포에서 GAC 활성: 768 U 아실라아제
얻은 현탁액을 Gl-7-ACA 용액에 첨가하고 반응을 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다.
7-ACA의 수율: 89%
출발 Gl-7-ACA 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Gl-7-ACA에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Gl-7-ACA에 대하여 3%
실시예 6을 PMSF 처리 없이 GAC 활성을 사용하여 반복하였다.
Gl-7-ACA의 수율: 83%
출발 Gl-7-ACA 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Gl-7-ACA에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Gl-7-ACA에 대하여 6%
실시예 7
재조합 대장균 균주, 예 CCM 4229(GAC 활성: 7350 U 아실라아제)의 습윤 세포 펠릿 10g으로부터 균질화된 세포들을 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 50ml 중에 재현탁시키고 플로쿨레이션(flocculation) 시약 (SediflocRCL 900-18/40 1ml)과 혼합시켰다. 얻은 혼합물의 pH를 아세트산을 첨가하여 5.2로 조정하고 얻은 혼합물을 약 40 ℃에서 약 1 시간 동안 교반하에 인큐베이션시키고 추가로 1 시간 동안 10℃에서 교반시켰다. 얻은 혼합물을 원심분리에 의해 정화시키고 GAC-함유 무세포 상층액(GAC 활성: 6150 U 아실라아제)를 pH 7.5로 조정하고, PMSF 용액과 혼합하고 실시예 5에 기재된 바와 유사하게 인큐베이션시켰다. PMDF 처리후 얻어진 무세포 추출물의 GAC 활성: 6220 U 아실라아제.
얻어진 혼합물을 아크릴산(고정화) 비이드(EupergitRC) 10g과 혼합하고 1M 황산 나트륨 수용액 50 ml로 처리하고 실온에서 64 시간 동안 진탕하에 인큐베이션시켰다. 얻은 효소-충전 담체 물질을 고정화 용액으로부터 분리하여 실시예 5에 기재된 바와 유사하게 Gl-7-ACA 용액과의 반응에서 촉매로 사용하였다.
7-ACA 활성: 90%
출발 Gl-7-ACA 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Gl-7-ACA에 대하여3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Gl-7-ACA에 대하여 3%
실시예 7을 PMSF 처리 없이 고정화 GAC 활성을 사용하여 반복하였다.
Gl-7-ACA의 수율: 83%
출발 Gl-7-ACA 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Gl-7-ACA에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Gl-7-ACA에 대하여 6%
실시예 8
GAC 활성은 실시예 7에 기재된 바와 유사하게 고정화시켰으나 단 PMSF 처리를 고정화 후에 수행하지 않고 실시예 5에 기재된 바와 유사하게 PMSF 용액 1ml을 GAC-함유 무세포 상층액, 유페르기트 및 황산 나트륨을 포함하는 혼합물에 첨가함으로써 고정화 동안 수행하였다.
얻어진 효소-충전 PMSF 처리된 담체 물질을 고정화 용액으로부터 분리하여 실시예 5에 기재된 바와 유사하게 Gl-7-ACA 용액과의 반응에서 촉매로 사용하였다.
7-ACA 및 데아세틸레이션 생성물의 수율은 실시예 7에 기재된 바와 실질적으로 동일하였다.
실시예 9
GAC-함유 상층액을 실시예 7에 기술된 바와 유사하게 생산하되, 단 PMSF 처리를 하지 않았다(GAC 활성: 5830 U 아실라아제). 얻어진 용액을 이온교환 수지(ReliteRDiaion-HPA25L) 40g과 혼합시키고, 얻은 혼합물을 pH 7.5로 조정하고 진탕하에 실온에서 약 300 분 동안 인큐베이션시켰다. 얻은 이온 교환 수지를 단리하고 세척하였다(GAC 활성; 1865 U 아실라아제).
얻은 이온 교환 수지를 50 mM 인산염 완충액 200 ml 중에 현탁시키고, 실시예 5에서와 같이 사용된 PMSF 용액 2 ml을 첨가하고 얻어진 혼합물을 교반하에 약 180 분 동안 인큐베이션시켰다. PMSF 처리된 이온 교환 수지 중의 GAC 활성: PMSF 처리 전 촉매 중의 활성의 97%에 해당하는 1810 U 아실라아제.
얻어진 효소-충전된 PMSF 처리된 이온 교환 수지를 실시예 5에 기재된 바와 유사하게 Gl-7-ACA 용액과의 반응에서 촉매로 사용하였다.
출발 Gl-7-ACA 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: Gl-7-ACA에 대하여 3%
얻어진 반응 용액 중의 3-데아세틸레이션 생성물의 합: 출발 Gl-7-ACA에 대하여 3%
실시예 10
a. 전처리
트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis), 예컨대 ATCC 58536(535 습윤 중량, DAO 활성: 25,970 U 옥시다아제)를 발효 브로쓰 중에 25% GDA 수용액 21g을 약 1 시간 동안 실온 및 pH 7.5에서 교반시킴으로써 발효 브로쓰 2.7kg 중에서 전처리시켰다. 세포들을 원심분리에 의해 얻은 세포 현탁액으로부터 수확하고 동결 상태로 저장하였다. 동결 세포 덩어리를 해동시키고, 미세 여과 수단에 의해 용수로 세척하고 약 735 ml의 부피로 농축시켰다. 농축 세포 질양 중의 DAO 활성: 26,350 U.
b. 폴리머 처리
단계 a.에서 얻은 세포 질량 735ml (100 g 건조 질량)을 β-메캅토에탄올 (5 mM), EDTA (2 mM) 및 물 중의 50% PEI 용액 40g, 분자량 600,000 - 1,000,000 (총 부피 약 800 ml) 중에 현탁시키고 약 90 분 동안 pH 11에서 서서히 교반시키고, 이것은 실온에서 가성 소다를 첨가함으로써 조절하였다. 얻어진 혼합물의 pH는 인산을 첨가하여 pH 9로 조정하였다. DAO 활성; 24,360 U (실시예 10 a.에 기재된 바와 같이 얻은 전처리된 DAO 활성의 94%).
c. 가교
교반 용기 중의 TBP 3000 ml에 단계 b.에서 얻은 세포/폴리머 혼합물을 교반 하에 실온에서 첨가하였다. TBP 중의 세포/폴리머 방울들의 균질한 분산물을 약 30 분내에 얻고 여기에 25% GDA 수용액 40g을 첨가하였다. 가교는 곧바로 개시되엇고 수 분 후에 종결되었다. 세포들을 고상 구형 입자들의 형태로 얻었다. 글리세롤2000g을 얻은 혼합물에 15 내지 20℃에서 첨가하고 TBP 층 및 수층 사이의 상전이를 시켰다. 주로 글리세롤 및 고상 구형의 세포 분획들을 함유하는 하층을 주로 TBP를 함유하는 상층으로부터 분리하였다. 얻은 상층(2900 ml)은 예를 들면 다른 가교 뱃취에서 재사용할 수 있다. 고상 구형의 입자들을 약 90 분 후에 하층으로부터 단리하고 용수로 세척하여 TBP 및 글리세롤 잔류물을 제거하였다.
옥시다아제 활성을 갖는 습윤 고상 구형의 입자 580g을 얻었는에, 이는 건조 중량의 121g에 해당한다. 고상 구형의 입자들 중의 비 DAO 활성은 32 U/g 습윤 중량(153 U/g 건조 중량)이었고, 즉 전체 DAO 활성은 18,560 U(실시예 10 a.에 기재된 바와 같이 얻은 전처리된 DAO 활성의 71%).
실시예 11
실시예 10 c.에서 얻은 고상 구형의 입자들 580 g(습윤 중량)을 용수 2000 ml 중에 현탁시키고 실온에서 교반시켰다. PMSF 20mg을 무수 에탄올 20ml 중에 용해시키고 얻어진 용액을 약 2 분 내에 옥시다아제 용액에 첨가하였다. 혼합물을 약 3 시간 동안 인큐베이션시키고, 얻어진 고상의 구형 입자들을 단리하고 수용성 에탄올(1000 ml, 10%)로 세척하고 용수로 세척하였다.
고상 구형의 입자들(습윤 중량; 건조 중량의 118g에 해당함) 563g을 얻었다.
PMSF 처리된 고상 구형의 입자들 중의 비 DAO 활성은 31 U/g 습윤 중량(148 U/g 건조 중량)이었고, 즉 전체 DAO 활성은 17,450 U(실시예 10 a.에 기재된 바와 같이 얻은 전처리된 DAO 활성의 67% 및 PMSF 처리 전의 활성의 94%). 얻어진 구형입자들의 에스테라제 활성은 실질적으로 제거되었다.
실시예 12
실시예 10 a. 및 b.에 기재된 바와 같은 세포/폴리머 생성물의 pH를 인산을 첨가함으로서 9.0으로 조정하고 산화 알루미늄 80g을 첨가하였다. 가교를 실시예 10 c.에 기재된 바와 같이 얻은 혼합물로 수행하였다.
고상 구형의 입자들(습윤 중량; 건조 중량의 193g에 해당함) 630g을 얻었다.
고상 구형의 입자들 중의 비 DAO 활성은 26 U/g 습윤 중량(85 U/g 건조 중량)이었고, 즉 전체 DAO 활성은 16,440 U(실시예 10 a.에 기재된 바와 같이 얻은 전처리된 DAO 활성의 63%). 240-500 ㎛의 입자들의 좁은 크기-분포-범위가 얻어졌다.
실시예 13
본 실시예는 글리세롤을 첨가한 것을 제외하고는 실시예 10에 기재된 바와 유사하게 수행하였다. 가교 후, 현탁액을 약 60 분 동안 교반시켰다. TBP 현탁액 중에 얻어진 고상 구형의 입자들을 얻어진 현탁액을 천공된 저면을 가진 용기를 통해 이동시킴으로써 단리하였는데 여기서 천공들은 얻어진 고상 구형 입자들의 크기 보다 적다. TBP 2680 ml이 얻어졌다. TBP 잔류물들은 용수로의 세척에 의해 얻어진 고상의 구형 입자들로부터 제거하였다.
고상 구형의 입자들(습윤 중량; 건조 중량의 126g에 해당함) 610g을 얻었다.
고상 구형의 입자들 중의 비 DAO 활성은 36 U/g 습윤 중량(174 U/g 건조 중량)이었고, 즉 전체 DAO 활성은 21,960 U(실시예 10 a.에 기재된 바와 같이 얻은 전처리된 DAO 활성의 85%).
실시예 14
실시예 10 및 11에 기재된 바와 유사하게 얻은 PMSF 처리된 고상의 구형의 입자들(81 g 습윤 중량, DAO 활성: 2,500 U)를 pH 7.2의 75 mM Ceph C 수용액 1 리터와 혼합시켰다. 5 바아 압력하에 공기를 얻은 혼합물에 약 80 분 동안 도입시켰다. 용액을 고상 구형의 입자들로부터 분리하고 HPLC에 의해 분석하였다. 0.6 mM Ceph C, 70.7 mM Gl-7-ACA, 및 3 mM KA-7-ACA가 분리된 용액 중에서 결정되었다.
실시예 14를 매회 새로운 Ceph C-용액을 사용하여 반복하고 매회 실시예 14에서 기재한 것과 동일한 PMSF 처리된 고상의 구형 입자들을 사용하였다.
용액을 뱃취 142 중의 고상 입자들로부터 Ceph C와 약 160 분 접촉 후 분리하고 HPLC에 의해 분석하였다. 0.5 mM Ceph C, 69.8 mM Gl-ACA, 및 0.4 mM KA-7-ACA가 분리된 용액 중에서 결정되었다.
뱃취 142 후, 고상 구형의 입자들을 308 시간 동안 사용하였다. 고상 구형의 입자 93g(습윤 중량, 건조 중량으 24 g에 해당함)을 단리하였다.
얻어진 고상의 구형 입자들 중의 비 DAO 활성은 12 U/g 습윤 중량이었고, 47 U/g 건조 중량에 해당하며, 즉 전체 활성은 1,120 U(원래 활성의 45%)이었다.
실시예 15
DAO 활성을 갖는 스키조사카로마이세스 프롬베(Schizosaccharomyces prombe)ATCC 38399 및 ATCC 38436(각각 82 g 및 90g 건조 중량)의 세포들을 25% GDA 수용액 3.3 g으로 실시예 10 a.에 기재된 바와 유사하게 각각 전처리하고(개별적으로), 수확하고 동결된 상태로 저장하였다. 해동후, 혼합물을 용수로 세척하고 농축시켜 예를 들면 ATCC 38399로 부터 164 ml 중의 건조 물질 20.4g 및 예컨대 ATCC 38436으로부터 180 ml 중의 건조 물질 24.1g을 얻었다.
예를 들면 ATCC 38399 및 예를 들면 ATCC 38436의 세포 건조 중량 7g 각각을 실시예 10 b.에 기재된 바의 50% PEI 수용액 2.8g으로 처리하였다(개별적으로).
가교는 얻어진 두 현탁액으로(개별적으로) 25% GDA 수용액 3.5g의 첨가 및 글리세롤 400g의 첨가하에 TBP 230 ml 중에서 실시예 10 c.에 기재된 바와 유사하게 수행하였다. 얻어진 고상 구형의 입자들을 체 위에서 용수로 세척하여 글리세롤 및 TBP 잔류물을 제거하였다.
DAO 활성을 갖는 고상 구형의 입자들의 59.5 g 습윤 중량 (14.0g 건조 중량)을 예컨대 ATCC 38436으로부터 얻고, DAO 활성을 갖는 고상 구형의 입자들의 55.6 g 습윤 중량 (16.1g 건조 중량)을 예컨대 ATCC 38399로부터 얻었다. 얻은 고상 구형의 입자들은 실시예 10 c.에서 얻은 구형의 입자들과 유사한 DAO 반응 특성 및 유사한 안정성 특성을 나타냈다.
스키조사카로마이세스 프롬베는 다양한 효소를 클로닝하고 발현시키기에 적합하다. 기타 생체 촉매, 예컨대 다른 효소 활성을 가진 고상의 구형 입자들도 본실시예에 기재된 바와 유사하게 간단한 방식으로 얻을 수 있다.
실시예 16
플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus) (90 g 습윤 중량, 18,970 페니실린 V 아실라아제)의 세포들을 실시예 10 a에 기재된 바와 유사하게 25% GDA 수용액 3.3 g으로 전처리하였다. 얻은 세포 현탁액으로부터의 세포를 수확하고, 동결된 상태로 저장하고, 해동후 용수로 세척하고 미세여과에 의해 농축시켰다.
얻어진 세포 18.6g(건조 중량)을 50% PEI 수용액 7.4g으로 처리하였다. 세포 가교는 실시예 10 c.에 기재된 바와 유사하게 25% GDA 수용액 7.4g의 첨가 및 글리세롤 370 g의 첨가하에 TBP 560 ml 중에서 수행하였다. 얻어진 고상의 구형 입자들을 체를 통하여 용수로 세척하여 글리세롤 및 TBP를 제거하였다.
페니실린 V 아실라아제를 함유하는 고상 구형의 입자들 223 g(습윤 중량; 건조 중량의 29.4 g에 해당함)g을 얻었다.
비 페니실린 V 아실라아제 활성은 50.4 U/g 습윤 중량이었고, 즉 전체 페니실린 V 아실라아제 활성은 11,240 U(원래 활성의 59%)이었다.
1 U 페니실린 V 아실라아제는 pH 7.5 및 28 ℃에서 인산염-완충시킨 K-페니실린-V 수용액 (50g/ℓ) 중의 6-아미노페니실란산의 분 당 1 μmol의 형성에 해당한다.
실시예 17
트리고놉시스 바리아빌리스 (Trigonopsis variabilis), 예컨대 ATCC 58536 (54 g 습윤 중량, DAO 활성: 2,6000 U)의 세포들을 실시예 10 a. 및 b.에 기재된 바와 유사하게 생산하였다. 가교는 실시예 10 c.에 기재된 바와 유사하게 수행하되, 단 트리고놉시스 바리아빌리스 세포(약 10 g 건조 중량)을 함유하는 세포/폴리머 혼합물을 교반하에서 글루타르산 디메틸에스테르 300 ml 또는 아디프산 디메틸에테트 300 ml 중 어느 하나에 첨가하였다(세포 건조 중량 100g에 대하여 TBP 3000 ml 대신에). 얻어진(개별적으로) 혼합물의 각각에 있어서 가교는 실시예 10 c.에 기재된 바와 유사하게 15 내지 20 ℃의 온도에서 25% GDA 수용액 5g의 각 혼합물에의 첨가 및 글리세롤 400 g의 각 혼합물에의 첨가하에 수행하였다. DAO 활성을 갖는 고상 구형의 입자들 93.4g 및 86.9g 각각을 얻었다(습윤 중량, 각각 건조 중량 20.6g 및 20.2g에 해당함).
비 DAO 활성은 각각 14.8 U/g 습윤 중량이거나, 12.5 U/g 습윤 질량이었고, 즉 활성은 각각 1382 U(원래 활성의 53%) 및 1086 U(원래 활성의 42%)이었다.
상기 참조.

Claims (13)

  1. 에스테라제 활성 및 D-아미노산 옥시다아제 활성 및/또는 글루타릴아실라아제 활성을 가진 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하는 것을 포함하는, 에스테라제 활성 및 D-아미노산 옥시다아제 활성 및/또는 글루타릴아실라아제 활성을 가진 혼합물 중에서 D-아미노산 옥시다아제 활성의 존재 또는 글루타릴아실라아제 활성의 존재하에 존재하는 에스테라제 활성을 감소시키는 방법.
  2. ⅰ) 에스테라제 활성 및 D-아미노산 옥시다아제 활성을 갖는 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하는 단계,
    ⅱ) 세팔로스포린 C를 단계 ⅰ)에서 얻은 혼합물과 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 얻는 단계를 포함하는,
    글루타릴-7-아미노세팔로스포란산의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계 ⅱ)에서 얻은 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. ⅰ) 에스테라제 활성 및 글루타릴아실라아제 활성을 갖는 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하는 단계,
    ⅱ) 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 단계 ⅰ)에서 얻은 혼합물과 반응시켜 7-아미노세팔로스포란산을 얻는 단계를 포함하는,
    7-아미노세팔로스포란산의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단계 ⅱ)에서 얻은 7-아미노세팔로스포란산을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. ⅰ) D-아미노산 옥시다아제 활성을 갖는 미생물 세포를 1급 또는 2급 아민을 함유하는 폴리머로 처리하고,
    ⅱ) 물과 이상계를 형성할 수 있는 유기 용매를 미생물 세포의 혼합물과 접촉시키고,
    ⅲ) 단계 ⅱ)에서 얻은 혼합물을 이관능성 시약으로 처리하고; 얻은 구형 입자를 단리하고, D-아미노산 옥시다아제 활성 존재하에 에스테라제 활성을 갖는 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하거나, D-아미노산 옥시다아제 활성 존재하에 에스테라제 활성을 갖는 단계 ⅲ)에서 얻은 구형 입자를 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하고,
    ⅳ) 세팔로스포린 C를 단계 ⅲ)에서 얻은 구형 입자와 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 얻는 단계를 포함하는,
    글루타릴-7-아미노세팔로스포란산의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 단계 ⅳ)에서 얻은 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 세팔로스포린 C를 제6항에 정의된 단계 ⅲ)에 의해 얻을 수 있는 구형 입자와 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 얻는 것을 포함하는, 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제2항의 단계 ⅱ) 또는 제6항의 단계 ⅳ)에 따라 얻은 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 7-아미노세팔로스포란산으로 전환시키는 7-아미노세팔로스포란산의 제조 방법.
  11. ⅰ) 글루타릴아실라아제 활성을 갖는 미생물 세포를 1급 또는 2급 아민을 함유하는 폴리머로 처리하고,
    ⅱ) 물과 이상계를 형성할 수 있는 유기 용매를 미생물 세포의 혼합물과 접촉시키고,
    ⅲ) 단계 ⅱ)에서 얻은 혼합물을 이관능성 시약으로 처리하고; 얻은 구형 입자를 단리하고,
    ⅳ) 글루타릴아실라아제 활성의 존재하에서 에스테라제 활성을 가지는 혼합물을 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하거나, 글루타릴아실라아제 활성의 존재하에서 에스테라제 활성을 가지는 단계 ⅲ)에서 얻은 구형의 입자를 페닐메틸술포닐 플루오라이드로 처리하고,
    ⅴ) 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 단계 ⅲ)에서 얻거나 단계 ⅳ)에서 얻은 구형의 입자와 반응시켜 7-아미노세팔로스포란산을 얻는 단계를 포함하는,
    7-아미노세팔로스포란산의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 단계 ⅴ)에서 얻은 7-아미노세팔로스포란산을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제4항 또는 제10항에 따라 제조된 7-아미노세팔로스포란산 또는 7-아미노-3-하이드록시메틸-3-세펨-4-카복실산을 중간체로 사용하는 세팔로스포린의 제조 방법.
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