DE4321109C2 - Pharmakologisch aktive Verbindungen mit Nitrosohydrazinpartialstruktur - Google Patents

Pharmakologisch aktive Verbindungen mit Nitrosohydrazinpartialstruktur

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Description

Die Erfindung betrifft pharmakologisch aktive Stickstoff­ monoxid (NO) freisetzende Verbindungen mit Nitrosohydrazin­ partialstruktur.
In den vergangenen Jahren wurde gefunden, daß endogen gebilde­ tem Stickstoffmonoxid eine wichtige Rolle in der Regulation zahlreicher physiologischer Prozesse wie Blutdruck und Blut­ fluß zukommt. Durch Stimulation der Guanylatcyclase kommt es zu einem Anstieg der Konzentrationen an intrazellulärem zykli­ schem Guanosininonophosphat (cGMP) in den glatten Gefäßmuskel­ zellen und Thrombozyten, der zu einer Verminderung des Gefäß­ widerstandes und einer Verbesserung der Fließeigenschaften des Blutes führt.
Bei Erforschung dieser Prozesse wurde erkannt, daß die Wirkun­ gen einiger in der Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen bereits eingesetzter Verbindungen über hieraus gebildetes Stickstoffmonoxid vermittelt werden.
So wurde gezeigt, daß die Wirkungen der altbekannten therapeu­ tisch sehr wertvollen Nitroverbindungen wie Glyceroltrinitrat (GTN), Isosorbidmononitrat (ISMN) und Isosorbiddinitrat (ISDN) hierauf zurückzuführen sind.
Nitrate sind jedoch mit dem Nachteil behaftet, daß bei andau­ ernder Gabe hoher Dosierungen ein Wirkungsverlust, die Nitrat­ toleranz, auftritt. Nach bisherigem Kenntnisstand ist dieser Wirkungsverlust nicht auf eine Überstimulation durch NO zu­ rückzuführen, sondern auf eine Verminderung der Stickstoff­ monoxidfreisetzung.
Entsprechend heutiger Vorstellung erfordert die Entstehung von Stickstoffmonoxid aus den Salpetersäureestern eine Umsetzung mit Thiolgruppen enthaltenden Aminosäuren, die dabei oxidiert und dadurch bei andauernder Gabe hohe Dosen nicht mehr in der erforderlichen Menge zur Verfügung stehen.
Eine weitere Wirkstoffgruppe, für die gefunden wurde, daß ihre pharmakologische Aktivität über die Freisetzung von NO vermit­ telt wird, sind die Sydnonimine.
Therapeutisch eingeführt wurde bisher das Sydnoniminderivat Molsidomin, das nach bisherigem Kenntnisstand keiner Tole­ ranzentwicklung unterliegt.
Dieses Verhalten wird darauf zurückgeführt, daß die Freiset­ zung von NO aus Molsidomin im Gegensatz zu den Nitraten keiner Umsetzung mit einem begrenzt vorhandenen und damit erschöpfba­ ren endogenem Substrat bedarf, sondern nichtenzymatisch aus seinem Metaboliten SIN-1 erfolgt.
EP 0 023 343, EP 0 059 356, EP 0 076 952, EP 0 210 474 und EP 0 276 710 offenbaren verschiedene 3-substituierte Sydnonimin­ derivate, die zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen angewendet werden können. Allen Verbindungen ist gemeinsam, daß das Stickstoffatom in Position 3 des Sydnoniminringes über ein weiteres Stickstoffatom mit einem Rest verbunden ist, der vorzugsweise Bestandteil eines heterocyclischen Ringes ist. Dieser kann zusammen mit den beiden Stickstoffatomen und dem Sauerstoffatom des Sydnoniminringes als eine Nitrosohydrazin­ partialstruktur betrachtet werden.
EP 0 324 408 offenbart weitere Verbindungen mit Nitrosohydra­ zinpartialstruktur, die zur Behandlung von Herz-Kreislaufer­ krankungen vorgesehen sind. Es werden N-substituierte-N- Nitroso-aminoacetonitrile beschrieben, die keine Sydnonimin­ struktur enthalten, in denen aber das substituierte Stick­ stoffatom wie beim Molsidomin Bestandteil eines heterozy­ klischen Ringes ist.
Es wurde nun gefunden, daß auch Verbindungen, die eine Nitro­ sohydrazinpartialstruktur enthalten, welche nicht teilweiser Bestandteil eines Sydnoniminringes oder eines gesättigten he­ terozyklischen Ringes ist, pharmakologisch wirksames Stick­ stoffmonoxid freisetzen können. Die Nitrosohydrazinstruktur kann dabei vollständiger Bestandteil mesoionischer Ringsysteme oder teilweiser Bestandteil aromatischer Ringsysteme sein oder in Form einer Kette vorliegen.
Erfindungsgemäß werden als pharmakologisch aktive Substanzen N2- Nitrosophenylhydrazo-Derivate, 3,4,5-substituierte Nitroso­ pyrazole, Triazole und Benzotriazinoxide verwendet.
Besonders vorteilhaft sind dabei Verbindungen, welche folgende chemische Formeln aufweisen:
N2-Nitrosophenylhydrazosulfonsäure-Kalium
3-Ethoxy-4,5-dimethyl-1-nitroso-H-pyrazol
3-Ethoxy-4-ethyl-5-methyl-1-nitroso-H-pyrazol
3-Methyl-1,2,3-benzotriazol-1-oxid
1-Hydroxy-1,2,3-triazol-4,5-dicarbonsäure und ihr Silbersalz
4-Nethyl-benzotriazin-3-oxid
4-Phenyl-benzotriazin-3-oxid
Die Ausführungsbeispiele, ohne darauf beschränkt zu sein, er­ läutern die Erfindung.
Beispiel 1 Darstellung von N2-Nitrosophenylhydrazosulfonsäure-Kalium 1. Stufe: Darstellung von N2-Phenyl-hydrazo-sulfonsäure Kalium
Man versetzt das Ammoniumsalz vorsichtig mit verdünnter KOH und fällt das Salz durch langsame Zugabe von konz. KOH aus. Man kristallisiert in Wasser um.
Leicht gelbliche Kristalle, Schmp. ab 280° (Zers.), Ausb. 40%. - C₆H₇N₂O₃SK (226.3). 0.1 KOH (231.9). -
2. Stufe: Darstellung von N2-Nitroso-N2-phenyl-hydrazo-sulfonsäure Kalium
Man nitrosiert 1 g frisch hergestelltes Sulfonsäurehydrazid 50 durch Zusatz von wenig Wasser und 0.5 ml konz. HCl mit 2 g KNO₂ in konz. Lösung. Man saugt die Kristalle ab und gibt sie sofort zur CHN.
Farblose Kristalle, Schmp. 203-210° (Zers.), Ausb. max. 40%. - C₆H₆N₃O₄SK (255.3). -
Beispiel 2 Darstellung von 3-Ethoxy-4,5-dimethyl1-nitroso-1-H-pyrazol 1. Stufe: Darstellung von 5-Ethoxy-3-4-dimethyl-1-H-pyrazol (54)
20 g Hydrazinsulfat werden in 300 ml Wasser gelöst und mit 20 g Methylacetessigsäure­ ethylester 30 min im Wasserbad erhitzt. Es wird mit konz. NaOH schwach alkalisiert, dann das anfallende Natriumsulfat abfiltriert und das Pyrazol mit Ether aus der Wasserphase ausge­ schüttelt. Danach werden die Etherphase mit Natriumsulfat getrocknet, der Ether i. Vak. entfernt und der Rückstand aus Ethanol/Wasser umkristallisiert.
Farblose Nadeln, Schmp. 97-99° (Zers.), Ausb. 25%. - C₇H₁₂N₂O (140.2). -
2. Stufe: Darstellung von 3-Ethoxy-4-5-dimethyl-1-nitroso-1 H-pyrazol
1 g der Verbindung 54 wird mit 10 ml 1N-HCl versetzt und unter Kühlung mit der 1.25fachen Menge NaNO₂ in konz. wäßriger Lösung langsam nitrosiert. Das kanariengelbe, kristallin anfallende Produkt wird abgesaugt, in Ether aufgenommen, getrocknet und der Ether wieder i. Vak. entfernt.
Gelbe Kristalle mit charakteristischem Geruch nach Liebstöckel, Schmp. 33° (Zers.), Ausb. 70%. - C₇H₁₁N₃O₂ (169.2) (.0.1 H₂O 171.0). -
Beispiel 3 Darstellung von 3-Ethoxy-4-ethy1-5-methyl-1-nitroso-1-H- pyrazol 1. Stufe: Darstellung von 5-Ethoxy-4-ethyl-3-methyl-1-H-pyrazol
Darstellung analog der Vorschrift zur Synthese der Verbindung (Beispiel 8, 1. Stufe).
Farblose Nadeln, charakteristischer Geruch, Schmp. 85° (klar), Ausb. 25%. - C₈H₁₄N₂O (154.2). -
2. Stufe: Darstellung von 3-Ethoxy-4-ethyl-5-methyl-1-nitroso-1-H-pyrazol
36 mg der Verbindung werden in 0.5 ml 0,1N DCl gelöst und mit 0.4 ml CDCl₃ unter­ schichtet. Man gibt 47 mg NaNO₂ in 0.15 ml D₂O unter Kühlung auf 0° C hinzu. Die Reaktion wird ¹H-NMR-spektroskopisch überwacht. Die ¹H-NMR-kontrollierte Studie der Reaktion zeigt, daß die Verbindung auch nach viertägiger Lagerung im Kühlschrank keine Veränderung zeigt. Das Erwärmen auf 37°C für eine Stunde hat keinen Einfluß auf die Lage der Signale. Das gelbe Produkt wird mit CHCl₃ ausgeschüttelt, getrocknet und das CHCl₃ i. Vak. entfernt.
Gelbes Öl; charakteristischer Geruch nach Liebstöckel, Ausb. 80%. - C₈H₁₃N₃O₂ (183 .2). -
Beispiel 4 Darstellung von 3-Methyl-1H-benzotriazol-1-oxid
0.1 Mol des Hydroxytriazol-1-oxid werden mit 0.1 l Mol Dime­ thylsulfat in 150 ml NaOH für 2 h unter Rückfluß erhitzt. Die wäßrige Phase wird nach dem Abkühlen mit CHCl₃ extrahiert. Die CHCl₃-Phase wird getrocknet, i. Vak. eingeengt und mit CHCl₃ durch Rotationschromatographie gereinigt.
Farblose Substanz, Schmp. 143° (Zers.), Ausb. 25%. - C₇H₇N₃O (149.2).0.1 H₂O (151). -
Beispiel 5 Darstellung von 1-Hydroxy-1,2,3-triazol-4,5-dicarbonsäure-di-Silber
10 g Hydroxybenzotriazol, werden in verd. KOH gelöst und 70 g Kaliumpermanganat in wäßriger Suspension langsam zugegeben. Man läßt die sich rasch braun färbende Suspension mindestens vier Tage bei RT rühren. Der entstandene Braunstein wird abfiltriert. Es wird mit 12.5-proz. HNO₃ angesäuert, die Säure als doppeltes Silbersalz ausgefällt und in 1.5N HNO₃ umkristallisiert. Die Substanz ist in allen Lösungsmitteln sehr schwer löslich, deshalb war weder eine ¹³C-NMR-spektroskopische Untersuchung möglich, noch eine NI-FAB-Messung.
Farblose bis graue Kristalle, Schmp. ab 280° (Zers.), Ausb. 15%. - C₄HN₃O₅Ag₂ (386.8). -
Beispiel 6 Darstellung von 1-Hydroxy-1,2,3-triazol-4,5-dicarbonsäure
Das Disilbersalz wird in 5N HCl auf 50° C erwärmt. Das ausfallende AgCl wird abfiltriert und das Filtrat unter geringer Erwärmung i. Vak. eingeengt. Man trocknet i. Vak. über konz. H₂SO₄.
Farblose Kristalle, Schmp. 90° (Zers.), Ausb. 40%. - C₄H2,75N₃O₅.0.25 Ag (199.8). -
Beispiel 7 Darstellung von 4-Methyl-1,2,3-benzotriazin-3-oxid 1. Stufe: Darstellung von 2-Aminophenyl-methyl-methanonoxim
0.1 Mol 2-Aminophenyl-methyl-methanon wird mit 0.3 Mol Hydroxylaminhydrochlorid und 0.8 Mol KOH in Ethanol im Wasserbad für etwa 1 h erhitzt. Danach wird das entstandene KCl abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Durch Zusatz von Wasser und Einleiten von CO₂ wird das Oxim ausgefällt und danach aus Wasser umkristallisiert.
Farblose Kristalle, Schmp. 111° (Zers.) (Lit. 109°), Ausb. 50%. - C₈H₁₀N₂O (150.2). -
Stufe 2: Darstellung von 4-Methyl-1,2,3-benzotriazin-3-oxid
5 g des Oxims werden in 50 ml warmer 1N HCl gelöst, mit Eis gekühlt und langsam mit 2.3 g NaNO₂ in konz. Losung nitrosiert. Dabei geht zuerst das Oximhydrochlorid in Lösung, und das N-Oxid wird nach der Nitrosierung als gelbes Pulver abgeschieden. Es wird sofort abgesaugt, mit Wasser gewaschen und in Ethanol umkristallisiert.
Orangerote bis orangebraune Kristalle, Schmp. 185° (Zers.) (Lit. 185-188°), Ausb. 80%. - C₈H₇N₃O (161.2). -
Beispiel 8 Darstellung von 4-Phenyl-1,2,3-benzotriazin-3-oxid 1. Stufe: Darstellung von 2-Amino-diphenylmethanon-oxim
0.1 Mol o-Amino-diphenylmethanon wird in Ethanol mit dem 1.25-fachen molaren Überschuß Hydroxylaminhydrochlorid sowie mit 0.2 Mol KOH versetzt. Es wird auf dem Wasserbad unter Rückfluß erhitzt, bis trotz zusätzlicher KOH-Zugabe keine Trübung mehr auftritt. Das Filtrat wird eingeengt und nach 24 h das ausgefallene KCl abfiltriert. Man verdünnt mit Wasser und leitet CO₂ in den getrübten Ansatz. Das ausgefallene Oxim wird gewaschen.
Farblose Kristalle, Schmp. 139° (Zers.)/Gemisch aus h- und n-Oxim (Lit.), Ausb. 50%. -C₁₃H₁₂N₂O (212.3). -
2. Stufe: Darstellung von 4-Phenyl-1,2,3-benzotriazin-3-oxid
2 g der Verbindung (Gemisch aus h- und n-Oxim) werden in 50 ml 1N HCl gelöst und mit Eisstückchen auf 0° C gekühlt. Es wird mit 0.5 g NaNO₂ in konz. Lösung über 1 h hinweg langsam nitrosiert, der gelbe Niederschlag sofort abgesaugt und in Ethanol umkristallisiert.
Kanariengelbe Kristalle, Schmp. 156° (Zers.) (Lit.154°), Ausb. 60%. - C₁₃H₉N₃O (223 .2). -
Pharmakologische Daten Stimulation der löslichen Guanylat-Cyclase (sGC)
Zum Nachweis der sGC-Stimulation durch aus den erfindungsge­ mäßen Verbindungen freigesetztes NO wurden ausgewählte wasser­ lösliche Verbindungen sowie Nitroprussid-Natrium als bekannte NO-freisetzende Kontrollsubstanz in einem Radioimmunassay nach Schultz und Böhme untersucht (G. Schultz, E. Böhme, in: H.U. Bergmeyer (ed.), Methods in Enzymatic analysis, 3rd Ed., Vol. IV, S. 379, Verlag Chemie, Weinheim, 1984). Hierzu wurde eine Mischung, bestehend aus cGMP, GTP und [α³²P] GTP in Trietha­ nolamin-HCl-Puffer mit den zur Umsetzung erforderlichen Me­ tallionen (MnCl₂ bzw. MgCl₂) versetzt, mit γ-Globulin und Dithiothreitol stabilisierte sGC-Lösung sowie verschiedene Konzentrationen der zu untersuchenden Verbindung zugegeben und 10 Min. bei 37°C inkubiert. Nach Aufarbeitung und Reinigung wurden die Zerfallsraten der bei diesen Umsetzungen entstan­ denen [α³²P] cGMP-Konzentrationen gemessen und hieraus die je­ weilige Michaelis-Menten-Konstante (Km) für die verschiedenen Substanzen bestimmt. Diese kennzeichnet die Substratkonzentra­ tion [mol/l], bei der 50% der vorhandenen Enzymmenge als En­ zymsubstrat-Komplex vorliegt und die halbmaximale Reaktionsge­ schwindigkeit erreicht ist. Tabelle 1 enthält die Km-Werte ausgewählter erfindungsgemäßer Verbindungen sowie Kontroll­ werte für Nitroprussid-Natrium in Gegenwart von Magnesium- und Manganionen.
Tabelle 1
Die niedrigen Km-Werte der erfindungsgemäßen Verbindung, bei Anwesenheit von Mg2+-Ionen liegt der Km-Wert sogar unterhalb des Kontrollwertes für Nitroprussid-Natrium, belegen die hohe Potenz dieser Substanz zur Stimulation der Guanylatcyclase.
Gefäßrelaxation in vitro
Die gefäßerschlaffende Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde in vitro an isolierten Rattenaortenringen untersucht. Hierzu wurde Ratten nach Betäubung die Aorta thoracalis entnommen, diese von Fett- und Adventivgewebe be­ freit und in ca. 5 mm breite Ringsegmente zerteilt. Die Aor­ tenringe wurden in temperierte, mit Carbogen begaste Bäder mit Tyrodelösung überführt und einer Vorlast von 2 g ausgesetzt. Unter kontinuierlicher Registrierung der Kraftentwicklung wurden die Gefäßringe nach 90 minütiger Äquilibrierung mit 2 × 10-7 mol/l Phenylephrin vorkontrahiert. Nach Erreichen eines stabilen Kontraktionsniveaus wurden die Verbindungen kumulativ der Gefäßbadflüssigkeit zugesetzt, wobei die Zugabe der jewei­ ligen nächsthöheren Konzentration erst nach Erreichen eines stabilen Relaxationsniveaus erfolgte. Aus den erhaltenen Konzentrations-Wirkungs-Kurven wurde die Konzentration der jeweiligen Verbindung ermittelt, welche zu einer 50%igen Relaxation des vorkontrahierten Gefäßringes führt (EC₅₀-Wert). Tabelle 2 enthält den so ermittelten EC₅₀-Wert einer beispiel­ haft ausgewählten Verbindung.
Tabelle 2
NO-Freisetzungsmessungen
Die NO-Freisetzung aus den erfindungsgemäßen Verbindungen wurde in einem modifizierten Chemoluminiszenz-Test nach Feelisch und Noack untersucht [M. Feelisch, E. Noack: Nitric oxide (NO) formation from nitrovasodilators occurs independently of hemoglobin or non-hemo iron, European J. Pharmacol. 142, 465-9 (1987)]. Hierzu wurden 1.000 µl einer 2 mM Substanzlösung, die durch Verdünnung einer 10 mM Lösung in Ethanol mit 100 mM Na-Phosphatpuffer pH 7,4 hergestellt wurde, in eine Mikrokammer gegeben und mit weiteren 1.000 µl Phosphatpuffer, der wahlweise 10 mM L-Cystein (L-Cys) oder Glutathion (GSH) enthielt, versetzt und bei 37°C inkubiert.
Das dabei freigesetzte NO wurde mit über die Flüssig­ keitsoberfläche strömendes NO-freies Stickstoffgas aus der In­ kubationslösung ausgetrieben, mittels einer Vakuumpumpe zusam­ men mit dem Trägergas in einen Chemoluminiszenzdetektor gezo­ gen und quantitativ bestimmt. Hierbei wird NO vollständig mit Ozon zu angeregtem NO₂* umgesetzt, welches unter Emission von Lichtquanten, deren Anzahl proportional zur NO-Konzentration ist, in den Grundzustand NO₂ zurückfällt. Die emittierten Lichtquanten werden über einen Photomultiplier gesammelt und ausgezählt. Tabelle 3 enthält die unter diesen Bedingungen gemessene NO-Freisetzung beispielhaft ausgewählter Verbin­ dungen.
Tabelle 3
Die gemessenen NO-Freisetzungsraten der erfindungsgemäßen Ver­ bindungen belegen ihre Fähigkeit zur NO-Freisetzung. Diese er­ folgt auch in Abwesenheit reduzierter Thiolverbindungen.

Claims (2)

1. Verwendung von Stickstoffmonoxid freisetzenden Verbindun­ gen mit Nitrosohydrazinpartialstruktur als pharmakologisch aktive Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß diese N2- Nitrosophenylhydrazo-Derivate, 3,4,5-substituierte Nitrosopyrazole, Triazole oder Benzotriazinoxide sind.
2. Verwendung von Stickstoffmonoxid freisetzenden Verbindun­ gen mit Nitrosohydrazinpartialstruktur als pharmakologisch aktive Substanzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese folgende chemische Formeln aufweisen:
N2-Nitrosophenylhydrazosulfonsäure-Kalium
3-Ethoxy-4,5-dimethyl-1-nitroso-H-pyrazol
3-Ethoxy-4-ethyl-5-methyl-1-nitroso-H-pyrazol
3-Methyl-1,2,3-benzotriazol-1-oxid
1-Hydroxy-1,2,3-triazol-4,5-dicarbonsäure und ihr Silbersalz
4-Methyl-benzotriazin-3-oxid
4-Phenyl-benzotriazin-3-oxid
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