DE4211237A1 - 2',5'-Oligoadenylat-2',3'-cyclophosphate - Google Patents
2',5'-Oligoadenylat-2',3'-cyclophosphateInfo
- Publication number
- DE4211237A1 DE4211237A1 DE19924211237 DE4211237A DE4211237A1 DE 4211237 A1 DE4211237 A1 DE 4211237A1 DE 19924211237 DE19924211237 DE 19924211237 DE 4211237 A DE4211237 A DE 4211237A DE 4211237 A1 DE4211237 A1 DE 4211237A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- treatment
- skin
- mucosal lesions
- weeks
- new
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
Description
Die Erfindung betrifft am 3′-Ende eine Cyclophosphatgruppe
und am 5′-Ende eine freie OH-Gruppe aufweisende 2′,5′-Oli
goadenylate, ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindun
gen, ein sie enthaltendes pharmazeutisches Präparat und die
Verwendung dieser Verbindungen zur Behandlung äußerer Papil
lomatosen.
Die Erfindung betrifft neue chemische Verbindungen, und zwar
2′,5′-Oligoadenylat-2′,3′-cyclophosphate der allgemeinen
Formel
worin 0n10, insbesondere 0 bis 10, vorzugsweise 1
oder 2.
Insbesondere die Verbindungen mit n=1 oder 2 können vor
teilhaft für medizinische Zwecke, und zwar für die topische
Behandlung von Haut und Epithelläsionen verwendet werden,
die durch Papillomaviren verursacht werden.
Durch Papillomaviren der Familie Papovaviridae verursachte
Papillomatosen sind weit verbreitete Infektionskrankheiten
bei Mensch und Tier. Gegenwärtig sind mehr als 60 Typen
menschlicher Papillomaviren bekannt.
All diese Viren weisen ähnliche Struktur auf. Ihr Genom
stellt jeweils eine doppelsträngige kovalent geschlossene
ringförmige DNA mit 8 000 Basenpaaren dar, welche die Virio
nenproteine und die für die interzelluläre Entwicklung des
Virus erforderlichen Proteine kodiert. In der infizierten
Zelle wird das Genom der Papillomaviren im Verlaufe vieler
Generationen in Form von Episomen (Dutzende Kopien pro
Zelle) redupliziert. Die Bildung der reifen Virionen erfolgt
erst in den Zellen auf der Endstufe der Differenzierung.
Unter persistenten Bedingungen werden nur die ersten Gene
des Papillomavirusgenoms exprimiert, wobei sie eine Verände
rung des Zellphänotyps verursachen und auf diese Weise zur
Bildung von Papillomatosen führen. In den infizierten Zellen
kann ein bestimmter Teil des Virusgenoms mit einer vom
Virustyp und anderen Faktoren abhängigen Wahrscheinlichkeit
in das Zellgenom eingebaut werden, was dann die Malignisie
rung auslösen kann. Es ist bekannt, daß eine erhebliche Zahl
von menschlichen Tumoren das Ergebnis der Malignisierung von
Papillomatosen ist. Diese stellen somit eine Folge persi
stenter latenter Virusinfektionen dar.
Auf sexuellem Wege übertragene Anogenitalpapillomatosen sind
dabei, was die Malignisierung betrifft, am gefährlichsten
(s. M. Spitzer, Obstet. Gynecol., 1989, vol. 73, N3, S. 303-
307; H. zur Hausen, A. Schneider, The Role of Papillomavi
ruses in Human Anogenital Cancer, in: The Papovaviridae
(N.P. Alzman ed.), 1987, vol. 2, S. 245-263; H. zur Hausen,
Papillomaviruses as Carcinomaviruses, in: Adv. in Virus
Oncology (G. Klein ed.), 1989, vol. 8, S. 1-26).
Da Papillomatosen leicht zu diagnostizierende präkanzeröse
Erkrankungen sind, kann die Entwicklung vieler Tumore durch
Behandlung gutartiger Papillomatosen verhindert werden, d. h.
bevor es zu einer malignen Umwandlung der infizierten Zellen
kommt.
Gegenwärtig sind die wichtigsten Methoden zur Behandlung von
Papillomatosen die chirurgische Entfernung der Papillome
sowie die Nekrotisierung durch Elektro-, Kryo- oder Laser
kauterisation (s. Virus infections. Etiology, epidemiology,
clinics, pathogenesis and diagnosis. Rep. Col. of Scient.
Public., Sverdlovsk, 1985 (in Russisch)). Zu diesem Zweck
verwendet man flüssigen Sauerstoff, Säuren und deren Gemi
sche (Salpeter-, Oxal-, Milchsäure usw.), welche die Nekrose
der umgebenden gesunden Gewebe verursachen, an der Applika
tionsstelle zur Narbenbildung und häufig zu Rückfällen sowie
zum Auftreten neuer Papillome nahe der Stelle, an der die
alten entfernt wurden, führt (s. S.A. Bashi. Cryoterapia
versus podophyllin in the treatment of genital warts. Int.
J. Dermatol., 1985, vol. 24, N 8, s. 535-536).
Die Wirksamkeit medizinischer Methoden zur Behandlung von
Papillomatosen unter Verwendung von Podophyllotoxin und
Interferon ist gering und geht außerdem Hand in Hand mit
starken Neben- bzw. Nachwirkungen, selbst wenn mit therapeu
tischen Dosen gearbeitet wird.
Die biologische Aktivität von Podophyllin läßt sich durch
ihre mit Colchicin vergleichbare antimitotische Wirkung
erklären. Seine Anwendung verursacht häufig lokale Reaktio
nen (Entzündungen, allergische Kontaktdermatosen, gelegent
liche Hauterosionen usw.) sowie unerwünschte Nachwirkungen
wie periphere Neuropathie, Tachipnoe, Hämaturie und Abortus
spontaneus (s. K.R. Beutner. Podophyllotoxin in the treat
ment of Genital Human Papillomavirus Infections. Seminars in
Dermatology, 1987, vol. 6, N1, S. 10-18).
Die Applikation von Interferon im Falle von Papillomatosen
zeigt nur geringe Wirkung und die für diese Behandlung
eingesetzten Dosen können zur Suppression des Immunsystems
sowie zur Auslösung von Autoimmunerkrankungen usw. führen
(s. F.G. Bruins, A.J.C. von den Brule, R. Mullnik, G.M.M.
Walboomers, C.J. Meÿer, R. Willemze. J. Invest. Dermatol.,
1989, vol. 93, N4, S. 544-545; M. Foldvan, A. Moreland, M.
Nezei, ibid., S. 550; G. Gross, Roussaki, ibid., S. 553; M.
Niimura, imbid., S. 567).
Synthetische Analoga von 2′,5′-Oligoadenylaten (2,5 A) sind
dafür bekannt, daß sie immunosuppressorische Aktivität
zeigen und wurden bisher für chirurgische Transplantationen
vorgeschlagen. Es wurde festgestellt, daß Oligoadenylate als
Mediatoren für die durch Interferon verursachten Wirkungen
weniger toxisch, spezifischer wirksam und effektiver sind
als Immunsuppressoren (s. A. Kimchi et al., US-Patent
4 378 352 (1983)).
Dieselbe Wirkung wird auch durch eine endständige Morpho
lingruppe enthaltendes synthetisches 2,5 A (s. R. Torrence
et al., US-Patent 4 515 781 (1985)) erzielt.
2,5 A-Analoga mit mindestens drei Adenosinfragmenten sind
als aktive Inhibitoren der Virusproteinsynthese in vitro
bekannt (s. Jan M. Kerr et al., US-Patent 4, 21, P, 746
(1980)).
Einige synthetische Analoga von 2,5 A-Oligo-3′-deoxyade
nylaten und ihre Derivate inhibieren insbesondere in in
vitro-Kulturen die Infektion und Transformation tierischer
Zellen mit Herpes simplex und Epstein-Barr-Viren, sind
jedoch inaktiv im Falle bereits infizierter oder transfor
mierter Zellen (s. R.I. Suhadolnik et al., US-Patent
4 464 359 (1984); R.I. Suhadolnik et al., US-Patent 4 539
313 (1985); R.1. Suhadolnik et al., US-Patent 4 708 935
(1987)).
Möglich ist die Verwendung von 2,5 A für die Behandlung von
Infektionskrankheiten, die durch Cytomegalovirus, Hepatitis-
B-Virus und Varicella zoster-Viren verursacht werden (s. Eu
ropäische Patentanmeldung Nr. 121 635 (Au, No. J, Dk, Fi,
Fr, Es), 1984).
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines wirksamen
Arzneimittels mit selektiver Wirkung für die Behandlung von
durch Papillomaviren verursachte Haut- und Epithelläsionen.
Der Erfindungszweck wird erzielt durch Bereitstellung von
2′,5′-Oligoadenylat-2′,3′-cyclophosphaten der Formel I
worin 0n10, insbesondere 0 bis 10, vorzugsweise 1
oder 2.
Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung
der neuen Verbindungen, wie sie im nachfolgenden im einzel
nen beschrieben werden, ausgehend von Poly(A).
Diese Verbindungen können in an sich bekannter Weise herge
stellt werden ausgehend von Poly(A) mit unregelmäßigen
2′,5′- und 3′,5′-Internucleotidbindungen nach einem bekann
ten Verfahren (s. A.M. Michelson: In the Chemistry of the
Nucleosides and Nucleotides (Academic Press) 1963, S. 418
und 419) durch chemische Polymerisation von 2′(3′)-Adenosin
monophsphat. Die nachfolgende Spaltung der 3′,5′-Bindungen
in diesem Polymer durch Ribonuklease aus B. intermedius
(E.C.3.1.4.23) führt zu einem Monomer und 2′,5′-Oligo
adenylate von unterschiedlicher Länge mit endständigen
2′,3′-Cyclophosphatgruppen enthaltenden Gemisch.
Dieselben Ergebnisse erzielt man auch mit einem anderen
zweistufigen Verfahren:
1. Spaltung der Poly(A) mit Ribonuclease T2 (oder ähnlichen
Ribonucleasen), was zu einer Reihe von 2′,5′-Oligoadenylaten
führt, wobei jedes Oligomer ein Gemisch aus 2′,3′-Cyclo
phosphat und 3′-Monophosphat darstellt, und
2. Behandlung dieses Gemisches mit einem 100fachen Überschuß
an BrCN in gepufferter wässeriger Lösung, was zur Umwandlung
der endständigen 3′-Phosphatgruppe in die 2′,3′-Cyclo
phosphatgruppe führt.
Diese beiden Synthesewege können schematisch wie folgt
dargestellt werden:
Die erhaltenen Gemische aus 2′,5′-Oligoadenylaten werden
analysiert und die erwünschten Oligonucleotide gemäß Formel
I werden durch HPLC gereinigt.
2′,5′-Oligoadenylate mit einer endständigen 2′,3′-Cyclo
phosphatgruppe als Einzelverbindungen wurden bisher nicht
beschrieben. Sowohl die 2′(3′)Phosphatgruppen als auch die
2′,3′-Cyclophosphatgruppen in den 2′,5′-Oligoadenylaten
verhindern wirksam die Hydrolyse dieser Verbindungen mit
Zellenzymen. Die Wirksamkeit der 2′-3′-Cyclophosphatanaloga
gegenüber den natürlichen, die 5′-Triphosphatgruppe enthal
tenden 2′,5′-Oligoadenylaten erklärt sich durch das höhere
Zellpermeationsvermögen aufgrund der geringeren Ladung und
die Beständigkeit gegenüber der Hydrolyse durch Phosphodie
sterasen mit Zellenzymen.
Die erfindungsgemäßen 2′,5′-Oligadenylate werden in Wasser
oder wässerigen Lösungen von neutralen Salzen gelöst und 1
bis 2 mal täglich während 2 Wochen auf die Hautläsionen
(gewöhnliche flache Warzen sowie Sohlenwarzen, Kondylome
usw.) aufgebracht. Die Wirkstoffkonzentration beträgt 10-4
bis 10-7 M.
Infolge der Behandlung der Kondylome kommt es zum Wachstums
stillstand, eine Neubildung erfolgt nicht und die alten
Kondylome werden innerhalb von 4 bis 6 Wochen in den meisten
Fällen zurückgebildet.
Im Falle gewöhnlicher Warzen kommt es gegen Ende der ersten
Woche zu einer Abflachung der Papeln und 2 bis 4 Wochen nach
Beginn der Behandlung verschwinden sie vollständig. Patien
ten mit flachen Warzen sind 1 Monat nach Beginn der Behand
lung vollständig geheilt.
Im Verlaufe der Behandlung von Papillomen schrumpfen nach
1,5 bis 2 Wochen die Neubildungen und kleinere Papillome
werden abgestoßen und innerhalb 1 Monats kommt es zur voll
ständigen Rückbildung der Hautläsionen. In keinem einzigen
Fall kommt es zur Narbenbildung. Die Heilung wird auch nicht
von toxisch-allergischen Reaktionen oder anderen Nebenwir
kungen begleitet.
Die Konzentration der aktiven Oligoadenylate in den Behand
lungslösungen ist zwar wenigstens um zwei Größenordnungen
höher als im Falle der interferoninduzierten Zellen, die
Gesamtmenge an aufgebrachter Lösung liegt jedoch gewöhnlich
unter 1,0 ml. Selbst wenn alle Oligoadenylate absorbiert
werden, liegt deshalb die Durchschnittskonzentration in den
Zellen und Körperflüssigkeiten (Blut, Urin usw.) weit unter
der in den nicht induzierten Zellen. Die Konzentration an
den aufgebrachten Verbindungen kann nur vorübergehend (un
mittelbar nach Behandlung) höher sein als die ihrer natürli
chen Analoga in den normalen Zellen und das auch nur in den
Geweben in der unmittelbaren Umgebung der Applikationsstel
le.
Die 2′,5′-Oligoadenylate können durch Nucleasen und Phospha
tasen, die innerhalb und außerhalb der Zellen des Organismus
vorhanden sind, leicht abgebaut werden. Als Endprodukte
fallen dabei Adenylsäure und Adenosin an, die übliche Zell
metabolite darstellen, deren Durchschnittskonzentration in
den Zellen unter 10-3 M liegt.
Für die Behandlung von durch Papillomaviren induzierten
Haut- und Epithelläsionen können sowohl einzelne Oligonu
cleotide der Formel I als auch sie enthaltende Gemische
verwendet werden.
Die topische Anwendung geringer Dosen der erfindungsgemäßen
2′,5′-Oligoadenylate zur Behandlung von Papillomatosen ist
überaus wirksam, wobei keine negativen Hautreaktionen und
auch keine systemischen Nebenwirkungen beobachtet werden.
Ergebnis der Behandlung der Läsionen ist eine vollständige
Rückbildung bei mehr als 80% der Patienten. Nach einer
Beobachtungsdauer von 3 Monaten sind keine Rückfälle festzu
stellen.
Das erfindungsgemäße Präparat kann in unterschiedlichen, für
die topische Anwendung annehmbaren Formulierungen verab
reicht werden. Diese stellt man her durch sorgfältiges
Mischen bzw. Lösen der Einzelverbindungen oder ihrer Gemi
sche mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger unter
Verwendung der üblichen Techniken, wobei der Träger je nach
der für die Applikation erwünschten Formulierung des Präpa
rats, d. h. auf der Außenhaut oder auf Schleimhautgeweben
sehr unterschiedliche Form haben kann. Für die Herstellung
der Präparate können die verschiedensten pharmazeutischen
Medien verwendet werden, wie z. B. flüssige Träger wie Was
ser, Dimethylsulfoxid in An- oder Abwesenheit von Alkoholen,
Glycolen usw. oder in Form einer Pomade, einer Salbe oder
eines Pflasters. Besonders vorteilhaft ist es, die erwähnten
pharmazeutischen Präparate zur Erleichterung und Verein
heitlichung der Dosierung in einer Dosiseinheitsform zu
formulieren. Der Ausdruck "Dosiseinheitsform" bezieht sich
auf physikalisch diskrete Einheiten, von denen jede eine
bestimmte Menge Wirkstoff enthält, die so berechnet ist, daß
in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger
die gewünschte therapeutische Wirkung erzielt wird. Die
entsprechende Dosis für eine einzige Anwendung zur Behand
lung von Papillomatosen sollte 10-9 bis 10-8 M Wirkstoff
(n=1 und/oder 2) pro Papel (3 bis 5 mm im Durchmesser) zu
betragen. Die Gesamtdauer der Behandlung beträgt bis zu 30
Tagen bei täglicher Applikation.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Herstellung von
Oligonucleotidgemischen und einzelnen 2′,5′-Oligoadenylaten.
Chemisch-enzymatische Synthese, Reinigung und Analyse
der 2′,5′-Oligoadenylate.
Sämtliche Reaktionen werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
0,9 g (2,5 mMol) Adenosin-2′(3′)-monophosphat in H⁺-Form und
1,2 ml (2,6 mMol) tri-n-Octylamin werden in 30 ml Methanol/-
Ethanol (1:1) gelöst, wobei die Lösung mehrere Stunden ge
rührt wird. Danach werden die unlöslichen Anteile mit Hilfe
eines Glasfilters abfiltriert, wonach das Filtrat mit Hilfe
eines Rotationsverdampfers bis zur Trockene eingedampft
wird. Der erhaltene Feststoff wird dann in 10 ml abs. Dioxan
gelöst und mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bis zur
Trockene eingedampft. Beide Vorgänge werden zweimal wieder
holt. Dann wird der erhaltene Feststoff in 5 ml abs. Dioxan
gelöst, wonach 0,77 ml (3,75 mMol) Diphenylphosphorylchlorid
unter Rühren mit Hilfe eines Magnetrührers zugetropft wer
den. Danach werden 3,3 ml (7,5 mMol) tri-n-Octylamin zu
gesetzt. Dann wird die erhaltene Lösung 1 Stunde lang ge
rührt, wonach 0,77 ml Diphenylphosphorylchlorid und 3,2 ml
tri-n-Octylamin zugesetzt werden und weitere 4 Stunden
gerührt wird. Dann wird das Reaktionsgemisch in 5 Vol.
Hexan/Ether (4:6) unter Rühren gegossen. Der Niederschlag
wird dann mit Hilfe eines Glasfilters abfiltriert und mit
dem erwähnten Gemisch und danach mit Ether gewaschen und im
Vakuum getrocknet. Man erhält auf diese Weise ein weißes
Pulver von Polyadenylat mit unregelmäßigen 2′,5′- und 3′,5′-
Internucleotidbindungen. Die allgemeine Formel des Gemisches
ist (A2′(3′)p-)n A<p, worin n=10.
Das trockene Polymergemisch wird in 12 ml Wasser gelöst, in
dem man den pH durch Zugabe von konz. Ammoniaklösung auf 9,3
einstellt. Danach werden 3 Vol. Ethanol zugegeben, worauf
der pH mit 5 M HCl auf 3,0 eingestellt wird. Der nach Halten
des Gemisches bei -18°C gebildete Niederschlag wird abzen
trifugiert, mit 75% Ethanol gewaschen und im Luftstrom
getrocknet. Ein erheblicher Anteil des Monomers bleibt im
Überstand zurück.
Der in a) erhaltene Niederschlag wird in 40 ml H2O gelöst,
wobei der pH mit einer 3 M-Lösung von tris-Base auf 7,0
eingestellt wird, wonach 2 ml einer Lösung von RNAse aus
Bacillus intermedius (Binase, E.C.3.1.4.23) (150 E/mg)
zugesetzt werden und dann während 10 bis 12 Stunden gerührt
wird. Danach wird das Enzym durch Extraktion mit demselben
Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Die
erhaltene wässerige Phase enthält ein Gemisch aus 2′,3′-
Cyclophosphaten von Adenosin und 2′,5′-Oligoadenylaten.
Die vorgängige Abtrennung der einzelnen Komponenten erfolgt
durch Ionenaustauschchromatographie mit Hilfe von DEAE
Spheron 1000 in HCO3-Form (16×600 mm, 120 ml). Das enzyma
tische Spaltprodukt von Poly(A) wird nach Deproteinierung
durch ca. 8- bis 10malige Rotationsverdampfung eingeengt und
nach Zugabe von zehn Vol. Ethanol bei -18°C während 12
Stunden gehalten. Nach Zentrifugieren (10 bis 20 min,
3000 U/min) wird der Niederschlag in Wasser gelöst und auf
die Säule (optische Dichte 25 000 bis 50 000 E bei 260 nm)
aufgegeben. Nach Waschen der Säule mit Wasser und mit 0,05 M
Triethylammoniumbicarbonat (pH 8,0) werden die Produkte bei
linearem Gradienten dieses Salzes (0,1 bis 0,8 M, Gesamt
volumen 1 L) eluiert. Die die angereicherten Einzelverbin
dungen enthaltenden Fraktionen werden dann am Rotationsver
dampfer bis zur Trockene eingedampft und zur vollständigen
Entfernung der Pufferkomponenten lyophilisiert.
Die abschließende Reinigung der individuellen Verbindungen
erfolgt durch HPLC, wie unten angegeben (Beschickung der
halbpräparativen Säule mit ca. 2 000 E optische Dichte). Die
Entsalzung der Lösung nach HPLC erfolgt durch Sorption einer
10- bis 20fach verdünnten Lösung an kleinen DEAE-Säulen nach
Waschen mit Wasser, Eluierung mit einem geringen Volumen von
1 M Triethylammoniumbicarbonat und Lyophilisierung der Lö
sung.
Die Ionenaustauschchromatographie erfolgt an einer NH2-Dia
sorb-Säule (8 µm, 4×150 mm für die Analyse und 10 µm, 9,2×
250 mm für die abschließende präparative Reinigung);
linearer Gradient: Eluent A - 20% MeOH; B - 2M AmAc, 20%
MeOH, 2% B pro Gemisch; Fließgeschwindigkeit - 0,7 ml/min
für die analytische Säule und 4 ml/min für die präparative
(Fig. 1 bis 3). Der Nachweis erfolgt mit Hilfe eine UV-
Überwachungsgeräts bei 260 nm.
Die Gemische enthalten aufgrund der optischen Dichte bei 260
nm 40 bis 50% Monomer ca. 20 bis 30% Diadenylat, ca. 5
bis 15% Triadenylat, 2 bis 8% Tetraadenylat und 2 bis 7%
höhere Oligoadenylate. Der durchschnittliche molare Extink
tionskoeffizient betrug 15·103 pro Adenosinrest, 36,8·103 für
das Trimer und 45,8·103 für das Tetramer.
Jede Verbindung wurde zur Öffnung der Cyclophosphatgruppe
bei pH 1,0 (1 Std. bei 37°C) gehalten, dann durch bakteriel
le alkalische Phosphatase dephosphoryliert und der Alkalihy
drolyse der Internucleotidbindungen (0,3 M NaOH, 48 Stunden
bei 20°C) unterworfen. Das Verhältnis der Endprodukte (Ade
nosin zu Adenosin-2′(3′)-phosphat) wurde durch HPLC ermit
telt. Die dabei erzielten Ergebnisse stimmen mit den vor
hergesagten gut überein: Ado:AMP=1:1 für das Dimer, 1:2
für das Trimer und 1:3 für das Tetramer. Der Standardfehler
lag unter 5%. Die durch Säureöffnung der 2′,3′-Cyclo
phosphatgruppe erhaltenen Verbindungen waren aufgrund ihrer
HPLC-Beweglichkeit und NMR-Spektra (31P und 1H) identisch mit
den bekannten 2′(3′)-Phosphaten der entsprechenden Oligo
adenylate. Andererseits werden die erhaltenen 2′(3′)-Phos
phate quantitativ in die Ausgangs-2′,3′-Cyclophosphate der
entsprechenden Oligoadenylate durch Einwirkung von BrCN
(100facher molarer Überschuß) in wässeriger Lösung bei
Raumtemperatur quantitativ umgesetzt.
Die Behandlung der 2′,3′-Cyclophosphate der einzelnen 2′,5′-
Oligoadenylate mit frischer Binase bewirkt unter Bedingun
gen, die zu einer vollständigen Aufspaltung zu Polyaden
ylsäure - Adenosin - 2′,3′-Cyclophosphat führen, keinerlei
Veränderung im HPLC-Abtrennungsprofil und in den 31P NMR-
Spektra.
In den 31P NMR-Spektra wurden lediglich die Peaks festge
stellt, die der endständigen Cyclophosphatgruppe (20 bis 21
ppm) und dem 2′,5′-Internucleotidphosphat (0,02 bis 0,4 ppm)
entsprachen, und zwar bei einem Verhältnis von 1:1 für das
Dimer, 1:2 für das Trimer und 1:3 für das Tetramer. Der
Standardfehler lag unter 2%. Die 3′,5′-Bindung (unter 1%
Internucleotidphosphat) wurde nur für das Tetramer nach
gewiesen.
Die Oligoadenylate sind farblose Verbindungen und in Wasser
(bis zu 10-2 M), Dimethylsulfoxid, wässerigem Ethanol oder
Glycerol leicht löslich. Sie sind in neutraler wässeriger
Lösung bei 4°C mehrere Monate lang und in eingefrorener
Lösung (-20°C) oder in lyophilisiertem Zustand unbegrenzt
löslich.
Die klinische Untersuchung des pharmazeutischen Präparats
erfolgte an Papillomatose-Patienten. Die Behandlung erfolgte
mit den Na- oder Triethylammoniumsalz der entsprechenden
Verbindung, die auf die erforderliche Konzentration mit
Wasser oder 0,1 M NaCl verdünnt worden war. Die Konzentra
tion der wirksamen Verbindung in der Endlösung wurde anhand
ihrer optischen Dichte bei 260 nm unter Heranziehung der
oben angeführten molaren Extinktionskoeffizienten ermittelt.
Die dabei erzielten Ergebnisse sind nachfolgend zusammen
gefaßt. Die Beispiele illustrieren lediglich die Erfindung,
schränken sie jedoch nicht ein.
Klinische Prüfung von 2′,5′-Triadenylat-2′,3′-cyclophosphat
(n=1, AIII)
Diagnose bei Patientin M. (1958): scharfkantige Kondylome. Befund: im Perineum-Bereich vier Kondylome (d=1 bis 2 mm, h=2 bis 8 mm), die hautfarben, rauh, elastisch und manch mal schmerzhaft waren. Begleiterkrankung: Kolpitis.
Diagnose bei Patientin M. (1958): scharfkantige Kondylome. Befund: im Perineum-Bereich vier Kondylome (d=1 bis 2 mm, h=2 bis 8 mm), die hautfarben, rauh, elastisch und manch mal schmerzhaft waren. Begleiterkrankung: Kolpitis.
Applikation von AIII (10-4 M) bei täglich ca. 50 µl pro
Kondylom. Am 4. Tag zeigten sämtliche Kondylome eine runze
lige Oberfläche und am 8. Tag waren sie vollständig ver
schwunden. Nach 8 Wochen waren keine Rückfälle zu beobach
ten.
Diagnose bei Patientin P. (1950): mehrfache Kondylome.
Befund: im Perineum-Bereich 14 Kondylome (d=2 bis 8 mm,
h=2 bis 5 mm), die elastisch, hautfarben und manchmal
schmerzhaft waren.
Applikation von AIII (10-4 M) während 2 Wochen täglich 50 µl
pro Kondylom. Am 6. Tag waren sämtliche Kondylome auf die
Hälfte bis ein Drittel geschrumpft und am 10. Tag waren
8 Kondylome vollständig verschwunden, ohne auf der Haut
Spuren zu hinterlassen. Die übrigen 6 Kondylome waren wei
terhin vorhanden und nahmen 3 bis 4 Wochen nach Beendigung
der Behandlung wieder ihre ursprüngliche Größe an. Die
Behandlung wurde nicht wiederholt. 10 Wochen nach Ende der
Behandlung waren keine Veränderungen festzustellen (keine
Rückfälle bzw. keine Bildung neuer Kondylome).
Diagnose bei Patientin C (1958): Sohlenwarze. Befund: Eine
Warze auf der Unterseite der großen Zehe (d=5 mm, h
3 mm), die kompakt, von der Farbe der umgebenden Gewebe, mit
rauher Oberfläche, beim Gehen stark schmerzend war.
Applikation von AIII (10-4 M) täglich 50 µl pro Warze. Am 6.
Tag war die Warze weicher geworden und bei mechanischer
Einwirkung ließ sich die Warzenoberfläche wegreiben. Am 10.
Tag war die Warze vollständig verschwunden und beim Gehen
waren keine Schmerzen mehr zu verspüren. Bei der Kontrolle
nach 12 Wochen zeigten sich keine Rückfälle. Die betreffende
Stelle der Hautoberfläche unterschied sich in nichts von dem
umgebenden Gewebe.
Diagnose bei Patientin C. (1926): Papillome.
Befund: Auf der Vorderseite und auf der rechten Seite des
Halses wurden 7 Papillome festgestellt, und zwar zwei große
(d=3 und 2 mm, h=2,5 mm, dunkelbraun) und 5 kleinere
(d=0,8 bis 1,5 mm, h=0,8 bis 1,5 mm, hautfarben). Aufgetre
ten sind die Papillome 1982 während der Menopause.
Applikation von AIII (10-5 M), während 2 Wochen täglich ca.
50 µl pro Papillom. Am 5. Tag waren die kleineren Papillome
verblaßt, geschrumpft und abgeflacht. Weitere Veränderungen
waren nicht festzustellen. 2 bis 3 Wochen nach Beendigung
der Behandlung wiesen die Papillome wieder die ursprüngliche
Form und Größe auf.
Klinische Prüfung von 2′,5′-Tetraadenylat-2′,3′-cyclo
phosphat (n=2, AIV)
Diagnose bei Patientin S, 27 Jahre alt: gewöhnliche Warzen. Befund: Drei Warzen auf dem Bauch, 3 cm unterhalb des Nabels von gräulicher Farbe, vorstehend, Durchmesser 2 bis 3 mm. Die Warzen wurden zwei Wochen lang mit 1 bis 3 Tropfen AIV (10-5 M) täglich behandelt. Am 7. bis 10. Tag nach Beginn der Behandlung waren alle Warzen geschrumpft und abgeflacht. Drei Wochen nach Ende der Behandlung war eine der Warzen völlig verschwunden und vier Wochen nach Ende der Behandlung alle übrigen. Keine narbenähnlichen Veränderungen in der Haut.
Diagnose bei Patientin S, 27 Jahre alt: gewöhnliche Warzen. Befund: Drei Warzen auf dem Bauch, 3 cm unterhalb des Nabels von gräulicher Farbe, vorstehend, Durchmesser 2 bis 3 mm. Die Warzen wurden zwei Wochen lang mit 1 bis 3 Tropfen AIV (10-5 M) täglich behandelt. Am 7. bis 10. Tag nach Beginn der Behandlung waren alle Warzen geschrumpft und abgeflacht. Drei Wochen nach Ende der Behandlung war eine der Warzen völlig verschwunden und vier Wochen nach Ende der Behandlung alle übrigen. Keine narbenähnlichen Veränderungen in der Haut.
Sieben weitere Patienten mit mehrfachen Warzen, und zwar mit
Kondylomen (sechs Patienten), gewöhnlichen Warzen (drei
Patienten) und nicht identifizierten Warzen (vier Patienten)
wurden mit einer wässerigen Lösung (10-5 M) von AIV täglich
zwei Wochen lang behandelt. Die Kondylome befanden sich an
den äußeren Genitalien und auf der Brust, die Warzen an den
Handgelenken, am Körper und an den Beinen.
In den meisten Fällen schrumpften und verkleinerten sich die
Kondylome und Warzen (insbesondere erstere) nach sechs- bis
neuntägiger Behandlung. 1 bis 2 Wochen nach Ende der Behand
lung oder während dieser Zeit waren drei Patienten bereits
völlig kondylomenfrei und zwei zeigten keine gewöhnlichen
Warzen mehr. Ein Patient war ca. 6 Wochen nach Beendigung
der Behandlung völlig frei von sämtlichen sechs Kondylomen
unter der Achselhöhle. In zwei Fällen verschwanden während
oder nach der Behandlung die kleinen Kondylome (d<3 mm,
insgesamt 11) an den äußeren Genitalien, während die größe
ren im selben Bereich (d<5 mm, zwei im ersten Fall und
drei im zweiten) 2 bis 6 Wochen nach der Behandlung ihre
ursprüngliche Größe und Form wiedererlangten. Zwei der sechs
nicht identifizierten Warzen waren 2 bis 3 Wochen nach der
Behandlung verschwunden, die übrigen zeigten jedoch keine
Reaktion.
In keinem einzigen Fall wurden während der Behandlung oder 8
bis 12 Wochen danach negative Reaktionen, Spuren auf der
Haut oder Rückfälle beobachtet.
Klinische Prüfung des Gemisches A (Gemisch von 2′,5,-
Oligoadenylat-2′,3′-cyclophosphaten, n<0)
Getestet wurden zwei Patienten, und zwar einer mit drei gewöhnlichen Warzen (3 bis 4 mm) am Hals, und ein zweiter mit zwei Kondylomata acuminata auf der Innenseite des Beins. Jede Warze wurde täglich mit 1 bis 2 Tropfen 10-4 M wässeri ger Lösung des Gemisches A befeuchtet. Am 9. Behandlungstag waren sämtliche gewöhnlichen Warzen verschwunden. Ein klei nes Kondylom verschwand nach 7 Tagen Behandlung, ein anderes drei Wochen nach Beendigung der Behandlung, d. h. fünf Wochen nach Beginn der Behandlung.
Getestet wurden zwei Patienten, und zwar einer mit drei gewöhnlichen Warzen (3 bis 4 mm) am Hals, und ein zweiter mit zwei Kondylomata acuminata auf der Innenseite des Beins. Jede Warze wurde täglich mit 1 bis 2 Tropfen 10-4 M wässeri ger Lösung des Gemisches A befeuchtet. Am 9. Behandlungstag waren sämtliche gewöhnlichen Warzen verschwunden. Ein klei nes Kondylom verschwand nach 7 Tagen Behandlung, ein anderes drei Wochen nach Beendigung der Behandlung, d. h. fünf Wochen nach Beginn der Behandlung.
Die erzielten Ergebnisse zeigen deutlich die hohe Wirksam
keit der untersuchten Verbindungen und des Verfahrens zur
Behandlung von durch menschliche Papillomaviren verursachten
Haut- und Epithelläsionen. In keinem einzigen Fall war die
Behandlung der Papillomatosen mit 2′,5′-Oligoadenylaten von
einer schmerzhaften oder entzündlichen Reaktion sowie einer
subjektiven oder objektiven Verschlechterung des Zustandes
des Patienten begleitet.
Die hohe klinische Wirksamkeit der 2′,5′-Oligoadenylate bei
sehr geringer Dosierung und das Fehlen lokaler Reaktionen
und systemischer Nebenwirkungen sowie die Rezidivfreiheit
beweisen die Vorteile der genannten Verbindungen für die
Behandlung von Papillomatosen.
Ähnliche Ergebnisse wie bei der Behandlung von Papillomato
sen wurden auch bei Verwendung bereits bekannter Verbindun
gen, d. h. von 2′,5′-Oligoadenylaten mit natürlichen Adeno
sinresten und 2′(3′)-Phosphatgruppen (Serie B) oder freien
2′- und 3′-Hydroxylgruppen (Serie C) am 3-endständigen
Adenosinrest erzielt. In diesen Fällen erweisen sich bei der
Behandlung äußerer Papillomatosen sowohl die Einzelverbin
dungen, wie z. B. Trimere und Tetramere oder ihre Gemische
mit anderen Oligomeren Trimere B und C, Tetramere B und C,
Gemische B und C) als überaus wirksam.
Claims (4)
1. 2′ 5′-Oligoadenylat-2′,3′-cyclophosphate der allgemeinen
Formel
worin 0n10, insbesondere 0 bis 10, vorzugsweise 1
oder 2.
2. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenosin-
2′(3′)-phosphat auf an sich bekannte Weise zu Poly(A) mit
unregelmäßigen 3′,5′- und 2′,5′-Internucleotidbindungen
polymerisiert und dieses Polymer mit RNAse aus B. inter
medius (E.C.3.1.4.23) behandelt wird.
3. Pharmazeutisches Präparat zur Behandlung gutartiger oder
präkanzeröser, durch Papillomaviren verursachter Haut- und
Schleimhautläsionen, das eine der Verbindungen nach Anspruch
1 oder Gemische davon als Wirkstoff im Gemisch mit einem
pharmazeutisch verträglichen Träger oder einem Lösungsmittel
enthält.
4. Verfahren zur Behandlung lokaler, durch Papillomaviren
verursachter Haut- und Schleimhautläsionen, das die topische
Applikation einer wirksamen Menge einer Verbindung oder
eines Präparats nach Anspruch 3 umfaßt.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19924211237 DE4211237C2 (de) | 1992-04-03 | 1992-04-03 | 2',5'-Oligoadenylat-2',3'-Cyclophosphate |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19924211237 DE4211237C2 (de) | 1992-04-03 | 1992-04-03 | 2',5'-Oligoadenylat-2',3'-Cyclophosphate |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4211237A1 true DE4211237A1 (de) | 1993-10-14 |
DE4211237C2 DE4211237C2 (de) | 1995-11-02 |
Family
ID=6456003
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19924211237 Expired - Fee Related DE4211237C2 (de) | 1992-04-03 | 1992-04-03 | 2',5'-Oligoadenylat-2',3'-Cyclophosphate |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4211237C2 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5955446A (en) * | 1997-01-16 | 1999-09-21 | Pentose Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating herpes infections with 2',5'-oligoadenylate-2',3'-cyclophosphate compounds |
US6468991B1 (en) | 1997-01-16 | 2002-10-22 | Cyclis Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating rhinoviral infections |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4990498A (en) * | 1988-04-26 | 1991-02-05 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2- and 8-azido(2'-5')oligoadenylates and antiviral uses thereof |
-
1992
- 1992-04-03 DE DE19924211237 patent/DE4211237C2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4990498A (en) * | 1988-04-26 | 1991-02-05 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2- and 8-azido(2'-5')oligoadenylates and antiviral uses thereof |
Non-Patent Citations (9)
Title |
---|
Anal. Biochem. 92(1979) 276-279 * |
Biochemistry 30(1991), 2027-2033 * |
BIOSIS-Datenbank, AN 83:327692 (1983) * |
Chem. Abstr. 102(1985), 181532t * |
Chem. Abstr. 108(1988), 164357w * |
Enzyme Nomenclature 1984, Academic Press., S. 304, 305 * |
J. Med. Chem. 26(1983), 1674-1678 * |
JP-Kokai 58-36386 * |
Nucleic Acid Chemistry, ed. L.B. Townsend, Part 3, Wiley Interscience 1986, S. 241-244 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5955446A (en) * | 1997-01-16 | 1999-09-21 | Pentose Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating herpes infections with 2',5'-oligoadenylate-2',3'-cyclophosphate compounds |
US6468991B1 (en) | 1997-01-16 | 2002-10-22 | Cyclis Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating rhinoviral infections |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE4211237C2 (de) | 1995-11-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0721457B1 (de) | Gegen Papillomaviren wirksame 2',5'-OLIGOADENYLAT-2',3'-CYCLOPHOSPHATE und 2',5'-OLIGOADENYLATE | |
EP0653439B1 (de) | Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung | |
DE69822482T2 (de) | Salze von di(uridine 5'-tetraphosphate), verfahren zur herstellung und verwendungen davon | |
DE3320342C2 (de) | ||
DE2451358A1 (de) | Verfahren zur herstellung von modifizierte ribonucleinsaeuremolekuele enthaltenden zusammensetzungen und diese zusammensetzungen | |
US3737524A (en) | Medicaments derived from nucleic acids,processes for their preparation and their use | |
EP1276760B1 (de) | Polyamidnukleinsäure-derivate, mittel und verfahren zur ihrer herstellung | |
EP0322659A1 (de) | Verwendung von polysulfatierten Heparinen | |
EP1204430B1 (de) | Konjugate und verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zum transport von molekülen über biologische membranen | |
DE2713536C2 (de) | Verfahren zur Isolierung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids | |
EP0095682A2 (de) | Verfahren zur Herstellung zell- und geweberegenerierender Stoffe | |
DE2441454C3 (de) | Antileukämische proteinhaltige Fraktion und ihre Herstellung | |
DE4211237C2 (de) | 2',5'-Oligoadenylat-2',3'-Cyclophosphate | |
DE4211238C2 (de) | Verwendung von 2',5'-Oligoadenylaten zur Behandlung von Papillomatosen | |
DE1965431B2 (de) | Inosin-Komplexverbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE2911353A1 (de) | 3-o-( beta -d-glucoronpyranosyl)- sojasapogenol b, verfahren zu deren herstellung und arzneimittel, welche diese enthalten | |
DE2538573A1 (de) | Uridine und diese enthaltende pharmazeutische praeparate | |
AT392971B (de) | Verfahren zur herstellung neuer antitumor-antibiotika | |
DE3325957A1 (de) | Anthracyclin-derivate, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatika | |
DE2723451A1 (de) | Polyribonucleotide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als oder in arzneimitteln | |
DE3837203C2 (de) | ||
DE69720469T2 (de) | Nuklein-säuren die mit einem texaphyrin-metallkomplex intern derivatsiert sind und ihre verwendungen | |
DE1617659A1 (de) | Polynucleotide,welche als die Interferonerzeugung in lebenden tierischen Zellen induzierende Verbindungen wirksam sind | |
CH658001A5 (de) | Liposom. | |
DE2819297A1 (de) | Verfahren zur abtrennung und reinigung von produkten mit interferonaktivitaet, die hierbei erhaltenen produkte und deren verwendung als arzneimittelwirkstoffe |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |