DE69720469T2

DE69720469T2 - Nuklein-säuren die mit einem texaphyrin-metallkomplex intern derivatsiert sind und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE69720469T2
Application number: DE69720469T
Authority: DE
Inventors: Darren Magda; P. Shaun CROFTS; Meredith Wright
Original assignee: Pharmacyclics LLC
Current assignee: Pharmacyclics LLC
Priority date: 1996-08-20
Filing date: 1997-08-20
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2017-08-21
Also published as: EP0920439A1; ATE236190T1; AU4232597A; CA2263137A1; EP0920439B1; JP2000516631A; WO1998007733A1; DE69720469D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Texaphyrine sind aromatische, fünfzähnige, makrocyclische „expandierte Porphyrine", die sich als Kontrastmittel für die Magnetresonanzabbildung, als Sensibilisatoren für ionisierende Strahlung und zur Verwendung in der photodynamischen Therapie (PDT) eignen. Sie wirken bei der Hydrolyse von Phosphatestern und Ribonukleinsäure (RNA) und bei der durch Licht induzierten Spaltung von RNA und Desoxyribonukleinsäure (DNA). Texaphyrin wird als ein aromatisches Benzannulen angesehen, das sowohl 18π- als auch 22π-Elektronendelokalisierungspfade enthält, siehe beispielsweise J. L. Sessler et al., Accounts of Chemical Research, 1994, 27: 43. Texaphyrinmoleküle zeigen eine starke Absorption im gewebetransparenten 730–900-nm-Bereich und inhärente selektive Aufnahme bzw. Biolokalisierung in bestimmten Geweben, insbesondere Regionen wie beispielsweise der Leber, Atheromen oder Tumorgewebe. Texaphyrine und wasserlösliche Texaphyrine, Herstellungsverfahren und verschiedene Anwendungen sind in den US-Patentschriften 4,935,498; 5,162,509; 5,252,720; 5,256,399; 5,272,142; 5,292,414; 5,369,101; 5,432,171; 5,439,570; 5,451,576; 5,457,183; 5,475,104; 5,504,205; 5,525,325; 5,559,207; 5,565,552; 5,567,687; 5,569,759; 5,580,543; 5,583,220; 5,587,371; 5,587,463; 5, 591, 422; 5, 594, 136; 5, 595, 726; 5, 599, 923; 5, 599, 928; 5, 601, 802; 5, 607, 924 und 5, 622, 946 und den PCT-Veröffentlichungen WO 90/10633, 94/29316, 95/10307, 95/21845, 96/09315; 96/38461 und 96/40253 beschrieben.
Texaphyrine können mit stellenfindenden Molekülen gekoppelt werden, wodurch Konjugate gebildet werden, die sich für eine gezielte Verabreichung in vivo eignen. Eine stellenspezifische, lichtinduzierte Photospaltung von DNA mit einem diamagnetischen Metall-Texaphyrin-Komplex/Oligonukleotid-Konjugat wurde bereits durchgeführt; siehe Magda, D. et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117: 3629 und WO 96/09315. Eine stellenspezifische Esterhydrolyse von RNA mit einem Lanthanidmetall-Texaphyrin-Komplex/Oligonukleotid-Konjugat wurde gezeigt; siehe Magda, D. et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116: 7439 und PCT-Veröffentlichung WO 94/29316. Wurde der Komplex kovalent an ein Ende des Oligonukleotids gebunden, konnte man eine Hydrolyse beobachten; eine Hydrolyse wurde jedoch nicht beobachtet, wenn der Komplex kovalent an eine 5-Stellung eines internen Thyminrests gebunden wurde. Es ist daher also bislang noch nicht gezeigt worden, daß ein Texaphyrin-Metall-Komplex/Oligonukleotid-Konjugat, in dem das Texaphyrin kovalent an eine interne Bindung des Oligonukleotids gebunden ist, RNA hydrolysiert. Daß ein solches Konjugat für weitere hydrolytische Spaltungen zur Verfügung stehen würde (d. h. „Stoffumsatz" zeigt), wurde ebenfalls noch nicht gezeigt. Ein solcher RNA-Hydrolysekatalysator wäre überaus nützlich, da wesentlich kleinere Mengen benötigt werden würden. Dies ist besonders wichtig bei in-vivo- bzw. ex-vivo-Behandlungssituationen, bei denen es wünschenswert ist, daß nur eine relativ kleine Menge an therapeutischem Mittel vorliegt, oder bei Situationen, in denen nur ein Teil des Mittels an die Behandlungsstelle gelangen kann. Weiterhin wäre ein solcher Katalysator wünschenswert, wenn der Metallkomplex bzw. das Oligonukleotid recht teuer ist oder nur in relativ kleinen Mengen hergestellt werden kann.
Die PCT-Veröffentlichung WO 94/15619 betrifft säureresistente Oligonukleotide, die 2'-O-Alkyl-ribosylgruppen oder Methylphosphonat-Internukleosidbindungen enthalten und von denen berichtet wird, daß sie sich für eine orale Verabreichung bei der Antisense- oder Tripelstrangtherapie eignen. Das US-Patent 5,216,141 betrifft Nukleotidanaloga und Oligonukleotidanaloga mit Sulfid-, Sulfoxid- bzw. Sulfon-Verbindungsgruppen, die Stabilität gegenüber chemischer oder enzymatischer Hydrolyse verleihen. Die französische Veröffentlichung 2 697 254 betrifft Konjugate, die ein Oligonukleotid und ein Derivat eines Metalloporphyrinkations enthalten und die über eine oxidative Spaltung einer Zielnukleinsäure und nicht über eine hydrolytische Spaltung zu wirken scheinen.
Reynolds et al., (Nucleic Acids Research, 24: 760–765, 1996) betrifft Antisense-Oligonukleotide, die eine interne Nicht-Nukleotid-Verbindungseinheit enthalten, die an ein Spaltmolekül für die stellenspezifische Spaltung von RNA gebunden ist. Da die Bindungsaffinitäten gering waren, wurde die Spaltung bei 25°C durchgeführt und betrug nach 5tägiger Inkubation den Angaben gemäß weniger als etwa 10%, eine Geschwindigkeit, die für eine biologische Anwendung eindeutig unzureichend ist. Weiterhin wären solche Mittel bei einer Körpertemperatur von 37°C instabil. Die PCT-Veröffentlichung WO 95/26733 betrifft ähnliche Oligonukleosid-spaltende Verbindungen, bei denen die Inkubationen bei 25°C über Zeiträume von 2–5 Tagen durchgeführt wurden. Bashkin et al. (J. Am. Chem. Soc. 1994, 116: 59811–5982 und WO 91/19730) betrifft die Hydrolyse von RNA bei Geschwindigkeiten von 18–25% nach 72 h bei 45°C durch ein Ribozym-Imitat (Mimic). Diese Geschwindigkeiten sind gleichfalls zu langsam für biologische Anwendungen.
Die PCT-Veröffentlichung WO 96/07667 betrifft Oligonukleotidkonjugate, Zusammensetzungen und Verfahren zur Spaltung von Ribonukleinsäuren. Ein Umesterungs- oder Hydrolysekatalysator wird an das Oligonukleotid gebunden, wobei die innere Sequenz des Oligonukleotids teilweise nicht komplementär zur einer natürlich vorkommenden Ziel-RNA ist. Die Stabilität, die biologische Verteilung und die Toxizität des von Terpyridin abgeleiteten Lanthanidkomplexes sind nicht bekannt.
Da sich Texaphyrine vorteilhaft als pharmazeutische Mittel einsetzen lassen, stellen die Erfinder der vorliegenden Erfindung hier Texaphyrin-Metall-Komplex/Oligonukleotid-Konjugate bzw. Konjugate mit Oligonukleotidanaloga bereit, die hydrolytisch auf RNA wirken, und es wird gezeigt, daß diese Aktivität katalytisch ist, wobei unter Reaktionsbedingungen mit einem Substratüberschuß „Turnover" (Stoffumsatz) erfolgt.
KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Hydrolyse von Ribonukleinsäure. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Konjugate von Oligonukleotiden oder Oligonukleotidanaloga mit einem Texaphyrin-Metall-Komplex, wobei das Texaphyrin an eine interne Bindung im Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon gebunden ist und die Konjugate die beschriebene hydrolytische Wirkung haben.
Grundlage der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung, daß Konjugate aus Texaphyrin-Metall-Komplex und Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon, in denen das Texaphyrin an eine interne Bindung des Konjugats gebunden ist, hydrolytisch auf RNA wirken. Die Sequenz des RNA-Substrats ist wenigstens teilweise komplementär zum Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon, und besonders bevorzugt ist die Sequenz der RNA nahezu vollständig komplementär zum Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon. Das RNA-Substrat kann Schleifen oder Ausbuchtungen, AP-Stellen und/oder Mismatche oder andere Regionen ohne Basenpaarung enthalten. Die interne Bindung ist eine Bindung, die eine hydrolytische Spaltung der Ziel-RNA erlaubt und ganz besonders bevorzugt eine Spaltung durch die kleine Furche (Minor Groove) eines RNA-Nukleinsäure- Doppelstrangmoleküls ermöglicht. Bevorzugte Bindungen sind beispielsweise eine 2'-Bindung an eine interne Riboseeinheit eines Ribonukleinsäurerests des Oligonukleotids oder eine Bindung an eine interne verzweigte Verbindungseinheit eines Oligonukleotidanalogons.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Konjugate aus Texaphyrin-Metall-Komplex und Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon bereit, die einen katalytischen „Turnover" zeigen, wie aus hydrolytischen Reaktionen mit RNA zu ersehen ist, die unter Reaktionsbedingungen mit einem Überschuß an Substrat durchgeführt werden.
Ein Verfahren zur Synthese eines Texaphyrin-Metall-Komplex/Oligonukleotid-Konjugats, bei dem der Texaphyrin-Metall-Komplex an einen internen Ribonukleotidrest gebunden wird, ist ein weiterer Aspekt der Erfindung. Dieses Verfahren beinhaltet den Schritt einer Kupplung einer 2'-Hydroxylgruppe eines Ribonukleotidrests im Inneren des Oligonukleotids an ein Amiditderivat eines Texaphyrin-Metall-Komplexes.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Synthese eines Texaphyrin-Metall-Komplex/Oligonukleotidanalogon-Konjugats, bei dem der Texaphyrin-Metall-Komplex an eine verzweigte Verbindungseinheit im Inneren des Oligonukleotidanalogons gebunden ist. Das Verfahren umfaßt den Schritt der Kupplung der verzweigten Verbindungseinheit mit einem Amiditderivat eines Texaphyrin-Metall-Komplexes.
Ein Verfahren zur Hydrolyse von Ribonukleinsäure unter Reaktionsbedingungen, bei denen ein Überschuß an Konjugat vorliegt, ist ein weiterer Aspekt der Erfindung. Bei dem Verfahren bringt man die Ribonukleinsäure mit einem Konjugat aus Texaphyrin-Metall-Komplex und Oligonukleotid bzw. Oligonukleotid analogon, bei dem das Texaphyrin an eine interne Bindung des Oligonukleotids bzw. des Oligonukleotidanalogons gebunden ist, in Kontakt und inkubiert die Ribonukleinsäure und das Konjugat unter Reaktionsbedingungen, bei denen ein Überschuß an Konjugat vorliegt, über eine Zeitspanne, die ausreicht, eine Phosphatesterbindung der Ribonukleinsäure zu hydrolysieren.
Ebenfalls ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Hydrolyse von Ribonukleinsäure unter Reaktionsbedingungen, bei denen ein Überschuß an Substrat vorliegt. Bei dem Verfahren bringt man die Ribonukleinsäure mit einem erfindungsgemäßen Konjugat in Kontakt, wobei die hydrolytisch spaltende Wirkung auf die Ribonukleinsäure Ribonukleinsäureprodukte produziert, die vom Konjugat weg diffundieren oder durch ein anderes Substrat verdrängt werden, wodurch das Konjugat wieder frei wird und eine weitere Spaltungsreaktion katalysieren kann, und inkubiert die Ribonukleinsäure und das Konjugat unter Reaktionsbedingungen, bei denen ein Überschuß an Substrat vorliegt, über eine Zeitspanne, die ausreicht, eine Phosphatesterbindung der Ribonukleinsäure zu hydrolysieren und „Turnover" des Konjugats zu erzielen.
Die Verwendung eines Konjugats, das einen Texaphyrin-Metall-Komplex gebunden an eine interne Bindung eines Oligonukleotids oder Oligonukleotidanalogons enthält, wobei das Konjugat hydrolytisch spaltende Wirkung auf Ribonukleinsäure zeigt, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung für die hydrolytische Spaltung von Ribonukleinsäure oder zur Behandlung eines menschlichen Patienten bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung.

Gemäß einer seit langem bestehenden Übereinkunft im Patentrecht bedeuten die Ausdrücke „ein" und „eine" in dieser Anmeldung einschließlich den Ansprüchen jeweils „ein(e) oder mehrere". ABKÜRZUNGEN

CED:	β-Cyanoethyldiisopropyl-Schutzgruppe
DMT:	Dimethoxytrityl-Schutzgruppe
DyTx:	Ein an das Metall Dysprosium gebundenes Texaphyrin
N-PAC:	Phenoxyacetal-Aminoschutzgruppe
THF:	Tetrahydrofuran

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen sind Teil der vorliegenden Beschreibung und zur eingehenderen Erläuterung bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung beigefügt. Durch Bezug auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung hier vorgelegter spezifischer Ausführungsformen ist ein eingehenderes Verständnis der Erfindung möglich.
1 zeigt die Daten für die stellenspezifische Hydrolyse von 5'-³²P-markierter RNA unter Anwendung eines mit einem Dysprosium-Texaphyrin endderivatisierten Oligonukleotids (
= ohne zugesetzte RNA, ⧫ = mit Zusatz von 250 nM nicht-markierter RNA) und eines mit einem Dysprosium-Texaphyrin intern derivatisierten Oligonukleotids (
= ohne zugesetzte RNA, ⦁ = mit Zusatz von 250 nM nicht-markierter RNA).
2A und 2B zeigen mögliche Mechanismen für die unterschiedliche hydrolytische Wirkung eines mit einem Dysprosium-Texaphyrin endderivatisierten Oligonukleotids (2A) und eines mit einem Dysprosium-Texaphyrin intern derivatisierten Oligonukleotids (2B).
3 zeigt die stellenspezifische Hydrolyse eines RNA-Substrats durch ein intern derivatisiertes Konjugat in Gegenwart eines endderivatisierten Konjugats, wobei die Konjugate Bindungsspezifität für das gleiche Substrat aufweisen. Für ausführliche Angaben, siehe Beispiel 4. Die Symbole geben die verschiedenen Konzentrationen an RNA-Substrat an: ⧫ = 25 nM,
= 100 nM,
= 250 nM und X = 500 nM.
4 zeigt die stellenspezifische Hydrolyse eines RNA-Substrats durch ein endderivatisiertes Konjugat in Gegenwart eines intern derivatisierten Konjugats, wobei die Konjugate Bindungsspezifität für das gleiche Substrat aufweisen. Für ausführliche Angaben, siehe Beispiel 4. Die Symbole geben die verschiedenen Konzentrationen an RNA-Substrat an und entsprechen denen in 3.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
In der vorliegenden Erfindung werden Konjugate aus Texaphyrin-Metall-Komplexen und Oligonukleotiden bzw. Oligonukleotidanaloga offenbart, wobei das Texaphyrin an eine interne Bindung des Oligonukleotids bzw. des Oligonukleotidanalogons gebunden ist und die Konjugate bei der Hydrolyse von Ribonukleinsäure katalytische Wirkung haben. In einem früheren Dokument zeigte ein Konjugat, bei dem das Texaphyrin an einen internen Thyminrest gebunden war, keine hydrolytische Wirkung (WO 94/29316). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Konjugate mit RNA-hydrolytischer Wirkung konstruiert, wobei angenommen wird, daß das frühere Konjugat möglicherweise deshalb unwirksam war, weil es nicht so angeordnet war, daß es in die kleine Furche des DNA-RNA-Doppelstrangs hineinreichen konnte, um katalytisch zu wirken, und/oder daß die RNA-Zielsequenz vollständig komplementär mit der Sequenz des Oligonukleotidkonjugats war, so daß eine Katalyse verhindert wurde. Damit es zu einer Katalyse kommt, scheint es wichtig zu sein, daß das Texaphyrin an einer anderen Position der Base oder am 5'-3'-Gerüst eines wie in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Konjugats angebracht ist. Ohne sich einer Theorie zu verschreiben, wird angenommen, daß es sich bei der zunächst durch den Texaphyrin-Metall-Komplex katalysierten Umsetzung um eine Umesterungsreaktion handelt, in der ein reaktives, cyclisches Phosphatzwischenprodukt gebildet wird; das Zwischenprodukt reagiert dann mit Wasser. Die Gesamtreaktion ist somit eine Hydrolyse des Phosphatdiesters, und der Ausdruck „Hydrolyse" bezeichnet hier die Gesamtreaktion. Diese hydrolytische Reaktion hängt nicht von Gegenwart bzw. Abwesenheit von Licht ab.
Bei der RNA kann es sich um eine Lösung oder um eine Suspension von RNA oder um zelluläre RNA in vitro, in vivo oder ex vivo handeln. Die Fähigkeit, RNA zu hydrolysieren und zu spalten, hat wichtige Auswirkungen auf die Behandlung verschiedener Krankheiten; auf die Zerstörung von retroviraler RNA, Boten-RNA, ribosomaler RNA, RNA-Cofaktoren, Transfer-RNA, kleiner nukleärer RNA und kleiner cytoplasmatischer RNA, wodurch sich ein multifaktorieller Ansatz zur Eliminierung von kranken Zellen, Krebszellen und anderen unerwünschten Zellen bzw. Geweben ergibt. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate in Vorschriften zur Reinigung von Blut, ex vivo oder in vitro, für antivirale Behandlungen oder als diagnostische Sonden wird als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen. Bei einer Verwendung als diagnostische Sonde könnte man beispielsweise ein erfindungsgemäßes Konjugat mit hydrolytisch spaltender Wirkung auf Ribonukleinsäure zur Bestimmung der Nukleotidsequenz der RNA oder zum Nachweis von RNA-Polymorphismen einsetzen.
Zur Herstellung von Mitteln, die einen katalytischen „Turnover" zeigen können, ist es wichtig, daß ein Texaphyrin-Metall-Komplex-Katalysator an einer internen Position eines Oligonukleotids eingebaut wird, da das Konjugat das Substrat mit einer Stärke und Spezifität binden muß, die ausreicht, um eine spezifische Spaltung zu bewirken; damit „Turnover" stattfindet, müssen die Spaltprodukte jedoch vom Konjugatkatalysator wegdiffundieren bzw. ein Ersetzen des Stranges erlauben. Ein katalytischer „Turnover" unter Anwendung von erfindungsgemäßen Konjugaten wird hier gezeigt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden unter Bedingungen durchgeführt, die genügen, um die RNA zu hydrolysieren. Diese Bedingungen sind dem Fachmann bekannt bzw. können vom Fachmann ohne übermäßige experimentelle Anstrengungen bestimmt werden. Es wurde gefunden, daß diese Bedingungen physiologische Bedingungen einschließen. Dies ist besonders dann von Nutzen, wenn die Texaphyrinkomplexe in vivo oder ex vivo als Behandlungsvorschrift zur Hydrolyse von RNA eingesetzt werden.
Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung kann man den mit einem Metallion zu komplexierenden Texaphyrinmakrocyclus unter allen Texaphyrinmolekülen einschließlich den bereits bekannten und in den US-Patentschriften offenbarten Molekülen auswählen. Repräsentative Beispiele für Texaphyrin-Metall-Komplexe, die zur vorliegenden Erfindung gehören, fallen unter die folgende Formel:
M steht für ein zweiwertiges Metallkation oder ein dreiwertiges Metallkation mit katalytischer Wirkung auf die Hydrolyse von Ribonukleinsäure. Das Metall ist insbesondere ein Lanthanid-Kation oder ein Lewis-saures Kation wie beispielsweise Ce(III), Pr(III), Nd(III), Pm(III), Sm(III), Eu(III), Gd(III), Tb(III), Dy(III), Ho(III), Er(III), Tm(III), Yb(III), Lu(III), La(III), Sc(III), Y(III), In(III), Mn(III), Co(III), Ni(III) oder Fe(III). Zweiwertige Kationen können beispielsweise Ca(II), Mn(II), Co(II), Ni(II), Zn(II), Cd(II), Hg(II), Fe(II), Sm(II) oder UO₂(II) sein. Zu den bevorzugten Metallkationen gehören Eu(III), Gd(III), Tb(III) und Dy(III).
R₁–R₄, R₇ und R₈ stehen unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogenid, Hydroxyl, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Halogenalkyl, Nitro, Formyl, Acyl, Hydroxyalkyl, Oxyalkyl, Oxyhydroxyalkyl, Hydroxyalkenyl, Hydroxyalkinyl, Saccharid, Carboxyl, Carboxyalkyl, Carbonsäureamid, Carbonsäureamidalkyl, Amino, Aminoalkyl, ein Oligonukleotid, ein Oligonukleotidanalogon, eine katalytische Gruppe, einen Antikörper, ein Steroid, ein Hormon, ein Peptid mit Affinität für einen biologischen Rezeptor, ein Sapphyrinmolekül oder ein an ein Oligonukleotid, ein Oligonukleotidanalogon, eine katalytische Gruppe, einen Antikörper, ein Steroid, ein Hormon, ein Peptid mit Affinität für einen biologischen Rezeptor oder ein Sapphyrinmolekül gebundenes Kupplungsglied.
R₆ und R₉ sind unabhängig voneinander aus den Gruppen für R₁–R₄, R₇ und R₈ ausgewählt, mit der Maßgabe, daß das Halogenid nicht Iodid ist und das Halogenalkyl nicht Iodalkyl ist.
R₅ und R₁₀–R₁₂ stehen unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Hydroxyalkyl, Oxyalkyl, Oxyhydroxyalkyl, Hydroxyalkenyl, Hydroxyalkinyl, Carboxyalkyl, Carbonsäureamid, Carbonsäureamidalkyl, Amino, Aminoalkyl oder ein an ein Saccharid, ein Oligonukleotid, ein Oligonukleotidanalogon, eine katalytische Gruppe, einen Antikörper, ein Steroid, ein Hormon, ein Peptid mit Affinität für einen biologischen Rezeptor oder ein Sapphyrinmolekül gebundenes Kupplungsglied.
In den Texaphyrin-Metall-Komplexen der Konjugate der vorliegenden Erfindung steht wenigstens einer der Reste R₁–R₁₂ für ein Oligonukleotid, ein Oligonukleotidanalogon oder ein Kupplungsglied, das an ein Oligonukleotid oder ein Oligonukleotidanalogon gekuppelt ist.
Bei der Ladung Z handelt es sich um einen ganzzahligen Wert von weniger als oder gleich 5. Bei einem basischen Makrocyclus mit einem zweiwertigen oder dreiwertigen Kation steht Z für 1 bzw. 2. Angesichts der vorliegenden Offenbarung wird es dem Fachmann jedoch einleuchten, daß sich die Ladung Z je nach der Wahl des Metalls M, dem in Betracht gezogenen pH-Wert und Ladungen, die an einem der Substituenten R₁–R₁₂ vorhanden sind, sowie Ladungen, die an einem kovalent gebundenen Molekül vorhanden sind, beispielsweise Ladungen der Phosphatgruppen an einem Oligonukleotid, ändern kann. Ist beispielsweise R₁ = Carboxyl und R₂–R₁₂ = Alkyl und das Metall M = Tb⁺³ und hat die Lösung einen pH-Wert = 7 (so daß R₁ = CO₂ ^–), dann wäre die Ladung Z Null. Die Ladung wäre negativ, wenn die Substituenten eine ausreichende Anzahl an negativen Ladungen tragen, beispielsweise wenn es sich bei einem Substituenten um ein Oligonukleotid handelt. Die Ladung wäre zum Beispiel +5, wenn M für Dy⁺³ steht und die Nettoladung des/der Substituenten drei positive Ladungen beträgt.
Für den Fachmann versteht sich, daß die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Komplexe einen oder mehrere zusätzliche Liganden aufweisen können, die für eine Neutralisierung der Ladung und/oder eine koordinative Absättigung des Metallions sorgen. Zu diesen Liganden gehören u. a. Chlorid, Nitrat, Acetat, Cholat und Hydroxid.
Zu repräsentativen Beispielen für Alkane, die sich als erfindungsgemäße Alkylgruppensubstituenten eignen, gehören beispielsweise Methan, Ethan, geradkettige, verzweigte oder cyclische Isomere von Propan, Butan, Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan und Decan, wobei Methan, Ethan und Propan bevorzugt sind. In der vorliegenden Erfindung werden Alkylgruppen mit bis zu etwa dreißig oder bis zu etwa fünfzig Kohlenstoffatomen in Betracht gezogen. Zu den repräsentativen Beispielen für substituierte Alkyle gehören Alkyle, die durch zwei oder mehr der hier beschriebenen funktionellen Gruppen substituiert sind.
Zu repräsentativen Beispielen für Alkene, die sich als Alkenylgruppensubstituenten eignen, gehören Ethen, geradkettige, verzweigte oder cyclische Isomere von Propen, Buten, Penten, Hexen, Hepten, Octen, Nonen und Decen, wobei Ethen und Propen bevorzugt sind. In der vorliegenden Erfindung werden Alkenylgruppen mit bis zu etwa dreißig oder fünfzig Kohlenstoffatomen und bis zu etwa fünf Doppelbindungen oder besonders bevorzugt bis zu etwa drei Doppelbindungen in Betracht gezogen.
Zu repräsentativen Beispielen für Alkine, die sich als Alkinylgruppensubstituenten eignen, gehören Ethin, geradkettige, verzweigte oder cyclische Isomere von Propin, Butin, Pentin, Hexen, Heptin, Octin, Nonen und Decin, wobei Ethin und Propin bevorzugt sind. In der vorliegenden Erfindung werden Alkinylgruppen mit bis zu etwa dreißig oder bis zu etwa fünfzig Kohlenstoffatomen und mit bis zu etwa fünf oder bis zu etwa drei Dreifachbindungen in Betracht gezogen.
Bei Aryl kann es sich um eine Verbindung handeln, deren Moleküle die für Benzol, Naphthalin, Phenanthren, Anthracen und dergleichen charakteristische Ringstruktur aufweisen, d. h. entweder der 6-Kohlenstoff-Ring von Benzol oder die kondensierten 6-Kohlenstoff-Ringe von anderen aromatischen Derivaten. Bei einer Arylgruppe kann es sich beispielsweise um Phenyl oder Naphthyl handeln, und der hier verwendete Ausdruck schließt sowohl unsubstituierte Aryle als auch Aryle, die durch einen oder mehrere Nitro-, Carboxyl-, Sulfonsäure-, Hydroxyl-, Oxyalkyl- oder Halogenidsubstituenten substituiert sind, ein. In diesem Fall kann man den Substituenten am Phenyl oder Naphthyl in einem Syntheseschritt nach dem Kondensationsschritt, bei dem der Makrocyclus gebildet wird, einführen.
Von den Halogenidsubstituenten werden Chlorid, Bromid, Fluorid und Iodid für die Ausführung der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen, wobei jedoch für R₆ und R₉ Iodid ausgenommen ist. R₆ und R₉ können Chlorid-, Bromid- oder Fluoridsubstituenten aufweisen. Repräsentative Beispiele für in der vorliegenden Erfindung verwendete Halogenalkylgruppen sind Methan-, Ethan-, Propan-, Butan-, Pentan-, Hexan-, Heptan-, Octan-, Nonan- und Decanhalogenide, wobei Halogenide, vorzugsweise Chloride oder Bromide, von Methan, Ethan und Propan bevorzugt sind.
„Hydroxyalkyl" bedeutet Alkohole von Alkylgruppen. Bevorzugt sind Hydroxyalkylgruppen mit einem bis zwanzig, besonders bevorzugt einem bis zehn, Hydroxylgruppen. „Hydroxyalkyl" beinhaltet Glykole und Polyglykole; Diole von Alkylgruppen, wobei Diole von C_1-10-Alkylgruppen bevorzugt sind und Diole von C_1-3-Alkylgruppen besonders bevorzugt sind; und Polyethylenglykol, Polypropylenglykol und Polybutylenglykol, sowie Polyalkylenglykole, die Kombinationen von Ethylen, Propylen und Butylen enthalten.
Repräsentative Beispiele für Oxyalkylgruppen sind die hier beschriebenen Alkylgruppen mit Etherbindungen. „Oxyalkyl" schließt Polyether mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen ein. Die Anzahl von sich wiederholenden Oxyalkylgruppen in einem Substituenten kann bis zu 200 betragen und liegt vorzugsweise bei 1–20, besonders bevorzugt bei 1–10 und ganz besonders bevorzugt bei 1–5. Eine bevorzugte Oxyalkylgruppe ist O(CH₂CH₂O)_xCH₃, wobei x = 1–100, vorzugsweise 1–10 und besonders bevorzugt 1–5.
„Oxyhydroxyalkyl" bedeutet Alkylgruppen mit Ether- oder Esterbindungen, Hydroxylgruppen, substituierten Hydroxylgruppen, Carboxylgruppen, substituierten Carboxylgruppen und dergleichen.
Repräsentative Beispiele für Thioalkylgruppen sind Thiole von Ethan, Thiole von geradkettigen, verzweigten oder cyclischen Isomeren von Propan, Butan, Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan und Decan, wobei Thiole von Ethan (Ethanthiol, C₂H₅SH) oder Propan (Propanthiol, C₃H₇SH) bevorzugt sind. Zu den sulfatsubstituierten Alkylgruppen gehören wie oben beschriebene Alkylgruppen, die durch eine oder mehrere Sulfatgruppen substituiert sind; ein repräsentatives Beispiel ist Diethylsulfat ((C₂H₅)₂SO₄).
Repräsentative Beispiele für Phosphate sind Phosphat- und Polyphosphatgruppen. Repräsentative Beispiele für phosphatsubstituierte Alkylgruppen sind wie oben beschriebene Alkylgruppen, die durch eine oder mehrere Phosphat- oder Polyphosphatgruppen substituiert sind. Repräsentative Beispiele für phosphonatsubstituierte Alkylgruppen sind wie oben beschriebene Alkylgruppen, die durch eine oder mehrere Phosphonatgruppen substituiert sind.
Repräsentative Beispiele für Carboxylgruppen sind Carbonsäuren der oben beschriebenen Alkylgruppen sowie Arylcarbonsäuren wie Benzoesäure. Repräsentative Beispiele für Carbonsäureamide sind primäre Carbonsäureamide (CONH₂), sekundäre (CONHR) und tertiäre (CONR'R'') Carbonsäureamide, wobei R' und R'' jeweils für wie hier beschriebene funktionelle Gruppen stehen.
Repräsentative Beispiele für brauchbare Amine sind primäre, sekundäre und tertiäre Amine einer wie oben beschriebenen Alkylgruppe.
„Carbonsäureamidalkyl" bedeutet Alkylgruppen mit sekundären oder tertiären Amidbindungen oder dergleichen. „Carboxyalkyl" bedeutet Alkylgruppen mit Hydroxylgruppen, carboxyl- oder amidsubstituierten Ethern, Esterbindungen, tertiären Amidbindungen, die sich nicht direkt am Ether befinden, oder dergleichen.
Der Ausdruck „Saccharid" schließt oxidierte, reduzierte und substituierte Saccharide, Hexosen wie D-Glucose, D-Mannose oder D-Galactose; Pentosen wie D-Ribose oder D-Arabinose; Ketosen wie D-Ribulose oder D-Fructose; Disaccharide wie Saccharose, Lactose oder Maltose, Derivate wie Acetale, Amine und phosphorylierte Zucker; Oligosaccharide sowie offenkettige Formen verschiedener Zucker und dergleichen ein. Beispiele für Aminderivatisierte Zucker sind Galactosamin, Glucosamin, Sialsäure und D-Glucaminderivate wie 1-Amino-1-desoxysorbit.
Sapphyrinverbindungen sind in den US-Patenten 5,041,078, 5,159,065, 5,120,411, 5,302,714 und 5,457,607 offenbart.
Repräsentative Beispiele für brauchbare Steroide sind alle Steroide der folgenden fünf Kategorien: Progestine (z. B. Progesteron), Glucocorticoide (z. B. Cortisol), Mineralcorticoide (z. B. Aldosteron), Androgene (z. B. Testosteron) und Östrogene (z. B. Östradiol). Der Ausdruck „Steroid" schließt Steroidderivate ein. Der Ausdruck „Hormon" schließt Hormone wie Östradiol, Histamin oder Hormonmimetika wie Morphin ein.
Der Ausdruck „ein Peptid mit Affinität für einen biologischen Rezeptor" bedeutet, daß es beim Inkontaktbringen des Peptids mit dem biologischen Rezeptor, beispielsweise unter geeigneten Bedingungen, was die Ionenstärke, die Temperatur, den pH-Wert und dergleichen betrifft, zu einer spezifischen Bindung kommt. Die Wechselwirkung kann auf einer spezifischen elektrostatischen, hydrophoben, entropischen oder anderen Wechselwirkung einer bestimmten Aminosäure oder eines glykolytischen Rests des Peptids mit einer spezifischen Aminosäure oder einem glykolytischen Rest des Rezeptors beruhen, wodurch unter den die Wechselwirkung fördernden Bedingungen ein stabiler Komplex gebildet wird. Durch die Wechselwirkung kann sich die dreidimensionale Konformation und die Funktion bzw. Aktivität von dem an der Wechselwirkung beteiligten Peptid und/oder dem beteiligten Rezeptor ändern. Beispiele für Peptide mit Affinität für einen biologischen Rezeptor sind Endorphine, Enkephaline, Wachstumsfaktoren, z. B. epidermaler Wachstumsfaktor, Poly-L-lysin, Hormone, Peptidregionen eines Proteins und dergleichen. Bei dem Hormon kann es sich beispielsweise um Östradiol handeln.
Die hydrolytische Spaltung von Phosphatesterbindungen in RNA-Texaphyrin-Komplexen kann durch zusätzliche katalytische Gruppen am Texaphyrinkomplex oder an einem Konjugat aus Texaphyrinkomplex und Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon gefördert werden. Mit dem Ausdruck „katalytische Gruppe" ist eine chemische funktionelle Gruppe gemeint, die die Katalyse unterstützt, indem sie als allgemeine Säure, Brønsted-Säure, allgemeine Base, Brønsted-Base, Nukleophil oder auf eine Weise wirkt, bei der die Aktivierungsschwelle für die Reaktion herabgesetzt wird oder die Energie des Substrats im Grundzustand erhöht wird. Als katalytische Gruppen kommen beispielsweise die folgenden Gruppen in Betracht, wobei die Aufzählung jedoch nicht hierauf beschränkt ist: Imidazol; Guanidin; substituierte Saccharide wie D-Glucosamin, D-Mannosamin, D-Galactosamin, D-Glutamin und dergleichen; Aminosäuren wie L-Histidin und L-Arginin; Aminosäurederivate wie Histamin; Aminosäurepolymere wie Poly-L-lysin, (LysAla)_n, (LysLeuAla)_n, wobei n für 1–30, vorzugsweise für 1–10 und besonders bevorzugt für 2–7 steht, und dergleichen; Derivate davon; und Texaphyrin-Metall-Komplexe. Der Ausdruck „am Texaphyrinkomplex bzw. Konjugat" bedeutet, daß die katalytischen Gruppen entweder direkt am Texaphyrin-Metall-Komplex gebunden sind oder über eine Verbindungseinheit oder ein Kupplungsglied variabler Länge mit dem Texaphyrinkomplex verbunden sind oder an einen Oligonukleotid- oder einen Oligonukleotidanalogonteil eines Konjugats gebunden sind, mit oder ohne Verbindungseinheit oder Kupplungsglied variabler Länge.
Beispiele für Oligonukleotide bzw. Oligonukleotidanaloga, die hier von Nutzen sind, sind Polydesoxyribonukleotide, Oligodesoxyribonukleotide, Polyribonukleotidanaloga und Oligoribonukleotidanaloga, jedoch ist die Aufzählung nicht hierauf beschränkt. Es versteht sich, daß die hier und in den angefügten Ansprüchen verwendeten Ausdrücke „Nukleotid", „Polynukleotid" und „Oligonukleotid" sich sowohl auf natürliche als auch synthetische Nukleotide, Poly- und Oligonukleotide und Analoga und Derivate davon wie Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphorothioate, Phosphoramidate und dergleichen beziehen. Der hier verwendete Ausdruck „Analogon" schließt weiterhin Oligonukleotide mit synthetisch eingeführten Resten bzw. Verbindungseinheiten ein, wie z. B. einen Ribonukleinsäurerest in einer DNA-Sequenz, ein verzweigtes verbindendes Mittel, wie z. B. ein Glycerinderivat, oder ein Aminoalkyl-Verbindungsglied, ein, wobei die Aufzählung jedoch nicht hierauf beschränkt ist. In der vorliegenden Erfindung wird eine Modifikation des Zucker-, Basen- oder Phosphatteils eines Rests in Betracht gezogen.
Oligonukleotide haben eine exzellente Spezifität für Zielstellen und lassen sich leicht kontruieren. Zur Verbesserung der Stabilität in vivo können Oligonukleotide an den Basen, den Zuckern, den Kettenenden oder den Phosphatgruppen des Gerüsts derivatisiert werden. CpG-Sequenzen können derivatisiert werden, um einen Abbau auf ein Mindestmaß zu reduzieren; die Derivatisierung kann durch Alkylierung, vorzugsweise Methylierung, erfolgen. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Modifikationen der Phosphatgruppen bevorzugt, da Phosphatbindungen gegenüber der Einwirkung von Nukleasen empfindlich sind. Bevorzugte Derivate sind die Methylphosponate, Phosphotriester, Phosphorothioate und Phosphoramidate. Die Derivate können weiterhin abwechselnd Phosphorothioatbindungen und nicht modifizierte Bindungen oder abwechselnd Methylphosphonatbindungen und nicht modifizierte Bindungen oder abwechselnd Phosphorothioat- und Methylphosphonatbindungen enthalten. Zusätzlich können die Phosphatbindungen vollständig durch Nicht-Phosphat-Bindungen wie Amidbindungen ersetzt sein. Exonukleaseresistenz läßt sich weiterhin erzielen, indem man Gruppen an den Enden der Oligonukleotidketten anbringt. Das 5'- bzw. 3'-Ende kann mit einer Phosphoramidatbindung, einem über eine 3'-3'-Bindung mit dem Oligonukleotid konjugierten invertierten Nukleotid, einen Aminoacridinrest oder Poly-L-lysin derivatisiert bzw. blockiert sein. Oligonukleotide können so entworfen werden, daß sie absichtlich ein Mismatch, bezogen auf das Ziel-RNA-Substrat, aufweisen oder im Ziel-RNA-Substrat absichtlich eine Schleife oder eine Ausbuchtung induzieren. Verfahren zur Herstellung von Texaphyrin-Oligonukleotid-Konjugaten, die so modifiziert sind, daß sie eine erhöhte Stabilität aufweisen, sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in WO 94/29316 offenbart, die bereits durch Verweis Teil der vorliegenden Anmeldung ist.
Zuckermodifikationen können Gruppen wie Halogen-, Alkyl-, Alkenyl- oder Alkoxygruppen einschließen, die an einen Sauerstoff einer Riboseeinheit in einem Ribonukleotid gebunden sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Gruppe an den 2'-Sauerstoff der Ribose gebunden. Man kann insbesondere Halogeneinheiten wie Fluor verwenden. Bei der Alkoxygruppe kann es sich um Methoxy, Ethoxy, Propoxy oder Methoxyethoxy handeln. Die bevorzugte Alkenylgruppe ist Allyl. Als Alkylgruppe wird eine Methylgruppe bevorzugt, und die Methylgruppe ist an den 2'-Sauerstoff der Ribose gebunden. Andere mögliche Alkylgruppen sind Ethyl und Propyl.
Der hier verwendete Ausdruck „intern derivatisiertes Konjugat von Texaphyrin-Metall-Komplex und Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon" bedeutet, daß der Texaphyrin-Metall-Komplex über eine interne Bindung des Oligonukleotids bzw. Oligonukleotidanalogons an das Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon gebunden ist. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen, gehen die Erfinder der vorliegenden Erfindung davon aus, daß die Hydrolyse dadurch erleichtert wird, daß der Texaphyrin-Metall-Komplex die kleine Furche eines Doppelstrangmoleküls überspannt. Daher würde jede Konfiguration von Kupplungsgruppen zwischen dem Texaphyrin-Metall-Komplex und dem Oligonukleotid, die einen Zugang zur kleinen Furche ermöglichen und diese überspannen würde, für die vorliegende Erfindung in Betracht kommen. Die Länge eines Kupplungsgliedes läßt sich leicht unter Anwendung des vorliegenden Phosphoramidit-Ansatzes einstellen. Ist, wie in der vorliegenden Erfindung, das Texaphyrin an eine Gerüstbindung gebunden, so würde ein kürzeres Kupplungsglied zu einer geringeren Anzahl konformationeller Freiheitsgrade innerhalb des Doppelstrangs mit RNA führen, was eine Hydrolyse erleichtert. Beispiele für Kupplungs glieder bzw. Kupplungsgruppen sind kovalente Amid-, Amin-, Disulfid-, Thioether-, Ether-, Polyether-, Ester-, Phosphat- oder Thiophosphatbindungen. Bei bevorzugten Ausführungsformen sind die Konjugate und angefügten Gruppen kovalent über eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-, eine Kohlenstoff-Stickstoff-, eine Kohlenstoff-Schwefel- oder eine Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindung, besonders bevorzugt über eine Kohlenstoff-Sauerstoff- oder eine Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung, an das Texaphyrin gebunden. Bevorzugte Kupplungsglieder sind beispielsweise O(CH₂)_nPO₄ mit n = 1–10, besonders bevorzugt n = 1–6 und ganz besonders bevorzugt n = 3–6.
In einem Konjugat kann eine Base und/oder ein Zucker fehlen, oder es kann an oder in der Nähe der Stelle, an der das Texaphyrin angebracht ist, eine derivatisierte Base und/oder ein Zuckeranalogon enthalten. Ein Nukleotidanalogon kann beispielsweise ein carbocyclisches Nukleotid sein. Konjugate können Peptidnukleinsäuren enthalten.
Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung ist wenigstens einer der Reste R₁–R₁₂ ein Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon oder ein Kupplungsglied, das an ein Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gebunden ist. Weiterhin sind bei der vorliegenden Erfindung Verbindungen bevorzugt, in denen R₁ für Hydroxyalkyl oder Ethyl steht und R₂, R₃ und R₄ für Alkyl stehen. R₇ und R₈ können jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, Hydroxyalkoxy oder Oxyalkyl stehen. Alternativ dazu kann es sich bei R₁, R₃, R₇ oder R₈ um ein Oligonukleotid oder ein Oligonukleotidanalogon oder ein Kupplungsglied, das an ein Oligonukleotid oder ein Oligonukleotidanalogon gebunden ist, handeln.
Bei einem bevorzugten Texaphyrinkomplex der vorliegenden Erfindung stehen R₁, R₂ und R₃ für CH₂CH₃; R₄ steht für CH₃; R₅, R₆, R₉, R₁₀, R₁₁ und R₁₂ stehen für H; R₇ steht für OCH₃ und R₈ steht für ein Kupplungsglied-Oligonukleotid oder Kupplungsglied-Oligonukleotidanalogon. Alternativ dazu steht R₇ für ein Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon oder ein Kupplungsglied, das daran gekuppelt ist, besonders bevorzugt für O(CH₂)_nPO₄-Oligonukleotid, wobei n für 1–8 und vorzugsweise für 3–6 steht. Steht R₇ für ein Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon oder ein daran gekuppeltes Kupplungsglied, so kann R₈ für H, OCH₃ oder einen der oben aufgeführten bevorzugten Substituenten stehen. Bei einem weiteren bevorzugten Texaphyrinkomplex der vorliegenden Erfindung steht R₁ für (CH₂)₂CH₂OH; R₂ und R₃ stehen für CH₂CH₃; R₄ steht für CH₃; R₅, R₆, R₉, R₁₀, R₁₁ und R₁₂ stehen für H; R₇ steht für OCH₃ und R₈ steht für ein Kupplungsglied-Oligonukleotid oder Kupplungsglied-Oligonukleotidanalogon.
Für die hier beschriebenen Anwendungen werden häufig wasserlösliche Texaphyrine bevorzugt, insbesondere wenn eine in-vivo-Verabreichung und -Behandlung beabsichtigt ist. „Wasserlöslich" bedeutet eine Löslichkeit in wäßrigen Flüssigkeiten von etwa 1 mM oder mehr. Aufgrund dieser Charakteristika eignen sich die Texaphyrine für Anwendungen in biologischen Systemen. Eine bessere Wasserlöslichkeit läßt sich beispielsweise durch Substituenten, ausgewählt aus Sacchariden oder hydroxylierten Substituenten, erzielen.
In anderen für die vorliegende Erfindung bevorzugten Texaphyrinverbindungen sind R₁–R₁₂ wie in den Tabellen A und B für die Texaphyrine A1–A108, und M ist wie oben definiert. Die angeführten Texaphyrine sind gegenwärtig bevorzugte Verbindungen für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung; die Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschränkt, und für die Ausführung der Erfindung können sich alle Texaphyrinkomplexe eignen, die hydrolytisch auf RNA wirken.

Dem Fachmann auf dem Gebiet der organischen Synthese sollte es in Anbetracht der vorliegenden Offenbarung und der Offenbarungen in den Patenten, Anmeldungen und Veröffentlichungen, die durch Verweis Teil der vorliegenden Anmeldung sind, möglich sein, die zugrundeliegende Synthesechemie weiter zu entwickeln und zu verbessern und so Texaphyrine mit verschiedenen Substituenten herzustellen. So lassen sich zum Beispiel auf ähnliche Weise polyethergebundene polyhydroxylierte Gruppen, Saccharidsubstituenten, in denen das Saccharid über eine acetalähnliche glykosidische Bindung gebunden ist, Oligosaccharide oder Polysaccharide an ein Texaphyrin binden. Ein zweifach carboxyliertes Texaphyrin, in dem die Carboxylgruppen über Arylether oder funktionalisierte Alkylsubstituenten an den Texaphyrinring gebunden sind, ließe sich in verschiedene veresterte Produkte umwandeln, in denen die Esterbindungen zum Anknüpfen von weiteren hydroxylhaltigen Substituenten dienen. Polyhydroxylierte Texaphyrinderivate lassen sich durch Anwendung von sekundären Amidbindungen synthetisieren. Saccharideinheiten können über Amidbindungen eingeführt werden. Polyhydroxylierte Texaphyrinderivate mit verzweigten Polyhydroxyl-(Polyol-)Untereinheiten können über Arylether- oder -esterbindungen an den Texaphyrinkern gebunden werden.
Phosphoramidite eines Texaphyrin-Metall-Komplexes lassen sich wie im US-Patent 5,565,552 ausgeführt synthetisieren. Bei den vorliegenden Verfahren wurde ein Texaphyrin-Metall-Komplex mit einer freien Hydroxylgruppe unter einer Stickstoffatmosphäre mit Dichlormethan, Diisopropylethylamin, 2-Cyanoethyltetraisopropylphosphorodiamidit und 1H-Tetrazol inkubiert. Nach Extraktion und Waschen läßt sich das Texaphyrin-Metall-Komplex-Phosphoramidit für Standard-Festphasen- oder -Flüssigphasen-DNA-Syntheseschemata verwenden.
Mit den vorliegenden Verfahren ist es möglich, einen Texaphyrin-Metall-Komplex an einer internen Position in der Sequenz eines Oligonukleotids bzw. Oligonukleotidanalogons anzubinden. Ein Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon wird durch automatisierte Verfahren synthetisiert, eine Hydroxylgruppe an einer internen Position wird selektiv entschützt und diese Hydroxylgruppe wird anschließend mit einem Texaphyrin-Metall-Komplex-Phosphoramidit gekuppelt. Der Einbau einer Hydroxylgruppe in ein Desoxyribonukleotid-Molekül wurde unter Anwendung der folgenden Methoden erzielt. Bei einer ersten Methode wurde ein AP-Phosphoramiditreagens, das als asymmetrisches verzweigtes Phosphoramidit bezeichnet wurde, verwendet (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), mit dem es möglich war, ein Desoxyoligonukleotidanalogon zu synthetisieren, das an einer internen Stelle eine Verzweigung enthielt. Bei einer zweiten Methode wurde an einer internen Position ein RNA-Amidit-Monomer (z. B. Adenosin-(N-PAC)-CED-phosphoramidit, Biogenex, San Ramon, CA) verwendet.
Das den verzweigten Rest enthaltende Konjugat wurde nach der Synthese selektiv entschützt, wobei nach dem Blockieren des 5'-Terminus mit Essigsäureanhydrid eine gepufferte Hydrazinlösung verwendet wurde. Das das RNA-Monomer enthaltende Konjugat wurde nach der Synthese mit einer gepufferten Fluoridlösung selektiv entschützt. Bei einer Methode wurde die Dimethoxytrityl-Schutzgruppe am 5'-Terminus dort belassen. Bei einer anderen Methode wurde die DMT-Gruppe entfernt und die Hydroxylgruppe mit Essigsäureanhydrid blockiert. Die freie Hydroxylgruppe wurde dann mit dem Metallotexaphyrinphosphoramidit gekuppelt. Bei einem alternativen Ansatz zur Synthese des Konjugats, bei der die Bindung zur 2'-Stellung einer Ribose erfolgt, entschützt man den RNA-Rest unmittelbar nach der Kupplung, führt den Texaphyrin-Metall-Katalysator ein und fährt dann mit der DNA-Synthese fort. Bei einem weiteren alternativen Ansatz werden „invertierte" RNA-Amidite (Biogenex, San Ramon, CA) eingesetzt, d. h. Reagentien, die so geschützt sind, daß man 5'-2'-gebundene anstelle von 5'-3'-gebundener RNA erhält. Bei Anwendung des RNA-gebundenen Ansatzes setzt man vorzugsweise eine Polystyrolsäule ein. Die oben beschriebenen Ansätze für eine Modifizierung eines Oligonukleotids an einer internen Position während der Festphasensynthese wurden bislang noch nicht im Zusammenhang mit der Darstellung von Konjugaten von Texaphyrin-Metall-Komplexen und Oligonukleotiden bzw. Oligonukleotidanaloga beschrieben. Angesichts dieser Offenbarung wird dem Fachmann einleuchten, daß sich an ein Oligonukleotid mit mehr als einer internen Bindung mehr als ein Texaphyrin anbinden läßt.
Die Oligonukleotide bzw. Oligonukleotidanaloga der Konjugate der vorliegenden Erfindung sind ausreichend lang für eine Anbindung von wahrscheinlich wenigstens etwa 8 Nukleotiden einer komplementären Nukleinsäure. Zur Katalyse einer RNA-Spaltung, bei der das Konjugat im Vergleich zum Substrat in einem Überschuß vorliegt, kann das Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon eine beliebige, durch Kenntnis der Sequenz eines Substratmoleküls vorgegebene Länge aufweisen. Liegt bei der Katalyse der RNA-Spaltung ein Überschuß an Substrat vor, muß sich das Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon so an das Substrat binden, daß eine Katalyse bewirkt wird, und gleichzeitig so ausgeführt sein, daß die Spaltprodukte sich nicht so eng an das Konjugat binden, daß sie einen Austausch des Strangs verhindern und nicht wegdiffundieren. Von den Erfindern der vorliegenden Erfindung wird hier gezeigt, daß sich mit einem Konjugat mit 7 Basen auf der einen Seite und 15 Basen auf der anderen Seite der Stelle, an der das Metallotexaphyrin angebunden ist, „Turnover" erzielen läßt. Es ist möglich, daß ein RNA-Substratmolekül dazu in der Lage ist, das an die längere Seite des Konjugats gebundene Reaktionsprodukt zu verdrängen. Angesichts dieser Offenbarung sollte es dem Fachmann möglich sein, Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga zu entwerfen, deren Schmelzpunkte genügend niedrig sind, so daß Spaltprodukte vom katalytischen Konjugat wegdiffundieren können bzw. ein Substrat-RNA-Strangaustausch möglich ist. Es ist allgemein bekannt, daß A-T-Bindungen mit zwei Wasserstoffbrückenbindungen weniger stark sind als G-C-Bindungen mit drei Wasserstoffbrückenbindungen. Ein Konjugat mit einer Nukleotidsequenz, in der viele A- und T-Reste vorkommen, kann daher länger sein als eines mit einer Nukleotidsequenz, in der viele G- und C-Reste vorkommen, und dennoch ein Wegdiffundieren des Produkts von der Reaktionsstelle zulassen, was „Turnover" des Katalysators erlaubt.
Bedingung für die Verwendung von Texaphyrinkomplexen zur Hydrolyse von RNA in vivo bei einer Behandlungsvorschrift ist eine effektive Lokalisierung des Komplexes an der gewünschten Spaltstelle. Bei der gewünschten Spaltstelle kann es sich um eine Position handeln, die neuartig ist, was im Gesundheitswesen unerwünschte Organismen betrifft. Bei der gewünschten Spaltstelle kann es sich um eine RNA, die für ein Produkt kodiert, das den Wirt schädigt, oder um normale RNA, die auf irgendeine Weise schädigend wirkt, handeln. Eine Behandlung von nativer RNA mit einem Konjugat aus Texaphyrin-Metall-Komplex und Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon führt dazu, daß sich das Konjugat über das eingefügte Oligonukleotid bzw. dessen Analogon an eine komplementäre RNA-Sequenz bindet. Der Texaphyrinkomplex spaltet dann die RNA in der Nähe dieser spezifischen Stelle. Weiterhin bildet sich durch die Bindung eines Konjugats an eine DNA-RNA-Doppelhelix eine Tripelhelix, die eine für eine effektive Spaltung hinreichende Stabilität aufweist. Die Spaltung erfolgt am effizientesten, wenn das intern derivatisierte Konjugat und das Zielsubstrat nicht exakt komplementär sind, d. h. eine Region vorhanden ist, in der ein „lokales Aufschmelzen" stattfindet. „Lokales Aufschmelzen" ist beispielsweise als Schleife oder Ausbuchtung, als AP-Stelle oder Mismatch-Base(n) zu verstehen. In den hier angeführten Beispielen wird gezeigt, daß eine Spaltung mit verschiedenen Mismatch-Doppelsträngen, bezogen auf die Stelle, an der der Texaphyrin-Metall-Komplex angebunden ist, möglich ist; eine optimale Spaltung läßt sich mit einem Mismatch bzw. einer Schleife in der Nähe der Stelle, an der der Texaphyrin-Metall-Komplex angebunden ist, erzielen.
Die Konjugate aus Texaphyrin-Metall-Komplex und Oligonukleotid bzw. Oligonukleotidanalogon können sich zur Inhibierung der Expression eines Gens in einem Tier oder in einem bestimmten Gewebe eines Tieres durch eine gezielte Hydrolyse intrazellulärer mRNA eignen. Unmittelbare Anwendungen für die Konjugate und die vorliegenden Hydrolysemethoden finden sich in der antiviralen und antibakteriellen Therapie sowie bei Krebs (beispielsweise ein Oligonukleotid oder ein Analogon davon, das komplementär zu einem Onkogen ist) und bei entzündlichen Reaktionen, die durch die Überexpression von bestimmten Proteinen hervorgerufen werden.
Eine beispielhafte Methode zur Verabreichung von Konjugaten von Texaphyrin-Metall-Komplexen und Oligonukleotiden bzw. Oligonukleotidanaloga in eine Zelle ist die Verwendung von Texaphyrin-Oligonukleotid-Glykokonjugaten, die Oligonukleotide tragen, die spezifisch für die Zielsequenzen sind. Konjugate, die über eine Disulfidbrücke mit einem Glykokonjugat verbunden sind, könnten eine Zielstelle wesentlich wirkungsvoller erreichen als das entsprechende Oligonukleotid. Poly-L-lysin kann durch drei Komponenten substituiert sein: ein Oligonukleotid als Erkennungssignal, einen therapeutischen Texaphyrin-Metall-Komplex und eine Gluconsäure als Neutralisierungs- und Solubilisierungsmittel. Diese Art von neutralem, äußerst wasserlöslichem glykosyliertem Polymer kann ein wirksamer Trägerstoff zum Einschleusen von Arzneimitteln in Zellen sein.
Wie durch Fluoreszenzlokalisierung beobachtet und in den PCT-Veröffentlichungen WO 96/40253 und WO 96/38461 berichtet, werden Texaphyrin-Oligonukleotid-Konjugate von eukaryontischen Zellen aufgenommen. HL-60-Zellen (eine humane promyelocytische Leukämiezellinie) wurden mit einer Lösung (Endkonzentration 5 μM) eines entweder mit einem Y(III)-Metallion oder einem Lu(III)-Metallion komplexierten Texaphyrin-Oligonukleotid-Konjugats (wobei es sich bei dem Oligonukleotid um ein Phosphorothioat mit 15 Basen handelt) inkubiert. Die Zellen wurden mindestens 10 min und bis zu etwa 60 min inkubiert und anschließend gewaschen. Die Fluoreszenz wurde mit einem konfokalen Argonlaser mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm gemessen. Zum Sichtbarmachen der durch das Texaphyrin verursachten Fluoreszenz wurde ein Sperrfilter verwendet, der Wellenlängen unter 700 nm eliminierte. Die so erhaltenen Fluoreszenzbilder zeigten eine diffuse cytoplasmatische Fluoreszenz mit einigen Anzeichen von lokalen „Hot Spots", an denen die Fluoreszenz konzentriert war. Daß Texaphyrin-Oligonukleotid-Konjugate wirksame und spezifische Antisense-Mittel sein können, d.h. daß sie dazu in der Lage sind, in eine Zelle zu gelangen, die vorgesehene Substrat-RNA zu lokalisieren und die vorgesehene Substrat-RNA zu spalten, wird durch Untersuchungen gezeigt, die mit 5'-DyTx-Anti-c-myc-Kontrukten für die in-vitro-Onkogensuppression in HL-60-Zellen durchgeführt wurden. 5'-derivatisierte DyTx-Oligonukleotid-Konjugate mit Phosphorothioatresten und einer Sequenz komplementär zu einer c-myc-Spleißstelle wurden zu HL-60-Zellen gegeben, und die Zellproliferation wurde mit einem Standard-MTT-Assay untersucht. Das Antisense-Konjugat zeigte eine Wachstumshemmung, die über den Hintergrund niveaus lag. Substituierte man das gleiche Konjugat mit einem Metall, von dem bekannt war, daß es keine hydrolytische Wirkung auf RNA zeigt, so wurde keine die Zellproliferation hemmende Wirkung gefunden.
Für die oben beschriebenen Anwendungen werden Konjugate aus Texaphyrin-Metall-Komplexen und Oligonukleotiden bzw. Oligonukleotidanaloga als pharmazeutische Zubereitungen bereitgestellt. Eine pharmazeutische Zubereitung eines Konjugats kann alleine oder in Kombination mit pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoffen, entweder als Einzel- oder als Mehrfachdosis, verabreicht werden. Als pharmazeutische Trägerstoffe eignen sich beispielsweise inerte feste Verdünnungsmittel oder Füllstoffe, sterile wäßrige Lösungen und verschiedene organische Lösungsmittel. Die durch Kombinieren eines Konjugats der vorliegenden Erfindung mit den pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoffen gebildeten pharmazeutischen Zusammensetzungen werden dann einfach in verschiedenen Verabreichungsformen verabreicht. Die Verabreichung kann intravenös, intraperitoneal, parenteral, intramuskulär, subkutan, oral oder topisch erfolgen, wobei eine topische und intravenöse Verabreichung bevorzugt und eine intravenöse Verabreichung besonders bevorzugt ist.
Es können Lösungen der Konjugate in Sesam- oder Erdnußöl, in wäßrigem Propylenglykol oder in steriler wäßriger Lösung verwendet werden. Solche wäßrigen Lösungen sollten, falls erforderlich, in geeigneter Weise gepuffert sein, und das flüssige Lösungsmittel sollte zunächst mit ausreichend Kochsalzlösung bzw. Glucose isotonisch gemacht werden. Diese besonderen wäßrigen Lösungen eignen sich vor allem zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen und intraperitonealen Verabreichung. In diesem Zusammenhang wird es dem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt sein, welche sterilen wäßrigen Medien sich anwenden lassen. Für ein Auftragen auf Regionen der Körperoberfläche kommen topische Cremes, Emulsionen, Lösungen und dergleichen in Frage. Eine topische Anwendung kann auch durch Iontophorese erfolgen.
Zum Erhalt der Stabilität des Oligonukleotids werden Hilfsstoffe und Konservierungsstoffe gewählt. Die stark negativ geladenen Phosphat- oder Schwefelgruppen des Oligonukleotidgerüsts können auf Epithelzellen oder andere Oberflächenzellen reizend wirken. Um eine Reizung zu verhindern, können aus Formulierungszwecken Gegenionen verwendet werden.
Zu den pharmazeutischen Formen gehören sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die extemporierte Herstellung von sterilen Injektionslösungen oder -dispersionen. In allen Fällen muß die Form steril und ausreichend flüssig sein, so daß sie sich leicht mit einer Spritze anwenden läßt. Sie muß unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen konserviert sein. Bei dem Trägerstoff kann es sich um ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium handeln, das beispielsweise Wasser, Ethanol, l (zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle enthält. Eine geeignete Fluidität kann beispielsweise durch einen Überzug wie Lecithin, durch das Aufrechterhalten der erforderlichen Partikelgröße im Fall einer Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden aufrechterhalten werden. Die Einwirkung von Mikroorganismen läßt sich durch verschiedene Mittel gegen Bakterien und Pilze, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen, verhindern. In vielen Fällen wird man es bevorzugen, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker wie Mannit oder Dextrose, oder Natriumchlorid, mit in die Formulierung aufzunehmen. Ein besonders bevorzugtes isotonisches Mittel ist eine Mannitlösung mit einer Konzentration von etwa 2–8% und ganz besonders bevorzugt von etwa 5%. Eine retardierte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen läßt sich erzielen, indem man in den Zusammensetzungen Mittel verwendet, die eine Absorption verzögern, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile Lösungen werden hergestellt, indem man die Wirkstoffe in der erforderlichen Menge je nach Bedarf mit verschiedenen anderen der oben aufgeführten Inhaltsstoffe in das entsprechende Lösungsmittel einbringt und anschließend durch Filtrieren sterilisiert. Dispersionen werden im allgemeinen hergestellt, indem man die verschiedenen sterilisierten Wirkstoffe einem sterilen Vehikel zufügt, das. das zugrundeliegende Dispersionsmedium und die anderen erforderlichen Inhaltsstoffe von den oben aufgezählten enthält. Bei sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen Injektionslösungen sind die bevorzugten Zubereitungsmethoden Vakuumtrocknungs- und Gefriertrockungsverfahren, die ein Pulver des Wirkstoffs plus jeglicher zusätzlicher gewünschter Inhaltsstoffe aus der zuvor sternfiltrierten Lösung davon ergeben.
Der hier verwendete Ausdruck „pharmazeutisch unbedenklicher Trägerstoff" schließt alle beliebigen Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, Penetrationsmittel, Mittel gegen Bakterien und gegen Pilze, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen ein. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutische Wirkstoffe ist im Stand der Technik allgemein bekannt. Für eine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen werden alle herkömmlichen Medien bzw. Mittel in Betracht gezogen, es sei denn, sie sind mit dem Wirkstoff inkompatibel. Darüber hinaus können auch zusätzliche Wirkstoffe in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden: Ein zuverlässiger Assay für die RNA-Hydrolyse ist ein Assay für die Hydrolyse einer komplementären Ribonukleinsäure, wie in WO 94/29316 und den vorliegenden Beispielen 3 und 4 beschrieben. Eine Spaltung durch ein Konjugat würde zeigen, daß das Konjugat die gewünschte Wirksamkeit und Wirkung hat. Zur Untersuchung des Ausmaßes der hydrolytischen Aktivität und weiterhin zu Charakterisierungszwecken wurden die Konjugate der vorliegenden Erfindung auf eine stellenspezifische Hydrolyse komplementärer oder nahezu komplementärer RNA-Substrate unter Bedingungen erster Ordnung untersucht, d. h. unter Bedingungen, bei denen das Konjugat in einem Überschuß zur Konzentration der Substrat-DNA vorliegt. Zur Bestimmung des katalytischen „Turnovers" belegt ein Assay unter Reaktionsbedingungen zweiter Ordnung, bei denen die Konzentration des Substrats höher ist als die des Konjugat-Katalysators und man eine Spaltung beobachtet, die höher ist als die Konzentration des Konjugat-Katalysators, einen katalytischen „Turnover".
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu erläutern. Es sollte dem Fachmann einleuchten, daß die in den folgenden Beispielen offenbarten Methoden Vorschriften darstellen, von denen die Erfinder gefunden haben, daß sie bei der Anwendung der Erfindung gute Ergebnisse liefern und somit als bevorzugte Vorgehensweisen für die Ausführung der Erfindung gelten können. Es wird dem Fachmann jedoch einleuchten, daß, angesichts der vorliegenden Offenbarung, viele Abänderungen an den speziellen offenbarten Ausführungsformen vorgenommen werden können und man dennoch gleiche oder ähnliche Ergebnisse erhält, ohne daß man vom Umfang der Erfindung abweicht.
BEISPIEL 1
Eine RNA-Amidit-Methode zur internen Kupplung von Texaphyrin an ein Oligonukleotid
Im vorliegenden Beispiel wird die Herstellung eines Texaphyrin-Oligonukleotid-Konjugats bereitgestellt, wobei das Texaphyrin an ein internes Nukleotid gebunden ist; bei diesem Verfahren wird ein RNA-Amidit als Ausgangsmaterial verwendet. Ein Dysprosium-Texaphyrin-Phosphoramidit wurde an die freie 2'-Hydroxylgruppe eines RNA-Rests gekuppelt, der sich in einem Desoxynukleotid mit Standard-5'-3'-Bindungen befand. Ein Dysprosium-Texaphyrin-Phosphoramidit und Verfahren zu dessen Herstellung werden hier bereitgestellt. Ein früheres Verfahren zur Herstellung eines solchen Amidits wird im US-Patent 5,565,552, das durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung wird, beschrieben. Die R-Gruppen des hier verwendeten Texaphyrins waren wie folgt: R₁, R₂, R₃ stehen für CH₂CH₃; R₄ steht für CH₃; R₅, R₆ und R₉–R₁₂ stehen für H; R₇ steht für OCH₃ und R₈ steht für -Verbindungsglied, wobei es sich bei dem Verbindungsglied entweder um O(CH₂)₃PO₄ oder O(CH₂)₆PO₄ (DyTxO(CH₂)_nPO₄, wobei n für 3 oder 6 steht) handelte.
Eine Texaphyrin-Phosphoramidit-Verbindung zur internen Kupplung an ein Oligonukleotid, wobei es sich bei dem Verbindungsglied um O(CH₂)₆PO₄ handelte, wurde wie folgt dargestellt. Eine weitere Verbindung mit dem Verbindungsglied O(CH₂)₃PO₄ wurde auf ähnliche Weise hergestellt, wobei die unten beschriebene Hexylverbindung durch eine Trimethylenverbindung ersetzt wurde. Angesichts der vorliegenden Offenbarung sollte es dem Fachmann möglich sein, andere Texaphyrin-Phosphoramidit-Verbindungen zu synthetisieren, in denen n für 1–10 steht.
1,2-Dinitro-4-hydroxy-5-methoxybenzol. Dinitroveratrol (5 g, 0,0219 mol) wurde in Eisessig (50 ml) gelöst und bei Raumtemperatur (RT) mit konzentrierter HBr (48 Gew.-% in Wasser, 165 ml) in einer Portion versetzt. Die Reaktionstemperatur wurde auf 110°C erhöht und die Mischung wurde 6 h lang gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurde mit Eiswasser (150 ml) versetzt, und die Mischung aus Ausgangsmaterial und Zielverbindung wurde mit Chloroform (2 × 400 ml) aus der wäßrigen Phase extrahiert. Die Zielverbindung wurde mit 2 N Natronlauge (600 ml) aus der Chloroformschicht extrahiert. Zum Entfernen verbliebener Spuren an Ausgangsmaterial wurde die basische wäßrige Phase mit Chloroform (2 × 200 ml) gewaschen. Die organischen Schichten aus den basischen Extraktionen wurden vereinigt und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Abdampfen der Lösungsmittel im Vakuum lieferte wiedergewonnenes Ausgangsmaterial als hellen kristallinen Feststoff (2,35 g). Der basische wäßrige Extrakt wurde mit konz. HCl (37 ml) auf einen pH-Wert von < 1 angesäuert und mit Essigsäureethylester (2 × 250 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum abgezogen, wodurch man die Titelverbindung als gelben, pulverförmigen Feststoff (1,82 g) erhielt.
1,2-Dinitro-4-(1-hydroxyhexyl)oxy-5-methoxybenzol. Eine Lösung des oben hergestellten Methoxybenzols (270 mg, 1,259 mmol) in Acetonitril (40 ml) wurde mit 6-Brom-1-hexanol (330 ml, 2,519 mmol) und dann mit Natriumiodid (190 mg, 1,259 mmol) und Kaliumcarbonat (697 mg, 5,045 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre auf 70°C erhitzt. Nach 5 Tagen wurde die Reaktionsmischung auf 0°C abgekühlt und durch einen Trichter aus feingesintertem Glas filtriert. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum abgezogen und der so erhaltene Feststoff wurde in Isopropylalkohol (2 ml) gelöst. Das Zielprodukt wurde durch Zusatz von Hexan (20 ml) zu der schnell gerührten Lösung ausgefällt. Der Feststoff wurde filtriert, mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet, wodurch man die rohe Zielverbindung als einen hellen gelben Feststoff (344 mg) erhielt. Aufreinigung durch Chromatographie einer kurzen Kieselgelsäule unter Verwendung von Methylenchlorid als Laufmittel führte zur Isolierung des Produkts als hellgelben, kristallinen Feststoff (274 mg, 69%).
4-(1-Hydroxyhexyl)oxy-5-methoxy-1,2-phenylendiamin. 1,2-Dinitro-4-(1-hydroxyhexyl)oxy-5-methoxybenzol
(300 mg, 0,9546 mmol) wurde in Methanol (30 ml) gelöst. Konz. HCl (1 ml) wurde zugesetzt, gefolgt von Palladiumkatalysator (10% auf Aktivkohle, 90 mg). Der Ansatz wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre bei 45 psi geschüttelt. Nach 5 h wurde nach Ende der Wasserstoffaufnahme der Katalysator durch Filtrieren über Celite entfernt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgezogen, wodurch man die Titelverbindung als Dihydrochloridsalz (305 mg, 98%) erhielt.
4,5,9,24-Tetraethyl-16(1-hydroxyhexyl)oxy-17-methoxypentaazapentacyclo[20.2.1.^3,6.1^8,11.0^14,19]heptacosa-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18,20,22(25),23-tridecaen.
Eine Lösung des obigen Phenylendiamin.2HCl (485 mg, 1,4821 mmol) in Methanol (240 ml) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre in einer Portion mit festem 2,5-Bis[5-formyl-3-ethyl-4-methylpyrrol-2-yl)methyl]-3,4-diethylpyrrol versetzt. Der Ansatz wurde 2 h lang auf 75°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Lösung wurde mit Aktivkohle (330 mg) versetzt, und die Mischung wurde 15 min lang gerührt. Die Aktivkohle wurde durch Filtrieren über Celite entfernt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgezogen. Die Zielverbindung wurde als Dihydrochloridsalz in Form eines orangefarbenen Glases (900 mg, 85%) isoliert.
Dysprosiumkomplex von 4,5,9,24-Tetraethyl-16-(1-hydroxyhexyl)oxy-17-methoxypentaazapentacyclo- (20.2.1.1^3,6.1^8,11.0^14,19]heptacosa-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18,20,22(25),23-tridecaen, Verb. 1_A. Eine Lösung des oben hergestellten Tridecaens (130 mg, 0,1824 mmol) in Methanol (30 ml) wurde mit Dysprosiumnitrat-Pentahydrat (120 mg, 0,2736 mmol) und anschließend mit Triethylamin (260 ml, 1,834 mmol) versetzt. Der Ansatz wurde unter leichtem Rückfluß in einem offenen System erhitzt. Nach 2,5 h wurde der Ansatz auf RT abkühlen gelassen und durch eine Schicht Celite filtriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgezogen und der so erhaltene rohe Komplex wurde 10 min lang mit Aceton (30 ml) verrieben. Der Feststoff wurde durch Absaugen isoliert und im Vakuum getrocknet. Zum Entfernen von nicht gebundenen Dysprosium-Metallionen wurde der Komplex in einer Mischung von Methanol/Wasser (9 : 1, 15 ml) gelöst und sachte mit Zeolith (SAY-54, 600 mg) gerührt, der zuvor mit verdünnter HCl und entsalztem Wasser gewaschen worden war. Nach 1,5 h wurde der Zeolith abfiltriert und der Vorgang mit frischem Zeolith wiederholt. Nach Entfernen des Zeoliths wurde der Ansatz mit n-Butylalkohol (10 ml) versetzt, um einen Siedeverzug während des Entfernens des Lösungsmittels zu verhindern. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum abgezogen, wodurch man die Zielverbindung 1_A als Dinitratsalz in Form eines intensivgrünen Feststoffs (97 mg, 58%) erhielt. MS(FABLR) M-HNO₃-NO₃ 796.
Dysprosiumkomplex von 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropyl-6-(4,5,9,24-tetraethyl-17-methoxypentaazapentacyclo[20.2.1.1^3,6.1^8,11.0^14,19]-heptacosa-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18,20,22(25),23-tridecaen-16(1-oxy)hexylphosphoramidit, Verb. 1_B. Unter einer Atmosphäre von ausschließlich Stickstoff wurde der oben hergestellte feste DyTx-Komplex (230 mg, 0,250 mmol) mit wasserfreiem Dichlormethan (22 ml) und dann mit 2-Cyanoethyltetraisopropylphosphordiamidit (793 ml, 2,496 mmol), N,N-Diisopropylethylamin (131 ml, 0,749 mmol) und 1H-Tetrazol (35 mg, 0,500 mmol) versetzt. Nach 4 h wurde der Ansatz mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (15 ml) und dann mit gesättigter Kochsalzlösung (15 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde 5 min über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, auf ein Volumen von 2,9 ml eingeengt und dann tropfenweise zu intensiv gerührtem Diethylether (153 ml) gegeben. Der so erhaltene Feststoff wurde unter Verwendung eines Trichters mit einer feingesinterten Glasfritte abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet, wodurch man die Titelverbindung 1_B als intensivgrünen Feststoff (142 mg) erhielt.
Unter Anwendung eines Standardprotokolls für einen DNA-Synthesizer nach Angaben des Herstellers (Modell 392, Perkin-Elmer, Foster City, CA) wurde ein DNA-Oligomer mit neun Nukleotiden im Maßstab von 1 μmol hergestellt. An die wachsende Kette wurde mit Adenosin-RNA-Amidit (Adenosin-(N-PAC)-CED-Phosphoramidit; BioGenex, San Ramon, CA) ein Adenosinrest gekuppelt. Die DNA-Synthese wurde über weitere acht Cyclen mit Standardbasen fortgesetzt, wodurch man eine Sequenz von 18 Resten erhielt. Die letzte 5'-DMT-Schutzgruppe wurde intakt gelassen.
Die Säule mit festem Träger, die das Oligonukleotid aus 18 Resten enthielt, wurde aus dem Synthesizer entnommen, an zwei Einwegspritzen (3 ml) angeschlossen und mit einer 1 : 1-Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (1 M in THF, Aldrich, Milwaukee, WI) und 2 M Triethylammoniumacetatpuffer (Glen Research, Sterling, VA), ungefähr 2 ml, 1,5 h lang behandelt, indem man die Reagentien mit Hilfe der Spritzen in gewissen Zeitabständen durch die Säule drückt. Dieses Verfahren wurde mit frischen Spritzen mit einer 2 : 1-Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (1 M in THF, Aldrich, Milwaukee, WI) und 2 M Triethylammoniumacetatpuffer (Glen Research) 1 h lang wiederholt. Die Säule wurde dann mit ungefähr 20 ml Acetonitril gewaschen und wieder in den Synthesizer eingesetzt.
Die Säule wurde dann mit dem DyTx-Amidit behandelt, wobei ein RNA-Kupplungszyklus nach Angaben des Herstellers des DNA-Synthesizers zur Anwendung kam, der wie folgt modifiziert wurde: der erste Schritt zur Abspaltung von DMT wurde ausgelassen, der Träger wurde dreimal 10 min mit dem DyTx-Amidit gekuppelt, und die Standardschritte von Oxidation, Blockieren und Abspalten des DMT wurden wie gewöhnlich durchgeführt.
Das so erhaltene trägergebundene DyTx-Oligonukleotid-Konjugat wurde vom festen Träger abgespalten und durch 90minütige Behandlung mit Ammoniumhydroxid (konz.): wäßriger Methylaminlösung (40% wäßrig, Aldrich, Milwaukee, WI) bei Raumtemperatur entschützt. Ein wichtiger Aspekt bei dieser Entschützungsmethode ist die Verwendung von acetylgeschützten Cytidinamiditen während der Synthese (Glen Research). Das rohe DyTx-Oligonukleotid-Konjugat wurde durch Ausfällung mit Ethanol, Umkehrphasen-HPLC und Gelelektrophorese gereinigt.
Mit dem RNA-Amidit-Verfahren wurden beispielsweise die folgenden Texaphyrin-Oligonukleotid-Konjugate hergestellt. Bei der Bindung zwischen der bindenden Phosphatgruppe und dem „A"-Rest handelt es sich um eine 2'-Bindung.
Weitere Texaphyrin-Oligonukleotid-Konjugate, in denen das Texaphyrin über eine 2'-Bindung gebunden ist, wurden unter Anwendung von Guanosin-, Cytosin- bzw. Uridinribonukleotiden analog den Adenosin-2'-Konjugaten im vorliegenden Beispiel hergestellt. Weiterhin wurde ein Kontrolloligonukleotid synthetisiert, das in Position 10 eines 18-Nukleotid-Moleküls einen Adenosin-RNA-Rest aufwies; der Adenosinrest war in der 2'-O-Stellung durch eine Silylschutzgruppe geschützt.
Durch dieses Verfahren unter Anwendung eines RNA-Phosphoramidits zur Konstruktion eines Oligonukleotidkonjugats, das intern mit Texaphyrin derivatisiert ist, erhält man eine zusätzliche (negativ geladene) Phosphatgruppe in der Nähe der Bindungsstelle.
Dieser Konjugattyp ist sterioisomerenrein. Die vom RNA-Amidit abgeleiteten Konjugate sind konformationssteif, wobei die Bindung zur 2'-Hydroxylposition der Riboseeinheit die Bindung auf die kleine Furche einer RNA/DNA-Heteroduplex lenkt. Ohne sich auf eine Theorie festzulegen, nehmen die Erfinder der vorliegenden Erfindung an, daß eine Hydrolyse in der kleinen Furche wirksamer erfolgen kann, da die RNA über die kleine Furche der RNA/DNA-Heteroduplex zugänglicher ist.
BEISPIEL 2
Eine Methode mit asymmetrischem, verzweigtem Amidit zur internen Kupplung von Texaphyrin an ein Oligonukleotid
Mit dem vorliegenden Beispiel wird ein weiteres Verfahren zur Herstellung eines Texaphyrin-Oligonukleotid-Konjugats bereitgestellt, bei dem das Texaphyrin durch eine interne Bindung gebunden wird; bei dem Verfahren wird ein asymmetrisches, verzweigtes Phosphoramidit als Ausgangsmaterial verwendet. Ein Dysprosium-Texaphyrin-Phosphoramidit wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Ein DNA-Oligonukleotid mit 18 Resten wurde im 1-μmol-Maßstab hergestellt, wobei die Synthese so programmiert wurde, daß ein asymmetrisches, verzweigtes Amidit (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) als 10. Rest in die Sequenz eingekuppelt wurde. Für dieses Amidit wurde die Kupplungszeit manuell auf 10 min verlängert. Die Synthese wurde mit „DMT Off" durchgeführt, und die 5'-Hydroxylgruppe wurde mit Essigsäureanhydrid (2 × 60 sec) blockiert, wobei der Synthesizer manuell gesteuert wurde. Die Synthesesäule wurde aus dem Synthesizer entnommen, und die Levulinylgruppe wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers (15minütige Behandlung mit 0,5 M Hydrazinlösung in 3 : 2 Pyridin : Essigsäure) selektiv abgespalten. Die Säule wurde wieder in den Synthesizer eingesetzt, mit DyTx-Phosphoramidit gekuppelt, entschützt und wie in Beispiel 1 angegeben gereinigt.
Durch die Methode mit asymmetrischem, verzweigtem Amidit hergestellte Derivate sind beispielsweise die folgenden:
Weiterhin wurde ein Kontrollnukleotid ohne das DyTx synthetisiert, das einen asymmetrischen, verzweigten Rest in Position 10 des Moleküls mit 18 Resten aufwies. Dem Fachmann würde angesichts der vorliegenden Offenbarung einleuchten, daß mit einem C in einer asymmetrischen, verzweigten Verbindungseinheit der vorliegenden Offenbarung ein Kohlenstoffatom gemeint ist, während ein C in einem Oligonukleotid für einen Cytosin-DNA- oder -RNA-Rest steht.
Oligonukleotide mit einem asymmetrischen, verzweigten Amidit weisen in der Verbindungseinheit eine diastereomere Position auf und liegen somit als Mischung von zwei Isomeren vor. Für die vorliegende Erfindung werden auch in flüssiger Phase synthetisierte Konjugate wie z. B. Konjugate, die unter Verwendung eines UNI-LINK^TM AminoModifier und AminoModifier II (Clontech, Palo Alto, CA) synthetisiert wurden, in Betracht gezogen, die ebenfalls eine Mischung von Diastereomeren enthalten würden.
BEISPIEL 3
RNA-Hydrolyse mit einem Konjugat, in dem Texaphyrin intern an ein Oligonukleotid gekuppelt ist
Im vorliegenden Beispiel werden die Ergebnisse von Untersuchungen angeführt, die zur Hydrolyse von RNA mit einem Texaphyrin-Oligonukleotid-Konjugat durchgeführt wurden, wobei es sich bei dem Oligonukleotid um komplementäre DNA oder nahezu komplementäre DNA handelt und das Texaphyrin intern an das Oligonukleotid gekuppelt ist.
Eine RNA mit 36 Resten (3'-A AAU AAA ACC UCU GAG GUA GAC ACU CGG CCC ACA AC-5', SEQ ID NO: 3), die am 5'-Terminus mit ³²P markiert war (etwa 70000 cpm), wurde in Microfuge-Hütchen vom Eppendorf-Typ gegeben, die 4 × Hydrolysepuffer und Kontrolloligonukleotid bzw. das zu testende Konjugat enthielten, wobei die Endkonzentrationen der Lösung wie folgt waren: 100 mM NaCl; 25 μM EDTA; 50 mM HEPES-Puffer, pH 7,5; 100 nm zu testendes Oligonukleotid-Konjugat; etwa 2 nM RNA-Oligomer. Proben, die Kontroll-DNA enthielten (d. h. Oligonukleotidausgangsverbindungen ohne DyTx-Komplex, die während der Aufreinigung des Konjugats mittels HPLC erhalten wurden), enthielten auch freien DyTx-Komplex in einer Endkonzentration von 100 nM. Die Proben wurden gevortext, kurz zentrifugiert und unter Ausschluß von Licht 15 h lang bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden unter Anwendung von Standardverfahren gefällt, in Gelladepuffer resuspendiert und einer Elektrophorese auf 20%igem, denaturierendem Polyacrylamidgel unterzogen.
Autoradiographie des Gels zeigte, daß die hydrolytische Spaltung des RNA-Substrats nur in den Proben erfolgte, die Konjugate enthielten. Durch Vergleich mit Sequenzierungsbahnen wurde festgestellt, daß die Hydrolyse an Stellen im Substrat erfolgte, die bei der Bildung eines Doppelstrangs von Konjugat und RNA-Substrat in der Nähe der Stelle lagen, an der das DyTx gebunden war. Weiterhin zeigten Konjugate, die neben der Stelle, an der das DyTx gebunden war, eine nicht komplementäre Base enthielten, an der nicht komplementären Stelle eine ca. 10fach geringere Hydrolyse. Kontrollbahnen, die DNA mit einer AP-Stelle an einer Position enthielten, die der Position entsprach, an der in einem experimentellen Konjugat Texaphyrin gebunden war, und freier DyTx-Komplex zeigten keine Hydrolyse oberhalb des Hintergrundniveaus.
Die Ergebnisse für die RNA-Hydrolyse durch intern mit DyTx modifizierte Konjugate sind wie folgt. Mit dem Pfeil (↓) sind die Stellen markiert, an denen eine bevorzugte Spaltung beobachtet wurde, während eine etwa 10fach geringere Spaltung durch den Pfeilkopf (v) angezeigt wird. Die asymmetrische, verzweigte Verbindungsstelle ist mit einem Sternchen (*) markiert. Mismatch-Basenpaare und Basen ohne Match sind fettgedruckt.
Diese Ergebnisse bestätigen, daß das DyTx an einer internen Position im Konjugat gebunden ist. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, daß das DyTx dazu in der Lage war, die RNA in Regionen zu hydrolysieren, die sich in dem hybridisierten Komplex, d. h. in einer vorwiegend doppelsträngigen Region, in der Nähe dieses Anbindungspunktes befanden. Weiterhin erfolgt die Spaltung sequenzspezifisch, wie durch die Spezifität der beobachteten Spaltungsstellen und durch die verminderte Aktivität des zusätzlichen Mismatch belegt wird. Eine Hydrolyse des RNA-Substrats wurde sowohl von Konjugaten, in denen das Texaphyrin über eine Verbindungseinheit aus drei Kohlenstoffen verfügte, sowie auch von Konjugaten, in denen das Texaphyrin über eine Sechs-Kohlenstoff-Verbindungseinheit verfügte, erzielt. Konjugate mit einem „G"-, „C"- bzw. einem „U"-Ribonukleotidrest an der Stelle, an der das Texaphyrin gebunden war, bewirkten ebenfalls eine Spaltung, insbesondere wenn das Ribonukleotid mit seinem Basenpaar fehlgepaart war.
Das asymmetrische, verzweigte Mittel enthält keine DNA-Base und keinen Zucker, und Hybride eines ein asymmetrisches, verzweigtes Mittel enthaltenden Oligonukleotid-Konjugats mit einem RNA-Substrat enthalten somit eine nicht basengepaarte Region, die eine Hydrolyse durch den Texaphyrin-Metall-Komplex erleichtern könnte. Man könnte ein Oligonukleotid-Konjugat entwerfen, in dem ein Texaphyrin wie in Beispiel 1 an einen Adenosinrest gebunden ist, wobei sich das Adenosin gegenüber oder neben einer nicht komplementären Base eines Zielsubstrats befinden würde. Durch diese Basen-Mismatch-Region im RNA-DNA-Doppelstrang könnte man, verglichen mit der Hydrolyse von basengepaarten Duplexregionen, eine bessere Hydrolyse erzielen. Diese Beobachtungen werden durch die Hydrolyseexperimente untermauert, da die Verwendung von intern derivatisierten DyTx-Konjugaten mit einem Mismatch an der Bindungsstelle zu einer stellenspezifischen Hydrolyse der RNA in der Position des Texaphyrins benachbarten Regionen führte. Ein zusätz licher Mismatch führt zu einer geringeren hydrolytischen Spaltung an der Mismatch-Stelle, möglicherweise aufgrund einer weniger effizienten Hybridisierung.
Die mit den intern derivatisierten Konjugaten beobachteten RNA-Hydrolyseniveaus ähnelten den mit 5'-derivatisierten Konjugaten (WO 94/29316, durch Verweis Teil der vorliegenden Anmeldung) erhaltenen Ergebnissen. Verschob man die Stelle der Texaphyrin-Derivatisierung zu einer internen Position im Oligonukleotid, so änderte sich die Hydrolysestelle entsprechend.
BEISPIEL 4
Nachweis des katalytischen „Turnovers"
In dem vorliegenden Beispiel werden die Ergebnisse aus Studien über die RNA-Hydrolyseeigenschaften eines intern mit Dysprosium(III)-Texaphyrin (DyTx), Verbindung 1, derivatisierten Oligodesoxynukleotids angeführt. Das Texaphyrin wies die gleichen R-Gruppen wie in Beispiel 1 beschrieben auf. Mit dem Symbol (*) ist die asymmetrische, verzweigte Bindung markiert:
Zum Vergleich wurde ebenfalls ein Desoxynukleotid mit zwanzig Resten, das in der 5'-Hydroxylstellung mit dem gleichen DyTx-Katalysator, der Verbindung 2, derivatisiert war, untersucht.
Die stellenspezifische Hydrolyse eines komplementären RNA-Substrats 3 wurde mit jedem der beiden DyTx-DNA-Konjugate 1 und 2 unter zwei verschiedenen Bedingungen untersucht: i) die Konzentration des DyTx-DNA-Konjugats war, bezogen auf die des RNA-Substrats, etwa 10fach höher (Bedingungen pseudo-erster Ordnung); und ii) im Vergleich zum DyTx-DNA-Konjugat lag das RNA-Substrat in einer etwa 10fach höheren Konzentration vor (Bedingungen zweiter Ordnung).
Für jedes der Konjugate wurden Pufferlösungen hergestellt (25 nM DyTx-DNA-Konjugat, 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 μM EDTA, 2 Einheiten/μL RNasin^TM-Nukleaseinhibitor (Promega Corporation, Madison, WI) und 2 mM Dithiothreitol, alle Konzentrationen sind Endkonzentrationen). Für den Assay unter Bedingungen mit Konjugatüberschuß wurde 5'-³²P-markierte radioaktive Substrat-RNA (etwa 2 nM) 5 min lang bei 60°C inkubiert und dann zu den Konjugatlösungen gegeben. Für Assays unter Bedingungen mit Substratüberschuß wurde 5'-³²P-markierte radioaktive Substrat-RNA (etwa 2 nM) und nicht markierte RNA (250 nM) gemischt und zusammen 5 min lang bei 60°C inkubiert und dann zu den Konjugatlösungen geben. Die so erhaltenen Mischungen wurden jeweils auf einzelne silanisierte Mikrozentrifugenhütchen verteilt, für jeden Zeitpunkt ein Hütchen. Alle Proben, mit Ausnahme der Probe für den Zeitpunkt Null, wurden zur Temperaturkontrolle mit einem PCR-Gerät bei 37°C inkubiert. Zu den gewählten Zeitpunkten wurden Proben entnommen, mit Ethanol gefällt, bei –20°C aufbewahrt und anschließend durch Elektrophorese an einem 20%igen denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt. Das Verhältnis von durch stellenspezifische Hydrolyse produzierten Fragmenten zu intakter Substrat-RNA wurden dann durch Phosphorimaging-Verfahren quantifiziert.
Die Hydrolyse des RNA-Substrats 3, ausgedrückt in Prozent nicht gespaltener RNA gegen die Zeit, ist in 1 gezeigt. Bei Bedingungen mit einem Überschuß an Konjugat zeigt das 5'-derivatisierte DyTx-DNA-Konjugat 2 (
größere Aktivität als das intern derivatisierte Konjugat 1 (
), wobei die Halbwertszeiten für die RNA-Hydrolyse etwa 4 h bzw. 6 h betragen. Bei Bedingungen mit Substratüberschuß (in Gegenwart von einem Überschuß an kalter RNA) nimmt die scheinbare Geschwindigkeit der Hydrolysereaktionen bei beiden Konjugaten ab, da die überschüssige, nicht markierte RNA mit dem markierten Substrat um das DyTx-DNA-Konjugat konkurriert. Die Ordnung der Hydrolyseaktivität für die beiden Konjugate ändert sich jedoch: bei der Reaktion mit dem 5'-derivatisierten DyTx-DNA-Konjugat 2 (⧫, mit 250 nM RNA) ist diese Hemmung nahezu vollständig, während bei der Umsetzung mit dem intern derivatisierten Konjugat 1 (⦁, mit 250 nM RNA) immer noch eine beträchtliche RNA-Hydrolyse beobachtet werden kann, in einer Größenordnung von 30% Spaltung nach 24 h. Dieses Spaltungsniveau, 75 nM nach 24 h (30% von 250 nM Gesamt-RNA), entspricht der dreifachen Konzentration des DyTx-DNA-Konjugats 1 im Reaktionsmedium.
Eine Erklärung für die Umkehr der Effizienz der RNA-Hydrolyse durch die beiden Konjugate unter Bedingungen zweiter Ordnung ist, daß das DyTx-DNA-Konjugat 1 einen katalytischen „Turnover" zeigen kann, während das beim DyTx-DNA-Konjugat 2 nicht der Fall ist. Dieser Unterschied in der katalytischen Leistung wird schematisch in 2A und 2B gezeigt. Beide Konjugate binden (K_b) und hydrolysieren (K_Kat) das RNA-Substrat. Bei der RNA-Hydrolyse durch Konjugat 2 (2A) bleibt das Konjugat jedoch an eines der Spaltprodukte gebunden. Diese Struktur ist unter den Reaktionsbedingungen stabil; die Dissoziation ist gehemmt und das Konjugat ist nicht länger aktiv. Eine Hydrolyse duch Konjugat 1 führt jedoch zu einer Spaltung an einer Stelle im Inneren der Doppelstrangregion (2B). Die RNA-Spaltprodukte (die nur über neun bzw. acht Basenpaare an das DNA-Konjugat gebunden sind) dissoziieren unter den Reaktionsbedingungen vom DNA-Konjugat, wodurch das Konjugat für die Bindung und Hydrolyse eines weiteren RNA-Substrats frei wird.
Weitere Ergebnisse wurden aus Studien zur Spaltung von Substrat 3 durch Konjugat 1 und Konjugat 4 erhalten. Die Konjugate spalten das Substrat 3 an verschiedenen Stellen, die durch Pfeile markiert sind; in dieser Untersuchung wurden die hydrolytischen Wirkungen der beiden Konjugate in Konkurrenz zueinander in der gleichen Reaktionsmischung untersucht.
Substrat 3 und Konjugat 1:
Substrat 3 und Konjugat 4:
Es wurden gepufferte Lösungen hergestellt, die die beiden Konjugate enthielten (jeweils 25 nM der DyTx-DNA-Konjugate 1 und 4, 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 μM EDTA, 2 Einheiten/μl RNasin^TM-Nukleaseinhibitor (Promega Corporation) und 1 mM Dithiothreitol, alle Konzentrationen sind Endkonzentrationen). Das 5'-³²P-markierte radioaktive RNA-Substrat (etwa 2 nM) und nicht markierte RNA (25 nM, 100 nM, 250 nM oder 500 nM) wurden gemischt und 5 min lang bei 60°C inkubiert und dann zu den Konjugatlösungen gegeben. Die so erhaltenen Mischungen wurden jeweils auf einzelne silanisierte Mikrozentrifugenhütchen verteilt, für jede RNA-Konzentration pro Zeitpunkt ein Hütchen. Alle Proben mit Ausnahme der Probe für den Zeitpunkt Null wurden unter Verwendung eines Thermocyclers (Perkin-Elmer Modell 2400) zur Temperaturkontrolle bei 37°C inkubiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden Proben aus der Inkubation entnommen, mit Ethanol gefällt, bei –20°C aufbewahrt und anschließend durch Elektrophorese auf einem 20%igen denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Mengen an intakter Substrat-RNA und durch die stellenspezifische Hydrolyse durch die einzelnen Konjugate produzierten Spaltprodukte wurden dann durch Phosphorimaging-Verfahren quantifiziert.
Das Ausmaß der stellenspezifischen Hydrolyse von RNA-Substrat 3 durch Konjugat 1, ausgedrückt in Prozent der Gesamt-RNA gegen die Zeit, ist in 3 gezeigt. Das Ausmaß der stellenspezifischen Hydrolyse von Substrat 3 durch Konjugat 4, ausgedrückt in Prozent der Gesamt-RNA gegen die Zeit, ist in 4 gezeigt.
Unter Bedingungen, unter denen die Substratkonzentration von 25 nM der Konzentration der einzelnen Konjugate entspricht, spaltet Konjugat 4 die RNA effizienter als Konjugat 1, insbesondere zu späteren Zeitpunkten. Dieses Resultat entspricht dem, das man erwarten würde, wenn ein durch Konjugat 1 produziertes Spaltprodukt als Substrat für die Spaltung durch Konjugat 4 dient.
Bei Substratkonzentrationen von mehr als 25 nM liegt, bezogen auf die Konzentration der einzelnen Konjugate, ein Überschuß an Substrat vor. Die gespaltene RNA, berechnet als prozentuales Produkt von gespaltener und gesamter RNA, ist bei der Verwendung von Konjugat 4 bei diesen verschiedenen Konzentrationen ungefähr äquivalent (4). Die gesamte Spaltung durch Konjugat 4 geht gegen 25 nM (ein Äquivalent RNA), überschreitet diesen Wert jedoch nicht. Diese Beobachtung würde man bei einem fehlenden „Turnover" bei diesem endderivatisierten Konjugat erwarten.
Im Gegensatz dazu wird der prozentuale Wert für die durch Konjugat 1 gespaltene RNA durch erhöhte RNA-Konzentrationen weniger beeinträchtigt (3). Bei einer RNA-Konzentration von 100 nM scheint die gesamte gespaltene RNA als Resultat einer Erschöpfung des Substrats ein Maximum von etwa 50 nM (50% Spaltung) zu erreichen. Bei den beiden höheren Substratkonzentrationen verläuft die Kurve für das durch Konjugat 1 gespaltene RNA-Produkt im Verlauf des Experiments nahezu linear. Man kann diese Reaktionen als Umsetzungen betrachten, die unter Bedingungen mit Substratüberschuß verlaufen. Weiterhin gibt es bei höheren Substratkonzentrationen eine Erhöhung der Geschwindigkeit der Gesamt-RNA-Spaltung. Bei der höchsten RNA-Konzentration beobachtet man nach 24 h eine Spaltung von etwa 23%, was 115 nM Konjugat-1-Spaltprodukt bzw. etwa vier oder fünf „Turnover" entspricht. Nach 48 h findet man eine RNA-Spaltung von etwa 45%, was 225 nM Konjugat-1-Spaltprodukt bzw. etwa 9 „Turnover" entspricht. Im Vergleich dazu wurde für das endderivatisierte Konjugat 4 nach 48 h 5% Spaltung von 500 nM Substrat (25 nM Produkt) gefunden, was darauf hindeutet, daß kein „Turnover" stattfindet.
Eine katalytische Aktivität, die bei der Verwendung von Konjugat 1 „Turnover" unter Bedingungen mit Substratüberschuß zeigt, hat wichtige Implikationen für die Verwendung von Konjugaten aus Texaphyrin-Metall-Komplex und Oligonukleotid im Rahmen einer Antisense- Therapie. Man würde erwarten, daß solche Konstrukte unter Bedingungen, in denen die Konzentration an RNA-Target über der an verfügbarem Konjugat liegt, beispielsweise bei Bedingungen im zellulären Milieu, wirksamer sind. Weiterhin ist neu transkribierte RNA ein potentielles Substrat, selbst wenn das Konjugat nicht weiter in die Zelle aufgenommen wird. Intern derivatisierte Konjugate hätten, verglichen mit endderivatisierten Konjugaten, eine längere hydrolytisch spaltende Wirkung in der Zelle.
BEISPIEL 5
Weitere „Turnover"-Untersuchungen zur RNA-Hydrolyse mit Konjugaten von intern mit Texaphyrin derivatisierten Oligonukleotiden
Im vorliegenden Beispiel werden weitere Studien zur Hydrolyse von RNA und „Turnover"-Daten, die mit intern mit Texaphyrin derivatisierten Oligonukleotid-Konjugaten erhalten wurden, angeführt. Die Konjugate wurden durch Umkehrphasen-HPLC und präparative Gelelektrophorese gereinigt und durch positive MALDI^TM-Massenspektroskopie (Charles Evans & Assoc., Redwood City, CA) charakterisiert.
Das Ausmaß der Spaltung von komplementärer Ziel-RNA 3 durch die DyTx-DNA-Konjugate 1 und 2 wurde sowohl unter Bedingungen von Konjugat- als auch Substratüberschuß analysiert. Von beiden zu testenden Spezies wurden gepufferte Lösungen angefertigt [50 nM DyTx-DNA-Konjugat, 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 μM EDTA, 2 Einheiten/μl RNasin^TM-Nukleaseinhibitor (Promega Corporation, Madison, WI) und 1 mM Dithiothreitol, alle Konzentrationen sind Endkonzentrationen]. Für den Assay unter Bedingungen mit Konjugatüberschuß wurde das Substrat, 5'-³²P-markierte radioaktive RNA (etwa 2 nM), 5 Minuten lang bei 60°C inkubiert und dann zu den Konjugatlösungen gegeben. Für den Assay unter Bedingungen mit einem Überschuß an RNA wurde eine Mischung von 5'-³²P-markierter radioaktiver RNA (etwa 2 nM) und nicht markiertem RNA-Substrat (500 nM) zusammen 5 Minuten lang bei 60°C inkubiert und dann zu den Konjugatlösungen gegeben. Das Ausmaß an stellenspezifischer RNA-Spaltung bei 37°C wurde wie in Beispiel 4 bestimmt. Bei einem Konjugatüberschuß (> 20fach) zeigten die Konjugate 2 und 1 eine ähnliche Spaltungskinetik, wobei für diese beiden Spezies Halbwertszeiten für die RNA-Umesterung von etwa 2,4 Stunden bzw. 2,2 Stunden festgehalten wurden. Bei Zusatz eines 10fachen Substratüberschusses (wodurch man 500 nM RNA erhielt) zeigte sich ein wichtiger Unterschied zwischen diesen beiden Spezies, nämlich daß die eine eine katalytische Spaltung bewirkt und die andere nicht. Insbesondere wird bei Einsatz des 5'-derivatisierten Konjugats 2 etwa 5% der RNA innerhalb von 24 Stunden gespalten, während bei der Umsetzung mit dem intern derivatisierten Konjugat 1 unter identischen Bedingungen eine Spaltung von 67% der gesamten RNA beobachtet wird. Dieses Ausmaß an gespaltener RNA, 335 nM nach 24 Stunden (67% von 500 nM Gesamt-RNA), entspricht einem Wert, der das 6,7fache der Konzentration des im Reaktionsmedium vorhandenen DyTx-DNA-Konjugats 1 beträgt.
Um diesen Reaktivitätsunterschied weiter zu belegen, wurde in derselben Reaktionsmischung die Spaltung von 3 durch 1 und durch ein 5'-derivatisiertes DyTx-DNA-Konjugat, das an einer stromaufwärts liegenden Stelle spaltet (als Konjugat 4 bezeichnet), verfolgt. Aufgrund der unterschiedlichen Länge der durch diese Konjugate bei der Spaltung produzierten RNA war es möglich, die Aktivitäten der beiden Konjugattypen beim Konkurrieren um dasselbe Substrat in derselben Reaktionsmischung zu untersuchen. Die Menge an durch das intern derivatisierte Konjugat gebildetem Produkt unter Bedingungen, bei denen es nicht zu einer Erschöpfung des Substrats kam, lag um einen Faktor von etwa 10 über der Menge an in dieser Konkurrenzstudie durch das am 5'-Ende markierte Konjugat gebildetem Produkt.
Diese Daten stützen die vorherigen Ergebnisse, die zeigen, daß das DyTx-DNA-Konjugat 1 katalytischen „Turnover" zeigen kann, während die 5'-gekuppelten DyTx-DNA-Konjugate 2 und 4 nicht dazu in der Lage sind, katalytischen „Turnover" zu erzielen.
Diese Ergebnisse bestätigen, daß es sich bei den verschiedenen von den am 5'-Terminus bzw. intern modifizierten DyTx-DNA-Konjugaten gezeigten RNA-spaltenden Wirkungen um eine den Verbindungen eigene Eigenschaft handelt, die nicht beispielsweise auf eine zufällig im Reaktionsmedium vorhandene Nukleaseaktivität zurückzuführen ist.
Bei einer höheren Substratkonzentration wurde für 1 eine erhöhte Geschwindigkeit bei der RNA-Spaltung beobachtet. Aus diesem Grund wurden Studien durchgeführt, in denen untersucht wurde, ob das intern modifizierte DyTx-DNA-Konjugat 1 bei Titration mit überschüssigem Substrat Sättigungsverhalten zeigen würde. Die Werte für K_Kat und K_M wurden aus den ursprünglichen Geschwindigkeitskurven für Konjugat 1 abgeleitet, und ebenfalls für Konjugate, bei denen die Länge des Antisense-Abschnitts um jeweils eine Base am 5'- bzw. 3'-Ende verkürzt bzw. verlängert war (siehe Tabelle 1).
TABELLE 1 Ursprüngliche Geschwindigkeitsdaten
Es wurde gefunden, daß die gemessenen Geschwindigkeiten zwischen etwa 0,2 und 0,3 Stunden^–1 schwankten, während die Werte für K_M im Bereich von etwa 6–69 nM lagen, je nach der Länge des bei der Hybridisierung mit dem RNA-Substrat 3 gebildeten Doppelstrangs.
Es wurden weitere Hydrolysestudien durchgeführt, wobei die Substrat-RNA so ausgelegt war, daß beim Hybridisieren mit dem Texaphyrin-Oligonukleotid-Konjugat eine oder zwei Basenausbuchtungen bzw. -schleifen im Substrat induziert werden würden. Die Schleife befand sich entweder an oder in der Nähe von (etwa 3–4 Nukleotide) einer Stelle komplementär zur Stelle, an der das Texaphyrin an das Konjugat gebunden war. Die Hydrolyse einer Ein-Basen-Schleife wurde in der Schleife und an Positionen auf der 5'-Seite der Schleife beobachtet. Eine Hydrolyse einer Zwei-Basen-Schleife wurde beobachtet, wenn Texaphyrin an einen Ribonukleotidrest gebunden war.
Ebenfalls untersucht wurde die Wirkung der Länge des Oligonukleotids des Konjugats auf die Hydrolyse und den „Turnover". Fand sich die Stelle, an der das Texaphyrin gebunden war, ungefähr in der Mitte des Konjugats, so wurden mit Konjugaten von einer Länge von 16–26 Nukleotiden Hydrolyse und „Turnover" der Substrat-RNA erzielt.
Es wurde die Wirkung der Stelle, an der das Texaphyrin relativ zu den Konjugatenden gebunden war, auf Hydrolyse und „Turnover" untersucht. Befand sich die Bindungsstelle 8 Basen vom 5'-Ende eines 24-mer-Konjugats, so kam es zu Hydrolyse und „Turnover". Im Gegensatz dazu zeigte ein 5'-modifiziertes 15-mer-Konjugat, das so konstruiert worden war, daß es die RNA an derselben Position spaltete, Spaltung, aber keinen „Turnover". Dieses Ergebnis legt nahe, daß die Verdrängung des Strangs der gespaltenen RNA durch ein neues Substrat durch den überhängenden Abschnitt des Konjugats erleichtert wird.
Das vorliegende Konjugat hat, verglichen mit Ribozymen zur Spaltung von RNA unter biologischen Bedingungen, zum Beispiel die folgenden Vorteile: ein DyTx-DNA-Konjugat wie 1 ist selbst ausreichend aktiv, da das sich vom Dysprosium(III)-Kation ableitende „aktive Zentrum" als Folge der Verwendung eines Texaphyrin-Makrocyclus in die Struktur des Katalysators vorprogrammiert ist; im Gegensatz dazu sind die Spaltungsgeschwindigkeiten von Hammerhead-Ribozymen kationenabhängig und werden typischerweise in Gegenwart von 10 mM an freiem Mg(II) gemessen, d. h. bei Bedingungen, deren Auftreten in vivo unwahrscheinlich ist; ein DyTx-DNA-Konjugat wie 1 ist von der Struktur her einfacher als ein Ribozym, es braucht lediglich eine Länge zu haben, die ausreicht, um das entsprechende RNA-Substrat spezifisch zu erkennen; RNA-spaltende Systeme kürzerer Länge können von der Zelle aufgenommen werden und lassen sich einfacher im Großmaßstab herstellen; und im Gegensatz zu Ansätzen, die auf Ribozymen basieren, besteht bei den vorliegenden Konjugaten keine Notwendigkeit, die Ribonukleotidregionen im katalytischen Teil des Konstrukts zu konservieren, und der Ansatz, der in Konjugat 1 ausgeführt ist, ist daher mit nicht in der Natur vorkommenden Antisense-Gerüsten als potentiellen therapeutischen Mitteln kompatibel.
Alle hier beanspruchten und offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren lassen sich angesichts der vorliegenden Offenbarung herstellen bzw. ausführen, ohne daß dies ein Übermaß an Experimenten erfordern würde. Die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung wurden als bevorzugte Ausführungsformen beschrieben; es wird dem Fachmann jedoch einleuchten, daß man die Zusammensetzungen, Methoden und Stufen bzw. die Abfolge der Stufen des hier beschriebenen Verfahrens variieren kann, ohne damit vom Konzept und vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Insbesondere wird einleuchten, daß man die hier beschriebenen Mittel durch bestimmte Mittel, die sowohl chemisch als physiologisch verwandt sind, ersetzen kann und dennoch gleiche oder ähnliche Ergebnisse erzielen würde. All diese ähnlichen, dem Fachmann einleuchtenden Ersetzungen und Modifikationen fallen mit in den Umfang und das Konzept der Erfindung wie durch die angefügten Ansprüche definiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Konjugat, umfassend einen Texaphyrin-Metall-Komplex, gebunden an eine interne Bindung eines Oligonukleotids oder Oligonukleotidanalogons, wobei das Konjugat hydrolytisch spaltende Wirkung für Ribonukleinsäure aufweist.
Konjugat nach Anspruch 1, wobei der Texaphyrin-Metall-Komplex die folgende Formel aufweist:
wobei M für ein zweiwertiges Metallkation oder ein dreiwertiges Metallkation mit katalytischer Wirkung für die Hydrolyse von Ribonukleinsäure steht; R₁–R₄, R₇ und R₈ unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogenid, Hydroxyl, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Halogenalkyl, Nitro, Formyl, Acyl, Hydroxyalkyl, Oxyalkyl, Oxyhydroxyalkyl, Hydroxyalkenyl, Hydroxyalkinyl, Saccharid, Carboxyl, Carboxyalkyl, Carbonsäureamid, Carbonsäureamidalkyl, Amino, Aminoalkyl, ein Oligonukleotid, ein Oligonukleotidanalogon, eine katalytische Gruppe, einen Antikörper, ein Steroid, ein Hormon, ein Peptid mit Affinität für einen biologischen Rezeptor, ein Sapphyrinmolekül oder ein an ein Oligonukleotid, ein Oligonukleotidanalogon, eine katalytische Gruppe; einen Antikörper, ein Steroid, ein Hormon, ein Peptid mit Affinität für einen biologischen Rezeptor oder ein Sapphyrinmolekül gebundenes Kupplungsglied stehen; R₆ und R₉ unabhängig voneinander aus den Gruppen für R₁–R₄, R₇ und R₈ ausgewählt sind, mit der Maßgabe, daß das Halogenid nicht Iodid ist und das Halogenalkyl nicht Iodalkyl ist; R₅ und R₁₀–R₁₂ unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Hydroxyalkyl, Oxyalkyl, Oxyhydroxyalkyl, Hydroxyalkenyl, Hydroxyalkinyl, Carboxyalkyl, Carbonsäureamid, Carbonsäureamidalkyl, Amino, Aminoalkyl oder ein an ein Saccharid, ein Oligonukleotid, ein Oligonukleotidanalogon, eine katalytische Gruppe, einen Antikörper, ein Steroid, ein Hormon, ein Peptid mit Affinität für einen biologischen Rezeptor oder ein Sapphyrinmolekül gebundenes Kupplungsglied stehen; wenigstens einer der Reste R₁–R₁₂ für ein Oligonukleotid, ein Oligonukleotidanalogon oder ein an ein Oligonukleotid oder ein Oligonukleotidanalogon gebundenes Kupplungsglied steht; und Z für eine ganze Zahl mit einem Wert von weniger als oder gleich 5 steht.
Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Oligonukleotid eine interne Riboseeinheit aufweist und der Texaphyrin-Metall-Komplex an eine 2'-Bindung der Riboseeinheit gebunden ist.
Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Oligonukleotidanalogon anstelle eines Nukleotids eine interne verzweigte Verbindungseinheit aufweist und der Texaphyrin-Metall-Komplex kovalent an die interne verzweigte Verbindungseinheit gebunden ist.
Konjugat nach Anspruch 4, wobei es sich bei der internen verzweigten Verbindungseinheit um ein Glycerinderivat handelt.
Konjugat nach Anspruch 4, wobei es sich bei der internen verzweigten Verbindungseinheit um eine Alkylamino-Verbindungseinheit handelt.
Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es dem Konjugat durch die hydrolytisch spaltende Wirkung für Ribonukleinsäure möglich ist, eine andere Spaltungsreaktion zu katalysieren.
Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Texaphyrin-Metall-Komplex an eine interne Bindung eines Oligonukleotidanalogons gebunden ist und das Oligonukleotidanalogon ein Derivat ausgewählt aus der aus Methylphosphonat, Phosphotriester, Phosporothioat, Phosphoramidat und 2'-O-Alkylribonukleotid bestehenden Gruppe enthält.
Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Texaphyrin-Metall-Komplex an eine interne Bindung eines Oligonukleotidanalogons gebunden ist und das Oligonukleotidanalogon ein 2'-O-Alkylribonukleotid enthält.
Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Ribonukleinsäure um Boten-RNA oder virale RNA handelt.
Konjugat nach Anspruch 2, wobei R₁, R₂ und R₃ für CH₂CH₃ stehen; R₄ für CH₃ steht; R₅, R₆, R₉, R₁₀, R₁₁ und R₁₂ für H stehen; R₇ für H oder OCH₃ steht und R₈ für ein Kupplungsglied-Oligonukleotid oder ein Kupplungsglied-Oligonukleotidanalogon steht.
Konjugat nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem Kupplungsglied um O(CH₂)₃PO₄ oder O(CH₂)₆PO₄ handelt.
Konjugat nach Anspruch 2, wobei R₁ für (CH₂)₂CH₂OH steht; R₂ und R₃ für CH₂CH₃ stehen; R₄ für CH₃ steht; R₅, R₆, R₉, R₁₀, R₁₁ und R₁₂ für H stehen; R₇ für OCH₃ steht und R₈ für ein Kupplungsglied-Oligonukleotid oder ein Kupplungsglied-Oligonukleotidanalogon steht.
Konjugat nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem Kupplungsglied um O(CH₂)₃PO₄ oder O(CH₂)₆PO₄ handelt.
Konjugat nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem dreiwertigen Metallkation um Eu(III), Gd(III), Tb(III) oder Dy(III) handelt.
Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon in der Ribonukleinsäure an oder in der Nähe einer Stelle, an der der Texaphyrin-Metall-Komplex angebunden ist, eine lokal geschmolzene Region bildet.
Verfahren zur Synthese eines Texaphyrin-Metall-Komplex/Oligonukleotid-Konjugats nach Anspruch 3, bei dem man: eine 2'-Hydroxylgruppe eines Ribonukleotidrests im Oligonukleotid mit einem Amiditderivat eines Texaphyrin-Metall-Komplexes kuppelt.
Verfahren zur Synthese eines Texaphyrin-Metall-Komplex/Oligonukleotidanalogon-Konjugats nach Anspruch 4, bei dem man: die interne verzweigte Verbindungseinheit mit einem Amiditderivat eines Texaphyrin-Metall-Komplexes kuppelt.
Verfahren zur Hydrolyse von Ribonukleinsäure unter Reaktionsbedingungen, bei denen ein Überschuß an Konjugat vorliegt, bei dem man: die Ribonukleinsäure mit einem Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 16 in Kontakt bringt und die Ribonukleinsäure und das Konjugat unter Reaktionsbedingungen, bei denen ein Überschuß an Konjugat vorliegt, über eine Zeitspanne inkubiert, die ausreichend ist für die Hydrolyse einer Phosphatesterbindung der Ribonukleinsäure.
Verfahren zur Hydrolyse von Ribonukleinsäure unter Reaktionsbedingungen, bei denen ein Überschuß an Substrat vorliegt, bei dem man: die Ribonukleinsäure mit einem Konjugat nach Anspruch 7 in Kontakt bringt und die Ribonukleinsäure und das Konjugat unter Reaktionsbedingungen, bei denen ein Überschuß an Substrat vorliegt, über eine Zeitspanne inkubiert, die ausreichend ist für die Hydrolyse einer Phosphatesterbindung der Ribonukleinsäure und den „Turnover" des Konjugats.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei der Texaphyrin-Metall-Komplex an eine interne Bindung eines Oligonukleotids gebunden ist, das Oligonukleotid eine interne Riboseeinheit aufweist und der Texaphyrin-Metall-Komplex an eine 2'-Bindung der Riboseeinheit gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei der Texaphyrin-Metall-Komplex an eine interne Bindung eines Oligonukleotidanalogons gebunden ist, das Oligonukleotidanalogon anstelle eines Nukleotids eine interne verzweigte Verbindungseinheit aufweist und der Texaphyrin-Metall-Komplex kovalent an die interne verzweigte Verbindungseinheit gebunden ist.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 16 in der Medizin.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 16 bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei der hydrolytischen Spaltung von Ribonukleinsäure.