DE4121115A1 - Gemische von polysacchariden mit niedrigem molekulargewicht, deren herstellungsverfahren und verwendung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Poly­ saccharide mit niedrigem Molekulargewicht. Insbesondere betrifft sie das Gebiet der Heparine mit niedrigem Mole­ kulargewicht.

Die Heparine sind biologische, durch Extraktion gewonne­ ne Substanzen der Familie der Glykosaminoglykane, die aufgrund von deren antikoagulierenden und antithromboti­ schen Eigenschaften verwendet werden. Insbesondere wer­ den sie bei der Behandlung post-operativer, venöser Thrombosen eingesetzt. In ihrer nativen Form besitzen je­ doch die Heparine eine bestimmte Anzahl von Nachteilen, die ihre Verwendungsbedingungen einschränken. Insbeson­ dere kann die antikoagulierende Aktivität Hämorrhagien zur Folge haben, und die Empfindlichkeit gegenüber be­ stimmten Serumfaktoren, wie pf4, erfordert die Verwen­ dung von relativ hohen Dosen. Es ist somit notwendig, der antithrombotischen Aktivität, die der Antiprothrombinase- Aktivität zuzuschreiben ist, auf Kosten der antikoagulie­ renden Aktivität, die der Antithrombin-Wirkung zuzu­ schreiben ist, den Vorzug zu geben.

Zu diesem Zweck wurde empfohlen, die Heparine in Mole­ küle mit geringeren durchschnittlichen Molekulargewichten aufzuteilen. Insbesondere kannte man im Stand der Tech­ nik das EP-Patent 40144. Dieses Patent beschreibt Mi­ schungen sulfatierter Polysaccharide mit der Grundstruk­ tur der das Heparin bildenden Polysaccharide, die eine ethylenische Doppelbindung an einem ihrer Kettenenden aufweist und deren durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 2000 und 10 000 Dalton liegt. Diese Gemische werden durch Depolymerisation und Verseifung eines Heparinesters erhalten. Es ist angegeben, daß sie eine erhöhte antithrombotische Aktivität und eine niedrigere antikoagulierende Gesamtaktivität als das Heparin be­ sitzen.

Dennoch beruht eines der bei den Heparinen vorzufinden­ den Hauptprobleme in der Tatsache, daß es sich um sehr heterogene Produkte handelt. Es ist somit schwierig, den Beitrag einer jeden der Species zu der Heparinaktivität zu bewerten, das Verhalten dieser Species bei der Depoly­ merisation zu kennen und schließlich die Struktur dieser Species und deren jeweilige Anteile in den Endprodukten zu kontrollieren. Aus diesen Gründen konnten die vorste­ hend erwähnten Nachteile nicht völlig zufriedenstellend behoben werden. Insbesondere ermöglichen es die im Stand der Technik und vor allem in dem EP-Patent 40 144 be­ schriebenen Verfahren nicht, Gemische mit den für eine bessere Anwendung erforderlichen pharmakologischen Eigen­ schaften, nämlich eine ausreichend hohe plasmatische Halbwertszeit, eine ziemlich große Absorptionsgeschwin­ digkeit, eine hohe Bioverfügbarkeit oder auch ein gerin­ ges "Clearance", zu erhalten.

Andere Verfahren wurden indes beschrieben, die es ermög­ lichen, das Heparin zu zerlegen, um seine unerwünschten Wirkungen zu verringern (Johnson et coll., Thrombos. Haemostas. Stuttg., 1976, 35, 586; Lane et coll., Thrombosis Research 16, 651; Lasker et coll. US 37 66 167). Ein jedes dieser Verfahren scheint anzugeben, daß die gewünschte Aktivität stärker hervortritt, wenn sich der Zerlegungs- bzw. Fragmentierungsgrad des Heparins erhöht (siehe auch die EP-A-3 01 618 betreffend Pentasaccharide mit antithrombotischer Aktivität).

In gleichem Sinn haben neuere Untersuchungen hinsichtlich des Wirkungsmechanismus der Heparine bei der Bildung von Thrombin einen Einfluß des durchschnittlichen Molekular­ gewichts der Heparine auf deren in vitro-Aktivität ge­ zeigt (Beguin et coll., Thromb. Haemost., 61, 30, 1989). Die Autoren geben an, daß die Heparine mit niedrigem Mo­ lekulargewicht eher eine Antiprothrombinase-Aktivität und die Heparine mit höherem Molekulargewicht eine Anti­ thrombin-Aktivität besitzen.

Parallel wurde auch empfohlen, die Heparine zu frakti­ onieren, um Gemische mit homogenerem durchschnittlichen Molekulargewicht zu extrahieren. Man kannte insbesondere die EP-Patentanmeldung 3 37 327, die ein Verfahren zur Herstellung von sich von Heparin ableitenden Oligosac­ charid-Fragmenten beschreibt, das es ermöglicht, Gemi­ sche mit einer verminderten molekularen Streuung zu er­ halten. Entsprechend diesem Verfahren eliminiert man zuvor die Fraktionen mit einem Molekulargewicht von ge­ ringer als 3000 Dalton, was dazu führt, daß dem Endpro­ dukt die Fragmente, die weniger als 10 bis 16 Sacchari­ de enthalten, und die Species mit einem Molekularge­ wicht von höher als 7000 Dalton entnommen werden. Nach den Erfindern würde diese Behandlung, die die Homogeni­ sierung des Endgemisches zum Ziel hat, es erlauben, die antikoagulierende Aktivität zu vermindern, wobei jedoch die gewünschte antithrombotische Aktivität beibehalten wird.

Indessen besitzen trotz dieser Arbeiten die erhaltenen Gemische stets eine hämorrhagische Restwirkung oder ei­ ne zu geringe antithrombotische Aktivität. Überdies gibt es nichts im Stand der Technik, was es erlauben würde zu bestimmen, welche Eigenschaften es sind, die vereint werden müssen, um zu einer optimalen biologi­ schen Aktivität zu gelangen. Im übrigen ist die Schluß­ folgerung der Autoren des vorstehend genannten Artikels vielsagend: "Nous ne savons pas quelle est la combinaison optimale des propri´t´s de l′h´parine. La caract´risa­ tion pr´cise de differentes pr´parations, et la correla­ tion de ces propri´t´s avec des observations cliniques pourrait eventuellement apporter une r´ponse" ("Wir wissen nicht, welche die optimale Kombination der Eigen­ schaften des Heparins ist. Die präzise Charakterisierung von verschiedenen Präparaten und die Korrelation dieser Eigenschaften mit den klinischen Beobachtungen könnten gegebenenfalls zu einer Antwort führen").

Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, Heparine mit vorteilhaften Eigenschaften, insbesondere für die Verwen­ dung bei der Prophylaxe und der Behandlung thromboti­ scher Unfälle, zu erhalten. Überraschenderweise hat die Anmelderin nun in der Tat gefunden, daß die gleichzeitige Anwesenheit von Species mit hohem und mit niedrigem Mole­ kulargewicht in dem Endprodukt dem Produkt eine bessere Aktivität verleiht. Im Gegensatz zu den Angaben des Stan­ des der Technik scheint es somit besser zu sein, in dem Endgemisch Species mit hohem Molekulargewicht sowie eine bestimmte Heterogenität beizubehalten.

Die pharmakokinetische Untersuchung der erfindungsge­ mäßen Gemische zeigt, daß sie besonders vorteilhafte Eigenschaften vereinigen.

Insbesondere besitzen die erfindungsgemäßen Gemische ei­ ne höhere Halbwertszeit als die bekannten Produkte und auch als das reife Heparin. Im übrigen ist es in bezug auf dieses letztgenannte von Bedeutung hervorzuheben, daß die Halbwertszeit der erfindungsgemäßen Gemische von der injizierten Dosis unabhängig ist. Dies ist von Inter­ esse, da sich die einstellende Wirkung viel besser vor­ hersagen läßt als im Falle des Heparins.

Überdies besitzen beim Menschen die erfindungsgemäßen Ge­ mische eine ausgezeichnete Bioverfügbarkeit, gemessen durch die Anti-Xa-Aktivität. Während sie somit etwa 30% für Heparin beträgt, beträgt sie etwa 90% für die erfin­ dungsgemäßen Gemische. Dies ist von großem Vorteil, da es hierdurch möglich wird, die injizierten Dosen zu ver­ ringern und die therapeutischen Möglichkeiten zu ver­ bessern.

Im übrigen besteht eine wichtige Eigenschaft der erfin­ dungsgemäßen Gemische in deren großer Absorptionsge­ schwindigkeit. Dieses Charakteristikum ermöglicht es, eine gleichsam augenblickliche biologische Aktivität zu erzielen, und erlaubt somit eine größere Sicherheit bei der Behandlung, indem man dem Patienten rasch Schutz gibt.

Ein weiteres Charakteristikum der erfindungsgemäßen Ge­ mische ist deren geringes "Clearance" im Vergleich zu anderen Produkten und zu reifem Heparin. Dank ihrer che­ mischen Struktur, ihres Molekulargewichts oder ihres Sulfatgehalts besitzen diese Gemische in der Tat eine besondere Beständigkeit gegenüber Abbau (Desulfatierung, Hydrolyse) und gegenüber Eliminierung, was noch deren therapeutische Kapazitäten erhöht.

Auch besitzen die erfindungsgemäßen Präparate eine er­ höhte Verweilzeit im Vergleich zu dem Ausgangs-Heparin. Diese Eigenschaft äußert sich in einer Verlängerung der Zeitdauer, während der das Produkt in vivo aktiv bleibt, und somit in einer besseren therapeutischen Wirksamkeit.

Überdies besitzen diese Präparate auch eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Serumfaktoren, was deren Wir­ kungsdauer in vivo erhöht und es erlaubt, sie in gerin­ gen Dosen einzusetzen.

Diese besonders vorteilhaften Eigenschaften werden er­ halten, indem man im Verlauf des Herstellungsverfahrens bestimmte strukturelle Merkmale der anwesenden Species sowie deren Molekularverteilung kontrolliert. Die so er­ haltenen Gemische liegen in einem günstigen Verhältnis zwischen den Fraktionen mit hohem und mit niedrigem Mole­ kulargewicht vor, das ihnen die erforderlichen anti­ thrombotischen Eigenschaften mit einer geringen hämor­ rhagischen Wirkung verleiht.

Dieses Merkmal der Erfindung wird ausgedrückt gleichzei­ tig durch den Prozentanteil an schweren Ketten und an leichten Ketten und durch das Verhältnis zwischen dem mittleren Molekulargewicht in Form des Gewichts der Ge­ mische und deren zahlenmittlerem Molekulargewicht, was die molekulare Streuung wiederspiegelt.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Ge­ mische sulfatierter Polysaccharide mit der Grundstruktur der das Heparin bildenden Polysaccharide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie ein gewichtsmittleres Mole­ kulargewicht besitzen, das niedriger ist als dasjenige des Heparins, und zwischen 9 und 20% Ketten mit einem Mo­ lekulargewicht von geringer als 2000 Dalton und zwischen 5 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton enthalten und daß in ihnen das Verhält­ nis von gewichtsmittlerem Molekulargewicht/zahlenmittle­ rem Molekulargewicht zwischen 1,3 und 1,6 liegt.

Außerdem hat die Anmelderin festgestellt, daß es möglich ist, noch die Eigenschaften der Gemische zu verbessern, indem man deren Gehalt an Verunreinigungen verringert. Insbesondere enthält die Mehrzahl der Heparine Verunrei­ nigungen, wie Nucleinsäuren, Polypeptide oder verschie­ dene Polysaccharide. Unter diesen kann man vor allem die Chondroitinsulfate, das Heparan oder das Dermatansulfat nennen. Eine jede dieser Verunreinigungen ist, sei es durch ihr sehr hohes Molekulargewicht, sei es durch Sub­ stituenten, die sie enthält, oder ihren Sulfatierungs­ grad, in der Lage, bei der Herstellung des Produkts (bei der Depolymerisation beispielsweise) einzugreifen, um die endgültige molekulare Verteilung zu modifizieren, oder direkt in die Aktivität durch Modifizierung, insbesondere der Anteile der aktiven Ketten. Die Anmelderin hat nun ein Verfahren bereitgestellt, das es ermöglicht, die­ se Verunreinigungen zu entfernen, und eine Verbesserung der Eigenschaften der dieser Vorbehandlung unterzogenen Gemische festgestellt. Die Wirkung dieser Vorbehandlung kann gemessen werden, indem man als Vergleichsverunrei­ nigung das Dermatansulfat verwendet.

Ein speziellerer Gegenstand der vorliegenden Erfindung beruht auf den Gemischen von sulfatierten Polysacchari­ den mit den vorstehend angegebenen Eigenschaften, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie weniger als 2% Dermatansulfat enthalten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die er­ findungsgemäßen Gemische sulfatierter Polysaccharide ein gewichtsmittleres Molekulargewicht zwischen etwa 3500 Dalton und etwa 5500 Dalton.

Stets bevorzugt, haben die Ketten der sulfatierten Poly­ saccharide, die die erfindungsgemäßen Gemische bilden, eine 2-O-Sulfo-4-enopyranosuronsäure an einer ihrer Enden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Gemische sulfatierter Polysaccharide mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht, das gerin­ ger ist als dasjenige des Heparins, welche zwischen 9 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton und zwischen 5 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton enthalten und in denen das Verhältnis gewichtsmittleres Molekularge­ wicht/zahlenmittleres Molekulargewicht zwischen 1,3 und 1,6 liegt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die folgenden Stufen durchführt:
in einer ersten Stufe führt man in wäßrigem Milieu ein Heparin mit einem langkettigen, quaternären Ammoni­ umsalz in ein Salz über,
in einer zweiten Stufe verestert man das so erhal­ tene Salz, um einen Ester mit einem Veresterungsgrad zwi­ schen 9,5 und 14% zu bilden, und
in einer dritten Stufe depolymerisiert man den erhaltenen Ester mit einem Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14%.

Die Anmelderin hat tatsächlich festgestellt, daß man das Depolymerisationsniveau und somit die molekularen Eigen­ schaften des Endprodukts kontrollieren kann, indem man auf den Veresterungsgrad des Ausgangs-Heparinsalzes ein­ wirkt.

Erfindungsgemäß ist es somit möglich, direkt auf repro­ duzierbare Weise Gemische von sulfatierten Polysacchari­ den mit den vorstehend angegebenen Merkmalen zu erhalten.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Aus­ gangs-Heparin ist vorzugsweise ein Heparin vom Schwein und insbesondere von der Schleimhaut des Schweins. Es wurde tatsächlich gefunden, daß entsprechend dem Ursprung des Ausgangs-Heparins die Aktivität der erhaltenen Gemi­ sche auf beträchtliche Weise variieren konnte. Insbeson­ dere wenn das Ausgangs-Heparin dem Rind entstammt, erhält man Gemische mit einer antikoagulierenden Aktivität, die höher ist als diejenige, die aus dem Heparin der in­ testinalen Schleimhaut des Schweins erhalten wird.

Überdies umfaßt bei einer besonders vorteilhaften Varian­ te das erfindungsgemäße Verfahren außerdem eine voran­ gehende Stufe der Ausfällung von Ausgangs-Heparin mit ei­ nem Alkohol. Diese Vorbehandlung ermöglicht es, den Ge­ halt an Verunreinigungen des Chondroitinsulfat- oder Heparansulfat-Typs zu verringern.

Ein Alkohol, der zu guten Ergebnissen führt, ist bei­ spielsweise Methanol.

Der Reinheitsgrad des Heparinnatriums kann darauf durch sterische Ausschluß-Flüssigkeitschromatographie bestimmt werden.

Diese vorangehende Stufe ermöglicht es vor allem, ein Heparin mit einem Dermatansulfat-Gehalt von niedriger als 2% herzustellen.

Genauer erfolgt die Salzbildung des Heparins auf folgen­ de Weise.

Das Heparinsalz kann durch Umsetzung eines Überschusses des entsprechenden Salzes mit einem Heparinnatrium in wäßrigem Milieu bei einer Temperatur um 20°C erhalten werden. Vorteilhafterweise ist das verwendete quaternäre Ammoniumsalz bevorzugt ein Benzethoniumsalz, wie insbe­ sondere das Benzethoniumchlorid, welches man mit dem Heparinnatrium umsetzen kann.

Was die zweite Stufe anbelangt, ist es bevorzugt, die Veresterung unter den folgenden Bedingungen durchzuführen.

Der partielle Ester des Heparins in Form des Salzes, des­ sen Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14% liegt, kann durch Veresterung des langkettigen, quaternären Ammonium­ salzes des Heparins in einem chlorierten, organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Chlorderivats erhalten werden. Darüber hinaus wird die Wirksamkeit der Umset­ zung erhöht, indem man die Anteile der verschiedenen Re­ agentien und die Temperatur und Reaktionsdauer kontrol­ liert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der partielle Ester des Heparins ein aromatischer Ester.

Ebenfalls bevorzugt ist das Chlorderivat das Benzylchlo­ rid, und das chlorierte Lösungsmittel wird unter Chloro­ form oder Methylenchlorid ausgewählt.

Um einen Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14% zu erhal­ ten, kann es ganz besonders vorteilhaft sein, je 1 Gew.- Teil Heparinsalz etwa 1 Vol.-Teil Chlorderivat in dem Medium von 3 bis 5 Vol.-Teilen organischem, chloriertem Lösungsmittel zu verwenden und die Reaktion während ei­ ner Zeitdauer von 15 bis 48 Stunden bei einer Temperatur zwischen 25 und 45°C und vorzugsweise zwischen 30 und 40°C durchzuführen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegt der partiel­ le Heparinester in Form eines Natriumsalzes vor.

Die so gebildeten Ester können durch Ausfällung mit einem Alkohol, wie insbesondere Methanol, in Gegenwart von Na­ triumacetat zurückgewonnen werden. Vorzugsweise verwendet man zwischen 1 und 1,2 Volumina Alkohol je Volumen Reak­ tionsmilieu. Der Veresterungsgrad des Esters kann hierauf durch Hochleistungschromatoraphie in flüssiger Phase kontrolliert werden. Insbesondere im Falle des Benzyl­ esters kann man die Menge des erhaltenen Benzylalkohols durch Verseifen des Esters bei 0°C bestimmen.

Die letzte Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorteilhaft auf folgende Weise durchgeführt.

Vorzugsweise erfolgt die Depolymerisation durch Behand­ lung des Esters mit einer starken Base in wäßriger Lö­ sung. Genauer kann man Natronlauge verwenden.

Bevorzugt liegt das Gewichtsverhältnis Base/Ester zwi­ schen 0,05 und 0,2 und vorzugsweise zwischen 0,08 und 0,15.

Die Temperatur des Milieus wird auf einen Wert zwischen 50 und 70°C, vorzugsweise zwischen 55 und 65°C, einge­ stellt und die Reaktion während einer Dauer von 30 Minu­ ten bis zu 3 Stunden, vorzugsweise von 1 bis 2 Stunden, durchgeführt.

Überdies ist es bevorzugt, in einem Milieu zu arbeiten, in dem das Gewichtsverhältnis Wasser/Ester zwischen 15 und 30 liegt.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform be­ steht die Depolymerisation darin, zu mischen:
1 Gew.-Teil eines aromatischen Esters des Heparins, wie er in der zweiten Stufe erhalten wurde, in Form des Salzes, dessen Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14% liegt,
zwischen 0,08 und 0,15 Gew.-Teile Natronlauge und
zwischen 20 und 30 Gew.-Teile Wasser
und hiernach 1 bis 2 Stunden die Temperatur zwischen 55 und 65°C zu halten.

Das Produkt kann dann durch Neutralisation des Reaktions­ milieus mit einer verdünnten Mineralsäure und vorzugs­ weise Chlorwasserstoffsäure und Ausfällung in Gegenwart eines Alkohols, wie Methanol, gewonnen werden.

Auf diese Weise ist es möglich, direkt und reproduzier­ bar ein Gemisch sulfatierter Polysaccharide zu erhalten, welches
zwischen 9 und 20% Ketten mit einem Molekularge­ wicht von geringer als 2000 Dalton,
zwischen 5 und 20% Ketten mit einem Molekularge­ wicht von höher als 8000 Dalton
enthält und ein mittleres Molekulargewicht zwischen 3500 und 5500 Dalton und ein Verhältnis gewichtsmittle­ res Molekulargewicht/zahlenmittleres Molekulargewicht zwischen 1,3 und 1,6 besitzt.

Die erfindungsgemäßen Gemische können vorteilhaft als antithrombotische Mittel eingesetzt werden.

Insbesondere sind sie bei der Verhütung von venösen Thrombosen in Situationen mit Risiken anwendbar. Dies besitzt auch Gültigkeit in Situationen mit langanhalten­ dem Risiko. Insbesondere ermöglichen es diese Gemische, erstmals bei festgelegten Dosen die Risiken thromboti­ scher Unfälle in der orthopädischen Chirurgie zu verrin­ gern. Dieses Risiko, das in Abwesenheit jeglicher Be­ handlung 70% beträgt und etwa 25% in Anwesenheit von Heparin, liegt bei den erfindungsgemäßen Gemischen in der Größenordnung von 10% oder gar geringer.

Ebenso können nach Injektion in die Verteiler einer künst­ lichen Niere diese Gemische die Thrombosen, die sich dort entwickeln können, reduzieren. Diese letztgenannte An­ wendung kann auf die Verhütung von Thrombosen in chir­ urgischem Material ausgedehnt werden.

Eine weitere, vorteilhafte, therapeutische Verwendung der erfindungsgemäßen Gemische beruht in der Verhütung arte­ rieller, thrombotischer Unfälle, insbesondere im Fall eines Herzinfarkts.

Außerdem beruht eine besonders interessante Anwendung der erfindungsgemäßen Gemische auf der Möglichkeit, zur Ver­ hinderung von venösen Thrombosen bei chirurgischen Patien­ ten einen post-operativen Bereich zu verwenden. Diese An­ wendung ist überaus vorteilhaft, da sie es erlaubt, wäh­ rend der Operation die Risiken einer Hämorrhagie und die Probleme des Typs und der Dosen des Anästhesiemittels zu vermeiden, welche durch eine Vorbeugung im prä-operati­ ven Bereich bedingt sind.

Die Gesamtheit dieser Eigenschaften zeigt die therapeuti­ schen Möglichkeiten der erfindungsgemäßen Präparate.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Bestimmungstechniken

Die Molekulargewichte und die Verteilungen des Molekular­ gewichts der Produkte werden durch Hochdruck-Flüssig­ keitschromatographie mit zwei Kolonnen in Reihe, z. B. denjenigen, die unter der Bezeichnung TSK G 3000 SW (30×0,75 cm) und Lichrosorb 100 Diol 10 u (25×0,75 cm) oder TSK G 2000 SW im Handel erhältlich sind, die mit ei­ nem refraktometrischen Detektor gekoppelt sind, bestimmt. Das verwendete Lösungsmittel ist ein Phosphatpuffer 0,3 M, pH 7, und der Durchsatz beträgt 0,7 ml/min. Das System wird mit Standards, hergestellt durch Fraktionie­ rung von Enoxaparin (PHARMUKA) durch Ausschlußchromato­ graphie an Agarose-Polyacrylamid (IBF) nach der von Barrow Cliffe et coll., Thromb. res., 12, 27-36 (1977-78), oder D. A. Lane et coll., Thromb. res., 12, 257-271 (1977- 78), beschriebenen Technik, geeicht. Die Ergebnisse wer­ den mit Hilfe der GPC6 Software (Perkin Elmer) berechnet.

In den folgenden Beispielen wird die antikoagulierende Gesamtaktivität der Gemische durch Trübungsmessung unter Verwendung des ersten internationalen Heparinstandards mit niedrigem Molekulargewicht bestimmt. Die Antifaktor- Xa(antithrombotische)-Aktivität wird mit der amidolyti­ schen Methode an einem von Teien et coll., Thromb. res., 10, 399-410 (1977), beschriebenen, chromogenen Substrat unter Verwendung des ersten internationalen Heparin­ standards mit niedrigem Molekulargewicht bestimmt.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die vorangehende Behandlungsstufe von Heparinnatrium, die es erlaubt, den Gehalt an Ver­ unreinigungen vom Chondroitinsulfat- und Heparansulfat- Typ zu reduzieren.

Zu 10 g im Handel erhältlichem Heparin (Natriumsalz) in Lösung in 100 ml Wasser, welches 3 g Natriumchlorid ent­ hält, gibt man 80 ml Methanol. Nach Ausfällen wird das erhaltene Produkt filtriert, gespült und dann getrocknet. Der Gehalt an Verunreinigungen des so erhaltenen Heparin­ natriums wird durch sterische Ausschluß-Flüssigkeits­ chromatographie mit zwei Kolonnen in Reihe, die unter der Bezeichnung TSK 2000 SW (60×0,75 cm) und TSK 3000 SW (60×0,75 cm) im Handel erhältlich sind, welche mit ei­ nem auf 206 nm eingestellten UV-Detektor gekoppelt sind, bestimmt. Die verwendete, bewegliche Phase ist eine mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zirkulierende 0,5 M wäßrige Natriumsulfatlösung. Der Versuch wird mit einem Vergleichsheparin verglichen, welches 2% Dermatan­ sulfat enthält.

Unter den vorstehend angegebenen Bedingungen enthält das erhaltene Heparin weniger als 2% Dermatansulfat.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung des quaternären Ammoniumsalzes des Heparins.

Zu einer Lösung von 10 g weniger als 2% Dermatansulfat enthaltendem Natriumheparinat gemäß Beispiel 1 in 100 ml Wasser gibt man eine Lösung von 25 g Benzethoniumchlorid in 125 ml Wasser. Das bei Raumtemperatur erhaltene Pro­ dukt wird hierauf filtriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet.

Auf identische Weise stellt man das Benzethoniumsalz ei­ nes Heparins her, das keiner Behandlung gemäß Beispiel 1 unterzogen worden ist.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung und die Eigenschaf­ ten der erfindungsgemäßen Gemische.

1. Veresterung

Zu einer Lösung von 15 g zuvor nach dem Verfahren des Beispiels 1 behandeltem Benzethoniumheparinat in 75 ml Methylenchlorid gibt man 15 ml Benzylchlorid. Die Lö­ sung wird auf eine Temperatur von 35°C erhitzt, welche 25 Stunden beibehalten wird. Man gibt dann 90 ml einer 10%igen Natriumacetatlösung in Methanol zu, filtriert, wäscht mit Methanol und trocknet. Man erhält so 6,5 g Heparinbenzylester in Form des Natriumsalzes, dessen Ver­ esterungsgrad, bestimmt wie vorstehend angegeben, 13,3% beträgt.

2. Depolymerisation

10 g vorstehend erhaltener Heparinbenzylester in Form des Natriumsalzes werden in 250 ml Wasser gelöst. Zu dieser auf 62°C erhitzten Lösung gibt man 0,9 g Natronlauge. Die Temperatur wird 1 Stunde und 30 Minuten bei 62°C gehal­ ten. Das Reaktionsgemisch wird hierauf auf 20°C abgekühlt und durch Zugabe von verdünnter Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Man stellt dann die Konzentration des Reak­ tionsmilieus auf 10% an Natriumchlorid ein. Das Produkt wird schließlich in 750 ml Methanol ausgefällt, filtriert und getrocknet. Man erhält so ein Heparin mit den fol­ genden strukturellen Merkmalen:
gewichtsmittleres Molekulargewicht: 3900 Dalton
molekulare Verteilung:
20% Ketten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton
5,5% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton
Dispersion: d=1,39
Anti-Xa-Aktivität: 106 IE
antikoagulierende Aktivität: 22,6 IE.

Beispiel 4

Auf ähnliche Weise stellt man, ausgehend von Estern mit einem Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14%, depolymeri­ sierte Heparinlösungen mit den folgenden strukturellen Merkmalen her:

• a) gewichtsmittleres Molekulargewicht: 4425 Dalton
  molekulare Verteilung:
  12,4% Ketten mit einem Molekulargewicht von ge­ ringer als 2000 Dalton
  9,3% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton
  Dispersion: d=1,37
  Anti-Xa-Aktivität: 102 IE
  antikoagulierende Aktivität: 33 IE
• b) gewichtsmittleres Molekulargewicht: 4579 Dalton
  molekulare Verteilung:
  11,2% Ketten mit einem Molekulargewicht von ge­ ringer als 2000 Dalton
  10,4% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton
  Dispersion: d=1,37
  Anti-Xa-Aktivität: 104 IE
  antikoagulierende Aktivität: 37 IE
• c) gewichtsmittleres Molekulargewicht: 4446 Dalton
  molekulare Verteilung:
  12,6% Ketten mit einem Molekulargewicht von ge­ ringer als 2000 Dalton
  9,5% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton
  Dispersion: d=1,38
  Anti-Xa-Aktivität: 100 IE
  antikoagulierende Aktivität: 32 IE.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines Gemisches, das nicht zu den erfindungsgemäßen Merkmalen führt.

1. Veresterung

Zu einer Lösung von 15 g eines nach dem Verfahren von Beispiel 1 vorbehandelten Benzethoniumheparinats in 60 ml Methylenchlorid gibt man 12 ml Benzylchlorid. Die Lösung wird auf eine Temperatur von 28°C erhitzt, die 30 Stun­ den beibehalten wird. Man gibt dann 90 ml einer 10%igen Natriumacetat-Lösung in Methanol zu, filtriert, wäscht mit Methanol und trocknet. Man gewinnt so 6,3 g Heparin­ benzylester in Form des Natriumsalzes. Der Veresterungs­ grad dieses Produkts, bestimmt durch Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographiemessung der Menge des durch Verseifung bei 0°C freigesetzten Benzylalkohols, beträgt 9,2%.

2. Depolymerisation

10 g des vorstehend in Form des Natriumsalzes erhaltenen Heparinbenzylesters werden in 200 ml Wasser gelöst. Zu dieser auf 58°C erhitzten Lösung gibt man 1,1 g Natron­ lauge. Die Temperatur wird 1 Stunde bei 58°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wird hierauf auf 20°C abgekühlt und durch Zugabe von verdünnnter Chlorwasserstoffsäure neutra­ lisiert. Man stellt dann die Konzentration des Reaktions­ milieus auf 10% an Natriumchlorid ein. Das Produkt wird schließlich in 600 ml Methanol ausgefällt, filtriert und getrocknet. Man gewinnt so ein Heparin mit den folgenden Strukturmerkmalen:
gewichtsmittleres Molekulargewicht: 5425 Dalton
molekulare Verteilung:
9,6% Ketten mit einem Molekulargewicht von ge­ ringer als 2000 Dalton
19,5% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton
Dispersion: d=1,44
Anti-Xa-Aktivität: 122 IE
antikoagulierende Aktivität: 68,6 IE.

Diese Resultate, die eine hohe antikoagulierende Aktivi­ tät zum Ausdruck bringen, zeigen die Überlegenheit der erfindungsgemäß hergestellten und die angegebenen Merkmale besitzenden Gemische.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt den Stabilitätsgewinn in vivo der erfindungsgemäßen Gemische, ausgedrückt durch ihre plasma­ tische Halbwertzeit.

Eine erste pharmakokinetische Untersuchung wurde an Frei­ willigen mit einem Alter von 21 bis 30 Jahren durchge­ führt. Subkutane Injektionen wurden in Dosen verabreicht, die zwischen 20 und 80 mg/ml variierten. Im Verlauf der Zeit wurden Proben entnommen (4,5 ml) und bei etwa 4°C gelagert. Die Proben wurden dann 15 Minuten bei 2300 g zentrifugiert, und das an Plättchen arme Plasma wurde ab­ getrennt und vor der Analyse eingefroren. Die Halbwerts­ zeit der Gemische wurde hierauf durch Messung der Anti- Xa-Aktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind die folgen­ den:
Bei den in den Beispielen 3 und 4 erhaltenen Gemi­ schen:
Dosis 40 mg: in 75% der Fälle ist die Halbwerts­ zeit höher als 4 Stunden und sie ist sogar höher als 4 ½ Stunden in etwa 45% der Fälle;
Dosis 60 mg: in 75% der Fälle ist die Halbwerts­ zeit höher als 3,7 Stunden;
unter identischen Bestimmungsbedingungen besitzt intra­ venös injiziertes, intaktes Heparin eine Halbwertszeit von etwa 0,6 Stunden;
wird das Produkt nach dem in dem EP-Patent 40 144 be­ schriebenen Verfahren hergestellt, ist die Halbwerts­ zeit höher als 4 ½ Stunden in 17% der Fälle.

Eine zweite, unter ähnlichen Bedingungen bei 20 Patien­ ten durchgeführte Untersuchung ergab die folgenden Resul­ tate für die erfindungsgemäßen Gemische:
Dosis 40 mg: in 80% der Fälle ist die Halbwerts­ zeit höher als 4 Stunden und sie ist höher als 4½ Stun­ den in etwa 40% der Fälle;
Dosis 20 mg: in 60% der Fälle ist die Halbwerts­ zeit höher als 3,9 Stunden.

Claims (15)

1. Gemische sulfatierter Polysaccharide mit der Grundstruktur der das Heparin bildenden Polysaccharide, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein gewichtsmittleres Molekulargewicht besitzen, das geringer ist als dasjeni­ ge des Heparins, zwischen 9 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton und zwi­ schen 5 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton besitzen und daß in ihnen das Ver­ hältnis gewichtsmittleres Molekulargewicht/zahlenmittle­ res Molekulargewicht zwischen 1,3 und 1,6 beträgt.

2. Gemische gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie weniger als 2% Dermatansulfat enthalten.

3. Gemische gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß sie ein mittleres Molekulargewicht zwi­ schen etwa 3500 Dalton und etwa 5500 Dalton besitzen.

4. Gemische gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Ketten der sulfatierten Polysac­ charide eine 2-O-Sulfo-4-enopyranosuronsäure an einem ihrer Enden aufweisen.

5. Verfahren zur Herstellung von Gemischen sulfatier­ ter Polysaccharide gemäß einem der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß man die folgenden Stu­ fen durchführt:
man in einer ersten Stufe in wäßrigem Milieu ein Heparin mit einem langkettigen, quaternären Ammoniumsalz in ein Salz überführt,
man in einer zweiten Stufe das so erhaltene Salz verestert, um einen Ester mit einem Veresterungsgrad zwi­ schen 9,5% und 14% zu bilden, und
man in einer dritten Stufe den erhaltenen Ester mit einem Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14% depoly­ merisiert.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeich­ net, daß die zweite Stufe in einem chlorierten, organi­ schen Lösungsmittel in Gegenwart eines Chlorderivats durchgeführt wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeich­ net, daß das Chlorderivat Benzylchlorid ist und das Lö­ sungsmittel unter Chloroform und Methylenchlorid ausge­ wählt wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 5, 6 oder 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Veresterung durchgeführt wird, in­ dem man 1 Gew.-Teil des Heparinsalzes mit etwa 1 Vol.- Teil eines Chlorderivats in dem Medium von 3 bis 5 Vol.- Teilen eines chlorierten, organischen Lösungsmittels bei einer Temperatur zwischen 25 und 45°C und vorzugsweise zwischen 30 und 40°C mischt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeich­ net, daß die dritte Stufe durchgeführt wird, indem man den Ester mit einer starken Base in wäßriger Lösung be­ handelt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeich­ net, daß das Gewichtsverhältnis Base/Ester zwischen 0,05 und 0,2 und vorzugsweise zwischen 0,08 und 0,15 beträgt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeich­ net, daß das Gewichtsverhältnis Wasser/Ester zwischen 15 und 30 beträgt.

12. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeich­ net, daß die Temperatur des Milieus auf einen Wert zwi­ schen 50 und 70°C und vorzugsweise zwischen 55 und 65°C eingestellt wird und die Reaktion während einer Dauer von 30 Minuten bis 3 Stunden und vorzugsweise 1 bis 2 Stunden durchgeführt wird.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 12, da­ durch gekennzeichnet, daß man in einer vorhergehenden Stufe das Ausgangs-Heparin mit Hilfe eines Alkohols ausfällt.

14. Verwendung der Gemische der sulfatierten Polysac­ charide gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 zur Herstellung therapeutischer Zusammensetzungen.

15. Verwendung gemäß Anspruch 14 zur Herstellung thera­ peutischer Zusammensetzungen für die Vorbeugung von venösen Thrombosen im post-operativen Bereich.