DE3887070T2

DE3887070T2 - Verfahren zur Herstellung von Brenztraubensäure durch Fermentation.

Info

Publication number: DE3887070T2
Application number: DE3887070T
Authority: DE
Inventors: Bernard Besnainou; Dominique Giani; Claire Sahut
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1987-10-15
Filing date: 1988-10-12
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2008-10-13
Also published as: EP0312453A1; US4918013A; JP2752102B2; ES2049760T3; FR2621925B1; EP0312453B1; FR2621925A1; KR970001687B1; KR890006821A; JPH01137985A; DE3887070D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Brenztraubensäure durch Fermentation, besonders durch Fermentation mittels Fermenten, die zur Gattung Candida gehören.
Die Brenztraubensäure ist ein interessantes Ausgangsmaterial für die Herstellung von nützlichen Aminosäuren, wie Tryptophan, Tyrosin oder Alanin. Es ist eine Verbindung, die ebenso durch sich selbst Nutzen hat, indem sie als Zusatzstoff einen säuerlichen Geschmack verleiht.
Man weiß, daß die Kultur der Fermente, wie der Gattung Candida, zur Herstellung von Brenztraubensäure in einem Kulturmilieu führt. Doch die Menge der unter diesen Bedingungen hergestellten Brenztraubensäure ist gering und es ist, aufgrund dieses geringen Wirkungsgrads, schwierig, diese Produktion in industriellem Rahmen anzustreben.
Durch die französische Patentanmeldung FR-A-2 277 890 kannte man ein Verfahren zur Herstellung von Brenztraubensäure durch Fermentation, das es ermöglicht, den Wirkungsgrad für Brenztraubensäure zu erhöhen, aufgrund der Verwendung besonderer Fermente, die Mutanten der Gattung Candida sind, welche für ihr Wachstum Thiamin und Methionin benötigen.
Dieses Verfahren weist also den Nachteil auf, die Verwendung von besonderen Fermentstämmen zu benötigen.
Die vorliegende Erfindung betrifft genau ein Verfahren zur Herstellung von Brenztraubensäure, das in industriellem Rahmen mit einem erhöhten Wirkungsgrad eingesetzt werden kann, das keine mutierten Stämme benötigt und das es ermöglicht, die gleichzeitige Herstellung von Alpha-Ketoglutarsäure zu beschränken.
Das Verfahren, gemäß der Erfindung, zur Herstellung von Brenztraubensäure durch Fermentation besteht aus:
1º) - dem Kultivieren von Zellen der Gattung Candida in einem Kulturmilieu, das eine Kohlenstoffquelle, eine Quelle für Stickstoff, Thiamin und Mineraliensalze umfaßt, bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5 unter aeroben Bedingungen,
2º) - dem Trennen der in dem Wachstumsmilieu somit hergestellten Zellen,
3º) - dem Kultivieren dieser Zellen in einem Milieu der Biokonversion, die eine Quelle für Kohlenstoff und Mineralelemente bei einem pH-Wert von 3,5 bis 4,5 unter aeroben Bedingungen enthält, und
4º) - dem Herausnehmen der produzierten Brenztraubensäure aus dem Kulturmilieu.
In dem dritten Abschnitt des Verfahrens ermöglicht es die Wahl eines pH-Wert von 3,5 bis 4,5, bevorzugterweise ungefähr 4, die Herstellung von Brenztraubensäure zum Nachteil von Alpha- Ketoglutarsäure zu begünstigen.
Andererseits ermöglicht es die Wahl dieses pH-Bereichs und eines Milieus zur Biokonversion, das bevorzugterweise kein Thiamin und kein Eisen enthält, diese Kultur ohne Erhöhung der Biomasse auszuführen, und somit die Mehrheit des, in das Kulturmilieu eingeführten, Kohlenstoffs in interessante Produkte wie Brenztraubensäure umzuwandeln.
Um einen interessanten Wirkungsgrad für Brenztraubensäure zu erhalten, ist die Konzentration der Zellen des Milieus der Biokonversion vorzugsweise mindestens 5 g/l zu Beginn der Kultur.
Das in der Erfindung verwendete Kulturmilieu ist eine herkömmliches Milieu, das es ermöglicht, Brenztraubensäure herzustellen. Daher enthält es Quellen assimilierbaren Kohlenstoffs und anorganischer Salze.
Diese Kohlenstoffquellen können Saccharide, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Stärkehydrolysate sein. Aus Kostengründen verwendet man vorzugsweise Stärkehydrolysate.
Die im Allgemeinen in dem Kulturmilieu verwendeten anorganischen Salze sind Salze von Fe, K, Na, Mg, Mn, N, P, S, das heißt, die für die enzymatische Synthese notwendigen, die eine Erhöhung der Biomasse ermöglichen.
Um die Herstellung von Brenztraubensäure zu begünstigen und ein Wachstum der Biomasse zu vermeiden, umfaßt das Milieu zur Biokonversion vorzugsweise weder Fe²&spplus;-Ionen noch Thiamin.
In dem Verfahren der Erfindung wird die Kultur in der Tat so ausgeführt, um Brenztraubensäure herzustellen und nicht um Zellen der Gattung Candida zu entwickeln und es ist also nicht notwendig, Fe²&spplus;-Ionen und Thiamin zuzufügen, welche die Entwicklung dieser Zellen fördern.
Als Beispiel eines für die Verwendung geeigneten Kulturmilieus kann man die wässerigen Lösungen anführen, die einzig Glucose oder eine Stärkehydrolysat, Ammoniumnitrat, Natriummonophosphat, Magnesiumsulfat und Kupferionen umfassen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung umfaßt das Verfahren zur Herstellung von Brenztraubensäure durch Fermentation nacheinander die folgenden Abschnitte:
a) - Herstellung der Zellen der Gattung Candida durch aerobe Kulturen in einem Kulturmilieu, das zu Beginn mindestens 0,2 g/l Zellen, die Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, die Mineralsalze und das, für die Entwicklung der Zellen notwendige, Thiamin bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5 umfaßt, bis zum Erhalten einer Zellenkonzentration in dem Kulturmilieu von mindestens 5 g/l,
b) - Abtrennen und Waschen der in Abschnitt a) hergestellten Zellen,
c) - aerobe Kultur der in Abschnitt b) abgetrennten Zellen in einem Milieu zur Biokonversion, das eine Quelle für Kohlenstoff und Mineralsalze umfaßt, aber weder Thiamin noch Eisen enthält, bei einem pH-Wert von 3,5 bis 4,5 mit einer Zellenkonzentration des Kulturmilieus zu Beginn der Kultur von mindestens 5 g/l, und
d) - Abziehen der Brenztraubensäure aus dem Kulturmilieu.
In dieser bevorzugten Ausführungsweise besteht der erste Abschnitt darin, die Zellen der Gattung Candida zu entwickeln, um die gewünschte Zellenkonzentration zu erhalten, indem man ein Kulturmilieu und einen pH-Wert (von ungefähr 5) verwendet, die das Wachstum dieser Zellen fördern. Wenn man die gewünschte Zellmenge erhält, trennt man diese vom Kulturmilieu und wäscht sie mit einem solchen Kulturmilieu, wie dem, das in dem folgenden Abschnitt c) verwendet wird; in diesem Abschnitt wird die Wahl der Bedingungen der Kultur auf die Herstellung von Brenztraubensäure ausgerichtet. Daher ist der pH-Wert von 3,5 bis 4,5, vorzugsweise 4, und man verwendet ein Milieu zur Biokonversion, das Kohlenstoff, aber weder Thiamin, noch Eisen umfaßt. Während diesem Abschnitt sammelt sich die Brenztraubensäure in dem Milieu zur Biokonversion und man zieht sie von diesem durch herkömmliche Verfahren ab, zum Beispiel, indem man die Brenztraubensäure von den Zellen durch Ultrafiltration abtrennt, dann die Brenztraubensäure von der Alpha-Ketoglutarsäure durch Kontakt mit einem Ionenaustauscherharz.
Im Allgemeinen setzt man dieses Verfahren kontinuierlich in einer Einrichtung ein, die einen Fermenter umfaßt, der mit einer Zelle zur Ultrafiltration gekoppelt ist. Daher kann man nach dem Wachstum der Zellen in dem ersten Abschnitt, die Abtrennung der Zellen von dem Kulturmilieu in der Zelle zur Ultrafiltration ausführen und ebenso das Waschen der abgetrennten Zellen ausführen, indem man nach und nach das Kulturmilieu durch Diafiltration wechselt. Man führt dann die Kultur bei einem pH-Wert von 3,5 bis 4,5 aus, indem man das Kulturmilieu, das die Zellen enthält, zwischen dem Fermenter und der Zelle zur Ultrafiltration zirkulieren läßt, um kontinuierlich die hergestellte Brenztraubensäure abzuziehen. Die in der Zelle zur Ultrafiltration mit dem Kulturmilieu abgezogene Brenztraubensäure kann durch ein Ionenaustauscherharz abgetrennt werden.
In dieser bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung enthält das in Abschnitt a) verwendete Kulturmilieu Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, sowie für Mineralsalze. Die Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff und den verwendeten Mineralsalzen können die oben erwähnten sein. Die Stickstoffquellen können organische oder anorganische Stoffe sein, zum Beispiel Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff, Pepton oder andere Peptidverbindungen. Zwischen zwei Stämmen, die zu gleichen Wirkungsgraden der Biokonversion des Substrats in Brenztraubensäure führen, führen die Kostengründe der Stickstoffquelle dazu, den Stab auszuwählen, der sich mit mineralischem Stickstoff begnügt. In diesem Fall umfaßt das Kulturmilieu ebenso Thiamin, das in reiner Form oder in entsprechender Form oder durch eine Substanz, die es enthält, eingeführt werden kann, zum Beispiel einen Fermentauszug oder die Flüssigkeit der Maismazerierung.
Bestimmte Kulturmilieus benötigen die Zufuhr anderer Additive, wie den Vitaminen, Methionin, etc.; aber die Verwendung solcher Additive führt zum Erhalten von Brenztraubensäure zu sehr erhöhten Kosten.
In den Abschnitten a) und c) des Verfahrens der Erfindung werden die aeroben Bedingungen durch Einblasen von Sauerstoff in das Kulturmilieu erhalten. In dem ersten Abschnitt, der auf die Entwicklung der Biomasse ausgerichtet ist, verwendet man eine größere Sauerstoffmenge als in dem dritten Abschnitt c), der auf die Herstellung von Brenztraubensäure ausgerichtet ist. In den beiden Fällen unterzieht man das Kulturmilieu einem Umrühren.
Andere Kennzeichen und Vorteile der Erfindung treten mehr bei der Lektüre der folgenden Beschreibung bezüglich den angefügten Zeichnungen hervor, auf denen:
Fig. 1 in schematischer Weise eine Einrichtung für den Einsatz des Verfahrens der Erfindung darstellt,
Fig. 2 ein Diagramm ist, das die Variationen der Menge der hergestellten Brenztraubensäure (Kurve I), die Menge der hergestellten Alpha-Ketoglutarsäure (Kurve II), und die Entwicklung der Konzentration der Biomasse (Kurve III) in Abhängigkeit von der Dauer der Kultur beschreibt, wenn man diese mit einem Wechsel der pH-Werts der Kultur von 5 auf 4 innerhalb von 90 h ausführt, und
Fig. 3 ist eine Diagramm, das die Herstellung von Brenztraubensäure (Kurve IV) und Alpha-Ketoglutarsäure (Kurve V) pro g verbrauchte Glucose in Abhängigkeit vom pH-Wert des Milieus der Biokonversion darstellt.
In Fig. 1 sieht man, daß die Einrichtung, die den Einsatz des Verfahrens der Erfindung ermöglicht, einen Fermenter 1 umfaßt, der mit Versorgungsgeräten 3 mit zur Fermentation nötigen Produkten, mit, in der Zeichnung nicht dargestellten, Geräten zur Regulierung der Temperatur, zur Regulierung des pH-Werts, für den Zufuhr von Sauerstoff und zum Umrühren ausgestattet ist.
Das in dem Fermenter 1 vorliegende Milieu kann durch die Leitung 5 eingesaugt werden, die mit einer Pumpe 7 ausgestattet ist, um in der Vorrichtung zu Ultrafiltration 9 in Kreislauf gebracht zu werden, welche mit Filterwänden 10 ausgestattet ist, von denen man durch die Leitung 11 das ultrafiltrierte flüssige Milieu abzieht, das besonders die während der Fermentation hergestellte Brenztraubensäure und Alpha-Ketoglutarsäure umfaßt. Das an Zellen angereicherte Kulturmilieu, das an der Vorrichtung zur Ultrafiltration 9 austritt, wird durch die Leitung 13 in dem Fermenter 1 wieder aufbereitet.
Um das Verfahren zur Herstellung von Brenztraubensäure gemäß der Erfindung einzusetzen, verfährt man in folgender Weise:

Abschnitt a): Herstellung der Zellen

Man führt diesen ersten Abschnitt aus, indem man in den Fermenter ein Kulturmilieu C1 einführt, das die folgende Zusammensetzung hat:
- Glucose : 50 g/l
- NH&sub4;NO&sub3;: 2,5 g/l
- MgSO&sub4; : 1 g/l
- KH&sub2;PO&sub4;: 2 g/l
- Fe²&spplus; : 2.10&supmin;&sup6; g/l
- Cu²&spplus; : 2.10&supmin;&sup6; g/l
- Fleischextrakt : 0,2 g/l
- Thiamin : 10&supmin;&sup6; g/l
zu der man 0,2 g/l Zellen der Gattung Candida Lipolytica gibt.
Man führt dann die Kultur unter den folgenden Bedingungen aus:
- pH-Wert: 5,
- Temperatur : 30ºC + 3ºC,
- Partialdruck des gelösten Sauerstoffs: 80% ± 10% des Sättigungsdrucks von Sauerstoff im Kulturmilieu bei 30ºC,
- Rühren: 250 bis 950 Umdrehungen/min (für eine Reynoldszahl von 8500 bis 32 000).
Man fährt mit der Kultur für 90h fort, indem man die Kulturbedingungen genau konstant hält.
Am Ende des Vorgangs bestimmt man die Konzentrationen an Zellen, an Brenztraubensäure und an Alpha-Ketoglutarsäure in dem Kulturmilieu. Die erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden:
- Zellen : 5 bis 15 g/l,
- Brenztraubensäure :10 bis 15 g/l,
- Alpha-Ketoglutarsäure : 5 bis 8 g/l.

Abschnitt b): Abtrennen der Zellen durch Ultrafiltration, Waschen der Zellen und Auswechseln des Kulturmilieus durch Diafiltration

Um diesen Abschnitt auszuführen, setzt man die Pumpe 7 in Gang und läßt das Kulturmilieu, das die Zellen enthält, in der Vorrichtung zur Ultrafiltration 9 zirkulieren, welche Filtermembranen der Marke Carbosep enthält, die aus einem porösen Kohlenstoffträger gebildet werden, der mit einer mikroporösen Zirkoniumoxidschicht bedeckt ist.
Man läßt das Milieu bei einer Tangentialgeschwindigkeit von 4 ± 2m/s zirkulieren. Während diesem Durchgang durch die Vorrichtung zur Ultrafiltration verarmt das Milieu an Flüssigkeit. In einer ersten Phase konzentriert man die Candida Lipolytica-Zellen auf 1/4 des Ausgangsvolumens V des Kulturmilieus.
In einer zweiten Phase führt man in die Vorrichtung zur Ultrafiltration durch die Leitung 3 das Kulturmilieu C2 ein, das für den folgenden Abschnitt zur Herstellung von Brenztraubensäure verwendet wird und das die folgende Zusammensetzung aufweist:
- Glucose :100 g/l
- NH&sub4;NO&sub3;: 5 g/l
- KH&sub2;PO&sub4;: 2 g/l
- MgSO&sub4; : 1 g/l
- Cu²&spplus; : 2.10&supmin;&sup6; g/l,
um das Volumen des Kulturmilieus von V/4 auf V/2 zurückzuführen. Man unterbricht dann diese Zugabe und man konzentriert das Kulturmilieu von neuem von V/2 auf V/4, indem man Flüssigkeit durch die Leitung 11 abzieht. Man wiederholt einmal diese Vorgänge des Zufügens zu dem zweiten Kulturmilieu C2, um von V/4 auf V/2 überzugehen. In einer letzten Phase füllt man das zweite Kulturmilieu C2 auf, um das Volumen des in dem Fermenter zirkulierenden Kulturmilieus von V/4 auf V zu erhöhen. Dieses Milieu enthält dann 5 bis 10 g/l Zellen und man kann dann den dritten Abschnitt c) ausführen.

Abschnitt c): Herstellung von Brenztraubensäure

Man führt die Zellkultur unter den folgenden Bedingungen weiter:
- pH-Wert: 4,
- Temperatur: 30ºC ± 3ºC,
- Partialdruck des Sauerstoffs: 50%,
- Rühren: 700 U/min (für eine Reynoldszahl von 23 500),
und man hält die Bedingungen der Kultur und die Zusammensetzung des Kulturmilieus für die gesamte Dauer der Kultur genau konstant.
Während diesem Abschnitt zur Herstellung von Brenztraubensäure geht das Kulturmilieu in die Vorrichtung zur Ultrafiltration über und man zieht dort kontinuierlich durch die Leitung 11 Flüssigkeit ab, welche Brenztraubensäure, Alpha-Ketoglutarsäure und andere Produkte enthält. Man gewinnt die in dieser Flüssigkeit anwesende Brenztraubensäure durch den Kontakt mit einem Ionenaustauscherharz vom Typ quartären Ammoniums, wie dem Harz Duolite A162, und man führt die Flüssigkeit und die Zellen durch die Leitung 13 wieder in den Fermenter 1 zurück.
Nach 90 h der Kultur bestimmt man die Konzentrationen der Zellen, der Brenztraubensäure und der Alpha-Ketoglutarsäure des Kulturmilieus. Im Folgenden ist ein Beispiel eines erhaltenen Ergebnisses:
- Brenztraubensäure :40,63 g/l,
- Alpha-Ketoglutarsäure : 5,90 g/l,
- Zellen : 6,0 g/l.
Man bemerkt dann, daß die Tatsache, in diesem Abschnitt c) einen pH-Wert von 4 anstelle eines pH-Werts von 5 und eine Kulturmilieu, das weder Thiamin noch Feb-Ionen und keinen Fleischextrakt umfaßt, es ermöglicht, die Herstellung von Brenztraubensäure zu erhöhen, während die Herstellung von Alpha-Ketoglutarsäure sinkt und die Menge der Zellen in dem Kulturmilieu auf einem praktisch konstanten Wert zu halten.
In Fig. 2 hat man die Änderungen der Konzentration (in g/l) der Brenztraubensäure (Kurve I), der Alpha-Ketoglutarsäure (Kurve II) und der Zellen (Kurve III) des Kulturmilieus in Abhängigkeit von der Dauer der Kultur (in Stunden) dargestellt, die unter den vorher beschriebenen Bedingungen mit dem Wechsel des Milieus und des pH-Werts nach 90 h ausgeführt wird.
In dieser Figur sieht man, daß die Herstellung von Brenztraubensäure und von Alpha-Ketoglutarsäure zu Beginn der Kultur genau dieselbe ist, also in Abschnitt a) bei pH 5, und daß ab dem Wechsel des pH-Werts und des Milieus, das heißt in Abschnitt c) bei pH 4, die Herstellung von Brenztraubensäure viel stärker steigt als die Herstellung von Alpha-Ketoglutarsäure. Die Herstellung der Candida-Zellen steigt in Abschnitt a) bis zum Wechsel des pH-Werts und des Milieus und sie wird etwas später nach dem Wechsel des Milieus konstant.
Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es also, die Herstellung von Brenztraubensäure bezüglich der von Alpha- Ketoglutarsäure zu erhöhen, und es ist daher für eine Nutzung in industriellem Rahmen interessant.
In der folgenden Tabelle hat man die Kohlenstoffbilanz während der Herstellung der Zellen (Abschnitt a) und während der Herstellung der Brenztraubensäure (Abschnitt c) dargestellt. TABELLE C-BILANZ Abschnitt Abschnitt Glucose Zellen Brenztraubensäure Alpha-Ketoglutarsäure CO&sub2; (und andere)
Hinsichtlich dieser Ergebnisse stellt man fest, daß, obwohl man in Abschnitt c) zweimal mehr Kohlenstoff hat, die Herstellung von Alpha-Ketoglutarsäure geringer ist als in Abschnitt a). Im Gegensatz dazu ist der Wirkungsgrad der Biokonversion von Brenztraubensäure offensichtlich in Abschnitt c) wesentlich größer als in Abschnitt a).
In einer anderen Versuchsreihe hat man das Kulturmilieu von Abschnitt c) verwendet und man hat eine Biokonversion unter denselben Bedingungen wie den vorher für Abschnitt c) beschriebenen für 90 h durchgeführt, aber indem man pH-Werte von 3 bis 9 verwendet hat. Am Ende des Vorgangs hat man jedes Mal die Konzentrationen an Brenztraubensäure und an Alpha-Ketoglutarsäure des Kulturmilieus bestimmt.
Fig. 3 bildet die erhaltenen Ergebnisse ab. In dieser Figur hat man auf der Ordinate die Mengen der hergestellten Brenztraubensäure (in Gramm pro Gramm eingeführter Glucose) und die Mengen der hergestellten Alpha-Ketoglutarsäure (in Gramm pro Gramm eingeführter Glucose) angetragen. Die Kurve IV bezieht sich auf die Brenztraubensäure und die Kurve V bezieht sich auf die Alpha-Ketoglutarsäure.
In dieser Figur sieht man, daß die Herstellung von Brenztraubensäure bei pH 4 durch ein Maximum geht. Im Gegensatz dazu geht die Kurve V, die sich auf die Herstellung von Alpha-Ketoglutarsäure bezieht, bei pH 5 durch ein stark ausgeprägtes Maximum und bei pH 4 durch ein Minimum.
Also ermöglicht es in der Erfindung die Verwendung eines pH-Werts gleich 4 für die Herstellung von Brenztraubensäure, die Herstellung von Alpha-Ketoglutarsäure zu beschränken. Im Gegensatz dazu ist es für die Herstellung von Zellbiomasse, was Abschnitt a) des Verfahrens der Erfindung entspricht vorzuziehen, sich bei einem pH-Wert von ungefähr 5 zu befinden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Brenztraubensäure durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß es darin besteht,

1º) - Zellen der Gattung Candida in einem Kulturmedium, das eine Quelle für Kohlenstoff, eine Quelle für Stickstoff, Thiamin und Mineralsalze enthält, bei einem pH von 4,5 bis 5,5 unter aeroben Bedingungen zu kultivieren,

2º) - die so erzeugten Zellen vom Kulturmedium zu trennen,

3º) - diese Zellen im einem Medium zur Biokonversion, das eine Quelle für Kohlenstoff und mineralische Elemente enthält, bei einem pH von 3,5 bis 4,5 unter aeroben Bedingungen zu kultivieren und

4º) - die erzeugte Brenztraubensäure vom Kulturmedium zu extrahieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium zur Biokonversion kein Thiamin und kein Eisen enthält.

3. Verfahren nach einem dem Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Biokonversion bei einem pH von ungefähr 4 durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkonzentration des Biokonversionsmediums zu Beginn der Kultur mindestens 5 g/l ist.

5. Verfahren zur Herstellung von Brenztraubensäure durch Fermentation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es nacheinander die folgenden Schritte umfaßt:

a) - Erzeugung von Zellen der Gattung Candida durch aerobe Kultur in einem Kulturmedium, das zu Beginn wenigstens 0,2 g/l Zellen, die Quellen für Kohlenstoff und für Stickstoff, die für die Entwicklung der Zellen nötigen Mineralsalze und Thiamin enthält, bei einem pH von 4,5 bis 5,5 bis zum Erhalt einer Zellkonzentration im Kulturmedium von wenigstens 5 g/l,

b) - Abtrennen und Waschen der in Schritt a) erzeugten Zellen,

c) - aerobe Kultur der in Schritt b) abgetrennten Zellen in einem Kulturmedium, das eine Quelle für Kohlenstoff und Mineralsalze umfaßt, das aber weder Thiamin noch Eisen enthält, bei einem pH von 3,5 bis 4,5 mit einer Zellkonzentration im Biokonversionsmedium zu Beginn der Kultur von mindestens 5 g/l und

d) - Extrahieren der Brenztraubensäure vom Kulturmedium.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH im ersten Schritt a) ungefähr 5 ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß der pH im Schritt c) ungefähr 4 ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Abtrennen und das Waschen der in Schritt a) erzeugten Zellen durch Ultrafiltration und Diafiltration geschieht.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Waschmedium das im Schritt c) verwendete Kulturmedium ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Brenztraubensäure von den Zellen durch Ultrafiltration abgetrennt wird und anschließend die Brenztraubensäure von der α-Ketoglutarsäure durch Zusammenbringen mit einem Ionenaustauscherharz abgetrennt wird.