DE3780770T2

DE3780770T2 - Therapeutisches gemisch aus einem faenger von freien radikalen oder einem stoffwechsel-hemmer und einem biologisch aktiven protein.

Info

Publication number: DE3780770T2
Application number: DE8787117149T
Authority: DE
Inventors: Marafino, Jr; Robert Zimmermann
Original assignee: Cetus Oncology Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1986-11-21
Filing date: 1987-11-20
Publication date: 1993-02-25
Anticipated expiration: 2007-11-21
Also published as: EP0269017A2; ES2042529T3; GR3005314T3; EP0269017A3; CA1321349C; ES2042529T4; DE3780770D1; JPS63190831A; EP0269017B1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Mittel, das für die Verabreichung an Säugerwirte als therapeutische Formulierung geeignet ist. Insbesondere betrifft diese Erfindung eine Kombinationstherapie gegen eine körperliche Schädigung durch freie Radikale unter Verwendung eines Lymphokins oder Cytotoxins, wie z. B. des Tumornekrose-Faktors (TNF), und eines biologischen Modifikators, bestehend entweder aus einem oder mehreren Fängern freier Radikale, die gegen die Schädigung schützen, die durch die Erzeugung freier Radikale verursacht wird, oder die selektiv die Empfänglichkeit eines Tumors gegenüber der Schädigung durch Radikale erhöhen, indem dessen Leistungsfähigkeit zum Abfangen freier Radikale erschöpft oder vermindert wird, oder einem Hemmstoff des Cyclooxygenase- und/oder des Lipoxygenase-Weges des Arachidonsäure- Stoffwechsels.
Lymphokine und Cytotoxine, wie z. B. Interleukin-2, Alpha-Interferon, Gamma-Interferon, koloniestimulierender Faktor und Tumornekrose-Faktor, sind Proteine, die von T- Zellen und/oder Makrophagen bei Aktivierung durch Antigene oder Lectine ausgeschieden werden. Interleukin-2 (IL-2), ein Lymphokin, das durch normale periphere Blutlymphocyten hergestellt wird und die Proliferation von Antigen- oder Mitogen-stimulierten T-Zellen nach Pflanzenlektin-, Antigen- Exposition oder Exposition anderer Stimuli induziert, wurde erstmals von Morgan, D.A. et al., Science (1976) 193: 1007-1008, beschrieben. Damals wurde es wegen seiner Fähigkeit, die Proliferation von stimulierten T-Lymphocyten zu induzieren, T-Zellen-Wachstumsfaktor genannt, nun hat man erkannt, daß es zusätzlich zu seinen Wachstumsfaktor-Eigenschaften verschiedenartige Funktionen von Zellen des Immunsystems in vitro und in vivo moduliert, und man hat es in Interleukin-2 (IL-2) umbenannt. IL-2 ist eines von mehreren von Lymphocyten produzierten, regulatorischen Messenger-Molekülen, die Immunzellen-Wechselwirkungen und -Funktionen vermitteln.
Der Tumornekrose-Faktor (TNF) wurde erstmals von Carswell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1975) J7:3666- 3670, als ein Endotoxin-induzierter Serumfaktor beschrieben, der Nekrose von chemisch transformierten Tumorzellen verursacht, wenn sie in Mäusen wachsen. Menschlicher TNF ist bekanntermaßen cytotoxisch gegenüber neoplastischen Zellen und wurde in rekombinanter Form hergestellt. Vgl. Pennica et al., Nature (London) (1984) 312:724-729, und Shirai et al., Nature (London) (1985) 313:803-806, Wang et al., Science (1985) 228:149-154.
Interferone (IFN) bilden eine Gruppe von natürlich vorkommenden Proteinen, die bekanntermaßen antivirale, Antitumor- und immunoregulatorische Eigenschaften aufweisen. Zwei Typen von IFN sind aufgrund von Unterschieden in den beobachteten biologischen Eigenschaften und Molekülstrukturen identifiziert worden: Typ I und Typ II. Beta-Interferon (IFN-β) ist ein Typ-I-IFN, das in Fibroblasten durch Virusexposition induziert werden kann und etwa 165 Aminosäuren enthält. IFN-α ist auch ein Typ-I-IFN, das in Leukocyten induzierbar ist, und IFN-γ ist ein Typ-II-IFN, das in Lymphocyten als Antwort auf spezifische mitogene Stimuli induziert wird und 146 Aminosäuren enthält.
Zur Behandlung von malignen Tumoren beim Menschen wird in Forschung und Klinik allgemein eine Kombinationschemotherapie mit zwei oder mehr Antikrebsmitteln eingesetzt. Die Antikrebsmittel können Antimetabolite, alkylierende Mittel, Antibiotika, allgemeine Gifte usw. sein. Arzneistoffkombinationen werden als Versuch verabreicht, um eine synergistische cytotoxische Wirkung für die meisten Krebsarten zu erhalten, z. B. Carcinome, Melanome, Lymphome und Sarcome, und um das Auftreten von Arzneistoff-resistenten Zellen zu verringern oder zu verhindern sowie um die Nebenwirkungen jedes Arzneistoffs zu verringern.
Beispielsweise ist bekannt, daß IL-2 zusammen mit IFN-γ verwendet werden kann, um tumortragende Wirte zu behandeln, wobei synergistische Ergebnisse erhalten werden [EP-A-0149551, veröffentlicht am 24. Juli 1985 (Genentech), und DE-A-3411184, veröffentlicht am 31. Oktober 1985 (Deut. Rotes Kreuz)] oder eine Steigerung der natürlichen Killer-Aktivität auftritt [Svedersky et al., J. Immunol. (1984), 133:714- 718, und Shalaby et al., J. Interferon Res. (1985), 5:571- 581]. Außerdem offenbart die US Statutory Invention Reg.-Nr. H22, veröffentlicht am 4. Februar 1986, von Creasey et al., ein Mittel, das in der Kombinationstherapie bestimmter Brustkrebs- und Myeloma-Zellinien eine synergistische cytotoxische Wirkung aufweist, wobei synergistisch wirksame Mengen von 5-Fluoruracil und menschlichem rekombinantem Beta-Interferon verwendet werden. Ferner ist bei Verwendung von IFN-γ in Kombination mit TNF und Chemotherapeutika eine verstärkte Antitumor-Aktivität beobachtet worden, Svedersky et al., Internl. J. of Immunopharm. (1985) 1:330.
Ein besseres Verständnis des Wirkungsmechanismus von verschiedenen Lymphokinen und Cytotoxinen und der Grundlage der Empfindlichkeit von Tumorzellen gegenüber solchen Proteinen würde die klinische Forschung und die Planung von klinischen Studien über diese Arzneimittel erleichtern. Beispielsweise hat sich gezeigt, daß TNF, das hauptsächlich von Makrophagen hergestellt wird, in seiner cytotoxischen oder cytostatischen Wirkung für viele Tumorzellen, nicht aber für normale Zellen, deutlich selektiv ist. Vgl. z. B. Carswell et al., a.a.O., Wang et al., a.a.O., Ruff und Gifford in Lymnhokines, Bd.2, Hrsg. Pick, E. (Academic Press, Inc., NY, NY, 1981), S. 235-272, Beutler und Cerami, Nature (1986) 320:584-588, und Urban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:5233-5237, und die darin zitierten Referenzen. Es ist bekannt, daß die Grundlage für dieses selektive Abtöten von Tumorzellen nicht auf dem Fehlen von Rezeptor beruht, da TNFr-Zellen, wie z. B. menschliche diploide Fibroblasten, eine ausreichende Zahl von hochaffinen Rezeptoren aufweisen, TNF aufnehmen und ihn in offensichtlich gleicher Art und Weise wie TNFs-Zellen abbauen, Tsujimoto, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:7626-7630.
Interleukin-1 alleine weist in einem Modell einer durch freie Radikale bedingten Gewebeschädigung eine schützende Wirkung auf, Neta et al., J. Immunol. (1986) 136:2483-2485. Außerdem ist gefunden worden, daß TNF-α und IFN-γ die Freisetzung von Superoxid durch Neutrophile von normalen Patienten und von Patienten mit chronischer Granulomatose-Erkrankung induzieren, Palladino et al., Clin. Res. (1986) 34:502, und Palladino et al., Ped. Res. (1986) 20:302.
Die biologische Wirkung sowohl von freien Sauerstoff-Radikaltypen als auch von verwandten mehrfach ungesättigten Fettsäure-Lipid-Peroxidationsprodukten ist eindeutig nachgewiesen worden. Beispielsweise ist gefunden worden, daß die Erzeugung von reaktiven Radikaltypen an den cytotoxischen Effekten ionisierender Strahlung [vgl., z. B., Petkau, Acta. Physiol. Scand. Suppl. (1980) 492:81-90, und Biaglow et al., Radiat. Res. (1983) 95:437-455], verschiedenen Chemotherapeutika [vgl., z. B., Tomasz, Chem. Biol. Interact. (1976) 13:89-97, Lown und Sim, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1977) 77:1150-1157, und Borek und Troll, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:1304-1307] und an verschiedenen anderen biologischen Prozessen, einschließlich Alterung, und Stadien der Initiierung und Förderung experimenteller Carcinogenese beteiligt ist [vgl., z. B., DiGuiseppi und Fridovich, CRC Crit. Rev. Toxicol. (1984) 12:315-342, und Slater, Biochem. J. (1984) 222:1-15]. Die Erzeugung und Freisetzung von reaktiven freien Radikalen im respiratorischen Burst-Phänomen, das von verschiedenen Zellen des Immunsystems angewendet wird, ist ein wohlbekannter Mechanismus zur Zerstörung eines fremden Ziels. Vgl., z. B., Bus und Gibson in Rev. Biochem. Toxicol., Hrsg. Hodgson et al. (Elsevier, North Holland, 1979), S. 125-149, und Badwey und Karnovsky, Ann. Rev. Biochem. (1980) 49:695-726.
Bei Aerobiern sind sowohl auf zellulärer Ebene als auch auf Organismen-Ebene verschiedene Mechanismen zum Abfangen von Radikalen entstanden, die vor möglicherweise letalen reaktiven Sauerstofftypen schützen, wie z. B. dem Hydroxylradikal, Superoxidanion und Wasserstoffperoxid. Vgl., z. B., DiGuiseppi und Fridovich, a.a.O., Slater, a.a.O., und Bus und Gibson, a.a.O.. Wesentlich ist, daß Sauerstoffradikale längerlebige Kettenreaktionen der Lipid-Peroxidation auslösen können, die sich von Zelle zu Zelle fortpflanzen können. Diese Peroxidationsprodukte sind befähigt, zelluläre DNA, RNA, Protein und zelluläre Phospholipide zu schädigen. Vgl., z. B., Slater, a.a.O., Bus, a.a.O., Moody und Hassan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:2855-2859, Lesko et al., Biochemistry (1980) 19:3023-3028, und Cerutti et al. in Genes and Proteins in Oncogenesis (Academic Press, NY, 1983), S. 55-67. Die zellulären Schutzmechanismen gegen diese Art von Schädigung umfassen Antioxidantien und Radikalfänger sowohl in der Lipidphase (z. B. α-Tocopherol, β-Carotin) als auch in der wässerigen Phase (z. B. Glutathion und Ascorbinsäure) der Zellen, außerdem Enzyme, wie z. B. Superoxid-Dismutase und Katalase. Vgl., z. B., Fridovich, Science (1978) 201:875-880, und Meister und Anderson, Ann. Rev. Biochem. (1983) 52:711-760. Außerdem ist gezeigt worden, daß der bei Menschen gefundene hohe Harnsäure-Spiegel im Plasma ein wichtiger Schutzfaktor gegen Radikale ist. Ames et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:6858-6862.
Glutathion (GSH) und verwandte zelluläre Sulfhydryl-Verbindungen stellen einen der Hauptmechanismen der Entgiftung von elektrophilen Metaboliten aus Fremdstoffen und Sauerstoff/Lipid-Radikaltypen dar, Meister und Anderson, a.a.O.. Es wird postuliert, daß bestimmte Strahlenschutzmittel, wie z. B. die Fänger freier Radikale Cystein und GSH, wirken, indem sie freie Radikale hemmen. Wenn Zellen Sauerstoff-erzeugenden Verbindungen oder einem anderen oxidativen Streß ausgesetzt werden, wird GSH oxidiert, so daß es eine Dithio-Gruppe enthält und gemischte Protein-Disulfide entstehen. Vgl. Adams et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (1983) 227:749-754. Aus diesem Grund ist der Gehalt an oxidiertem GSH ein wichtiger Indikator entweder für die Art der Schädigung, die auf die Zelle eingewirkt hat, oder für deren Fähigkeit, sich vor der oxidativen Schädigung selbst zu schützen. Es wurde gezeigt, daß Buthioninsulphoximin ein Hemmstoff der GSH-Biosynthese ist. Vgl. Minchinton et al., Int J. Radiation Oncology Biol. Phys. (1984) 10:1261-1264.
Ein Protein, genannt Monocyten-Zellinie-Cytotoxin (MCCT), wurde charakterisiert und die Hemmwirkung verschiedener Protease-Hemmstoffe und Wasserstoffperoxid-Fänger auf die MCCT-Aktivität untersucht, Armstrong et al., J.N.C.I. (1985) 74:1-9. Außerdem wurde gefunden, daß verschiedene Hydroxyl-Radikal-Fänger die Herstellung eines Lymphotoxins hemmten. Vgl. Kobayashi et al., J. Biochem. (Tokyo) (1984) 95:1775-1782. Schließlich ist gezeigt worden, daß Methisoprinol, ein Purin-Derivat, die Herstellung von Lymphotoxin, das ein Lymphokin ist, steigert, Morin und Ballet, Allergol. Immunopathol. (1982) 10:109-114.
Marcus et al., Cancer Research, 47:4208-4212 (1987), beschreiben die Verwendung von Vitamin C und IL-2.
Arrick et al., J. Clin. Invest., 71:258-267 (1983), beschreiben, daß die Hemmung der Glutathion-Synthese [z. B. durch Buthioninsulfoximin (BSO)] die Lyse von Tumorzellen durch antineoplastische Mittel steigert.
Romine und Kessel, Biochem. Pharmacol. (UK) (1986) 35:3323-3326, beschreiben die Rolle von intrazellulärem Glutathion als Determinante für die Reagibilität gegenüber Antitumor-Arzneistoffen.
Ono et al., Br. J. Cancer (UK) (1986) 54:749-754, beschreiben die kombinierte Wirkung von BSO und Cyclophosphamid auf murine Tumoren und Knochenmark.
Hamilton et al., Biochem. Pharmacol. (15. Juli 1985) 34:2583-2586, beschreiben die Steigerung der Cytotoxizität von Adriamycin, Melphalen und Cisplatin in Arzneistoff-resistenten und Arzneistoff-empfindlichen Carcinom-Zellinien durch Verwendung von BSO.
Andrews et al., Cancer Res. (Dez. 1985) 45:6250-6253, beschreiben die differentielle Potenzierung der Cytotoxizität von alkylierenden und platinierenden Mitteln in menschlichen Ovarcarcinomzellen durch Glutathion-Verarmung.
Russo et al., Cancer Res. (Juni 1986) 46:2845-2848, beschreiben die selektive Modulierung von Glutathion-Spiegeln in menschlichen Normalzellen im Vergleich zu Tumorzellen und die differentielle Antwort auf Chemotherapeutika.
Tew et al., Cancer Treatment Rep. (Juni 1986) 70:715- 720, beschreiben die Beziehung von Glutathion-Verarmung und antimitotischen Eigenschaften von Estramustin.
Russo et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. (Aug. 1986) 12:1347-1354, beschreiben die Rolle von intrazellulärem Glutathion in der antineoplastischen Chemotherapie.
Dorr et al., Invest. Hew Drugs (1986) 4:305-313, beschreiben die cytotoxischen Effekte der Hemmung der Glutathion-Synthese durch BSO auf menschliche und murine Tumorzellen.
Green et al., Cancer Res. (Nov. 1984) 44:5427-5431, beschreiben, daß die Inkubation von Zellen in Gegenwart von 850 zu einer deutlich gesteigerten (synergistischen) Melphalan-Cytotoxizität führte, und Oxols, Semin. Oncol. (Sept. 1985) 12:7-11, beschreibt, daß BSO die Cytotoxizität von Melphalan und Cisplatin steigert.
Oxols et al., Dev. Oncol. (1986) 47:277-293, beschreiben die Wirkung von BSO auf die Wirksamkeit von Antitumor-Arzneistoffen.
Crook et al., Cancer Res. (1986) 46:5035-5038, beschreiben, daß BSO die Cytotoxizität von Cyclophosphamid steigert. Hodgkiss et al., Biochem. Pharmacol. (1985) 34:2175-2178, beschreiben die Verwendung von BSO zur Steigerung der Cytotoxizität von nitroaromatischen Verbindungen. Somfai-Relle et al., Biochem. Pharmacol. (1984) 33:485-490, beschreiben, daß murine Tumorzellen durch BSO gegenüber LPhenylalanin-Lost empfindlich werden.
EP-A-0177342 offenbart pharmazeutisch verträgliche Zubereitungen, die für die Verabreichung bestimmter amphophiler Proteine in Kombination mit lipophilen Trägern und Mitteln, welche die Absorption im Gastrointestinaltrakt steigern, in oraler Dosierungsform entwickelt wurden. Diese Zubereitungen umfassen keine biologischen Modifikatoren, wie z. B. Fänger freier Radikale oder Stoffwechsel-Hemmstoffe.
Demgemäß beruht die vorliegende Erfindung auf dem Befund, daß der therapeutische Index eines Lymphokins oder Cytotoxins in in-vitro- und in-vivo-Systemen gesteigert werden kann, indem der Wirt gleichzeitig oder unabhängig davon mit einem Fänger freier Radikale, wie z. B. einem Strahlenschutzmittel oder einem Stoffwechsel-Hemmstoff, in solchen Mengen behandelt wird, daß die Wirksamkeit des Lymphokins oder Cytotoxins erhöht und/oder die Toxizität des Lymphokins oder Cytotoxins vermindert wird.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Mittel, das geeignet ist für die Verabreichung an Säugerwirte zur therapeutischen und prophylaktischen Behandlung einer biologischen Schädigung der Säugerwirte, die durch die Erzeugung freier Radikale verursacht wird, wobei das Mittel ein Gemisch in pharmakologisch wirksamen Mengen aus mindestens einem Lymphokin oder Cytotoxin einer Säugerart und mindestens einem biologischen Modifikator umfaßt, der ausgewählt ist aus einem Fänger freier Radikale oder einem Stoffwechsel-Hemmstoff.
Das Lymphokin oder Cytotoxin ist vorzugsweise der Tumornekrose-Faktor oder Interleukin-2 und der Fänger freier Radikale oder Stoffwechsel-Hemmstoffist vorzugsweise Harnsäure, Buthioninsulphoximin, Vitamin C, Indomethacin, Ibuprofen, N-Acetylcystein oder Aspirin.
Man vermutet, ohne sich auf eine beliebige Theorie beschränken zu wollen, daß die Empfindlichkeit von geschädigten Zellen, wie z. B. tumorösen, infizierten oder bestrahlten Zellen, gegenüber einem Lymphokin oder Cytotoxin, wie z. B. TNF, von der Fähigkeit abhängt, freie Radikale abzufangen. Außerdem wird vermutet, daß die Aktivierung der Arachidonsäure-Kaskade möglicherweise am Wirkungsmechanismus des Lymphokins oder Cytotoxins beteiligt ist, wobei die Lipid-Peroxidation stattfinden kann und andere damit zusammenhängende Radikaltypen und außerdem die biologisch aktiven Stoffwechselprodukte des Lipoxygenase- und Cyclooxygenase- Stoffwechsels erzeugt werden können.
Der hier verwendete Begriff "Lymphokin" bezeichnet Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, die von T-Zellen und/oder Makrophagen ausgeschieden werden, wenn Antigene oder Lectine das Wachstum oder die Aktivierung von T-Zellenoder Makrophagen stimulieren. Der Begriff "Cytotoxin" bezeichnet ein beliebiges Protein, das Effektorzellen aktiviert, die fremde Stoffe, wie Pathogene,in der Zelle abtöten. Beispiele solcher Lymphokine und Cytotoxine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Interferone [z. B. Alpha-Interferon (IFN-α), Beta-Interferon (IFN-β) und Gamma-Interferon (IFN-γ)], Interleukine [z. B. Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-3 (IL-3) und Interleukin-4 (IL-4)], Tumornekrose-Faktor-alpha (TNF-α), Tumornekrose- Faktor-beta (TNF-β) (auch Lymphotoxin genannt), einen koloniestimulierenden Faktor (z. B. CSF-1, CSF-G oder CSF-GM), Chemotaxine, Migrationshemmfaktor (MIF), Makrophagenaktivierungsfaktor (MAF), NK-Zell-Aktivierungsfaktor, T-Zell- Ersatzfaktor, Leukocytenhemmfaktor (LIF), andere Lymphotoxine, Osteoklastenaktivierungsfaktor (OAF), löslichen Immunantwort-Suppressor (SIRS), wachstumstimulierenden Faktor und einen Monocyten-Wachstumsfaktor. Vorzugsweise ist das Lymphokin oder Cytotoxin ein Interleukin (stärker bevorzugt IL-2), ein Interferon (stärker bevorzugt IFN-β), TNF-α oder -β, oder ein koloniestimulierender Faktor (stärker bevorzugt CSF-1). Am stärksten bevorzugt ist hier TNF-α.
Der hier verwendete Begriff "rekombinant" bezeichnet Lymphokine oder Cytotoxine, die durch DNA-Rekombinations- Techniken hergestellt werden, wobei im allgemeinen das für das Lymphokin oder Cytotoxin codierende Gen durch bekannte DNA-Rekombinations-Technologie cloniert wird. Beispielsweise wird unter Verwendung der menschlichen Lymphokin- oder Cytotoxin-cDNA als Matrize das Gen, das zu der menschlichen Lymphokin- oder Cytotoxin-cDNA komplementär ist, in einen geeigneten DNA-Vektor, wie z. B. ein bakterielles Plasmid, vorzugsweise ein E. coli-Plasmid, eingefügt, wodurch ein rekombinantes Plasmid erhalten wird, und das Plasmid zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet. Das Gen wird im Wirt exprimiert, wobei das rekombinante Protein erzeugt wird. Beispiele rekombinanter Plasmide, die für diesen Zweck geeignet sind, umfassen pBR322, pCR1, pMB9 und pSC1. Der transformierte Wirt kann eukaryotisch oder prokaryotisch sein, vorzugsweise handelt es sich um einen prokaryotischen Wirt.
Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch verträglich" bezeichnet ein Trägermedium, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität der Wirkstoffe nicht beeinträchtigt und das für den Wirt, dem es verabreicht wird, nichttoxisch ist.
Der hier verwendete Begriff "prophylaktische oder therapeutische" Behandlung bezeichnet die Verabreichung des Lymphokins (der Lymphokine) oder des Cytotoxins (der Cytotoxine) und des (der) biologischen Modifikators (Modifikatoren) an den Wirt entweder vor oder nach Beginn der biologischen Schädigung des Wirts. Wenn das (die) Lymphokin(e) oder Cytotoxin(e) und der (die) biologische(n) Modifikator(en) vor Exposition des Mittels verabreicht werden, das die biologische Schädigung verursacht, ist die Behandlung prophylaktisch (d. h. sie schützt den Wirt vor der Schädigung), wenn sie dagegen nach Exposition des Mittels, das die Schädigung verursacht, verabreicht werden, ist die Behandlung therapeutisch (d. h. sie schwächt die vorliegende Schädigung ab). Der Verabreichungsplan und die Dosierung hängt z. B. vom Wirtstyp, von der Erkrankung, dem Lymphokin oder Cytotoxin und dem biologischen Modifikator ab. Sofern die biologische Schädigung durch Infektion verursacht wird, werden die Dosen vorzugsweise von 18 Stunden vor der Infektion, bei prophylaktischer Behandlung und in der frühen Phase der Infektion bei therapeutischer Behandlung, bis zu 18 Stunden nach der Infektion in der späteren Phase der Infektion bei therapeutischer Behandlung verabreicht.
Wenn es sich bei der biologischen Schädigung um Krebs handelt, wird die Behandlung dann nicht als therapeutisch beurteilt, wenn nach der Behandlung ein Tumor auftritt oder wenn ein vorliegendes Tumorleiden nicht geheilt oder gebessert wird. Die Wirkung der Dosen nimmt mit der Zeit ab, die Dosis kann an Menschen aber monatelang oder sogar jahrelang verabreicht werden. Die prophylaktische Behandlung von Krebs bezieht sich auf die Verabreichung, nachdem der Patient gegen Krebs behandelt worden ist, um das Wiederauftreten von Krebs zu verhindern.
Die hier verwendete Bezeichnung "biologische Schädigung des Wirts, die durch Erzeugung freier Radikale verursacht wird", bezieht sich auf eine beliebige zelluläre, Gewebeoder andere Schädigung von Körperteilen oder -funktionen, die der Wirt als Wirkung der im Körper des Wirts erzeugten freien Radikale erleidet. Die freien Radikale können zur direkten Mobilisierung der Arachidonsäure-Stoffwechselwege führen oder sie können die Lipid-Peroxidation auslösen, wodurch die Arachidonsäure mobilisiert wird. Diese Radikale können als Mechanismus zum Abtöten von Zellen erzeugt werden. Beispiele, die eine solche Schädigung verursachen können, umfassen Hyperthermie, die während der Krebsbehandlung auftreten kann, wenn die Temperatur des Tumors mittels lokaler oder allgemeiner Mikrowellenbestrahlung erhöht wird, die Schädigung, die durch Chemotherapeutika (Chemotherapie), Bestrahlungstherapie oder hohen Sauerstoffdruck verursacht wird, wobei Radikale erzeugt werden, um Zellen abzutöten, sowie Infektion. Außerdem können behandelte Tumorzellen dazu beitragen, die Schädigung durch Radikale auszubreiten. Ein Beispiel für hohen Sauerstoffdruck ist der Zustand, der eintritt, wenn Frühgeburten einem hohen Sauerstoffdruck ausgesetzt werden, was zu Erkrankungen von Retina und Lunge führt. Andere Zustände, die eine durch die Erzeugung freier Radikale verursachte Schädigung zeigen, müssen auch in Betracht gezogen werden und fallen unter diese Definition.
Der in der vorstehenden Definition verwendete Begriff "Krebs" bezeichnet eine beliebige neoplastische Störung, umfassend solche zelluläre Störungen, wie z. B. Nierenzellkrebs, Kaposi-Sarkom, chronische Leukämie, Brustkrebs, Sarkom, Ovarcarcinom, Rectumkrebs, Kehlkopfkrebs, Melanom, Colonkrebs, Blasenkrebs, Mastocytom, Lungenkrebs und Gastrointestinal- oder Magenkrebs. Vorzugsweise ist der Krebs Colonkrebs, Melanom, Nierenzellkrebs, Sarkom, Lungenkrebs, Adenocarcinom oder Brustkrebs.
Der in der vorstehenden Definition verwendete Begriff "Infektion" bezeichnet eine beliebige pathogene Erkrankung, umfassend diejenigen, die durch Bakterien, Pilze, Viren, Protozoen oder Parasiten verursacht werden. Beispiele bakterieller Infektionen umfassen P. aeruginosa, E. coli, Tetanus, Mycobacterium-Arten, Streptococcus-Stämme, Diphtheria und Salmonella. Beispiele von Pilz-Infektionen umfassen Cryptococcosis, Histoplasmosis und andere Infektionen, die auf Candida-Arten zurückzuführen sind. Beispiele von Virus- Infektionen umfassen Hepatitis A, rezidivierenden Herpes simplex, AIDS, Herpes zoster, Influenza und Rhinoviren. Vorzugsweise handelt es sich bei der Infektion um eine bakterielle Infektion, stärker bevorzugt um eine gramnegative Infektion und am stärksten bevorzugt um eine P. aeruginosaund E. coli-Infektion.
Der hier verwendete Begriff "biologischer Modifikator" bezeichnet ein oder Zwei Verbindungen: einen Fänger freier Radikale oder einen Stoffwechsel-Hemmstoff. Der Begriff "Fänger freier Radikale" bezeichnet eine beliebige Verbindung oder Substanz, die einen Säugerwirt vor der durch die Erzeugung freier Radikale verursachten biologischen Schädigung schützt. Diese Definition schließt sowohl diejenigen Mittel ein, die durch ein direktes Abfangen von Radikalen wirken, als auch diejenigen, die wirken, indem sie die Fähigkeit des Wirts und/oder Tumors zum Abfangen der Radikale verändern. Jeder der beiden Mechanismen beeinträchtigt die Antwort des Wirts auf das Lymphokin oder Cytotoxin. Solche Fänger freier Radikale können Strahlenschutzmittel sein und umfassen Verbindungen, wie z. B. Harnsäure, Buthioninsulfoximin, Maleinsäurediethylester, Vitamin E, Vitamin C, Cystein wie N-Acetylcystein oder Glutathion, Metronidazol und ein Retinoid, wie z. B. Vitamin A. Während Maleinsäurediethylester die Toxizität des Lymphokins oder Cytotoxins steigern kann, reduziert es außerdem Glutathion vorzugsweise im Tumor im Vergleich zum Wirt und sollte daher zu einem erhöhten therapeutischen Index führen. Eine beliebige Kombination dieser Modifikatoren kann angewendet werden. Am stärksten bevorzugt ist der hier bei Menschen verwendete Fänger freier Radikale Buthioninsulphoximin, Vitamin C, Vitamin E oder N-Acetylcystein [das letztere hat den Handelnamen Mucomyst (Mead Johnson)]. Vgl. Physician's Desk Reference, 1987, Ausg. 41, Barnhart, Verl., Oradell, N.
J.: Medical Economics Company, Inc. Harnsäure verursacht beim Menschen Gicht, also kann sie in kleineren Mengen toleriert werden; sie kommt in der Natur im menschlichen Plasma mit etwa 300 uM vor; man nimmt an, daß Menschen etwa 600 bis 1500 uM tolerieren können.
Der zweite Typ des biologischen Modifikators, ein "Stoffwechsel-Hemmstoff", bezieht sich auf eine Verbindung oder Substanz, die den Cyclooxygenase- und/oder Lipoxygenase-Stoffwechselweg der Arachidonsäure-Kaskade hemmt oder blockiert, wobei Phospholipide durch Phospholipase A&sub2; oder C zu Arachidonsäure umgewandelt werden, sodann kann die Arachidonsäure in einen der beiden Stoffwechselwege eingehen. Eine solche Blockierung oder Hemmung kann ein Enzym, das einen oder beide Stoffwechselwege katalysiert, einen Zelltyp, der das Enzym enthält, oder ein oder mehrere natürliche Produkte der Stoffwechselwege betreffen. Eine Verminderung der Zahl solcher Leukotriene, Hydroperoxyeicosatetraensäure, Hydroxy- und Dihydroxyeicosatetraensäuren, Prostaglandine, Thromboxane und/oder Prostacycline, die zu der hierin definierten biologischen Schädigung führen, zeigt eine Stoffwechsel-Hemmung an.
Beispiele von Stoffwechsel-Hemmstoffen umfassen Aspirin, Indomethacin, Ibuprofen, Nordihydroguajaretsäure (4,4ma [2,3-Dimethyl-1,4-butandiyl]-bis[1,2-benzoldiol]) (NDGA), cis-8,11,14-Eicosatrien-5-insäure (ETYA) und synthetische Prostaglandine (im Gegensatz zu natürlichen Prostaglandinen) und/ oder Leukotriene, die die Wirkungen der natürlichen Stoffwechselprodukte eher auf Produktionsebene als auf Enzymebene blockieren. Aspirin, Indomethacin, Ibuprofen und ETYA blockieren den Cyclooxygenase-Weg, wobei sie die Produktion von natürlichen Prostaglandinen, Thromboxanen und Prostacyclinen hemmen. In höheren Konzentrationen blockiert Indomethacin auch die Phospholipase A&sub2;. NDGA und ETYA blockieren den Lipoxygenase-Weg, wobei sie die Erzeugung von natürlicher Hydroperoxyeicosatetraensäure, Leukotrienen und Hydroxy- und Dihydroxyeicosatetraensäuren hemmen. Die für die Verwendung zusammen mit TNF hier bevorzugten Stoffwechsel-Hemmstoffe sind Aspirin, Indomethacin oder Ibuprofen. Indomethacin ist ein nichtsteroidales Antiarrhythmikum mit lokaler entzündungshemmender Aktivität. Ibuprofen ist ein Ersatzmittel für Aspirin. Auf beide Arzneistoffe wird in Physician's Desk Reference, 1987, a.a.O., Bezug genommen.
Die hier verwendete Bezeichnung "pharmakologisch wirksame Mengen", die beim Lymphokin oder Cytotoxin und beim biologischen Modifikator angewendet wird, bezieht sich auf die Menge jeder Komponente, die im Gemisch vorliegt oder die dem Wirt verabreicht wird, die zu einer Steigerung des therapeutischen Index des Wirts führt. Der "therapeutische Index" kann für die vorliegenden Ziele mit dem Begriff Wirksamkeit (Umfang der Verminderung des Tumors oder der Infektion oder eine andere Heilung) und mit dem Begriff Toxizität für den Wirt definiert werden.
Bei nicht-menschlichen Wirten ist der therapeutische Index erhöht, wenn die Wirksamkeit mindestens um 50% gegenüber der Wirksamkeit einer Exzipient-Kontrolle (z. B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) ansteigt und das Verhältnis von durchschnittlichem Körpergewicht am Ende des Auswertungszeitraums, in dem die Wirksamkeit auftritt, zu durchschnittlichem Körpergewicht zu Beginn der Behandlung mindestens 0,90 ist (d. h. nicht mehr als 10% Körpergewichtsverlust). Das Verhältnis von durchschnittlichen Körpergewichten zeigt den Umfang der Toxizität an, wobei ein Wert von 1 für keine Toxizität steht. Bei nicht-menschlichen Wirten, die gegen Krebs behandelt werden, kann der Umfang der erreichten Wirksamkeit bestimmt werden, indem das Verhältnis von durchschnittlichem Tumorvolumen am Ende des Auswertungszeitraums, in dem die Wirksamkeit auftritt, zu durchschnittlichem Tumorvolumen zu Beginn der Behandlung gemessen wird. Eine Verminderung des Verhältnisses von mindestens 50% gegenüber der Exzipient-Kontrolle zeigt eine erhöhte Wirksamkeit an. Am stärksten bevorzugt sind diejenigen Dosen, Verabreichungspläne und Typen biologischer Modifikatoren, die zu einem durchschnittlichen Tumorvolumen-Verhältnis von zwischen 0 und 5 führen, wobei ein Wert von 0 das Optimum darstellt und eine Heilung anzeigt.
Bei menschlichen Wirten ist der therapeutische Index erhöht, wenn die Wirksamkeit bei Behandlung mit dem Lymphokin/Cytotoxin und den biologischen Modifikatoren mindestens um 50% ansteigt und die Toxizität annehmbar ist, d. h. nicht mehr als Fieber, Frösteln und/oder allgemeine Unpäßlichkeit auftritt. Bei menschlichen Wirten, die gegen Krebs behandelt werden, wird der Umfang der Wirksamkeit im allgemeinen in der Klinik bestimmt, indem die senkrecht zueinander stehenden Durchmesser der Produkte der gesamten gemessenen Erkrankung gemessen werden. Eine partielle Antwort liegt vor, wenn der Tumor in der Summe der Produkte aus den senkrecht zueinander stehenden Durchmessern der gesamten gemessenen Erkrankung um mindestens 50% schrumpft. Wenn beispielsweise ein Tumor, der senkrecht zueinander stehende Durchmesser von 10 und 10 aufweist, auf Durchmesser von 8 und 8 schrumpft, dann ist der Tumor nur von 100 auf 64 geschrumpft, was keine 50%-ige Verminderung und damit keine partielle Antwort darstellt. Wenn der Tumor jedoch von 10 und 10 auf 7 und 7 schrumpft, dann stellt dies eine partielle Antwort dar, da er von 100 auf 49 und damit um mehr als 50% geschrumpft ist.
Die Verwendung dieser Erfindung schließt die Herstellung eines Arzneimittels ein, das einem Säugerwirt, vorzugsweise einem menschlichen Wirt, in pharmakologisch wirksamen Mengen von einem oder mehreren Lymphokinen oder Cytotoxinen und einem oder mehreren biologischen Modifikatoren verabreicht werden kann. Das (die) Lymphokin(e), Cytotoxin(e) und der (die) biologische(n) Modifikator(en) können in vitro vor Verabreichung kombiniert werden oder unabhängig voneinander in beliebiger Reihenfolge oder zusammen oder gleichzeitig dem Wirt verabreicht werden, wobei eine beliebige Verabreichung des Lymphokins/Cytotoxins im allgemeinen bis zu 24 Stunden nach der Verabreichung des biologischen Modifikators stattfindet, und eine beliebige Verabreichung des biologischen Modifikators bis etwa eine Stunde nach Verabreichung des Lymphokins/Cytotoxins stattfindet. Vorzugsweise wird der biologische Modifikator vor Gabe des Lymphokins oder Cytotoxins oder zusammen mit dem Lymphokin oder Cytotoxin gegeben.
Die Verabreichung(en) kann (können) mittels einer beliebigen Technik durchgeführt werden, einschließlich der oralen, subcutanen und parenteralen Verabreichung, vorzugsweise wird parenteral oder oral verabreicht. Beispiele parenteraler Verabreichung schließen die intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre und intraperitoneale Verabreichung ein, wobei die intraperitoneale und intravenöse Verabreichung bevorzugt ist.
Die Dosis und Dosierungsvorschrift hängt hauptsächlich davon ab, ob das (die) Lymphokin(e) oder Cytotoxin(e) und der (die) biologische(n) Modifikator(en) für therapeutische oder prophylaktische Zwecke unabhängig voneinander oder als Gemisch verabreicht werden, außerdem von der Art der biologischen Schädigung und dem Wirt, dem Lymphokin- oder Cytotoxin-Typ und dem verwendeten biologischen Modifikatortyp. Die Menge muß bewirken, daß ein erhöhter therapeutischer Index wie vorstehend definiert erreicht wird. Es wird darauf hingewiesen, daß Menschen länger als die hier in den Beispielen aufgeführten Mäuse und Ratten behandelt werden, wobei die Dauer der Behandlung proportional zur Dauer des Erkrankungsprozesses und zum Wirksamkeitsgrad des Arzneistoffes ist. Die Dosen können Einzeldosen oder mehrmalige Dosen über einen Zeitraum von mehreren Tagen sein, jedoch sind Einzeldosen bevorzugt. Für die vorliegenden Ziele bedeutet ein Schutz in Höhe von mindestens 50%, daß sich bei mindestens 50% der behandelten Wirte der Zustand nach Infektion bessert, eingeschlossen, aber nicht beschränkt auf, eine verbesserte Überlebensrate, eine schnellere Genesung oder eine Verbesserung oder ein Verschwinden von Symptomen.
Bei der Behandlung von Krebs muß die Dosis im allgemeinen bewirken, daß der Tumor verkleinert oder die Aktivität der Lymphokin-aktivierten Killer(LAK)-Zellen gesteigert wird. LAK-Zellen sind lymphoide Zellen, die frische, nichtgezüchtete, gegen natürliche Killerzellen resistente Tumorzellen, nicht aber normale Zellen, lysieren können. Die Dosen können Einzeldosen oder mehrmalige Dosen sein. Wenn mehrmalige Dosen verwendet werden, wie bevorzugt, hängt die Häufigkeit der Verabreichung beispielsweise vom Typ des Wirts und vom Krebstyp, von den Dosismengen usw. ab. Bei einigen Krebstypen oder Krebslinientypen kann eine tägliche Verabreichung wirksam sein, wohingegen bei anderen eine Verabreichung jeden zweiten oder jeden dritten Tag wirksam, eine tägliche Verabreichung jedoch unwirksam sein kann. Der Praktiker kann durch Routineversuche herausfinden, welcher Verabreichungsweg und welche Verabreichungshäufigkeit in einem bestimmten Fall am wirkungsvollsten sind.
Die hier am wirkungsvollsten erscheinenden Dosismengen gegen Krebs sind diejenigen, die zu einer Rückbildung der Tumorgröße oder zu einem vollständigen Verschwinden oder Nicht-Wiederauftreten des Tumors führen, und die außerdem für den Wirtpatient nichttoxisch oder annehmbar toxisch sind. Im allgemeinen werden Zustände wie Fieber, Frösteln und allgemeine Unpäßlichkeit als annehmbar eingestuft. Zusätzlich darf die Dosis des biologischen Modifikators nicht so hoch sein, daß er die Antitumor-Aktivität des Lymphokins oder Cytotoxins hemmt. Diese optimalen Dosisspiegel hängen von vielen Faktoren ab, z. B. vom Wirtstyp, Krebstyp, Verabreichungsweg, -plan und von der Verabreichungsabfolge, vom vorliegenden Tumorleiden, vom Lymphokin- oder Cytotoxintyp und vom biologischen Modifikator sowie von der Definition der Toxizität. Toxizität kann definiert werden als Ausmaß und Art von Nebenwirkungen in menschlichen Wirten, wobei Fieber, Frösteln und allgemeine Unpäßlichkeit in der hier vorliegenden Studie als annehmbare Toxizität eingestuft werden, oder als die Größe des Körpergewichtsverlustes oder als Todesfälle bei nicht-menschlichen Wirten nach einem bestimmten Zeitabschnitt, wie vorstehend für den therapeutischen Index definiert.
Wenn TNF-α als das Lymphokin oder Cytotoxin eingesetzt wird, beträgt die Dosis beim Menschen im allgemeinen mindestens 0,24 ug/kg Patientengewicht und bei Mäusen mindestens 25 ug/kg. Als allgemeine Regel gilt, daß die an Menschen verabreichte Menge TNF-α den ungefähren oder genauen Wert darstellt, der bei Mäusen verwendet wird, wobei aber die Einheiten ug/m² anstelle von ug/kg sind. Wenn vor und/oder während des Verlaufs der Verabreichung von TNF-α an Menschen Buthioninsulphoximin in einer minimalen, zum Abfangen von Radikalen wirksamen Konzentration verabreicht wird, dann wird TNF-α vorzugsweise in einer Menge von etwa 25 bis 100 ug/m² verabreicht. Smith et al., Proceedings of AACR, 28 (März 1987), S. 440, berichten, daß bei Beagle-Hunden fünfzehn Dosen von 100 mg/kg/Dosis BSO oral alle acht Stunden relativ nichttoxisch sind, wohingegen 400 bis 800 mg/kg BSO unter solchen Verabreichungsbedingungen toxisch sind. Wenn vor der Verabreichung von TNF-α an Menschen Vitamin C in einer minimalen, zum Abfangen von Radikalen wirksamen Konzentration gegeben wird, dann wird TNF-α vorzugsweise in einer Menge von 125 ug/m² verabreicht. Wenn vor (z. B. 1 bis 4 Stunden) der Verabreichung von TNF-α an Menschen Aspirin in einer Menge von etwa 15 bis 30 mg/kg Patientengewicht gegeben wird, dann wird TNF-α vorzugsweise in einer Menge von 25 bis 100 ug/m² verabreicht. Wenn vor der Verabreichung von TNF-α an Menschen Indomethacin in einer Menge von etwa 25 bis 50 mg gegeben wird, dann wird TNF-α vorzugsweise in einer Menge von etwa 50 bis 200 ug/m² verabreicht. Wenn vor der Verabreichung von TNF-α an Menschen Ibuprofen in einer Menge von etwa 400 bis 600 mg gegeben wird, dann wird TNF-α vorzugsweise in einer Menge von etwa 150 bis 250 ug/m² Wirt verabreicht. Wenn vor der Verabreichung von TNF-α an Menschen N-Acetylcystein in einer Menge gegeben wird, die 250 bis 1000 mg/kg Rattengewicht entspricht, dann wird TNF-α vorzugsweise in einer Menge von etwa 200 bis 400 ug/m² verabreicht. Der Praktiker kann die optimalen Dosierungen und den Verabreichungsplan bestimmen, wenn Wirt, Lymphokin/Cytotoxin und biologischer Modifikator geändert werden.
Wenn IL-2 als das Lymphokin oder Cytotoxin verwendet wird, beträgt das Dosierungsniveau bei Menschen im allgemeinen mindestens etwa 3 · 106 Einheiten/m²/Tag und bei Mäusen mindestens etwa 5 bis 10 mg/kg. Wenn vor der Verabreichung von IL-2 an Menschen Vitamin C, Vitamin E, Aspirin, N-Acetylcystein, Ibuprofen oder Indomethacin gegeben wird, dann wird IL-2 vorzugsweise in einer Menge von mindestens 3 · 106 Einheiten/m²/Tag verabreicht.
Das Dosierungsniveau von CSF-1 bei Menschen ist bisher noch nicht bestimmt worden, bei Mäusen kann es jedoch im allgemeinen etwa 50 mg/kg betragen (wobei die Mäuse bei 100 bis 150 mg/kg verenden).
Das typische Dosierungsniveau von Interferon (insbesondere INF-β) bei Menschen liegt im Bereich von etwa 100 Einheiten bis eine Milliarde Einheiten/m². Wenn vor der Verabreichung von IFN-β an Menschen Vitamin C, Vitamin E, Aspirin, N-Acetylcystein, Ibuprofen oder Indomethacin gegeben wird, dann wird IFN-β vorzugsweise in einer Menge von mindestens 1000 Einheiten/m² verabreicht.
Für die parenterale Verabreichung wird (werden) das (die) Lymphokin(e) im allgemeinen in einer injizierbaren Einheitsdosierungsform (Lösung, Suspension, Emulsion) zubereitet, vorzugsweise in einem pharmazeutisch verträglichen Trägermedium, das von sich aus nichttoxisch und nichttherapeutisch oder nichtprophylaktisch ist. Beispiele solcher Träger umfassen Wasser, Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung, Mannit und normales Serumalbumin. Auch können nichtwässerige Träger, wie z. B. nichtflüchtige Öle, Propylenglykol und Ethyloleat, verwendet werden. Das Trägermedium kann sehr kleine Mengen von Zusatzstoffen enthalten, wie z. B. Substanzen, welche die isotonischen Eigenschaften und die chemische Stabilität erhöhen, z. B. Puffer und Konservierungsstoffe. Das (die) Lymphokin(e)/ Cytotoxin(e) und die biologischen Modifikatoren werden in solchen Trägern typischerweise mit einer Konzentration von jeweils etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise jeweils 0,2 bis 1 mg/ml, zubereitet.
Alternativ kann das Lymphokin, sofern es sich um IL-2 handelt, als sterile, stabile, gefriergetrocknete Formulierung zubereitet werden, in der das gereinigte IL-2 mit einem wasserlöslichen Träger, wie z. B. Mannit, der das Füllmittel bereitstellt, und einer ausreichenden Menge Natriumdodecylsulfat, das die Löslichkeit des rekombinanten IL-2 in Wasser sicherstellt, gemischt wird. Die Formulierung ist für die Rekonstituierung in wässerigen Injektionslösungen zur parenteralen Verabreichung geeignet und stabil und wird von menschlichen Patienten gut vertragen. Das Formulierungsverfahren wird in US-A-4 604 377 vollständiger beschrieben. Alternativ kann IL-2 unter Verwendung von Guanidin umgefaltet werden, wodurch ein löslicheres Produkt erhalten wird. Guanidin kann zur Solubilisierung der IL-2-Partikelmasse verwendet werden, wobei das Verfahren die nachfolgenden Stufen umfaßt:
(a) Aufschließen der Zellmembran des Mikroorganismus;
(b) Abtrennen von wasserunlöslichem, IL-2-enthaltendem Material aus dem Aufschlußmaterial;
(c) Mischen des unlöslichen, IL-2-enthaltenden Materials aus Stufe (b) bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 9 mit einer wässerigen Lösung eines Reduktionsmittels und eines chaotropen Mittels, wodurch das IL-2 im unlöslichen Material gelöst und denaturiert wird;
(d) Abtrennen der IL-2-enthaltenden Lösung aus Stufe
(c) vom ungelösten Teil des unlöslichen Materials;
(e) Entfernen des Reduktionsmittels aus der abgetrennten IL-2-enthaltenden Lösung;
(f) Oxidieren von IL-2 in der Lösung, währenddessen Aufrechterhalten der Konzentration des chaotropen Mittels bei einer stark denaturierenden Konzentration, wodurch die natürliche Disulfidbrücke von IL-2 gebildet wird;
(g) nachdem die Oxidation von Stufe (f) vollständig abgelaufen ist, Verdünnen der Lösung, um die Konzentration des chaotropen Mittels in der Lösung auf einen Pegel einzustellen, welcher die Renaturierung des oxidierten IL-2 gestattet und sich ein Niederschlag bildet;
(h) Abtrennen des Niederschlags aus der Lösung zur Bereitstellung eines Überstandes;
(i) Reinigen des oxidierten IL-2 im Überstand durch (1) Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und anschließend durch Lösung des aus der Chromatographie resultierenden Niederschlags in einer Lösung eines chaotropen Mittels sowie Entfernung des chaotropen Mittels aus der Lösung, oder durch (2) Chromatographie mittels hydrophober Wechselwirkungen und anschließend Ionenaustausch-Chromatographie; und
(j) Gewinnung eines gereinigten oxidierten, löslichen, heterologen, menschlichen IL-2-Mittels, das einen IL-2-Gehalt von mindestens etwa 95%, bestimmt durch Analyse mittels reduzierender Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, eine Löslichkeit in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung von mindestens etwa S mg IL-2 pro ml, eine spezifische Aktivität von mindestens etwa 1 · 10&sup6; Einheiten/mg, bestimmt durch den HT-2-Zell-Proliferationstest, und einen Endotoxin-Gehalt von weniger als etwa 0,1 ng/mg IL-2 aufweist.
In einer anderen Ausführungsform kann das Guanidin nach der HPLC-Stufe angewendet werden, das entsprechende Verfahren wird nachstehend beschrieben. Kurz gesagt, das rIL-2 wird von der Masse der zellulären Komponenten der transformierten Mikroorganismenwirte, die das rIL-2 enthalten, abgetrennt, das rIL-2 wird in reduzierter Form solubilisiert, oxidiert, bis zu einer klinisch verträglichen Reinheit und entsprechenden Endotoxin-Gehalten gereinigt und denaturiert, indem das rIL-2 in eine Lösung eines chaotropen Mittels eingebracht wird. Danach werden die Feststoffe aus der Lösung entfernt und das rIL-2 aus der Lösung renaturiert. Die Lösung eines chaotropen Mittels ist vorzugsweise eine 4 bis 8 molare wässerige Guanidin-Hydrochlorid-Lösung.
Eine weitere Alternative stellt die Verabreichung von IL-2 zusammen mit isolierten Lymphokin-aktivierten Lymphocyten in einem pharmazeutisch verträglichen Träger in einem adoptiven Immunotherapieverfahren dar, wobei die Lymphocyten Antitumor-Aktivität besitzen, wenn sie zusammen mit dem IL-2 an Menschen, die an dem Tumor leiden, verabreicht werden. Dieses Verfahren wird in US-A-4 690 915, veröffentlicht am 1. September 1987, und von S. Rosenberg et al., New Enaland Journal of Medicine (1985) 313:1485-1492, ausführlicher beschrieben. Bei einer anderen Alternative, die in S. Rosenberg et al., Science 233:1318-1321 (1986), beschrieben wird, können Tumor-infiltrierende Lymphocyten (TIL), expandiert in IL-2, als therapeutische Behandlung adoptiv übertragen werden, insbesondere in Kombination mit Cyclophosphamid. Das TIL-Vorgehen kann hier auch verwendet werden.
Wie vorstehend erwähnt, kann das hier verwendete rekombinante Lymphokin ein beliebiges Lymphokin sein, das aus Gewebekulturen oder durch Rekombinations-Techniken sowie aus einer beliebigen Säugerquelle, wie z. B. Maus, Ratte, Kaninchen, Primat, Schwein und Mensch, erhalten wird. Vorzugsweise stammt das Lymphokin aus einer menschlichen Quelle und stärker bevorzugt ist es ein menschliches rekombinantes Lymphokin. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Lymphokin um rekombinantes menschliches IL-2 oder TNF, alleine oder in Kombination mit rekombinantem TNF bzw. IL-2.
Das rekombinante IL-2 kann erhalten werden, wie von Taniguchi et al., Nature 302:305-310 (1983), und Devos, Nucleic Acids Research 11:4307-4323 (1983), beschrieben, indem das natürliche menschliche IL-2-Gen cloniert und in transformierten Mikroorganismen exprimiert wird. Es kann auch ein IL-2-Mutein sein, wie in US-A-4 518 584 beschrieben, in dem der normalerweise in Postition 125 des Wildtypoder natürlichen Moleküls vorliegende Cysteinrest durch eine neutrale Aminosäure, wie z. B. Serin oder Alanin, ersetzt worden ist, oder es kann ein IL-2-Mutein sein, wie in EP-A-0200280, veröffentlicht am 5. November 1986, beschrieben, in dem der normalerweise in Position 104 des Wildtyp- oder natürlichen Moleküls vorliegende Methioninrest durch eine neutrale Aminosäure wie Alanin ersetzt worden ist.
Vorzugsweise ist das IL-2 ein unglykosyliertes Protein, das von einem Mikroorganismus hergestellt wird, der mit der menschlichen cDNA-Sequenz oder einer modifizierten menschlichen cDNA-Sequenz von IL-2 transformiert worden ist, die für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz codiert, die mindestens im wesentlichen mit der Aminosäuresequenz des natürlichen menschlichen IL-2 identisch ist, umfassend die Disulfidbindung der Cysteinreste in den Positionen 58 und 105, und das eine biologische Aktivität aufweist, die beim natürlichen menschlichen IL-2 vorliegt. Eine wesentliche Übereinstimmung der Aminosäuresequenzen bedeutet, daß die Sequenzen gleich sind oder sich durch eine oder mehrere Aminosäure-Änderungen (Deletionen, Additionen, Substitutionen) unterscheiden, die zu keiner funktionellen Verschiedenartigkeit zwischen dem synthetischen Protein und dem natürlichen menschlichen IL-2 führen. Beispiele von IL-2-Proteinen mit solchen Eigenschaften umfassen diejenigen, die von Taniguchi et al., Nature (1983) 302:305-310, Devos, Nucleic Acids Research (1983) 11:4307-4323, und in EP-A-0 091 539 und 0088195, in US-A 4 518 584, a.a.O., und in EP-A-0 200 280, a.a.O., beschrieben werden. Am stärksten bevorzugt ist IL-2 das des-Ala&sub1;-IL-2ser125-Mutein, in dem der ursprüngliche terminale Alaninrest deletiert und der Cysteinrest in Position 125 durch einen Serinrest ersetzt ist.
Das IL-2 kann nach dem in US-A-4 569 790, veröffentlicht am 11. Februar 1986, beschriebenen und offenbarten Verfahren hergestellt und bis zur klinischen Reinheit gereinigt werden. Außerdem kann das IL-2 aus lichtbrechenden Körpern unter Verwendung eines Saccharosegradienten gewonnen werden, wie in EP-A-0 206 828, veröffentlicht am 30. Dezember 1986, beschrieben. Das IL-2 kann auch durch Derivatisierung mit Polyethylenglykol oder einem polyethoxylierten Polyol modifiziert werden, wie in PCT 87/00056, veröffentlicht am 15. Januar 1987, beschrieben.
Der menschliche TNF-α kann hier in rekombinanter Form erhalten werden, wie von Pennica et al., Nature (1984) 312:724-729, Yamada et al., J. Biotechnoloqy (1985) 3: 141-153, Wang et al., Science (1985) 228:149-154, Shirai et al., Nature (London) (1985) 313:803-806, EP-A-0 155 549, veröffentlicht am 29. September 1985, EP-A-0 158 286, veröffentlicht am 16. Oktober 1985, EP-A-0 168 214, veröffentlicht am 15. Januar 1986, und PCT US85/01921, veröffentlicht am 24. April 1986, beschrieben. Rekombinanter Kaninchen-TNF-α kann erhalten werden, wie in EP-A-0 146 026, veröffentlicht am 26. Juni 1985, und EP-A-O 148 311, veröffentlicht am 17. Juli 1985, beschrieben.
Die Clonierung von menschlichem TNF-α, der 151 und 155 Aminosäuren aufweist (2 und 6 weniger als die natürliche Form), wird in EP-A-0 155 549, veröffentlicht am 25. September 1985 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), beschrieben, und menschlicher TNF-α, der 155 Aminosäuren aufweist, wird in EP-A-0 158 286, veröffentlicht am 16. Oktober 1985 (Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha), und der entsprechenden GB-A-2 158 829A, veröffentlicht am 20. November 1985, offenbart. Die Clonierung von reifem TNF-α (157 Aminosäuren) und verschiedenen modifizierten Formen davon (Muteinen) wird in EP-A-0 168 214, veröffentlicht am 15. Januar 1986 (Genentech), und US-A-4 677 064, veröffentlicht am 30. Juni 1987, und US-A-4 677 063, veröffentlicht am 30. Juni 1987 (beide Cetus Corporation), offenbart.
Vorzugsweise ist der hier verwendete TNF-α ein menschliches TNF-Mutein, in dem einer oder mehrere der ersten acht Aminosäurereste, vorzugsweise entweder die ersten vier oder die ersten acht, deletiert worden sind, wobei das in US-A-4 677 064, a.a.O., beschriebene Verfahren verwendet wurde, oder der TNF-α ist ein von Cysteinresten befreites Mutein, beschrieben in US-A-4 677 063, veröffentlicht am 30. Juni 1987, a.a.O., und in US-A-4 518 584, a.a.O.. Der TNF kann nach dem in EP-A-0 220 966, veröffentlicht am 6. Mai 1987, beschriebenen Verfahren gereinigt werden.
Die genaue chemische Struktur des TNF-α hier hängt von mehreren Faktoren ab. Da im Molekül ionisierbare Amino- und Carboxylgruppen vorliegen, kann eine bestimmte Form von TNF-α als saures oder basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden. Alle diese Zubereitungen, die bei Überführung in geeignete Umgebungsbedingungen ihre Bioaktivität behalten, sind in der Definition des TNF-α hier eingeschlossen. Ferner kann die primäre Aminosäuresequenz von TNF-α durch Derivatisierung unter Verwendung von Zuckerresten (Glykosylierung) oder durch andere Zusatzmoleküle, wie z. B. Lipide, Phosphate oder Acetylgruppen, gebräuchlicher durch Konjugation mit Sacchariden, vergrößert werden. Bestimmte Aspekte einer solchen Vergrößerung werden durch posttranslationale Ausführungssysteme des produzierenden Wirts erreicht; andere derartige Modifikationen können in vitro eingeführt werden. In jedem Fall sind solche Modifikationen in der Definition von TNF-α hier eingeschlossen, solange die Bioaktivität des TNF-α nicht zerstört wird. Natürlich rechnet man damit, daß derartige Modifikationen die Bioaktivität quantitativ oder qualitativ beeinträchtigen können, indem sie die Aktivität des TNF-α in den verschiedenen Tests entweder erhöhen oder vermindern.
In einer Formulierung kann der TNF-α mit einem Homopolymer oder Copolymer von Polyethylenglykol oder einem polyethoxylierten Polyol umgesetzt werden, unter der Maßgabe, daß das Polymer bei Raumtemperatur in Wasser löslich ist. Das Polymer wird zuerst mit einem Kupplungsmittel umgesetzt, das terminale Gruppen aufweist, die sowohl mit den freien Amino- oder Thiolgruppen des Proteins als auch der Hydroxylgruppe des Polymers reaktiv sind. Beispiele solcher Kupplungsmittel umfassen Hydroxynitrobenzolsulfonsäureester, Cyanurchlorid und N-Hydroxysuccinimid. Der TNF-α wird sodann direkt mit dem wasserlöslichen Träger und Puffer wie vorstehend beschrieben zubereitet, die Formulierung kann gefriergetrocknet werden und das gefriergetrocknete Gemisch wie vorstehend beschrieben rekonstituiert werden.
Rekombinantes IFN-γ kann wie von Gray et al., Nature 295:503 (1982), beschrieben erhalten werden.
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung werden in den nachstehenden Beispielen weiter beschrieben, die den Umfang der Patentansprüche in keiner Weise einschränken sollen. In diesen Beispielen sind alle Teile für Feststoffe auf Gewicht bezogen und alle Prozentangaben für Flüssigkeiten und Gase auf Volumen bezogen, sofern es nicht anders aufgeführt ist, außerdem sind alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben.

BEISPIEL 1 - Verwendung von Harnsäure

A. Allgemeine Behandlung

Mäuse

Bei den in vivo-Tests wurden weibliche Balb/c-Mäuse (Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, MA) verwendet, die jeweils 6 bis 8 Wochen alt waren. Die Tiere mit einem Gewicht von 20 ± 3 g wurden willkürlich in Gruppen zusammengefaßt, wobei jeweils 5 Tiere in einen Käfig kamen, und im Ohr mit Kerben markiert. Alle Tiere wurden nach der Ankunft sieben Tage zur Beobachtung in Quarantäne gehalten, sie wurden in Mikroisolator-Käfigen gehalten und mit Standard-Laboratoriumsnahrung gefüttert, wobei sie Wasser nach Belieben trinken konnten.

TNF-α

Ein Mutein von menschlichem TNF-α, bei dem die ersten acht Aminosäuren vom N-Terminus deletiert waren, wurde wie in US-A-4 677 064, veröffentlicht am 30. Juni 1987, und von Wang et al., Science (1985) 228:149-153, beschrieben hergestellt. Mit kurzen Worten beschrieben, wurde TNF aus HL-60- Zellen induziert, gereinigt und sequenziert. Sodann wurde eine für den menschlichen TNF codierende, intronfreie Sequenz hergestellt, indem angereicherte mRNA erzeugt, eine cDNA-Bibliothek konstruiert, eine Sonde selektiert und die Bibliothek zur Gewinnung der Sequenz mit der Sonde durchgemustert wurde. Anschließend wurde ein ATG-Startcodon unmittelbar vor der GTC-Sequenz, die für das N-terminale Valin des reifen Proteins codiert, durch gezielte Mutagenese eingeführt. Clone wurden selektiert und Stränge in Expressionsvektoren ligiert, um eine prokaryotische Expression des Muteins zu erhalten. Das Mutein wurde sodann durch Säulenreinigung unter Verwendung einer beliebigen Standard-Reinigungstechnik gereinigt und im Reinigungspuffer gewonnen. Das Mutein wurde als gefriergetrocknetes Pulver in sterilen Gläschen hergestellt, unter Verwendung von steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung innerhalb von vier Tagen vor Verwendung rekonstituiert und suspendiert und, wenn überhaupt, bei 4ºC gelagert. Der TNF enthielt, abhängig von der Produktionscharge, weniger als 0,001 bis 0,006 ng Endotoxin/mg Protein.

Fänger freier Radikale

Als Fänger freier Radikale wurde hier die im Handel erhältliche Harnsäure (Sigma) verwendet.

Krebszellinie und Tumor-Injektionen

Als Zielzellen wurde ein Methylcholanthren-induziertes murines Fibrosarcom (Meth-A) (Balb/c) verwendet, das als Ascites-passierter Tumor von Dr. Lloyd Old, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, New York, gefroren als Vorrat erhalten und vor Verwendung mindestens zweimal in Aseites passiert wurde. Diese Zellen wurden in den suprascapularen Bereich des Mauswirts subcutan implantiert.

B. Ergebnisse

Tabelle I zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn TNF-Mutein alleine, Harnsäure alleine und verschiedene Kombinationsinjektionen aus dem TNF-Mutein und Harnsäure an fünf Mäuse pro Gruppe (2 bis 3 Wiederholungen) dreimal, jeden dritten Tag, intravenös verabreicht wurden, wobei sieben Tage nach Tumorimplantation begonnen wurde und die letzten Messungen am 14. Tag durchgeführt wurden. Die Exzipient-Kontrolle erhielt PBS-Injektionen.
Die Harnsäuredosis lag wenig unter der maximalen, ohne Verminderung des Tiergewichts verabreichbaren Konzentration, die in einer vorher durchgeführten Toxizitätsstudie bestimmt wurde, und wurde unmittelbar vor der TNF-Impfung verabreicht.
Die TNF-Dosen wurden so gewählt, daß sie die Bereiche von 50, 100, 150, 200 und 250 ug/kg Mäusegewicht abdeckten (die Mäuse wogen jeweils etwa 20 g). Immer wenn Harnsäure verabreicht wurde, betrugen die Harnsäuredosen 25 mg/kg Mausgewicht. TABELLE I Gruppe ΔBWa Todesfälle ΔTWb Heilerfolgec Exzipient-Kontrollen Harnsäure a ΔBW = Änderung des Körpergewichts, gemessen durch das Verhältnis von durchschnittlichem Körpergewicht (in g) 14 Tage nach Behandlung zu durchschnittlichem Körpergewicht (in g) zu Beginn der Behandlung. b ΔTW = Änderung der Tumorvolumina, gemessen durch das Verhältnis von durchschnittlichem Tumorvolumen (in mm³) 14 Tage nach Behandlung zu durchschnittlichem Tumorvolumen (in mm³) zu Beginn der Behandlung. c Heilerfolge = ΔTW=0 oder kein sichtbarer Tumor nach 21 Tagen von Beginn der Behandlung ab. * = "Tumortod", kein toxischer Tod.
Die Ergebnisse zeigen, daß eine kombinierte Behandlung der Mäuse sowohl gegenüber der PBS-Kontrolle als auch gegenüber TNF alleine zu einem Abnahme der Toxizität, die durch Todesfälle der Wirte gemessen wurde, und zu einer Zunahme der Wirksamkeit führte, die durch Vergleich des ΔTW der PBS- Kontrolle und des ΔTW der Kombinationen gemessen wurde. Folglich ist der therapeutische Index, wie er hier definiert ist, gesteigert worden.
Ames et al., a.a.O., haben postuliert, daß Harnsäure eine Hauptschutzsubstanz gegen die Schädigung durch reaktive Sauerstofftypen und Lipid-Peroxidation ist, die in Primaten, nicht aber in Nagetieren, vorkommt. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, daß reaktive Sauerstoff-Radikale und/oder Lipid-Peroxid-artige Produkte im Wirkungsmechanismus von TNF eine Rolle spielen.
Der Praktiker kann voraussetzen, daß diese Ergebnisse aufgrund des erwarteten Zusammenhangs zwischen der dosisabhängigen Antitumor-Wirkung von TNF bei Tieren und Menschen leicht auf Menschen übertragbar sind. Die vorklinische Antwort von TNF alleine entsprach einer klinischen Antwort von TNF gegen Colonkrebs.

BEISPIEL 2 - Verwendung von Vitamin C (Ascorbinsäure)

Weibliche Balb/c-Mäuse erhielten subcutane Implantationen von Meth-A-Tumorzellen wie in Beispiel 1 beschrieben.
Tabelle II zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn entweder Vitamin C oder das TNF-Mutein von Beispiel 1 alleine oder verschiedene Kombinationen aus Vitamin C und dem unmittelbar darauf folgenden TNF-Mutein intravenös an Gruppen von 5 Mäusen verabreicht wurden, wobei die Behandlung sieben Tage nach Tumorimplantation begonnen und jeden dritten Tag fortgesetzt wurde, bis insgesamt drei Injektionen verabreicht waren, und die Messungen am vierzehnten Tag nach Behandlungsbeginn durchgeführt wurden. TABELLE II TNF ug/kg Vit. C mg/kg % Kontrolle ΔBWa Todesfälle % Kontrolle ΔTWb "Heilerfolge"c a = ΔBW = Änderung des Körpergewichts, gemessen als Verhältnis von durchschnittlichem Körpergewicht (in g) 14 Tage nach Behandlung zu durchschnittlichem Körpergewicht (in g) zu Beginn der Behandlung; % Kontrolle ist der normalisierte Wert, bezogen auf die Kontrollgruppen. b ΔTW = Änderung der Tumorvolumina, gemessen als Verhältnis von durchschnittlichem Tumorvolumen (in mm³) 14 Tage nach Behandlung zu durchschnittlichem Tumorvolumen (in mm³) zu Beginn der Behandlung; % Kontrolle ist der normalisierte Wert, bezogen auf die Kontrollgruppen. c Heilerfolge = ΔTW=0 oder kein sichtbarer Tumor 21 Tage nach Behandlungsbeginn.
Vitamin C wirkt als Radikalfänger im wässerigen Kompartiment und außerdem auf die Kollagenstabilität.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung mit Vitamin C und TNF bei einer TNF-Dosis von 125 ug/kg zu weniger Heilerfolgen und einer geringen Änderung der Toxizität, jedoch bei den zwei höheren Vitamin C-Dosen zu einer Steigerung der Effizienz gegenüber der PBS-Kontrolle führte. Bei hohen Dosen von TNF (250 ug/kg) war ein puffern mit Vitamin C nicht möglich. Vitamin C alleine war in den drei getesteten Dosen nichttoxisch. Da Nager endogene Ascorbinsäure aufweisen, liegen dort möglicherweise Regulationsmechanismen vor, die eine exogene Verabreichung beeinflussen. Trotzdem scheint Vitamin C bei der Dosis von 7 mg/kg den therapeutischen Index signifikant zu verbessern.

BEISPIEL 3 - Verwendung von Buthioninsulphoximin (BSO)

Weibliche Balb/c-Mäuse erhielten subcutane Implantationen von Meth-A-Tumorzellen wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Behandlung wurde sieben Tage nach der Implantation begonnen.
Ein Protokoll wurde angewendet, in dem BSO oder das TNF-Mutein aus Beispiel 1 alleine, oder BSO zusammen mit dem TNF-Mutein verabreicht wurden. BSO wurde intraperitoneal und TNF intravenös verabreicht. Die Verabreichung von BSO wurde 24 Stunden vor der TNF-Verabreichung begonnen und zweimal täglich (zwischen den Dosen jeweils 6 bis 8 Stunden) zehn Tage lang durchgeführt, TNF wurde mit der zweiten BOS-Dosis dreimal, jeden dritten Tag, gegeben. BSO-Exzipient wurde als Volumenkontrolle in den Gruppen verwendet, die TNF alleine erhielten. PBS wurde als Kontrolle verwendet. Das Protokoll wird nachstehend erläutert:
(Tage) -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
BSO TNF BSO BSO TNF BSO BSO TNF BSO BSO
BSO BSO BSO
Tabelle III erläutert die Ergebnisse dieser Studie, wobei die Begriffe im Tabellenkopf in den Fußnoten von Tabelle II definiert sind. Die Zahlen in Klammern geben die Ergebnisse aus einer Wiederholung des Experiments wieder. TABELLE III Die Hemmung der Glutathion-Synthese durch Buthioninsulphoximin erhöhte in vivoa die Empfindlichkeit von Meth-A-Tumorzellen gegenüber TNF Behandlungsgruppe ΔBWb Todesfälle ΔTWc Heilerfolged Dosis-Modifizierungs-Faktore Kontrollen (Kochsalzlösung) a Die Daten stehen für zwei unabhängige Experimente mit jeweils 5 Mäusen/Gruppe. b Durchschnittliche Werte aus zwei Experimenten c Durchschnittliche Werte d "Heilerfolge" bedeutet kein tastbarer Tumor an Tag 14. e "Dosis-Modifizierungs-Faktor" ist das Verhältnis von ΔTW von TNF alleine/ΔTW von TNF+BSO. f Signifikant verschieden von der Gruppe, die TNF alleine erhielt, in der "Quade"-Reihenanalyse der Varianz (p festgesetzt auf 0,05).
Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, daß die Vorbehandlung mit BSO den therapeutischen Index des TNF bei allen getesteten TNF-Dosen erhöhte; sie erhöhte die Antitumor-Wirksamkeit von TNF bei einer geringen Steigerung der Toxizität, wie in der mit "Dosis-Modifizierungs-Faktor" überschriebenen Spalte erläutert wird. Die Daten stützen ferner die Hypothese, daß der in-vivo-Mechanismus der Wirksamkeit und in gewissem Maß die Toxizität mit der Erzeugung freier Radikale zusammenhängt. Die Empfindlichkeit/Resistenz der Tumorzellen hängt von der Fähigkeit der Tumorzellen ab, sich selbst vor der Schädigung durch freie Radikale zu schützen.
Die nachstehende Tabelle IV erläutert die Empfindlichkeit verschiedener menschlicher Zellinien gegenüber TNF und das Verhältnis von TNF-Empfindlichkeit zu Glutathion(GSH)- Gehalt in den Zellen. BSO wird eingesetzt, um vorzugsweise den GSH-Spiegel von Meth-A im Vergleich zum Wirt herabzusetzen, wodurch die Fähigkeit des Tumors zum Abfangen von Radikalen erschöpft wird. Alle nachstehend erwähnten Zellinien sind von der "American Type Culture Collection" (ATTC) in Rockville, MD, erhältlich. TABELLE IV Intrazelluläre Glutathion-Spiegel hängen mit der TNF-Resistenz in vivo zusammen Tumorlinie uM Summe Gluthation-Äquivalente/10&sup6; Zellen % Hemmung des Tumorwachstumsa a Bestimmt bei maximal tolerierter Dosis von TNF an einem definierten Endpunkt, an dem der Kontrolltumor im Volumen mindestens um das 20fache zunahm, für diese Modelle im allgemeinen 17 bis 28 Tage nach Implantation. Bei den L1210-, P388-, P815- und B-16-Tumorlinien wurden die Mäuse einen Tag nach der subcutanen Tumorbeimpfung täglich 14 Tage lang i. p. mit 250 ug/kg behandelt. PAN-02 und HT29 wurden dreimal, jeden dritten Tag, i. v. mit 150 bzw. 100 ug/kg behandelt, wobei die Behandlung 7 Tage nach Tumorbeimpfung begonnen wurde. Diese Bedingungen führten zu einem Körpergewichtsverlust von weniger als 10% gegenüber den Kontrollen und wurden als maximales Antitumor-Wirksamkeitssignal eingestuft, das in diesen Modellen erhalten werden konnte, ohne eine unspezifische Hemmung des Tumorwachstums aufgrund von Wirtstoxizität zu induzieren. b Nicht bestimmt. Früher veröffentlichte Daten haben gezeigt, daß in vitro die Dosis von TNF, bei der 50% der Tiere verenden (TCID&sub5;&sub0;), für ME180 = 50 ug/ml, für L929 = 20 ug/ml [Creasey et al., Canc. Res. 47: 145-149 (1987)].

BEISPIEL 4 - Verwendung von Aspirin

Weibliche Balb/c-Mäuse erhielten subcutane Implantationen von Meth-A-Tumorzellen wie in Beispiel 1 beschrieben. Fünf Mäuse pro Gruppe wurden eingesetzt. Die Behandlung wurde sieben Tage nach der Implantation begonnen.
Ein Protokoll wurde angewendet, in dem Aspirin oder das TNF-Mutein von Beispiel 1 alleine, oder Aspirin zusammen mit dem TNF-Mutein intravenös verabreicht wurden. In der Kombinationsgruppe wurde Aspirin fünf Tage lang täglich verabreicht und ein bis vier Stunden nach Verabreichung jeder Dosis TNF gegeben. PBS wurde als Kontrolle verwendet.
Wenn 250 ug/kg TNF nach einer Einzeldosis von 30 mg/kg Aspirin oder einmal täglich fünf Tage lang verabreichten Aspirindosen verabreicht wurden, verendeten 9/10 mit Aspirin behandelte Mäuse innerhalb von 48 Stunden der TNF-Behandlung. Im Gegensatz dazu war Aspirin alleine nichttoxisch und TNF alleine führte zum Tod von 1/5 Mäusen.
Die Dosierung von TNF wurde auf 25 bis 150 ug/kg Wirtsgewicht reduziert, die Ergebnisse werden in Tabelle V dargestellt, wobei die abschließenden Messungen 14 Tage nach Behandlungsbeginn durchgeführt wurden. Die Begriffe im Tabellenkopf sind in den Fußnoten von Tabelle I definiert. TABELLE V Gruppe ΔBW Todesfälle ΔTW "Heilerfolge"
Die Ergebnisse zeigen, daß eine Vorbehandlung mit Aspirin bei den niedrigeren TNF-Dosen den therapeutischen Index von TNF steigerte (erhöhte Wirksamkeit bei einem leichten Anstieg der Toxizität). Tatsächlich war die Wirksamkeit gegenüber TNF alleine, gemessen durch ΔTW, bei 50 ug/kg TNF in Gegenwart von 30 mg/kg Aspirin um einen Faktor von etwa zwei gesteigert, und außerdem wurden in der Kombinationsgruppe 3
Heilerfolge von 4 Behandelten im Vergleich zu 1 von 5 mit TNF alleine erhalten. Bei dem TNF-Spiegel von 100 ug/kg zeigte sich ein ähnlicher Trend, wobei in der Kombinationsgruppe 3 Heilerfolge von 4 Behandelten im Vergleich zu 2 von 5 in der Gruppe mit TNF alleine erhalten wurden. Bei 150 ug/kg war die Aspirin-Kombination bei geringer Änderung der Wirksamkeit toxischer.

BEISPIEL 5 - Verwendung von Nordihydroguajaretsäure (NDGA), Aspirin oder der Kombination mit TNF

Weibliche Balb/c-Mäuse erhielten subcutane Implantationen von Meth-A-Tumorzellen wie in Beispiel 1 beschrieben.
Tabelle VI zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn NDGA (von Sigma Chemicals Co.), Aspirin, die Kombination aus NDGA und Aspirin, das TNF-Mutein von Beispiel 1 alleine und verschiedene Kombinationen aus NDGA und Aspirin und danach das TNF-Mutein an Gruppen von 5 Mäusen verabreicht wurden, wobei die Verabreichung sieben Tage nach Tumorimplantation begonnen und dreimal, jeden dritten Tag, fortgesetzt wurde. Einzelheiten der Protokolle finden sich in den Fußnoten von Tabelle VI. PBS wurde als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse wurden 14 Tage nach Behandlungsbeginn bestimmt. Die Begriffe im Tabellenkopf sind in den Fußnoten von Tabelle I definiert. TABELLE VI Gruppe ΔBW ΔTW Heilerfolge Todesfälle (1 Tumortodesf. Tag 14) a = 100 ug/kg i. v. jeden dritten Tag, dreimal, für alle Kombinationen b = 30 mg/kg i. v. eine Stunde vor jeder TNF-Verabreichung c = 312 ug/20 g Maus (15,6 mg/kg) in Propylenglykol i. p. 5 Minuten vor jeder TNF-Verabreichung d = i. v. jeden dritten Tag, dreimal e = i. p. jeden dritten Tag, dreimal f = Aspirin i. v. jeden dritten Tag, dreimal; NDGA i. p., eine Stunde nach jeder Aspirin-Verabreichung.
NDGA hemmt bekanntermaßen den 5'-Lipoxygenase-Weg, wodurch vermutlich die Leukotrien-Synthese, und dadurch die mit deren Erzeugung im Wirt einhergehende Toxizität gehemmt wird. Außerdem kann NDGA in einigen Fällen in einer Radikalfängerrolle wirken, wobei diese Rolle vermutlich auch die Toxizität von TNF herabsetzen würde. Die genauen Wirkungsmechanismen unter den vorliegenden Bedingungen sind bisher nicht vollständig bekannt, die gezeigten Tatsachen lassen jedoch vermuten, daß einer oder beide Effekte die TNF-Toxizität vermindert.

BEISPIEL 6 - Verwendung von Indomethacin, Ibuprofen oder Aspirin zusammen mit TNF

Weibliche Balb/c-Mäuse erhielten subcutane Implantationen von Meth-A-Tumorzellen wie in Beispiel 1 beschrieben.
Tabelle VII zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn Aspirin, Indomethacin, Ibuprofen, das TNF-Mutein von Beispiel 1 alleine und entweder Aspirin, Indomethacin oder Ibuprofen und zwei Stunden danach das TNF-Mutein an Gruppen von 10 Mäusen und 5 Mäusen verabreicht wurden, wobei die Verabreichung sieben Tage nach Tumorimplantation begonnen wurde. Einzelheiten der Protokolle finden sich in den Fußnoten von Tabelle VII. Die Ergebnisse für TGI wurden 14 Tage und die für die Daten der Heilerfolge mindestens 21 Tage, üblicherweise 28 Tage, nach Behandlungsbeginn bestimmt. TGI bedeutet Hemmung des Tumorwachstums, berechnet als prozentuales Verhältnis des Gewichts des behandelten Tumors an Tag 14 zum Gewicht des Tumors der Kontrollen an Tag 14, substrahiert von 100. (Wenn beispielsweise das behandelte Volumen 30 und das Kontrollvolumen 1200 beträgt, dann ist das Verhältnis 2,5% und Prozent TGI 97,5.) Heilerfolge sind genauso wie in Fußnote c von Tabelle I definiert.
Die Ergebnisse zeigen, daß die beste TNF-Dosierung für Mäuse mit 3 mg/kg Indomethacin bei etwa 50 bis 200 ug/kg Wirtsgewicht (50 bis 200 ug/m² für Menschen) liegt. Die Effekte von Ibuprofen in Kombination mit TNF entsprachen etwa denjenigen von Aspirin in Kombination mit TNF. Die Ergebnisse bestätigen die beste TNF-Dosis für die Aspirindosis von 30 mg/kg Wirt. Tabelle VII Effekte von Cyclooxygenase-Inhibitoren auf Toxizität und Wirksamkeit von TNF Dosis-Gruppe Toxische Todesfälle/insgesamt Behandelte Prozent Todesfälle Todestag Prozent TGI Prozent Heilerf./Überlebende Tabelle VII (Fortsetzung) Dosis-Gruppe Toxische Todesfälle/insgesamt Behandelte Prozent Todesfälle Todestag Prozent TGI Prozent Heilerf./Überlebende a TNF, dreimal, jeden dritten Tag, intravenös verabreicht; 6 Tests, davon 2 Tests mit jeweils 10 Mäusen pro Gruppe und 4 Tests mit 5 Mäusen pro Gruppe. b Indomethacin (3 mg/kg), 2 Stunden vor TNF dreimal, jeden dritten Tag, i. p. verabreicht; 3 Tests, davon 2 Tests mit 10 Mäusen pro Gruppe und 1 Test mit 5 Mäusen pro Gruppe. b' Ibuprofen (20 mg/kg), 2 Stunden vor TNF dreimal jeden dritten Tag i. p. verabreicht. c Aspirin (30 mg/kg) i. v., 2 Stunden vor TNF jeden dritten Tag, dreimal; 4 Tests, davon 2 Tests mit 10 Mäusen pro Gruppe und 2 Tests mit 5 Mäusen pro Gruppe. e 3 Tests, davon 2 Tests mit 10 Mäusen/Gruppe und 1 Test mit 5 Mäusen/Gruppe. f 6 Tests, davon 2 mit 10 Mäusen/Gruppe und 4 Tests mit 5 Mäusen/Gruppe. Endotoxin (LALs): INDO = > 0,12/< 1,2 ng/ml (200 ul Dosisvol.) IBU = < 0,2 ng/ml ASA = < 0,01 ng/ml

BEISPIEL 7 - Verwendung von N-Acetylcystein zusammen mit TNF

CD-Ratten, bezogen von Charles River Labs, erhielten entweder 200 oder 400 ug/kg des vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen TNF-Muteins intravenös einmal bei Stunde 0. Außerdem erhielten CD-Ratten intravenös 24 Stunden und eine Stunde vor TNF-Behandlung bei Stunde 0 i.v. N-Acetylcystein (Sigma) mit 250 und 1000 mg/kg Wirt. Die in Tabelle VIII dargestellten Daten bedeuten die Todesfälle innerhalb von 24 Stunden zu insgesamt behandelten Ratten. Es zeigt sich, daß die Verabreichung von N-Acetylcystein die Toxizität von TNF bei allen getesteten Dosen herabsetzt. TABELLE VIII Todesfälle innerhalb von 24 Stunden/insgesamt behandelte Ratten 0 mg/kg N-Acetylcystein
Die vorstehenden Effekte werden vermutlich auch mit anderen Lymphokinen oder Cytotoxinen als TNF auftreten. Beispielsweise können die biologischen Modifikatoren bei der IL-2-vermittelten tumoriziden Aktivität eine Rolle spielen. Ein deutlicher Zusammenhang ist zwischen dem Ausmaß der Fähigkeit verschiedener Tumorzellen zum Abfangen von Radikalen (gesamter Glutathion-Gehalt) und deren Empfindlichkeit gegenüber TNF und IL-2 gefunden worden. Das nachstehende Experiment erläutert, daß IL-2 genauso wirkungsvoll sein kann wie TNF.

BEISPIEL 8 - Verwendung von Harnsäure zusammen mit IL-2

Weibliche Balb/c-Mäuse erhielten subcutane Implantationen von Meth-A-Tumorzellen wie in Beispiel 1 beschrieben.
Ein IL-2-Mutein, bezeichnet mit des-Ala&sub1;-IL2ser&sub1;&sub2;&sub5; (das keinen Alaninrest in Position 1 des reifen IL-2-Moleküls und einen Serinrest in Position 125 des reifen IL-2-Moleküls aufwies), wurde nach dem in US-A-4 518 584, a.a.O., beschriebenen Verfahren hergestellt, aus lichtbrechenden Körpern isoliert, gemäß dem in EP-A-0 206 828, veröffentlicht am 30. Dezember 1986, beschriebenen Verfahren, und wie in US-A-4 604 377 beschrieben in Natriumdodecylsulfat zubereitet. Die Bezeichnung des-Ala&sub1;-IL-2ser&sub1;&sub2;&sub5; bedeutet, daß der Alaninrest am Anfang der reifen natürlichen IL-2-Sequenz fehlt und daß der Cysteinrest in Position 125 der reifen natürlichen IL-2-Sequenz durch einen Serinrest ersetzt worden ist.
Tabelle IX zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn das hier beschriebene ZL-2-Mutein alleine, Harnsäure alleine und verschiedene Kombinationsinjektionen, bestehend aus dem IL-2-Mutein und der Harnsäure, an fünf Mäuse pro Gruppe (2 bis 3 Wiederholungen) intravenös verabreicht wurden, wobei die Verabreichungen sieben Tage nach Tumorimplantation begonnen und fünf Tage lang einmal täglich durchgeführt wurden und die Harnsäure direkt (etwa 10 Minuten) vor der IL-2-Verabreichung verabreicht wurde, wenn beide Substanzen verabreicht wurden. Die abschließenden Messungen wurden an Tag 14 durchgeführt. Als Exzipientkontrolle wurde PBS injiziert. Die Harnsäuredosen betrugen alle 25 mg/kg Mäusegewicht. Die Bezeichnungen im Tabellenkopf sind in den Fußnoten von Tabelle Z definiert. TABELLE IX Gruppe ΔBW Todesfälle ΔTW Heilerfolge Exzipient-Kontrollen Harnsäure
Die Ergebnisse zeigen, daß die kombinierte Behandlung der Mäuse zu einer Abnahme der Toxizität gegenüber der IL-2- Kontrolle führte; das IL-2 war jedoch bei Verabreichung zusammen mit Harnsäure etwa um den Faktor zwei weniger wirkungsvoll als die IL-2-Kontrolle. Diese Abnahme ist in der Größenordnung ähnlich wie die Ergebnisse, die mit niedrigeren TNF-Dosen und Harnsäure beobachtet wurden. Man kann voraussagen, daß längere Behandlungen und eine höhere Dosis von IL-2 zu Tumorheilungen führen werden. Die bevorzugten biologischen Modifikatoren für die Anwendung beim Menschen sind Aspirin, Vitamin c, Vitamin E, Ibuprofen, Indomethacin und N-Acetylcystein. Bei Menschen wird IL-2 typischerweise in einer Dosis von 3 · 106 Einheiten/m² täglich verabreicht.
Die vorliegende Erfindung erreicht die folgenden Ziele: Erstens wird die Fähigkeit des Wirts oder Tumors, Radikale abzufangen, durch die Kombinationstherapie, z. B. mit 850, vermindert, wodurch der therapeutische Index des Tumors gegenüber dem Wirt erhöht wird. Zweitens wird die biologische Schädigung auf Wirtsebene, die durch die Erzeugung freier Radikale verursacht wird, z. B. durch den Plasma-vermittelten Radikalfänger Harnsäure, blockiert. Drittens kann der Metabolismus der Arachidonsäure-Kaskade, der durch reaktive Radikaltypen in Lipid- und wässerigen Kompartimenten beeinflußt wird und diese selbst produziert, moduliert werden, wodurch der therapeutische Index des Lymphokins oder Cytotoxins erhöht wird. Wenn klinische Studien mit Menschen durchgeführt werden, können die für Menschen wirksame Mengen des biologischen Modifikators bestimmt werden, indem die Mäuse- Daten umgerechnet werden.
Zusammenfassend wird gezeigt, daß die vorliegende Erfindung eine Kombination aus Lymphokin oder Cytotoxin und biologischem Modifikator bereitstellt, die, bezogen auf das Lymphokin oder Cytotoxin alleine, in einem Säugerwirt einen erhöhten therapeutischen Index zur Folge hat.

Claims

1. Mittel, das geeignet ist für die Verabreichung an Säugerwirte zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung einer biologischen Schädigung des Wirtes, die durch Erzeugung freier Radikale verursacht wird, wobei das Mittel ein Gemisch in pharmakologisch wirksamen Mengen von mindestens einem Lymphokin oder Cytotoxin einer Säugerart und mindestens einem biologischen Modifikator umfaßt, der ausgewählt ist aus einem Fänger freier Radikale oder einem Stoffwechsel-Hemmstoff.

2. Mittel nach Anspruch 1, wobei das Lymphokin oder Cytotoxin Interleukin-2, Interferon-β, Tumornekrose-Faktor oder koloniestimulierender Faktor-1 ist.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Lymphokin oder Cytotoxin Tumornekrose-Faktor-α ist.

4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der biologische Modifikator ausgewählt ist aus Harnsäure, Buthioninsulfoximin, Vitamin E, Vitamin C, N-Acetylcystein, einem Retinoid, Glutathion, Metronidazol, Aspirin, Indomethacin, Ibuprofen, Nordihydroguajaretsäure, cis-8,11,14-Eicosatrien-5-insäure, synthetischen Prostaglandinen, synthetischen Leukotrienen, und Kombinationen von einem oder mehreren dieser Modifikatoren.

5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 2 oder 4, wobei das Lymphokin Interleukin-2 ist.

6. Mittel nach Anspruch 5, wobei der biologische Modifikator Harnsäure ist und das Interleukin-2 ein Desalanyl-1mutein mit einem Serinrest in Stellung 125 des nativen Interleukin-2-Moleküls ist.

7. Verwendung von pharmakologisch wirksamen Mengen mindestens eines Lymphokins oder Cytotoxins einer Säugerart und mindestens eines biologischen Modifikators, ausgewählt aus einem Fänger freier Radikale oder einem Stoffwechsel-Hemmstoff, für die Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung einer biologischen Schädigung eines Säugerwirts, die durch die Erzeugung freier Radikale verursacht wird.

8. Verwendung von mindestens einem biologischen Modifikator, ausgewählt aus einem Fänger freier Radikale oder einem Stoffwechsel-Hemmstoff, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verstärkung des therapeutischen Index' von mindestens einem Lymphokin oder Cytotoxin einer Säugerart bei der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung einer biologischen Schädigung eines Säugerwirts, die durch Erzeugung freier Radikale verursacht wird.

9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Lymphokin oder Cytotoxin ausgewählt ist aus einem Interleukin, einem Interferon, einem Tumornekrose-Faktor oder einem koloniestimulierenden Faktor.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die biologische Schädigung Krebs, eine Infektion oder eine Schädigung ist, die durch hohe Sauerstoffspannung, Radiotherapie oder Chemotherapie verursacht wird.