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Diese
Erfindung betrifft Verfahren zur Stimulierung von Wirts-Abwehrmechanismen
gegen pathologische Leiden bei einem Menschen durch Verabreichung
von hohen Dosen an Interferon über
die Mundschleimhaut. Insbesondere ist die Erfindung in Verfahren
zur Behandlung von Krebs einsetzbar.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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α-Interferone
werden umfassend zur Behandlung zahlreicher verschiedener hämatologischer
Malignitäten,
umfassend Haarzellenleukämie,
chronische myelogene Leukämie,
minderschwere Lymphome, Haut-T-Zell-Lymphome und mit AIDS verbundenes
Kaposi-Sarkom, eingesetzt (J.U. Gutterman, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91, 1198–1205
(1994)). Tumorbekämpfende
Wirkungen werden üblicherveise
bei hohen Dosierungen beobachtet, häufig im Bereich von mehreren
Dutzend Millionen Einheiten von Interferon-α (IFN-α), die mittels parenteraler
Injektion verabreicht werden. Interferon-β (IFN-β) ist für die klinische Verwendung
zur Behandlung von multipler Sklerose mit Rückfalls- und Remissionsphasen
und von chronischer viraler Hepatitis B und C zugelassen.
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Interferon-α und Interferon-β sind beide
Interferone vom Typ I. Interferone vom Typ I sind eine große Gruppe
von natürlich
vorkommenden Cytokinen, die über
16 Untergruppen von IFN-α plus
IFN-β und
IFN-ω umfasst.
Die Interferone vom Typ I binden sich an einen einzelnen Zelloberflächenrezeptor
und stimulieren eine komplexe Reihe von Signaltransduktionsereignissen,
die schließlich
zu antiviralen, antiproliferativen und anderen immunmodulierenden
Wirkungen, Cytokininduktion und HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-Regulation
führen
(Pestka et al., Annu. Rev. Biochem. 56, 727 (1987)). Einzelne Subtypen
von Typ-I-IFN variieren in ihrer Aktivität. Die am häufigsten beobachtete Aminosäure an jeder
Position wurde durch Scannen einer großen Anzahl an Allel-Subtypen
von IFN-α identifiziert,
und ein synthetisches Interferon vom Typ I mit der Consensus-Sequenz
wurde synthetisiert (Alton et al., in "The Biology of the Interferon System", E. de Maeyer & H. Schellekens
(Hrsg.), Elsevier, 1991–128
(1983)). Dieses Consensus-Interferon ist im Handel erhältlich (Infergen;
Amgen, Inc.), und es wurde erst kürzlich dafür gezeigt, dass es höhere Aktivität (gewichtsbezogen)
als IFN-α2a
oder IFN-α2b
aufweist; es wurde vorgeschlagen, dass Consensus-IFN klinisch gesehen
IFN eines individuellen natürlichen
Subtyps überlegen
ist (Blatt et al., J. Interferon and Cytokine Research 16, 489–499 (1996)).
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Auch
wenn zahlreiche Arten der Verabreichung, einschließlich intravenöser, subkutaner,
intramuskulärer,
topischer und intraläsionaler
Injektion, üblicherweise
zur Verabreichung von Typ-I-Interferonen verwendet werden, wurde
die orale Verabreichung im Allgemeinen nicht verwendet, da Interferone
Proteine sind, von denen angenommen wird, dass sie durch proteolytische
Enzyme deaktiviert werden, und die nicht in annehmbarer Weise in
ihrer nativen Form im Magendarmtrakt absorbiert werden. Tatsächlich konnten
in zahlreichen Studien nach oraler Verabreichung keine Interferone
im Blut nachgewiesen werden (Cantell & Pyhäla, J. Gen. Virol. 20, 97–104 (1973);
Wills et al., J. IFN Res. 4, 399–409 (1984); Gilson et al.,
J. IFN Res. 5, 403–408 (1985)).
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Es
wird durchwegs in Betracht gezogen, dass, um die maximale therapeutische
Wirkung zu erzielen, die höchstmögliche Dosis
an Interferon verwendet werden sollte (Hayden et al., J. Infect.
Dis. 148, 543–550 (1983);
US 5286748 ). Auch wenn die
Verfügbarkeit
von rekombinantem Material bedeutete, dass sehr hohe Dosen verabreicht
werden könnten,
wurde in der praktischen Anwendung erkannt, dass die Nebenwirkungen von
Interferonverabreichung die einsetzbare Interferondosis und die
Behandlungsdauer stark einschränkten. Diese
Nebenwirkungen umfassen starkes Unbehagen und Depression, was in
manchen Fällen
sogar zum Suizid führen
kann. Ein erst jüngst
erschienener Leitartikel von Hoofnagle im New England Journal of
Medicine fasst diese Probleme zusammen (J.H. Hoofnagle & D. Lau, New Eng.
J. Medicine 334, 1470–1471
(1996)). Eine Meta-Analyse der Wirkung von Interferon-α-Behandlung bei Patienten
mit Hepatitis B, wie antigenpositive chronische Hepatitis B, zeigte
eine Remissionsrate von 25 bis 40 % unter Patienten mit typischer
chronischer Hepatitis B, die mit 5 Millionen IE täglich oder
10 Millionen IE dreimal wöchentlich,
3 bis 6 Monate lang, behandelt wurden. Diese Resultate zeigen dennoch
keine Eignung als Behandlung auf, da die meisten Patienten bezüglich Hepatitis-Oberflächenantigen
positiv bleiben und virale DNA in sich tragen, wenn sie mittels
Polymerasekettenreaktion getestet werden. Weiters werden diese Dosen
an Interferon nur schlecht vertragen, und 10 % bis 40 % der Patienten
bedürfen
aufgrund von nicht annehmbaren Nebenwirkungen einer Reduktion der
Dosis. Bei einer gut vertragenen Dosis von 1 Million IE täglich liegt
die Remissionsrate jedoch bei nur 17 % (Perrillo et al., New Eng.
J. Medicine 323, 295–301
(1990)). Bei Patienten mit chronischer Hepatitis C wird langfristige
Verbesserung mit dem Verlust an HCV RNA assoziiert, der nur bei
10 bis 20 % der Patienten, die mit einer Dosis von 3 Millionen IE
dreimal wöchentlich
6 Monate lang behandelt wurden, eintritt (Hoofnagle & Lau, s.o.). Bei
Patienten mit Krebs werden signifikante Reaktionsreaten üblicherweise
bei den höchsten
tolerierten Dosen von Interferon-α beobachtet.
Somit beträgt
bei Patienten mit multiplem Myelom beispielsweise die Reaktionsrate
50 % bei jenen Patienten, die mit 3 Millionen IE behandelt wurden.
Sehr wenige Patienten sind jedoch in der Lage, den hochdosierten
Behandlungsplan länger
als eine kurze Zeit zu tolerieren (Ahre et al., Eur. J. Hematol.
41, 123–130
(1988)). Somit gibt es auf dem Gebiet der Erfindung eindeutig einen
Bedarf an Mitteln, die die Verabreichung von hohen Dosen an Interferon
ermöglichen
würden,
ohne schwer wiegende Nebenwirkungen zu induzieren.
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Es
gab mehrere vereinzelte Berichte zur Wirksamkeit von geringen Dosen
an Interferon, die als Nasenspray oder als eine orale Flüssigformulierung
im Rahmen der Behandlung zahlreicher verschiedener Viruserkrankungen,
insbesondere Influenza, verabreicht wurden. In den meisten dieser
Berichte waren die Interferonpräparate
jedoch relativ unrein. Ein Placebo-kontrollierter Versuch mit einer
relativ hohen Dosis an intranasal verabreichtem Interferon zur Behandlung
von Rhinovirusinfektion zeigte, dass die Behandlung wirksam war,
dass jedoch ein signifikantes Auftreten von Nebenwirkungen zu beobachten
war (Hayden et al., J. Infect. Dis. 148, 914–921 (1983)). In ähnlicher
Weise konnten, auch wenn mehrere Studien, die zwei randomisierte klinische
Doppelblindversuche umfassten (Douglas et al., New Engl. J. Med.
314, 65–80
(1986); Hayden et al., New Engl. J. Med. 314, 71–75 (1986)) die Wirksamkeit
von nasal verabreichtem rekombinantem Interferon-α2 in hohen
Dosen beim Schutz von gegenüber
Rhinovirusinfektionen ausgesetzten Individuen aufzeigten, diese Versuche
keinen Beweis für
eine systemische Wirkung liefern.
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In
noch jüngerer
Vergangenheit beschrieb eine Reihe von Patenbeschreibungen die Verwendung
von geringen Dosen an oral verabreichtem Interferon, das seinen
Ursprung in einer heterologen Spezies fand, zur Behandlung von infektiöser Rhinotracheitis
("Läusefleckfieber") bei Rindern und
von feliner Leukämie
sowie zur Behandlung anderer Erkrankungen, zur Steigerung der Effizienz
von Vakzinen; zur Verbesserung der Effizienz der Nahrungsverwertung;
und zur Prävention
von Rinder-Theileriose. Siehe das US-Patent Nr. 4.462.985, das Australische
Patent Nr. 608519, das Australische Patent Nr. 58332 bzw. das US-Patent
Nr. 5.215.741. Darüber
hinaus offenbart das US-Patent Nr. 5.017.371 die Verwendung von
Interferon auf diese Weise zur Behandlung von Nebenwirkungen von
Krebschemotherapie oder -strahlentherapie. In diesen Beschreibungen
war das verwendete Interferon menschliches Interferon-α, hergestellt
durch das Verfahren von Cantell, verabreicht in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
in einer Dosis von 0,01 bis 5 IE pro Pfund Körpergewicht. Während diese
Beschreibungen in Betracht ziehen, dass solche geringen Dosen an
Interferon, die an die oropharyngeate Mucosa, vorzugsweise in einer
Form, die an längeren
Kontakt mit der Mundschleimhaut angepasst ist, verabreicht werden,
zur Behandlung zahlreicher verschiedener Erkrankungen einschließlich Krebs
wirksam sein können,
stellen die aus den Versuchen gewonnenen Resultate für Leiden
abgesehen von Läusefleckfieber,
feliner Leukämie,
caninem Parvovirus und Theileriose fast durchwegs nur vereinzelte
Beweise dar. Insbesondere werden keine sorgfältig kontrollierten Versuche
zur dieser Behandlung in keiner der Tiermodelle für menschliche
Krebsarten dargeboten.
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Noch
aktuellere Studien zu den Wirkungen von sehr geringen Dosen an Interferon,
die über
die orale und oropharyngeale Mucosa verabreicht werden, wurden ebenfalls
bereits veröffentlicht
(Bocci, Clin. Pharmacokinet. 21, 411–417 (1991); Critic. Rev. Therap.
Drug Carrier Systems 9, 91–133
(1992); Cummins & Georgiades,
Archivum Immun. Therap. Exp. 41, 169–172 (1993)). Es wurde vorgeschlagen,
dass dieser Behandlungstyp zur Behandlung von HIV-Infektion besonders
nützlich
ist und die Le bensqualität
von AIDS-Patienten zumindest verbessern kann (Kaiser et al., AIDS
6, 563–569
(1992); Koech et al., Mol. Biol. Ther. 2, 91–95 (1990)). Andere Berichte
weisen jedoch darauf hin, dass solche Behandlungen keinen klinischen
Nutzen bringen. Eine Phase-I-Studie zur Verwendung von oralen Pastillen,
die geringe Dosen an Interferon enthalten, zur Behandlung von Hepatitis
B wurde ebenfalls bereits veröffentlicht
(Zielinska et al., Archiv. Immunol. Therap. Exp. 41, 241–252 (1993)).
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Hingegen
zeigte die Internationale Patentanmeldung Nr. WO 95/27499 des Brigham
and Women's Hospital,
dass Interferon-β,
verabreicht über
Magenintubation, die Entwicklung von Autoimmunkrankheiten wie Typ-I-Diabetes,
multipler Sklerose und Autoimmunarthritis in anerkannten Tiermodellen
zumindest teilweise unterdrückte,
wenn es vor dem induzierenden Antigen verabreicht wurde. Interferon-β, das auf
diesem Weg oder intraperitoneal in Verbindung mit intragastrischem "Bystander"-Antigen verabreicht
wurde, war bei der Induktion von Toleranz sogar noch wirksamer.
Dies lässt
darauf schließen,
dass Interferon-β zur
Steigerung der Induktion von oraler Toleranz wirksam ist, und nicht
zur Induktion von entweder humoralen oder zellulären Antworten auf exogenes
Antigen.
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In
der Australischen Provisional Patent-Anmeldung Nr. PN 9765 wurde
für geringe
Dosen an Interferon, die in den oropharyngealen Hohlraum über die
Mundschleimhaut verabreicht wurden, gezeigt, dass sie beim Schutz
von Mäusen
vor einem Challenge mit hoch metastasierenden Tumorzellen wirksam
waren. Die eher außergewöhnliche
Natur dieser Resultate zeigt zusammen mit der Tatsache, dass sehr
wenige Substanzen Aktivität
gegen diese sehr aggressiven Tumoren aufweisen, dass die Verabreichung
von Interferon in den oropharyngealen Hohlraum bei der Behandlung
von Krebs nützlich
ist. Geringe Dosen an Interferon, verabreicht in die Mundschleimhaut,
waren auch bei der Behandlung von Mäusen, denen Enzephalomyokarditisvirus
(EMCV) intraperitoneal injiziert wurde, wirksam, das normalerweise
eine rasch fortschreitende, tödliche
Erkrankung induziert, die durch Einbindung des Zentralnervensystems
und Enzephalitis gekennzeichnet ist. Auch wenn dieses System ein
sehr strenger Test auf antivirale Aktivität ist, war die Verabreichung
von Interferon über die
Mundschleimhaut gegenüber
intraperitonealer Verabreichung vergleichsweise wirksam.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zur Stimulation von Wirts-Abwehrmechanismen
bei einem Menschen mittels Verabreichung eines Interferons über die
Mundschleimhaut in Dosen bereit, die höher als jene sind, die eine
pathologische Antwort induzieren, wenn sie Menschen parenteral,
im Allgemeinen in Dosen über etwa
20 × 106 IE homologes Interferon-α, verabreicht
werden. Für
andere Typen von Interferon kann die eine pathologische Antwort
induzierende Dosis von jener unterscheiden, die beim Menschen durch
homologes Interferon-α induziert
wird.
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In
einem Aspekt kann die Erfindung als Verfahren zur Stimulation der
Immunantwort bei einem Menschen durch Verabreichung einer immunstimulierenden
Menge eines Interferons über
Kontakt mit der Mundschleimhaut an den Menschen betrachtet werden,
worin die Menge mehr als eine Dosis desselben Interferons umfasst,
die eine pathologische Reaktion induziert, wenn sie parenteral verabreicht
wird.
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Alternativ
dazu stellt die Erfindung ein Verfahren zur Steigerung des therapeutischen
Index von Interferon durch Verabreichung von Interferon über die
Mundschleimhaut bereit.
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Die
Verabreichung über
die Mundschleimhaut kann die Verabreichung einer wirksamen Dosis
an Interferon in einer einzelnen Dosis umfassen, oder die wirksame
Dosis kann in mehreren kleinen Dosen über einen Zeitraum hinweg verabreicht
werden, der ausreicht, um Immunstimulation hervorzurufen, die jener
einer einzelnen Dosis entspricht. In ähnlicher Weise kann die Interferon-Dosis
kontinuierlich über
einen Zeitraum hinweg verabreicht werden, der ausreicht, um eine
Wirkung zu erzielen, die jener einer einzelnen Dosis entspricht.
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In
ihren Anwendungsaspekten stellt die Erfindung ein Verfahren zur
Behandlung von Krebsleiden über die
Verabreichung einer wirksamen Menge an Interferon an das Säugetier über Kontakt
mit der Mundschleimhaut bereit, worin die Menge mehr als die Dosis
desselben Interferons umfasst, die eine pathologische Reaktion induziert,
wenn sie parenteral verabreicht wird.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung von multiplem
Myelom, Haarzellenleukämie, chronischer
myelogener Leukämie,
minderschwerem Lymphom, Haut-T-Zell-Lymphom, karzinoiden Tumoren, Zervixkrebs,
Sarkomen einschließlich
Kaposi-Sarkom, Nierentumoren, Karzinomen, umfassend Nierenzellkarzinom,
hepatisches zelluläres
Karzinom, Nasopharynxkarzinom, hämatologischen
Malignitäten,
Kolorektalkrebs, Glioblastom, Larynxpapillomen, Lungenkrebs, Kolonkrebs,
malignen Melanomen und Hirntumoren einschließlich maligner Hirntumoren
bereit. In einer Ausführungsform
ist das Verfahren im Allgemeinen bei der Behandlung von Krebsarten
mit nichtviraler Ätiologie
einsetzbar.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung über die
Mundschleimhaut kann eine therapeutisch wirksame Menge an zumindest
einem Interferon, worin die Menge größer als jene Menge ist, die eine
pathologische Antwort hervorruft, wenn sie parenteral verabreicht
wird, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. Die Zusammensetzung
kann als Lösung,
Tablette, Pastille, Gel, Sirup, Paste oder als Mundschleimhaut-Zufuhrsystem
mit gesteuerter Freisetzung bereitgestellt werden. Gegebenenfalls kann
die Zusammensetzung Puffer, Stabilisatoren, Eindickmittel, Absorptions-
und Viskositäts-Enhancer
und dergleichen enthalten.
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In
einer Ausführungsform
wird die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Einheitsdosis
mit etwa 20 × 106 IE bis etwa 1.000 × 106 IE
Interferon, vorzugsweise etwa 20 × 106 IE
bis etwa 500 × 106 IE, noch bevorzugter etwa 50 × 106 IE bis etwa 500 × 106 IE,
bereitgestellt.
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Das
Verfahren kann entweder als unabhängiger therapeutischer Ansatz
oder als Ergänzung
zu Strahlentherapie, Chemotherapie oder gemeinsam mit anderen Cytokinen,
wie Interleukin-2, -12 oder -15, oder mit IFN-Induktoren durchgeführt werden.
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Das
Verfahren wird vorzugsweise unter Verwendung eines Typ-I- oder Typ-II-IFN,
ausgewählt
aus α, β, γ, ω und Consensus-Interferonen,
am meisten bevorzugt mit einem rekombinanten IFN-α, durchgeführt.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung wird nun im Detail anhand von Verweisen und nur unter
Verwendung der folgenden Definitionen und Beispielen beschrieben.
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Definitionen
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Wie
hierin verwendet bezieht sich "Interferon" auf ein Interferon
vom Typ I oder Typ II, einschließlich jener, die üblicherweise
als α, β, γ und ω bezeichnet
werden, und Gemischen davon, einschließlich der Consensus-Sequenz.
Interferone sind aus zahlreichen verschiedenen Handelsquellen erhältlich und
sind zur Behandlung zahlreicher Indikationen anerkannt. Das Interferon
kann aus natürlichen
Quellen stammen, ist vorzugsweise jedoch ein rekombinantes Produkt.
Für die
Zwecke der Erfindung umfasst die Bezeichnung "Interferon" auch Polypeptide oder ihre Fragmente,
die Interferonaktivität
aufweisen, und chimäre
oder mutierte Formen von Interferon, in die Sequenzmodifikationen
eingeführt
wurden, beispielsweise um Stabilität zu steigern, ohne die Natur
ihrer biologischen Aktivität
zu beeinflussen, wie sie u.a. beispielsweise in den US-Patenten
Nr. 5.582.824, 5.593.667 und 5.594.107 offenbart sind.
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Unter
der Bezeichnung "hohe
Dosis" wird eine
Dosis über
der maximalen, üblicherweise
tolerierten Dosis desselben Interferon bei parenteraler Verabreichung,
z.B. intravenöser
oder intraperitonealer Verabreichung, verstanden. Wie zur Zeit ange nommen
beläuft
sich eine hohe Dosis an Interferon auf mehr als etwa 20 × 106 IE homologes Interferon-α für eine erwachsene
Person mit 70 kg. Vorzugsweise liegt die Dosis über etwa 30 × 106 IE. In einer besonders bevorzugten Form
der Erfindung beläuft
sich die Gesamtdosis auf etwa 50 × 106 IE
bis etwa 1.000 × 106 IE, am meisten bevorzugte auf etwa 50 × 106 IE bis 500 × 106 IE.
Wie hierin verwendet wird eine "hohe
Dosis" im Allgemeinen
als eine therapeutisch wirksame Dosis betrachtet, wenn sie über die
Mundschleimhaut verabreicht wird, und die, wenn sie parenteral verabreicht
wird, eine pathologische Antwort induzieren würde, die sich entweder durch
das Auftreten von unerwünschten
Nebenwirkungen oder durch Ersatzmarker von Toxizität zeigen
würde.
Die Definition von hoher Dosis ist notwendigerweise flexibel, da
sie u.a. je nach individueller Empfindlichkeit, Größe, Gewicht
und Alter des Patienten, der Art und Schwere der zu behandelnden
Erkrankung, dem jeweils verwendeten Interferon und dem spezifischen
Verabreichungsvehikel variieren kann. Ein Arzt, der einen Patienten
mit einem bestimmten Interferon behandelt, wird in der Lage sein,
den geeigneten hohen Dosierungsbereich für den zu behandelnden Patienten
problemlos zu bestimmen.
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Gegebenenfalls
kann das Interferon gleichzeitig mit einem Induktor von Interferonsynthese
und -freisetzung verabreicht werden. Der Induktor kann zusammen
mit dem Interferon oder getrennt verabreicht werden. Interferoninduktoren
umfassen beispielsweise Polynucleotide wie Poly I:C; vorzugsweise
wird ein niedermolekularer, oral verabreichbarer Interferoninduktor
verwendet. Geeignete Induktoren sind auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt, beispielsweise Tiloron (US-Patent Nr. 3592819; Albrecht
et al., J. Med. Chem. 17, 1150–1156
(1974)) und das Chinolonderivat Imiquimod (Savage et al., Brit.
J. Cancer 74, 1482–1486
(1996)).
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Die
Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung können gegebenenfalls in Verbindung
mit einer oder mehreren anderen Behandlungen für die jeweilige Erkrankung
verwendet werden, und der zuständige Arzt
wird leicht in der Lage sein, solch eine andere Behandlung, die
unter den bestimmten Umständen
geeignet sein könnte,
auszuwählen.
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In
einer Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bei
einem Menschen bereit, das den Schritt der Verabreichung von Interferon
wie zuvor beschrieben umfasst. Der Krebs kann ein metastasierender
Krebs sein.
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Obwohl
des Verfahren der Erfindung ohne gleichzeitige Behandlung mit anderen
Mitteln eingesetzt werden kann, wird erwogen, dass diese Ausführungsform
der Erfindung in den folgenden Situationen besonders nützlich ist:
- a) als Adjuvanstherapie, nach einem chirurgischen
Eingriff, einer Chemotherapie oder einer Strahlentherapie gemäß herkömmlichen
Therapievorschriften;
- b) zur Behandlung von Interferon-empfindlichen Krebsarten wird
das Verfahren der Erfindung entweder alleine oder in Verbindung
mit herkömmlicher
Chemotherapie oder Strahlentherapie eingesetzt; und
- c) zur Behandlung von Interfern-resistenten Krebsarten wird
das Verfahren der Erfindung entweder alleine oder am meisten bevorzugt
in Verbindung mit herkömmlicher
Chemotherapie oder Strahlentherapie eingesetzt.
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Die
obigen Verfahren zielen darauf ab, eine Remission der Erkrankung
zu induzieren und/oder aufrechtzuerhalten. Unter "in Verbindung mit
einer anderen Behandlung" wird
verstanden, dass das Interferon vor, während und/oder nach der Strahlentherapie
oder einer anderen Chemotherapie verabreicht wird. Die geeignetste
Therapievorschrift hängt
von zahlreichen verschiedenen Faktoren ab, wie nachstehend noch
erläutert wird.
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Insbesondere
wird erwogen, dass das Verfahren der Erfindung vorzugsweise in Verbindung
mit zumindest einer anderen Behandlung, ausgewählt aus der aus Chemotherapie
unter Verwendung von zytostatischen Wirkstoffen, einem oder mehreren
Cytokinen, die Antikrebs-Aktivität
aufweisen, jedoch einen anderen Wirkmechanismus als Interferon haben,
antiangiogenen Mitteln und Mitteln, die die Aktivität von Interferon
potenzieren, bestehenden Gruppe, verwendet wird. Vorzugsweise ist
das zweite Cytokin Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-12
(IL-12) oder Interleukin-15 (IL-15); vorzugsweise ist der Angiogeneseinhibitor AGM-1470;
vor zugsweise erfolgt die Interferon potenzierende Behandlung mittels
Hyperthermie oder Argininbutyrat.
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Bevorzugte
zytostatische Wirkstoffe, die in Verbindung mit Interferon verabreicht
werden, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Cyclophosphamid, Cisplatin,
Carboplatin, Carmustin (BCNU; N,N-Bis(2-chlorethyl)-N-nitrosoharnstoff),
Methotrexat, Adriamycin, α-Difluormethylornithin
und 5-Fluoruracil.
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Die
Krebsarten, die für
dieses Verfahren anfällig
sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Krebsarten, die auf
parenterale Verabreichung von hohen Dosen an IFN-α reagieren,
wie hämatologische
Malignitäten,
multiples Myelom, Haarzellenleukämie
oder chronische myelogene Leukämie,
minderschwere Lymphome, Haut-T-Zell-Lymphome,
feste Tumoren wie Nierenzellkarzinom und -melanom, karzinoide Tumoren oder
mit AIDS verbundenes Kaposi-Sarkom, insbesondere maligne Tumoren
mit nichtviraler Ätiologie.
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Bei
der Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung
in dieser Erfindung können
zahlreiche verschiedene Vehikel und Arzneimittelträger für IFN verwendet
werden, wie Fachleuten sicherlich bekannt ist. Beispielhafte Formulierungsverfahren
werden u.a. in Remington: The Science and Practice of Pharmacy,
19. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995), und den vorangehenden
Auflagen beschrieben. Die IFN-Formulierung kann Stabilitäts-Enhancer
wie Glycin oder Alanin, wie im US-Patent Nr. 4.496.537 beschrieben,
und/oder einen oder mehrere Träger
wie ein Trägerprotein
umfassen. Zur Behandlung von Menschen beispielsweise wird üblicherweise
menschliches Serumalbumin mit pharmazeutischer Reinheit, gegebenenfalls
zusammen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel,
verwendet. Ist der Arzneimittelträger für IFN menschliches Serumalbumin,
so kann das menschliche Serumalbumin aus menschlichem Serum stammen
oder es kann rekombinanten Ursprungs sein. Normalerweise ist Serumalbumin,
wenn es verwendet wird, homologen Ursprungs.
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Das
IFN kann durch jegliches Mittel verabreicht werden, das für Kontakt
von IFN mit dem mit Mundschleimhaut ausgekleideten Hohlraum des
Rezipienten sorgt. Somit ist eindeutig verständlich, dass die Erfindung
nicht auf einen bestimmten Formulierungstyp beschränkt ist.
Die vorliegende Beschreibung beschreibt die Verabreichung von IFN
tief in den mit Mundschleimhaut ausgekleideten Hohlraum hinein;
dies kann mit Flüssigkeiten,
Feststoffen oder Aerosolen sowie mit Nasentropfen oder -sprays erreicht
werden. Somit umfasst die Erfindung, ist jedoch nicht beschränkt auf,
Flüssigkeiten,
Spray, Sirup, Pastillen, Tabletten zur oralen Einnahme und Zerstäuberformulierungen.
Fachleute werden erkennen, dass für Aerosol- oder Zerstäuberformulierungen
die Partikelgröße des Präparats wichtig
sein kann, und sie werden geeignete Verfahren kennen, mittels derer
die Partikelgröße modifiziert
werden kann.
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In
einem Aspekt wird das Interferon in einer einzelnen Dosis verabreicht.
Alternativ dazu wird das Interferon in mehreren kleineren Dosen,
die auf einen bestimmten Zeitraum aufgeteilt sind, verabreicht,
sodass die tatsächliche
Wirkung jener der Verabreichung der einzelnen höheren Dosis entspricht. Ein
Ansatz zu diesem Zufuhrverfahren arbeitet über die Bereitstellung einer
Retardvorrichtung oder einer Vorrichtung zur gesteuerten Freisetzung,
die im Mundschleimhauthohlraum angebracht oder in diesen implantiert
und so konzipiert ist, dass sie Interferon über einen bestimmten Zeitraum
in einer Menge freisetzt, die jener einer einzelnen hohen Dosis
entspricht.
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Beispiele
für Interferonformulierungen
zur Anwendung an der Mundschleimhaut umfassen die folgenden Formulierungen
(alle % sind Gew.-%):
Tablette: Dextrose BP 45 %; Gelatine
BP 30 %; Weizenstärke
BP 11 %; Carmellose-Natrium
BP 5 %; Ovalbumin BPC 4 &;
Leucin USP 3 %; Propylenglykol BP 2 %; und 50 × 106 IE
IFN-α2.
Die Tablette kann je nach Bedarf unverändert verwendet und langsam
im Mund auflösen
gelassen werden, oder sie kann in Wasser aufgelöst und im Mund in Kontakt mit
der Mundschleimhaut gehalten werden.
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Eine
Interferonpaste kann wie im US-Patent Nr. 4.675.184 beschrieben
aus Glycerin 45 %, Natrium CMC 2 %, Citratpuffer (pH 4,5) 25 %,
destilliertem Wasser auf 100 % und 50 × 106 IE
IFN-α2 hergestellt
werden. Die Interferonpaste kann an die Mundschleimhaut aufgetragen
werden.
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In ähnlicher
Weise kann ein Gurgelmittel oder ein Sirup durch Zusatz der erwünschten
Mengen an Interferon zu einem handelsüblichen Mundwasser oder einer
Hustensirupformulierung hergestellt werden.
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Innerhalb
der spezifischen Dosierungsbereich, auf die oben Bezug genommen
wurde, hängt
die optimale Behandlung in jedem einzelnen Fall von der Art des
betreffenden Leidens, der Phase der Erkrankung, früheren Therapien,
anderen kontinuierlichen Therapien, dem allgemeinen Gesundheitszustand
des Säugetiers,
der Empfindlichkeit des Individuums gegenüber Interferon und dergleichen
ab und wird somit nach dem Ermessen des behandelnden Arztes bestimmt,
der all diese Umstände
bei seiner Entscheidung berücksichtigt. Die
Dauer der Behandlung variiert natürlich mit der zu behandelnden
Erkrankung, beispielsweise wird erwartet, dass die Behandlung eines
langsam wachsenden Krebses, wie Prostatakrebs, einen anderen Behandlungsverlauf
umfasst als die Behandlung eines rasch wachsenden Krebses, wie beispielsweise
von hepatischem zellulärem
Karzinom.
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Die
hierin offenbarte, wirksame Dosis ist eine, die eine pathologische
Antwort im Patienten hervorruft, wenn sie parenteral verabreicht
wird, die jedoch sowohl wirksam und entweder nichttoxisch oder weniger
toxisch ist, wenn sie über
die Mundschleimhaut verabreicht wird. Eine pathologische Antwort
kann akut, chronisch oder kumulativ sein und kann sich durch Veränderungen
der Körperchemie,
z.B. in Form von Leukozytopenie, Knochenmarkdepression oder anderen
histologischen Parametern, manifestieren. Wie hierin verwendet umfasst
eine pathologische Antwort negative Nebenwirkungen wie Fieber, Unwohlsein
oder grippeähnliche Symptome,
vaskuläre
Reaktionen wie Phlebitis und lokale Entzündungsreaktionen an der Stelle
der Injektion. Solche Antworten variieren in Anbetracht der individuellen
Unterschiede bezüglich
der Empfindlichkeit gegenüber
Interferon unter den verschiedenen Patienten stark.
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Für zahlreiche
Patienten wird angenommen, dass Dosen für die Mundschleimhaut jene überschreiten, die
in bestehenden anerkannten Therapievorschriften zur parenteralen
Verabreichung toleriert werden können.
In einer Ausführungsform
kann die Gesamtdosis in mehreren kleineren Dosen über einen
bestimmten Zeitraum verabreicht werden, oder sie kann sogar kontinuierlich
oder in Intervallen aus einer Vorrichtung zur gesteuerten Freisetzung,
die an der Mundschleimhaut angebracht oder in diese implantiert
ist, zugeführt
werden.
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INTERFERONE UND INTERFERONFORMULIERUNGEN
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Maus-IFN-α/β
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Maus-IFN-α/β (Mu IFN-α/β) wurde aus
Kulturen von C243-3-Zellen, induziert mit Newcastle-Krankheitsvirus
(NDV), hergestellt und wie zuvor beschrieben gereinigt (Tovey et
al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 146, 809–815 (1974)). Das in dieser
Studie verwendete Präparat
hatte einen Titer von 4 × 106 Internationalen Einheiten (IE)/ml und eine
spezifische Aktivität
von 5 × 107 IE/mg Protein, wie an Maus-929-Zellen, provoziert mit
Gingivostomatitis-herpetica-Virus (vesicular stomatitis virus, VSV)
wie zuvor beschrieben (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med.
146, 809–815
(1974)), getestet wurde. Das Präparat
wurde auf das internationale Referenzpräparat von murinem IFN-α/β der National
Institutes of Health (NIH) (G-002-9004-5411) bezogen standardisiert.
-
Menschliches IFN-α-1-8
-
Rekombinantes
menschliches IFN-α-1-8
(Hu IFN-α 1–8; BDBB
Chargen-Nr. CGP 35269-1, Ciba-Geigy, Basel, Schweiz) wurde wie zuvor
beschrieben (Meister et al., J. Gen. Virol. 67, 1633–1643 (1986))
hergestellt und gereinigt. Das in dieser Studie verwendete Präparat hatte
einen Titer von 70 × 106 IE/ml an homologen menschlichen WISH-Zellen,
provoziert mit VSV wie zuvor beschrieben (Tovey et al., Nature 267,
455–457 (1977)),
und einen Titer an heterologen Maus-L929-Zellen von 1 × 106 IE/ml. Das Präparat wurde im Vergleich sowohl
auf das internationale menschliche IFN-α- Referenzpräparat der NIH (G-023-901-527)
als auch auf den murinen IFN-α/β-Standard
(G-002-9004-5411) bezogen standardisiert. Die spezifische Aktivität des IFN-Präparats betrug
2 × 108 IE/mg Protein.
-
REKOMBINANTES
MURINES INTERFERON-α
-
Rekombinantes
murines Interferon-α wurde
bei Life Technologies Inc. erworben. Das in dieser Studie verwendete
Präparat
(Chargen-Nr. HKK404) hatte einen Titer von 6 × 106 IE/ml
und eine spezifische Aktivität von
6 × 108 IE/mg Protein, wie an Maus-L929-Zellen, provoziert
mit VSV (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 146, 809–815 (1974)),
getestet wurde.
-
REKOMBINANTES
MURINES INTERFERON-β
-
Rekombinantes
murines Interferon-β wurde
bei R & D Systems
Inc. erworben. Das in dieser Studie verwendete Präparat (Chargen-Nr.
1976–01S)
hatte einen Titer von 3,2 × 104 IE/ml und eine spezifische Aktivität von 8 × 106 IE/mg Protein, wie an Maus-L929-Zellen, provoziert
mit VSV (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 146, 809–815 (1974)),
getestet wurde.
-
REKOMBINANTES MURINES
INTERFERON-γ
-
Rekombinantes
murines Interferon-γ wurde
bei R & D Systems
Inc. erworben. Das in dieser Studie verwendete Präparat (Chargen-Nr.
2580–03SA)
hatte einen Titer von 2 × 105 IE/ml und eine spezifische Aktivität von 1 × 107 IE/mg Protein, wie an Maus-L929-Zellen, provoziert
mit VSV (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 146, 809–815 (1974)),
getestet wurde.
-
Alle
Interferonpräparate
wurden gleichzeitig im selben Test titriert und auf das internationale
Referenzpräparat
von murinem Interferon α/β der US National
Institutes of Health (G-002-9004-5411) bezogen standardisiert.
-
Sowohl
murines Interferon-α/β als auch
rekombinante murine Interferone wurden vor der Verabreichung in
FerimmuneTM-Arzneimittelträger aufgenommen.
-
ARZNEIMITTELTRÄGER
-
Interferonpräparate wurden
entweder in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die Rinderserumalbumin
(BSA) enthielt, oder in den nachstehend beschriebenen, markenrechtlich
geschützten
Arzneimittelträgern
verdünnt.
Rinderserumalbuminfraktion V (RIA-Grad; Immunglobulin-frei; Kat.-Nr.
A7888; Sigma; USA) wurde in einer Endkonzentration von 100 μg/ml in PBS
(pH 7,4) aufgelöst
und durch Filtration sterilisiert (0,2 μ, Millex-GV, Millipore, USA).
-
In
den hierin beschriebenen Versuchen wurden die Interferonpräparate in
einem markenrechtlich geschützten
Arzneimittelträger
verdünnt.
Der verwendete Arzneimittelträger
wurde wie folgt in Form von Tabletten zugeführt (Ferimmune
TM,
Pharma Pacific):
-
Eine
einzelne Tablette wurde in 1,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgelöst, bei
16.000 g 15 min lang zentrifugiert und anschließend steril filtriert (0,2 ×, Millex-GV,
Millipore, USA) und bei 4°C
bis zur Verwendung gelagert. Arzneimittelträger wurde täglich vor der Verwendung hergestellt.
-
INTERFERON-ZUFUHRSYSTEM
-
Frühere Versuche
zeigten, dass die Anwendung von 5 μl Kristallviolett in jeder Nüster einer
normalen erwachsenen Maus unter Verwendung einer P20-Eppendorf-Mikropipette
zu einer beinahe unmittelbaren Verteilung des Farbstoffs über die
gesamte Oberfläche
des oropharyngealen Hohlraums führte.
Die Färbung
des oropharyngealen Hohlraums war auch etwa 30 min nach Anwendung
des Farbstoffs noch sichtbar. Im Wesentlichen ähnliche Resultate wurden unter
Verwendung von 125I-markiertem, rekombinantem menschlichem
IFN-α 1–8, das
in derselben Weise angewandt wurde, erzielt. Dieser Verabreichungsverfahren
wurde daher in allen nachfolgenden Versuchen verwendet.
-
Für die Zwecke
der in dieser Beschreibung dargestellten Tierversuche ist eindeutig
zu verstehen, dass die Ausdrücke "oromucosal" ("Mundschleimhaut") oder "oropharyngeal" oder "intranasal/oral" oder "intranasal plus oral" oder "in/or" in Bezug auf die
Art der Verabreichung von IFN eine Art Verabreichung des IFN-Präparats tief
in den Nasenhohlraum, sodass es rasch in den mit Mundschleimhaut
ausgekleideten Hohlraum, d.h. den Mund und Hals des Rezipientensäugetiers,
verteilt wird, um mit der diesen Hohlraum auskleidenden Schleimhaut
in Kontakt zu treten, bezeichnen.
-
EMCV (ENZEPHALOMYOKARDITISVIRUS)
-
- Charge: Chargen-Nr. 095001
- Ablaufdatum: Dezember 1997
- Herstellung: EMCV-Stamm JH wurde auf Maus-L929-Zellen unter
Verwendung von bereits früher
beschriebenen Verfahren (I. Gresser, C. Bourali, M.T. Thomas, E.
Falcoff. Effect of repeated inoculation of interferon preparations
on infection of mice with encephalomyocarditis virus. Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 127, 491–496 (1968))
vermehrt
- Charakterisierung: Der in dieser Studie verwendete Virusstamm
hatte einen Titer von 5 × 108 62TCID50 an Maus-L929-Zellen.
- Lagerung: Stamm-EMCV wurde bei –70°C gelagert. Ein Stromausfall
an Tag 1 der Virus-Titration erforderte vorübergehenden Transfer in Sicherungslagerplätze bei
etwa denselben Temperaturen. Das Material blieb über den gesamten Zeitraum hinweg
gefroren. An Tag +8 der Virus-Titration wurde die Temperatur des –70°C-Gefriergerätes auf –60°C angehoben.
Verdünntes
EMCV wurde unmittelbar vor Verwendung hergestellt und wurde bis
zur Verwendung auf Eis oder im Tierraum-Kühlgerät gehalten.
-
FRIEND-ERYTHROLEUKÄMIEZELLEN
-
Der
IFN-α/β-resistente
Klon, 3C18, von Friend-Erythroleukämiezellen (FLC) wurde von Dr.
E. Affabris, Rom, erhalten und wird im Detail auch von Affabris
et al., Virology 120, 441–452
(1982), beschrieben. Diese Zellen wurden daraufhin durch In-vivo-Passage
aufrechterhalten. Kurz zusammengefasst wurden DBA/2-Mäuse durch
intraperitoneale (ip) Injektion mit etwa 100 LD50 von
3C18-Zellen inokuliert, und eine Woche später wurden die Tumorzellen
aus dem Peritoneum der Mäuse
geerntet, gezählt,
und andere Mäuse
wurden wiederum mit 100 LD50 von 3C18-Zellen
inokuliert. Dieses Verfahren wurde für 60 bis 100 Passagen wiederholt.
Es wurde gezeigt, dass die bei der 60. und 100. In-vivo-Passage
verwendeten 3C18-Zellen für
die Leber und Milz hoch metastasierend waren (Gresser et al., Int.
J. Cancer 39, 789–792
(1987)). Der Phänotyp
von IFN-Resistenz wurde routinemäßig durch
Kultivieren der In-vivo-Passage
unterzogenen Zellen in vitro in der Gegenwart von IFN-α/β bestätigt (Belardelli
et al., Int. J. Cancer 30, 813–820
(1982)).
-
L1210R6-KLON & EL4-TRANSPLANTIERBARER
TUMOR
-
Der
IFN-α/β-resistente
Klon, L1210R6, von L1210-Lymphomzellen wurde in den Laboratorien
der Erfinder isoliert (Gresser et al., Interferon and cell division.
IX. Interferon-resistant L1210 cells: Characteristics and Origin.,
J. Nat. Cancer Inist. 52, 553–559
(1974)).
-
Der
EL4-transplantierbare Tumor stammte ursprünglich aus Mäusen, die
mit dem chemischen Karzinogen 1-2-Dimethylbenzanthrein inokuliert
worden waren (P.A. Gorer, Br. J. Cancer 4, 372–381 (1950)).
-
Die
L1210-Lymphomzellen wurden durch serielle In-vivo-Passage in spezifischpathogenfreien DBA/2-Mäusen aufrechterhalten.
-
Der
EL4-Tumor wurde durch serielle In-vivo-Passage in spezifisch-pathogenfreien
C57BL/6-Mäusen aufrechterhalten.
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B16-MELANOM
-
Das
B16-Melanom ist ein transplantierbarer Tumor spontanen Ursprungs,
der aus einer C57BL/6-Maus stammt (I.J. Fidler & M.L. Kriple, Science 197, 893–897 (1977)).
Das B16-Melanom ist ein rasch wachsender, hoch anaplastischer, Melanin-produzierender
Tumor, der prinzipiell in die Lunge metastasiert. Das B16-Melanom
wird als gutes Modell für
rasch wachsende, hochaggressive menschliche Tumoren angesehen.
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B16-Melanomzellen
wurden durch serielle In-vivo-Passage in spezifisch-pathogenfreien C57BL/6-Mäusen aufrechterhalten.
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TIERE
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Die
in dieser Studie verwendeten Mäuse
wurden aus einer spezifisch-pathogenfreien Kolonie (IFFA CREDO,
Frankreich) erhalten. Sie wurden in einer spezifisch-pathogenfreien
Tiervorrichtung am Institut Federatif CNRS in Villejuif gemäß EEC-Standards
untergebracht.
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INTERFERON-BIOASSAY
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Interferon
wurde gemäß einem
herkömmlichen
Verfahren getestet. Kurz zusammengefasst wurden Proben (20 μl) in 80 μl Eagle's Minimal Essential
Medium (MEM) (Gibco, Frankreich), das 2 % hitzedeaktiviertes fötales Rinderserum
(FCS) (Gibco, Frankreich) enthielt, verdünnt und zu jedem Well einer
Mikrotiterplatte (Falcon, Kat.- Nr. 3072) unter Verwendung einer
Mehrkanalmikropipette (Finnpipette, Labsystem, 50–300 μl) zugesetzt.
WISH- oder L929-Zellen (2 × 104 Zellen/Well) wurden in 100 μl MEM, das
2 % FCS enthielt, zugesetzt und über
Nacht bei 37°C
in einer Atmosphäre
von 5 % CO2 in Luft (Forma 3029 CO2-Inkubator) inkubiert. Die Zellen wurden
auf jegliche Zeichen von Toxizität
unter Verwendung eines verkehrten Olympus-IIM-GLDW-Mikroskops, das mit einem 10X-Objektiv
ausgestattet war, untersucht. Proben, die keine nachweisbare Toxizität aufwiesen,
wurden anschließend
Zweifach-Reihenverdünnungen,
ausgehend von einer Anfangs-1:10-Verdünnung in einem Gesamtvolumen
von 200 μl
Eagle's MEM, das
2 % FCS enthielt, durch Übertragen
von 100 μl
verdünntem
Material mit einer Mehrkanalmikropipette in eine Mikrotiterplatte,
die 100 μl
pro Well an frischem Eagle's
MEM mit 2 % FCS enthielt, unterzogen. Ebenfalls wurden Zweifach-Reihenverdünnungen
des menschlichen IFN-α-Referenzstandard
der NIH (G-023-901-527) oder des murinen IFN-α/β-Referenzstandard der NIH (G-002-9004-5411)
hergestellt. WISH- oder L929-Zellen (2 × 104 Zellen/Well)
in 100 μl Eagle's MEM mit 2 % FCS
wurden anschließend
zu jeder Platte, sofern geeignet, zugesetzt und über Nacht bei 37°C in einer
Atmosphäre
von 5 % CO2 in Luft inkubiert. Die Zell-Monolayer
wurden dann auf jegliche Zeichen von Toxizität überprüft, und bei Abwesenheit von
jeglicher augenscheinlicher Toxizität wurde die Kultur abgesaugt
und durch 200 μl
Eagle's MEM, das
2 % FCS enthielt, das 100 TCID50 von VSV
enthielt (2 × 10–4 VSV23 für
WISH-Zellen oder 10–5 VSV23 für L929-Zellen)
ersetzt. Die Platten wurden dann über Nacht bei 37°C in einer
Atmosphäre
von 5 % CO2 in Luft inkubiert. Die Zell-Monolayer
wurden anschließend
unter Verwendung eines verkehrten Olympus-IM-ULWD-Mikroskops auf
spezifische virale zytopathogene Wirkung untersucht. Interferontiter
wurden anhand des Kehrwerts der Verdünnung bestimmt, der 50 % Schutz
vor spezifischer viraler zytopathogener Wirkung ergab, und sind
in internationalen Referenzeinheiten/ml (IE/ml) angegeben.
-
Beispiel 1 Wirkung von
hochdosiertem Interferon auf das Überleben nach letalem Challenge
mit EMCV (Enzephalomyokarditisvirus)
-
Die
Wirkungen von IFN-α-Dosen
von 1.000, 10.000 und 100.000 IE, verabreicht über die Mundschleimhaut, wurde
in männlichen
und weiblichen Mäusen,
denen eine letale Dosis an EMCV verabreicht wurde, getestet. Verschiedene
Typen von IFN-α wurden
getestet, und die Wirkung der Verabreichung über die Mundschleimhaut wurde
mit jener von intraperitonealer (ip) Verabreichung verglichen. Zusätzlich zur
Beobachtung des Überlebens
nach dem letalen Challenge wurde die Toxizität der IFN-Behandlung unter
Verwendung verschiedener klinisch-chemischer und hämatologischer
Parameter beobachtet.
-
Die
Behandlung von Mäusen
mit 105 IE an IFN-α durch Verabreichung über die
Mundschleimhaut einmal täglich
4 Tage lang führte
zu einem vollständigen
Schutz aller Tiere, wenn die Behandlung nach der Virusinfektion
begonnen wurde. Hundert Tage nach der Infektion mit der letalen
Dosis an EMCV (100 LD50) unter denselben
Bedingungen, unter denen alle virusinfizierten, nicht behandelten
Kontrolltiere innerhalb von 7 Tagen starben, hatten 100 Prozent
der IFN-behandelten Tiere überlebt
und waren sogar bei gutem Gesundheitszustand.
-
Bezogen
auf das Körpergewicht
entspricht die Behandlung von Mäusen
mit 105 IE mittels Verabreichung über die
Mundschleimhaut einer Dosis beim Menschen von 240 Millionen IE,
was nach Kenntnis der Erfinder wesentlich mehr ist, als jemals einem
Menschen verabreicht wurde.
-
Da
die Behandlung von Mäusen
mit 105 IE an IFN-α über den in/or-Weg zu einem
höheren
Maß an Schutz
führte
als die Behandlung von Tieren mit 104 IE
an IFN-α,
ist es wahrscheinlich, dass sogar noch stärkere Wirkungen (gegen eine
noch größere Virusbelastung
oder Tumorbelastung) mit sogar noch höheren Dosen an IFN-α erzielt
werden können.
Bis heute konnten die Erfinder noch keinen Hinweis auf einen Abflachung der
Dosis-Reaktions-Kurve feststellen.
-
Die
Resultate der Erfinder zeigen auch, dass hohe bis extrem hohe Dosen
an IFN, die über
den in/or-Weg verabreicht werden, eine stark schützende antivirale Wirkung zeigen
und dass 105 IE an IFN-α, die auf diesem Weg verabreicht
werden, eine vollständige
Behandlung gegen die verwendete EMCV-Dosis bereitstellt. Trotz der
Tatsache, dass die verwendeten Dosen auf das Körpergewicht gerechnet noch
viel höher
waren als jene, die je an Menschen verabreicht worden waren, nämlich 240 × 106 IE, wurde kein klinischer, biochemischer
oder hämatologischer
Beweis für
Toxizität
beobachtet. Hingegen liegt die maximale tolerierte Dosis an parenteral
verabreichtem IFN in der klinischen Praxis im Bereich von 20 bis
30 × 106 IE täglich.
-
Beispiel 2 Wirkung von
hochdosiertem IFN-α auf
Mäuse.
die mit stark metastasierenden Tumorzellen provoziert wurden
-
Gruppen
von 10, sechs Wochen alten DBA/2-Mäusen wurden intravenös entweder
mit 105 Friend-Erythroleukämiezellen
des Interferon-resistenten Klons 3C18 oder mit 105 L1210-Lymphomzellen
(Interferon-resistente L1210R-Zellen) an Tag 0 provoziert. Nach
der Inokulation wurden die Mäuse
entweder unbehandelt gelassen oder zweimal täglich 20 Tage lang über den
in/or-Weg mit 105 IE Maus-IFN-α/β in einem
Volumen von 10 μl
Arzneimittelträger
oder mit 10 μl
Arzneimittelträger
alleine (Kontrolle) behandelt.
-
Hundert
Tage nach der Inokulation mit den stark metastasierenden Friend-Erythroleukämiezellen
hatten 50 Prozent der Tiere, die mit IFN über den in/or-Weg behandelt
worden waren, überlebt
und befanden sich in einem guten Gesundheitszustand. Hundert Tage
nach der Inokulation mit den stark L1210-Lymphomzellen hatten 30
Prozent der Tiere, die mit IFN über
den in/or-Weg behandelt worden waren, überlebt und befanden sich in
einem guten Gesundheitszustand. Klinische Beobachtungen lassen darauf
schließen,
dass alle der IFN-behandelten Tiere, die 100 Tage lang überlebten,
auch eine normale Lebensdauer lang gelebt hätten, wenn sie nicht getötet worden
wären.
Histologische Untersuchungen von Organen zeigten keine verbleibenden
Tumoren. Hingegen waren alle unbehandelten Tiere und Kontrolltiere
innerhalb von 13 Tagen nach dem Challenge mit Friend-Erythroleukämiezellen
bzw. innerhalb von 14 Tagen nach dem Challenge mit L1210-Lymphomzellen
tot.
-
Diese
Resultate sind äußerst bedeutend,
da beide der verwendeten Tumorzelllinien äußerst aggressiv sind und da
die verwendete Challenge-Dosis etwa dem 20.000fachen der LD50 entsprach. Darüber hinaus sind Friend-Leukämie und
L1210-Lymphom darin sehr unterschiedliche Tumortypen, dass Friend-Leukämiezellen ein
Retrovirus, das Friend-Leukämievirus,
tragen, während
L1210-Lymphom mit keiner der bekannten viralen Ätiologien assoziiert werden
kann. Die mit in/or-IFN-α-Therapie
von Tieren, die mit L1210-Lymphom inokuliert wurden, erhaltenen
Resultate scheinen jenen zu entsprechen oder ihnen sogar überlegen
zu sein, die mit systemischer IFN-α-Therapie in diesem Modell erzielt
wurden (I. Gresser, nicht veröffentlichte
Resultate). In der früheren
Studie der Erfinder, über
die in der Australischen vorläufigen
Anmeldung Nr. PN9765 der Erfinder berichtet wurde, überlebte
keine der mit Friend-Leukämiezellen
inokulierten und mit 100 oder 1.000 IE an IFN-α behandelten Mäuse, und
bei einer Dosis von 10.000 IE wurden nur 10–20 % der Tiere als geheilt
angesehen.
-
Beispiel 3 Wirkung von
hochdosiertem IFN-α auf
Mäuse,
die mit stark metastasierenden B16-Melanomzellen oder EL4-Tumorzellen
provoziert wurden
-
Gruppen
von 10 Wochen alten C57B1/6-Mäusen
wurden intravenös
entweder mit 105 B16-Melanomzellen oder
mit 105 EL4-Tumorzellen provoziert. Nach
der Inokulation wurden die Mäuse
entweder unbehandelt belassen oder zweimal täglich 20 Tage lang über den
in/or-Weg mit 105 IE an Maus-IFN-α/β in einem
Volumen von 10 μl
Arzneimittelträger
oder mit 10 μl
Arzneimittelträger
alleine (Kontrolle) behandelt.
-
Dreißig Prozent
der mit IFN über
den in/or-Weg behandelten Tiere waren 100 Tage nach Inokulation mit
hoch metastasierenden B16-Melanomzellen oder EL4-Tumorzellen am
Leben und bei guter Gesundheit. Hingegen starben alle unbehandelten
Tiere und Kontrolltiere innerhalb von 20 Tagen nach dem Challenge
mit B16-Melanomzellen bzw. innerhalb von 22 Tagen nach dem Challenge
mit L4-Tumorzellen. Klinische Beobachtungen lassen darauf schließen, dass
alle der IFN-behandelten Tiere, die nach 100 Tagen noch am Leben waren,
auch weiter überlebt
hätten,
wenn sie nicht getötet
worden wären,
obwohl die Interferonbehandlung nach 20 Tagen beendet worden war.
Histologische Untersuchungen der Organe zeigten, dass in Interferon-behandelten
Tieren, die nach 100 Tagen getötet
worden waren, kein Tumor verblieben war.
-
Vergleichsbeispiel 4 Wirkung
von über
die Mundschleimhaut verabreichtem Interferon gegen Gingivostomatitis-herpetica-Virus
-
Gruppen
von zehn 6 Wochen alten Mäusen
aus einer spezifischen, pathogenfreien Zuchtkolonie wurden intranasal
mit 100 LD50 an Gingivostomatitis-herpetica-Virus
(VSV) (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 146, 406–415 (1974))
in einem Volumen von 10 μl
infiziert. Sieben Stunden nach der Virusinfektion wurden Mäuse entweder
unbehandelt belassen oder einmal täglich 4 Tage lang mittels intranasaler/oraler
Verabreichung mit einer gegeben Dosis an murinem Interferon α/β in einem
Volu men von 10 μl
Ferimmune-Arzneimittelträger
oder mit 10 μl
Arzneimittelträger
alleine (Kontrolle) behandelt.
-
Die
Behandlung von erwachsenen Mäusen
mit murinem Interferon α/β resultierte
in einem ausgeprägten
Anstieg des Prozentsatzes an Tieren, die die Infektion mit einer
letalen Dosis an VSV überlebten.
Somit waren 30 % der mit 10.000 IE Interferon α/β behandelten Tiere 21 Tage nach
der Infektion mit der letalen Dosis an VSV am Leben, und dies unter
denselben Bedingungen, unter denen alle unbehandelten Tiere oder
die mit Arzneimittelträger
behandelten, virusinfizierten Kontrolltiere bis zum 10. Tag tot
waren. Klinische Beobachtungen lassen darauf schließen, dass
die meisten der Interferon-behandelten Tiere, die bis zum 21. Tag überlebten,
auch weiter überleben
würden.
-
Beispiel 5 Wirkung von über die
Mundschleimhaut verabreichtem Interferon auf die Expression von
zellulären Proteinen
-
IFN-α ist bekannt
dafür,
die Expression zahlreicher zellulärer Proteine nach Bindung des
Proteins an seinen Zelloberflächenrezeptor
zu induzieren. Von diesen Proteinen wird angenommen, dass sie einen
nützlichen
Marker für
IFN-Wirkung darstellen.
-
Die
Erfinder bewerteten die Wirkung von IFN-α, das über den in/or-Weg verabreicht
wurde, auf die Expression von drei IFN-induzierten Proteinen, MHC-Klasse-I-Antigenen,
Ly-6A/E-Antigen und 2'-5'-Oligoadenylatsynthetase.
-
Die
Behandlung von DBA-2-Mäusen
(H-2Kd) mit bis zu 20.000 IE an Mu IFN-α über den
in/or-Weg steigerte H-2-Kd-Expression an
peripheren Blutlymphozyten, -monozyten oder -granulozyten unter
Bedingungen nicht signifikant, unter denen eine geringe Menge wie
20 IE an Mu IFN-α,
das intraperitoneal verabreicht wurde, die Expression von H-2-Kd-Antigenen sowohl an peripheren Blutmonozyten
als auch -granulozyten deutlich steigerte. Tatsächlich war die Expression an
Monozyten leicht unterdrückt.
-
In ähnlicher
Weise zeigte die Behandlung von Mäusen mit bis zu 20.000 IE an
IFN-α über den in/or-Weg
keine signifikante Wirkung auf die Expression von Ly6-A/E-Antigenen,
deren Expression an der Oberfläche
von zahlreichen verschiedenen Lymphzellen nach parenteraler Verabreichung
von Typ-I-IFN deutlich anstieg (Dumont et al., J. Immunol. 137,
201–210
(1986)). Ähnliche
Resultate wurden mit 200 oder 20.000 IE von entweder Mu IFN-α oder Hu
IFN-α 1–8 über den
in/or-Weg erzielt.
-
Die
Behandlung von entweder Swiss- oder DBA/2-Mäusen mit nur 20 IE an Mu IFN-α, ip injiziert, resultierte
in einem deutlichen Anstieg der 2'-5'-Oligoadenylatsynthetaseaktivität sowohl
in peripheren einkernigen Blutzellen als auch in Splenozyten. Hingegen
steigerte im selben Versuch die Behandlung von Mäusen mit bis zu 20.000 IE an
Mu IFN-α über den
in/or-Weg die Expression von 2'-5'-Oligoadenylatsynthetaseaktivität nicht
signifikant. Weiters zeigte die Behandlung mit 200 oder 20.000 IE
an entweder Mu IFN-α oder
Hu IFN-α über den
in/or-Weg zu keinem getesteten Zeitpunkt innerhalb der ersten 10
Tage nach Beginn der IFN-Behandlung eine signifikante Wirkung auf
2'-5'-Oligoadenylatsynthetaseaktivität.
-
Beispiel 6 Bioverfügbarkeit
von Interferon nach Verabreichung über die Mundschleimhaut
-
Um
die Bioverfügbarkeit
und Pharmakokinetik von IFN zu untersuchen, wurden Mäuse, die
das günstigste
Verhältnis
zwischen Wirkstoff und Blutvolumen für solche Studien aufweisen,
mit einer einzelnen hohen Dosis an rekombinantem IFN-α, markiert
bis zur höchstmöglichen
spezifischen Radioaktivität
mit 125I, behandelt.
-
Ein
reines Präparat
von 70 × 106 IE an Hu IFN-α 1–8 wurde in 1,4 ml PBS aufgenommen
und wie von Mogensen et al. (Int. J. Cancer 28, 575–582 (1981))
beschrieben unter Verwendung einer Modifikation des Chloramin-T-Verfahrens,
das von Hunter & Greenwood
(Nature 194, 495–496
(1962)) beschrieben wurde, iodiert.
-
Das 125I-markierte Hu IFN-α 1–8 (Chargen-Nr. CGP35269-1)
wies eine biologische Aktivität
von 2 × 107 IE/ml, wenn es an menschlichen WISH-Zellen,
provoziert mit VSV, getestet wurde, und von 1 × 106 IE/ml,
wenn es an Maus-L929-Zellen, provoziert mit VSV, getestet wurde,
auf.
-
Sechs
bis sieben Wochen alten, weiblichen Swiss-Mäusen wurden 2 × 107 IE entsprechend 1 × 106 murinen
IE von 125I Hu IFN-α 1–8 (1,0369 × 107 cpm/Maus)
iv oder ip injiziert, oder sie wurden damit in/oder behandelt. Zu
den angegebenen Zeitpunkten wurden drei Mäuse pro Gruppe getötet, Blut
wurde abgenommen, und das Volumen wurde bestimmt. Niere, Leber,
Lunge, Milz und Magen/Speiseröhre
wurden entnommen, geblottet und mit einer Genauigkeit von ±1,0 μg gewogen.
Die Radioaktivität
jeder Probe wurde einzeln unter Verwendung eines γ-Zählers bestimmt.
Vollblut wurde anschließend
durch Zentrifugation (800 g × 10 min.,
4°C) aufgetrennt,
das Serum wurde entnommen, gezählt
und bei –80°C gefroren.
Das Serum wurde dann auf IFN-Gehalt unter Verwendung eines Standard-Bioassays
sowohl an menschlichen WISH-Zellen als auch an Maus-L929-Zellen
wie zuvor beschrieben getestet. Das in den Serumproben vorhandene,
radioaktive Material wurde dann durch Affinitätsimmunfällung isoliert und mittels
SDS-PAGE analysiert.
-
Sehr
hohe Konzentrationen an Radioaktivität (> 2 × 106 cpm/ml) wurden im peripheren Blut von Tieren 5
min nach der Injektion von 1,0369 × 107 cpm/Maus
von 125I-markiertem
Hu IFN-α 1–8 über einen
intravenösen Bolus
detektiert. Die Menge an Radioaktivität, die im Vollblut vorhanden
war, ging dann nach 15 und 30 min nach und nach zurück. Die
Konzentrationen an Radioaktivität,
die im peripheren Blut von Tieren 5 min nach der intraperitonealen
Injektion von 1,0369 × 107 cpm/Maus von 125I-markiertem
Hu IFN-α 1–8 detektiert
wurden, waren etwa 20fach geringer als die Konzentrationen, die
nach einem intravenösen
Bolus detektiert wurden. Die Konzentrationen an Radioaktivität stiegen
dann schrittweise nach 15 und 30 min nach der Injektion an. Die Konzentrationen
an Radioaktivität,
die im Blut von Tieren nach 5, 10 und 15 min nach der in/or-Verabreichung von 125I IFN-α 1–8 detektiert
worden waren, waren signifikant niedriger als jene, die zu einem
gegebenen Zeitpunkt nach der ip- Injektion
derselben Menge an radioaktivem IFN detektiert worden waren. Bei
allen drei Arten der Verabreichung wurden im Serum höhere Konzentrationen
an Radioaktivität
als im Gesamtblut nach in/or-Verabreichung von 125I-markiertem
IFN-α 1–8 detektiert.
Die geringeren Konzentrationen an Radioaktivität, die pro ml Gesamtblut detektiert
wurden, im Vergleich zu demselben Volumen an Serum, spiegelt das
tatsächlich
größere Volumen
an Serum wider, das nach der Entfernung der zellulären Komponente
von Vollblut gezählt
wurde.
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Serumproben
aus allen Mäusen
der Studie wurden auf die Gegenwart von biologisch aktivem IFN unter
Verwendung eines Standard-Bioassays, wie zuvor beschrieben, getestet
und zeigten zu allen getesteten Zeitpunkten leicht nachweisbare
Konzentrationen an biologisch aktivem IFN im Serum aller Tiere,
denen 125I Hu IFN-α 1–8 entweder iv oder ip injiziert
worden war. Hingegen wurde nach der in/or-Verabreichung von IFN, trotz
der Gegenwart von relativ hohen Konzentrationen an Radioaktivität im Serum
dieser Tiere, in keinem der Tiere zu irgendeinem getesteten Zeitpunkt
biologisch aktives IFN im Serum detektiert.
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Um
zu bestimmen, ob das im Serum der mit 125I
HU IFN-α 1–8 behandelten
Tiere detektierte radioaktive Material tatsächlich natives IFN darstellte,
wurden die Proben mit Protein-A-G-Agarose immungefällt, um in
der Probe vorhandene Immunglobuline auszufällen, mit einem Affinititäts-gereinigten,
polyklonalen Anti-IFN-α-Antikörper behandelt
und weiter immungefällt.
Die Proben wurden dann SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
wie zuvor beschrieben unterzogen.
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SDS-PAGE-Analyse
des radioaktiven Materials in Serum nach iv- oder ip-Injektion von 125I Hu IFN-α 1–8 zeigte eine einzelne homogene
Bande, die mit einer elektrophoretischen Mobilität migrierte, die mit jener von
nicht injiziertem 125I Hu IFN-α 1–8 identisch
war. Das scheinbare Molekulargewicht des Materials wurde auf etwa
20.000 Da geschätzt,
was dem Molekulargewicht von nativem Hu IFN-α 1–8 exakt entspricht. Hingegen enthielt
keine der Serumproben aus Mäusen,
die in/or mit 125I IFN-α 1–8 behandelt worden waren,
Material mit einem scheinbaren Molekularge wicht, das jenem von nativem
IFN ähnlich
war, auch wenn eine identische Menge an radioaktivem Material auf
jedes Gel geladen worden war.
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Die
Gewebeverteilung von radioaktiv markiertem Material zeigte sehr
hohe Konzentrationen an Radioaktivität in den Nieren, hohe Konzentrationen
in der Leber, Lunge und Milz von Tieren 5 min nach iv-Injektion von 125I IFN-α 1–8. Es wurde
beobachtet, dass die in jedem dieser vier Organe vorhandene Konzentration
an Radioaktivität
nach 15 und 30 min schrittweise zurückging. Dahingegen stieg die
Konzentration an Radioaktivität
im Magen nach 15 und 30 min schrittweise an, um schließlich eine
mit jener Konzentration vergleichbare Konzentration zu erreichen,
die im Serum von Tieren 30 min nach einem iv-Bolus vorhanden war.
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Die
Verabreichung von 125I IFN-α 1–8 durch
ip-Injektion führte
zu Höchstkonzentrationen
an Radioaktivität
in allen innerhalb von 15 min untersuchten Geweben, woraufhin ein
Rückgang
nach 30 min folgte. In ähnlicher
Weise führte
in/or-Verabreichung von 125I Hu IFN-α 1–8 zu Höchstkonzentrationen
an Radioaktivität
in allen innerhalb von 15 min untersuchten Geweben, wobei die Konzentrationen
an nach 30 min vorhandener Radioaktivität leicht zurückging.
Die Konzentrationen an Radioaktivität, die in Magen/Speiseröhre vorhanden waren,
waren um eine Größenordnung
größer als
jene, die in jedem anderen Organ nach in/or-Verabreichung von 125I-markiertem IFN-α 1–8 detektiert
wurden, und waren deutlich höher
als die Konzentrationen, die in diesen Geweben nach parenteraler
Verabreichung derselben Menge an radioaktiv mar- kiertem Hu IFN-α 1–8, entweder
iv oder ip, vorhanden waren.
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Beispiel 7 Pharmakokinetik
von Interferon nach intranasaler/oraler Verabreichung
-
Zur
exakten Bestimmung der Pharmakokinetik von Hu IFN-α 1–8 wurden
Mäuse iv,
ip oder in/oder mit 1,0369 × 107 cpm/Maus an 125I-markiertem
Hu IFN-α 1–8 behandelt,
und die Konzentrationen an Radioaktivität, die sowohl im Vollblut als
auch im Serum vorhanden waren, wurden zu mehreren verschiedenen
Zeitpunkten innerhalb von 24 h bestimmt.
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Das
pharmakokinetische Profil von 125I markiertem
Hu IFN-α 1–8, das
im Blut von Mäusen
nach einem iv-Bolus vorhanden war, folgte fast exakt einer logarithmischen
Clearance-Kurve. Dies stimmte mit Resultaten aus einer früheren Studie überein,
die an Mäusen
unter Verwendung eines eng verwandten Moleküls, d.h. von rekombinantem
menschlichem α-A/D
(Bgl), durchgeführt
wurde (Bohoslawed et al., J. IFN Res. 6, 207–213 (1986)). Die Menge an
bioverfügbarem
Material, die aus der Fläche
unter der Kurve von Konzentration über Zeit berechnet wurde, war
jener für
menschliches α-A/D
ebenfalls ähnlich.
Eine zweiphasige, viel Zeit umfassende Clearance-Kurve wurde nach
einem iv-Bolus von 125I IFN-α 1–8 beobachtet,
was für
Substanzen charakteristisch ist, die durch die Nieren geklärt werden,
was mit den Resultaten aus Beispiel 6 übereinstimmt. Die Pharmakokinetik
von 125I-markiertem IFN-α 1–8 nach ip-Injektion war jener, über die
bereits frühere
für IFNs, die
intramuskulär
verabreicht wurden, berichtet wurde, sehr ähnlich.
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Leicht
nachweisbare Konzentrationen von biologisch aktivem IFN waren im
Serum aller Tiere entweder nach einem iv-Bolus oder nach ip-Injektion
von 125I-markiertem IFN-α 1–8 vorhanden.
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1. Diskussion
der Antitumor-Aktivität
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Das
Friend-Erythroleukämiemodell
stellt einen sehr strengen präklinischen
Test zu Antitumor-Aktivität dar,
da FLC äußerst maligne
sind und sowohl in der Leber als auch der Milz metastasieren, wenn
sie iv injiziert werden. Tatsächlich
bildeten die unter Verwendung dieses Modells erzielten Resultate
die Grundlage für
die Aufnahme von parenteraler Injektion von IFN-α zur Behandlung von menschlichen
Krebsarten. Somit starben in allen Versuchen, die im Rahmen dieser
Studie durchgeführt
wurden, alle unbehandelten Tiere und Tiere, die mit Kontrollpräparaten
behandelt wurden, innerhalb von 10 bis 11 Tagen. Die Injektion von
nur 4 oder 5 FLC-Zellen tötet
Mäuse,
sofern keine Behandlung verabreicht wird. Dahingegen sind manche
Tiere, die mit murinem IFN-α mittels
Verabreichung über
die Mundschleimhaut behandelt wurden, mehr als 100 Tage nach der
Inokulation von 105 FLC stets am Leben und
können
als geheilt betrachtet werden.
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Tatsächlich scheint,
ausgehend von früheren
Forschungsarbeiten, IFN-α,
das über
die Mundschleimhaut verabreicht wird, wirksamer als parenteral verabreichtes
Cyclophosphamid, 5-Fluoruracil oder Methotrexat zu sein, Mittel,
die die Überlebensdauer
bei Tieren, denen FLC injiziert wurde, um nur einige wenige Tage verlängern (Gresser
et al., J. Natl. Cancer Inst. 80, 126–131 (1988)). Andere Wirkstoffe,
wie Cisplatin, Vincristin, Doxorubicin, Bleomycin oder Etoposid,
sind gegen diesen Tumor wirkungslos (Gresser et al., J. Natl. Cancer
Inst. 80, 126–131
(1988)).
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In ähnlicher
Weise scheint IFN-α,
das über
die Mundschleimhaut verabreicht wurde, wirksamer gegen FLC zu sein
als andere Cytokine wie IL-1β,
IL-2 und TNF-α,
die systemisch verabreicht werden und in diesem Modell nur sehr
geringe Aktivität
aufweisen.
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Frühere Forschungsarbeiten
zeigten, dass parenteral verabreichtes IFN einer der aktivsten Antitumor-Wirkstoffe
in diesem Modell ist und dass IFN-Therapie sogar wirksam ist, wenn
begonnen wird, nachdem Tumormetastasen bereits in der Leber vorhanden
sind (Gresser et al., Int. J. Cancer 39, 789–792 (1987)). Die vorliegenden
Resultate zeigen, dass IFN-Verabreichung über die Mundschleimhaut gleich
wirksam oder sogar wirksamer ist.
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Tägliche Injektionen
von IFN-α,
verabreicht zusammen mit einer einzelnen Dosis an Cyclophosphamid,
erhöhte
das Überleben
von Lymphom-tragenden AKR-Mäusen
im Vergleich zu Tieren, die mit einem der Mittel alleine behandelt
wurden, deutlich, wenn die Therapie begonnen wurde, nachdem das
Lymphom diagnostiziert worden war (Gresser et al., Eur. J. Cancer
14, 97–99
(1978)). Es wurde auch bereits über
eine erfolgreiche Kombinationstherapie unter Verwendung von IFN-αZβ und BCNU,
cis-DDP (Cisplatin), Methotrexat, Adriamycin und α-Difluormethylornithin
bei verschiedenen präklinischen
Tiertumormodellen berichtet. Über Kombinationstherapie mit
5-Fluoruracil (5-FU) und IFN wurde auch bereits berichtet, dass
sie für
die Behandlung von metastasierendem Kolonkrebs bei Menschen von
Nutzen ist (Ernstoff et al., Journal of Clinical Oncology 7, 1764–1765 (1989)).
Es gibt jedoch auch andere Studien, die von einer reduzierten Antitumor-Aktivität berichteten,
wenn IFN-Therapie mit der Verwendung von Cyclophosphamid (Marquet
et al., Int. J. Cancer 31, 223–226
(1983); Lee et al., Biochem. Pharmacol. 33, 4339–3443 (1984)), Adriamycin (Blackwill
et al., Cancer Res. 44, 904–908
(1984)) oder 5-FU (Marquet et al. 109, 156–158 (1985)) kombiniert wurde,
d.h. mit exakt denselben Wirkstoffen, für die gezeigt wurde, dass sie
eine positive Wirkung haben, wenn sie in Kombination mit parenteraler
IFN-Therapie verwendet werden. Kombinationen zwischen IFN und anderen
chemotherapeutischen Mitteln können
leicht unter Verwendung von hierin beschriebenen Verfahren getestet
werden.
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Kombinierte
Interleukin-1-(IL-1-) und IFN-α/β-Therapie
resultiert in einer synergistischen Antitumor-Wirkung in Mäusen, denen
FLC injiziert werden (Belardelli et al., Int. J. Cancer 49, 274–278 (1991)).
Dieselbe Behandlung übt
auch eine ausgeprägte
Antitumor-Wirkung gegen eine metastasierende Variante (p11-R-Eb)
des Eb-Lymphoms, gegen das jedes Mittel alleine wirkungslos ist,
aus (Gabriele et al., Invasion Metastasis 13 (174–162 (1993)).
Von allen getesteten Cytokinen wurde für IL-1 erkannt, dass es das
wirksamste ist, wenn es mit parenteraler Typ-I-IFN-Therapie kombiniert
wird.
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Kombinationstherapie
mit dem Angiogeneseinhibitor AGM-1470 [(Chloracetyl)carbaminsäure (3R-(3α,4α(2R*,3R*),5β,6β))-5-methoxy-4-(2-methyl-3-(3-methoxy-2-butenyl)oxiranyl)-1-oxaspiro(2.5)oct-6-yl-ester],
zusammen mit IFN-α/β verabreicht,
führte
zu einer deutlich erhöhten
Antitumor-Wirkung im Vergleich zu jedem Mittel alleine (Brem et
al., J. Pediatric Surgery 28, 1253–1257 (1993)).
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Auch
wurde gezeigt, dass Hyperthermie die Antitumor-Wirkung von IFN-α/β gegen das
Lewis-Lungenkarzinom steigert (Yerushalmi et al., Proc. Soc. Exp.
Biol. Med. 169, 413–415
(1982)). Für
Argininbutyrat wurde auch gezeigt, dass es die Antitumor- Wirkung von IFN-α potenziert
(Chany & Cerutti,
Int. J. Cancer 30, 489–493 (1982)).
Ein Vergleich des Ausmaßes
an Schutz, das erzielt wird, wenn ein gegebener Typ und eine gegebene Dosis
an IFN über
die Mundschleimhaut verabreicht wird, mit den Resultaten, die nach
systemischer Verabreichung (ip-Injektion) erzielt wurden, zeigte,
dass parenterale Verabreichung von IFN in manchen Fällen geringfügig wirksamer
und in anderen Fällen
nicht wirksamer als die Verabreichung über die Mundschleimhaut war.
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2. Diskussion
der antiviralen Aktivität
-
Auch
wenn antivirale Aktivität
im Serum von Tieren nach in/or-Verabreichung von 125I
IFN-α 1–8, Mu IFN-α/β und Mu IFN-α nicht detektiert
werden konnte, wurde nichtsdestoweniger ein statistisch signifikantes Ausmaß an Schutz
gegen eine Infektion mit einer letalen Dosis an EMCV in diesen Tieren
beobachtet (Tabelle 1).
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-
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Die
Resultate der Erfinder, die in einem gut definierten, präklinischen
Modell von akuter Virusinfektion erzielt wurden, lieferten einen
eindeutigen Beweis, der den "Beweis
des Prinzips" für die Verwendung
von hoch dosiertem, über
die Schleimhaut verabreichtem IFN bei der Therapie von akuten systemischen
Virusinfektionen in Menschen untermauert und zeigt, dass sowohl
ein natürliches
Gemisch von mehreren IFN-α-Subtypen als
auch ein einzelner rekombinanter IFN-α-Isotyp (beispielsweise Mu IFN-α) statistisch
signifikante antivirale Aktivität
in diesem Modell ausübt.
Natürliches
Mu IFN-α/β und Hu IFN-α 1–8 schienen
gleich wirksam zu sein, wenn sie über die Mundschleimhaut verabreicht
wurden. Rekombinantes Mu IFN-β und
Mu IFN-γ zeigten
auch ähnliche
Antivirus-Aktivität.
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Ein
Vergleich des Ausmaßes
an Schutz, das erzielt wurde, wenn ein bestimmter Typ und eine bestimmte
Dosis an IFN über
die Mundschleimhaut verabreicht wurde, mit den Resultaten, die nach
systemischer Verabreichung (ip-Injektion) erzielt wurden, zeigte,
dass parenterale Verabreichung in manchen Fällen geringfügig wirksamer
und in anderen Fällen
nicht wirksamer als die Verabreichung über die Mundschleimhaut war.
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3. Allgemeine
Diskussion
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Die
Resultate der Biomarker-Pilotstudie zeigen sehr eindeutig, dass
keiner der drei getesteten Biomarker (MHC-Klasse-I-Antigen, Ly6-A/E-Antigen
und 2'-5'-Oligoadenylatsynthetaseaktivität) die sehr
stark ausgeprägte,
biologische Aktivität
(beispielsweise antitumorale und antivirale Aktivität) zu Tage
bringt, die IFN-α,
verabreicht über
die Mundschleimhaut, zeigt.
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Der
Gegensatz zwischen der stark ausgeprägten Steigerung der Expression
aller drei IFN-induzierten Proteine, die in allen drei Versuchen
beobachtet werden konnte, die nach der ip-Injektion von nur 20 IE
an IFN-α durchgeführt wurden,
und keiner nachweisbaren Wirkung nach der Verabreichung von bis
zu 20.000 IE an IFN-α über die
Mundschleimhaut ist erstaunlich.
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Auch
wenn die Erfinder die Möglichkeit
nicht ausschließen
können,
dass eine Wirkung auf den einen oder den anderen Biomarker zu einem
früheren
oder dazwischenliegenden Zeitpunkt beobachtet werden hätte können, scheint
dies unwahrscheinlich, da IFN auf die Transkription der Gene, die
für diese
Proteine kodieren, Einfluss nimmt und somit nicht erwartet werden
würde,
eine Wirkung von einem dieser Biomarker vor einigen Stunden nach
der IFN-Behandlung zu sehen.
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Und
auch wenn die Erfinder die Möglichkeit
ebenfalls nicht ausschließen
können,
dass eine systemische Wirkung auf eines der anderen zahlreichen,
IFN-induzierten Proteine nach der Behandlung mit IFN-α über die
Mundschleimhaut beobachtet werden hätte können, ist dies wiederum unwahrscheinlich,
da dies eine differenzielle Regulierung der Expression bestimmter
IFN-induzierter Gene voraussetzen würde. Es ist jedoch auf alle
Fälle möglich, dass
eine Wirkung auf einen IFN-Biomarker nach der Verabreichung von
IFN-α über die Mundschleimhaut
lokal beobachtet werden kann, beispielsweise in nasalen Lymphozyten.
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In Übereinstimmung
mit dem Ausbleiben einer nachweisbaren Wirkung auf die untersuchten
Biomarker wurde keine übereinstimmende
Wirkung auf irgendeinen der hämatologischen
oder Blutchemie-Parameter beobachtet, die im Laufe der Mundschleimhaut-IFN-Therapie überwacht
wurden, auch nicht in Tieren, die mit bis zu 20.000 IE an IFN-α behandelt
worden waren.
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Die
Resultate der Studie zur Pharmakokinetik und Bioaktivität zeigen
sehr eindeutig, dass eine statistisch signifikante, antivirale Wirkung
nach der Verabreichung einer einzelnen Dosis an radioaktiv markiertem Hu
IFN-α 1–8 über die
Mundschleimhaut unter Bedingungen, unter denen kein zirkulierendes
IFN im peripheren Blut nachgewiesen werden kann, unter Verwendung
von Detektionsverfahren, die um eine Größenordnung empfindlicher als
jene davor verwendeten sind, erzielt werden kann. In Übereinstimmung
mit diesen Resultaten schien das Ausmaß der antiviralen Wirkung,
die vom über
die Mundschleimhaut verabreichten IFN ausgeübt wurde, einem klassischen
Dosis-Antwort-Verhältnis
zu entsprechen.
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Leicht
detektierbare Konzentrationen an radioaktiv markiertem Material
wurden sowohl in Vollblut als auch in Serum von Tieren nach Verabreichung über die
Mundschleimhaut von 125I-markiertem IFN-α 1–8 gefunden.
Diese Resultate stehen im Gegensatz zu den Resultaten aus früheren Studien,
die kein IFN im Serum von Tieren detektieren konnten, sogar nach
der oralen Verabreichung von großen Mengen an unmarkiertem IFN
nicht. Das radioaktive Material, das sowohl in Vollblut als auch
in Serum nach Verabreichung über
die Mundschleimhaut detektiert wurde, war jedoch biologisch inaktiv.
Darüber
hinaus zeigten die Resultate der SDS-PAGE-Analyse, dass dieses Material
ein geringes Molekulargewicht aufwies, und spiegelten wahrscheinlich
die Absorption von Abbauprodukten nach dem Verdau von IFN im Magen
und im Dünndarm
wider. Eine Analyse der Gewebeverteilung von radioaktiv markiertem
Material nach der Verabreichung über
die Mundschleimhaut zeigte deutlich höhere Konzentrationen an Radioaktivität im Magen
als in irgendeinem der anderen getesteten Organe. Die Resultate
der Erfinder zeigen eindeutig, dass, obwohl biologisch aktives IFN
nach Verabreichung über
die Mundschleimhaut nicht absorbiert wurde, diese Behandlung nichtsdestoweniger
eine statistisch signifikante Antitumor- und Antivirus-Aktivität in vivo
ausübt.
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Ohne
hier eine Einschränkung
auf irgendeinen vorgeschlagenen Mechanismus für die beobachtete positive
Wirkung zu beabsichtigen, lassen die Resultate der Erfinder darauf
schließen,
dass über
die Mundschleimhaut verabreichtes IFN seine Wirkungen gegen Tumorzellen
oder gegen Viren über
einen zur Zeit nicht definierten, neuen Mechanismus ausübt, der
keine direkte Wirkung von exogen verabreichtem IFN oder die Einführung von
endogenem IFN einbindet. Diese Annahme untermauert das Fehlen von
nachweisbaren Konzentrationen an IFN oder den drei getesteten Biomarkern
im Blutkreislauf. Es scheint, dass dieser Mechanismus zumindest
teilweise durch Stimulation des reichlich vorhandenen Lymphgewebes,
das den nasopharyngealen und oralen Hohlraum umgibt, funktionieren
kann. Da die Erfinder zeigten, dass über die Mundschleimhaut verabreichtes
IFN in seiner Wirksamkeit mit systemisch verabreichtem IFN zumindest
vergleichbar ist, liefern ihre Resultate eine starke Grundlage für die Verabreichung
von IFN über
die Mundschleimhaut im Rahmen der Behand lung von Krebs. Dies könnte für die klinische
Verwendung von IFN wichtige Auswirkungen haben.