KR960008009B1 - 인터류킨 및 이중-가닥 rna를 포함하는 상승작용화 조성물 - Google Patents

인터류킨 및 이중-가닥 rna를 포함하는 상승작용화 조성물 Download PDF

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Abstract

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Description

인터류킨 및 이중-가닥 RNA를 포함하는 상승작용화 조성물
제1도는 제조합 인터류킨-2(rIL-2) 및 림포킨 활성 킬러(LAK) 세포를 사용한 현행 종양 치료요법을 나타낸 도면으로, 문헌[Rosenberg, S. A. 등의 New Englan d Journal of Medicine 313 : 1485 1985. 9. 12)]에 보고된 LAK/IL-2 치료요법의 NIH 치료 프로토콜에 관한 도면.
제2도는 다양한 IL-2 용량과 이에 따른 독성 및 용량 한계 독성을 비교한 개괄적인 임상 자료를 나타낸 막대 그래프.
제3도는 IL-2의 용량은 다르게 하고 dsRNA의 용량은 일정하게(각각 상단의 그래프는 효과인자 : 표적세포를 50 : 1 및 하단의 그래프는 25 : 1로 한 것임) 했을 때의 세포독성을 비교한 막대 그래프.
제4도는 rIL-2와 dsRNA의 배합물을 사용한 치료요법에서 사람 LAK 세포활성이 증가되었음을 나타내는 막대 그래프.
제5도는 dsRNA rIL-2의 배합물을 포함한 4개의 서로다른 그룹에 대한 흑색종 폐 전이의 수를 나타내는 막대 그래프.
제6도는 4개의 서로다른 그룹에 대해서, 지시된 일수 동안에서 악성 흑색종이종이식편 보유 무흉선증 마우스의 생존율을 비교한 그래프.
제7도는 사람에 있어 IL-2 환제의 용량을 증가시켰을때 나타나는 독성을 예시한 것으로, 현행 IL-2투여용량 범위와 IL-2 및 dsRNA 배합물의 계획된 용량 범위를 비교한 제1도와 유사한 막대 그래프.
현재 사용되고 있는 림포킨류(인터류킨-1,2 및 3, 인터페론, 종양 괴사인자 등)는 사람의 암 또는 바이러스성 질환에 효력을 나타내기 위해 필요로 하는 높은 용량에서는 통상 심각한 독성이 관찰된다는 점과 치료 범위 또한 좁다는 점 때문에 사용하는데 있어 커다란 제약이 있어 왔다. 본 발명은 림포킨류 및 dsRNA 들간의 상승작용화 방법 및 이들로 구성된 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의해 림포킨류, 특히 IL-2의 필요 용량을 크게 감소시키고 동시에 이들의 치료 범위를 확장시킬 수 있는 방법을 제시하고자 함을 목적으로 한다. dsRNA와 IL-2로 구성된 특징 배합물은 암, 바이러스 및 염증성 질환의 치료시, IL-2 노출에 의한 응답 반응으로 1차적으로 형성되는 림포킨 활성 킬러 세포(LAK)의 dsRAN를 증가시키기 때문에 부분적으로 사람 흑색종-보유 동물의 생존율을 현저히 증가시킨다. 본 발명은 사람의 암 및 각종 사람의 바이러스성 감염질환 모두를 무독성적이며, 효과적으로 조절할 수 있는 광범위한 적용범위를 갖는다.
현행 치료요법에서는 원형(Prototype) 림포킨 상태로 인터류킨-2(IL-2)를 사용하고 있다. 림포킨은 현재 재조합 DNA 기술에 의해 통상적으로 제조되고 있다. rIL-2는 재조합 인터류킨-2를 지칭하는 용어이며, LAK는 림포킨 활성 킬러 세포(lymphokine activated killer cells)를 지칭한다. 후자의 세포는 사람 혈액 세포(백혈구분리반출법으로 수득함)를 rIL-2에 노출시킴으로써 생체외에서도 생성된다. 상기 세포들을 통상적으로 환자에게 재주입한 후, IL-2자극을 계속하면 LAK세포가 환자의 종양을 사멸시키기거나, 제어하는 것으로 예측된다. 현재 이용되고 있는 치료요법이 제1도에 제시되어 있다. 괄호한의 화살표는 과도한 독성으로 인해 통상적으로는 제공할 수 없는 IL-2 투여를 나타낸 것이다. 이러한 독성 반응을 줄이기 위해 실시한 임상실험 및 측정실험에서 보고된 독성들에 관한 사항은 하기 표 1 및 표2에 제시되어 있다.
엄청난 부작용 때문에, 릴포킨을 사용해 치료한 환자중의 10-20%에서만 치료 효과를 보고 있다(참조 : Rosenberg등의 New England Journal of medicine volume 313, p1485, 1985). 림포킨만을 제공했을 때 가장 반응성이 큰 종양은 신장암과 흑색종 인것으로 나타났으나, 본 발명은 일반적인 다른 암, 바이러스성 질환 및 각종 염증 상태에도 광범위한 적용성을 가진다. 이들과 통상적으로 사용되는 화학치료제를 배합시킴으로써 이들의 효능을 증가시킬 수 있다는 사실에 대해서는 입증된 바가 없다.
림프킨의 독성은 용량과 관련이 있다. 제2도는 IL-2 용량이 체중(kg) 당 105유니트 이상인 경우/ 심각한 독성이 사람에게 나타날 수 있다는 것을 나타내는 임상 자료이다. 그러나, 일반적으로 종양이 퇴화를 야기시키기 위해서는 이 정도의 용량이 필요한 것으로 생각되고 있다. 불행하고도, 현재 시행되고 있는 림프킨 용법으로는 종양이 어느 정도 작아지게 되기도 전에 종정 환자들이 IL-2 독성으로 인해 사망하기도 한다.
무독성원으로서의 dsRNA와 독성원으로서의 림포킨의 배합물은 상승효과를 나타내어 림포킨, 특히 IL-2의 필요 용량을 적당량 내지 무독성 용량으로 크게 감소시킬 뿐만 아니라, 동시에 이들의 치료 범위를 확장시킨다. 특히 림포킨 성분으로서 IL-2 같은 각종 인터류킨이나 인터페론의 상승작용화 배합물은 상기 제시된 치료 방법에 의해 사람의 암, 특히 폐암과 신장암 및 악성 흑색종이나 기타 질환을 제어하는데 효과적이다. 또한 상기 배합물은 각종 사람의 바이러스성 감염질환을 치료하는데에도 효과적이다. 본 발명은 이러한 치료용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 dsRNA와 인터류킨을, 각 성분을 개별적으로 투여하였을 때 나타나는 독성에서 증가된 독성 즉, 과동한 독성을 나타내지 않고도 유기체내에서 NK와 LAK 세포의 양을 모두 증가시켜, 항종양 응답반응 항바이러스 응답반응 또는 면역조절 응답반응을 증진시키는 용량으로 함유하는 조성물 및 이들을 동시 또는 연속적으로 투여하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 dsRNA/림포킨 치료용법과 병행하여, 시클로옥시게나제 활성제(cyclooxygenase activator)를 억제하는 물질을 투여하는 것도 또한 포함한다. 일례로서, 본 발명은 인도메타신(indomethacin)과 프로스타글라딘 억제제(prostaglandin inhibitor)를 병용투여하는 것을 포함하는데, 이로써 프로스타글라딘 방출 및 생성된 NK 세포감소 조절 반응이 억제된다.
이러한 방법으로, 목적하는 NK 세포의 천연 억제제가 제거되고, 그 결과 NK 세포군의 증가하게 된다. 본 발명은 dsRNA, 림포킨 및 시클로옥시게나제 활성제를 억제하는 물질로 구성된 신규 배합물(적절하게는 치료요법 및 약학 조성물)을 포함한다.
상기 배합물을 구성하는 성분들의 함량은 임상 관찰 및 치료이 결과에 따라 달라진다. dsRNA 성분의 통상적인 사용량은 투여직후 주입 부위에서 떨어진 지점에서 측정시, 전선(systemic) 순환 혈액중 최고 혈중 농도가 1ml당 0.1 내지 1000㎍의 dsRNA가 되도록 하는 양이다. 인터페론, 바람직하게는 인터페론(알파) 올 림포킨으로 사용하는 경우는, 환자의 체액 1ml당 0.01 내지 100,000IRU의 양을 제공한다. IL-2, 바람직하게는 rIL-2를 림포킨으로 사용하는 경우, 그 투여량은 환자의 체중 kg당 약 102IL-2 유니트 내지 허용불가능한 독성 수준에 도달하는 수치 즉, 106유니트 정도의 높은 농도까지도 사용할 수 있다. 가장 효과적이고, 조절가능한 독성 반응치는 체중 kg당 약 103내지 104IL-2 유니트이다.
생체외 및 생체내 실험결과, dsRNA(및 특히 부정합(mismatched) dsRNA가 일반적으로 인터류킨(특히 IL-2)와 함께 약리적으로 상승작용을 제공하여, 결과적으로 독성을 크게 감소시키면서 생체 응답반응(항종양, 항바이러스, 면역조절)을 증진시킴이 확인되었다. 통상적으로 부정합 dsRNA를 이용한 실험결과, 항종양 응답반응에 요구되는 IL-2의 용량을 30배 내지 100배 이상 감소시킬 수 있음이 입증되었다. 이러한 약리적 상승효과는 NK(natural killer : 천연 킬러)-감수성 및 또한 NK-내성 종양 또는 바이러스-감염 세포의 레벨모두에 제공된다(그러나, 이들에만 국한되지는 않는다). NK-내성 종양 또는 바이러스-감염 세포들은 또한 LAK(lymphokine activated killer 림포킨 활성킬러) 세포로 지칭되기도 한다. 본 원의 발명자는 모노클로널(monoclonal) 항체 마커(markers)를 이용하여 상기한 작용이 NK 세포(아시알로-Gm1모노클로널항체 이용) 및 LAK 세포(Thy 1.2 모노클로널 항체 이용) 양자 모두에서 동시에 크게 증가하는 것을 관찰함으로써, 이를 명백히 입증하였다. 상기한 항체들은 본 기술분야와 관련된 곳에서 용이하게 입수할 수 있는 모노클러널 항체 시약이다. 또한 본 발명자는 각종 NK 세포 천연 길항제(예, 프로스타글라딘 등)의 생체 농도를 감소시키는 화합물을 병용함으로써 거의 무독성적이거나 또는 독성을 최소화시키는 방식으로 상기한 상승효과를 더욱 증대시킬 수 있다는 사실을 관찰하였다. 그 일례로서, 인도메타신(60kg인 한 개인에 대해 25mg/일)을 사용한 결과, 내인성 프로스타글라딘 농도가 감소되어 일부 약리적 상승작용이 현저히 증가되었다.
본 발명자들은 무독성 방식으로, IL-2에 의해 생성된 LAK 세포에 의해 특이적으로 사멸되는 종양 세포의 수를 증가시키기 위한 생화학적 촉매로서 dsRNA의 작용효과를 검증하였다. 이러한 사실은 다음의 세포 배양 실험에 의해 입증된다. 7860으로 지정된 사람의 신장암 세포주를 표준 페트리 접시에서 성장시킨 후 각종 잠재성 킬러 세포에 노출시켰다. 정상 개체로부터 얻어진 말초 혈액 세포를 효과인자(킬러 세포)라고 명명하고, 신장암 세포를 표적 세포라고 명명하였다. 초생체 염색법(supravital stain) 또는 방사능동위원소의 사용을 비롯한 여러 가지 방법에 의해 사멸정도(세포독성이라고 언급함)를 측정하였다 : 일반적으로, 죽은 종양 세포는 이전에 흡수한 방사능 물질대사 전구체를 방출하며, 더 이상 세포외 영양분 등을 섭취할 수 없게 된다. 제3도에는 부정합 dsRNA인 암플리겐(Ampligen)이 사람 LAK 세포(정상인의 혈액으로부터 얻은 것)의 활성을, IL-2 단독 사용시 얻을 수 있는 활성보다도 크게 증가시킨다는 사실이 제시되어 있다. 제3도는 IL-2의 용량은 다르게 하고, dsRNA의 용량은 일정하게 했을 때의 세포독성을 비교한 것이다(IL-2를 1000유니트/ml로 사용한 경우는, 이미 최대의 세포 사멸이 이루어진 상태이므로 dsRNA를 사용해 추가로 더 효과를 증대시키는 것이 불가능하다). 이러한 시스템에서 촉매인 dsRNA만을 단독으로 사용한 경우는 완전히 불활성인 상태이다. 따라서, 종양 세포 사멸에 대한 효과는 이들 2가지 활성제 효능의 단순한 산술적 합산 효과가 아니다. 제4도에서도 이와 유사한 결과가 얻어졌으며, 이로써 바이러스 감염 또는 자체-면역(자가면역) 조절의 혼란에 의해 신생항원(neoantigens)을 발현시키는 세포에 동일하게 적용하였을때도 상기한 현저한 효과가 재현될 수 있음이 확인되었다.
별도의 실험에서도, dsRNA(부정합 dsRNA)가 IL-2를 생성하도록 임파구를 유도하지 않는 것으로 나타났다. 배양 배지 중의 IL-2 농도는 CTLL 분석법으로 측정했으며 ; 보고된 농도는 평균치 ± SEM으로 표시했다. 오히려, dsRNA는 표적 세포상의 특정 항원의 밀도를 변화시켜 사멸율을 증대시키는 것을 비롯하여, 여러 가지의 다른 방법에 의해 IL-2 림포킨 시스템에서 작용하는 것으로 보인다. 또한, dsRNA와 IL-2는 함께 효과인자-표적 세포 결합을 증대시키거나, 각종 세포독성 인자의 생산을 증대시키거나 또는 한 개의 표적 종양 세포에서 다음 표적 종양 세포로 킬러 세포가 순환하는 작용을 증대시키는 것과 같이 사멸 이후의 효과를 변화시키는 것일 수도 있다.
동물 연구 결과, 생존율이 증가하였으며 종양 확산 정도가 감소되었음이 입증되었다. 동물 연구에 의해, 림포킨 또는 dsRNA를 단독 사용한 경우보다 림포킨/dsRNA 배합물을 사용했을 때 생존율이 증가되고, 종양의 확산 정도도 감소되는 것으로 나타났다. BRD로 명명된 사람 흑색종 종양을 무흉선중 마우스 그룹의 발에 주입하였다. 무흉선중 마우스들은 사람 종양을 이물질로서 거부하는 것이 불가능하다. 결과적으로, 무처리 마우스에서는 종양 세포가 증식하여 폐로 확산되고, 그 동물은 사망하게 된다. 제5도에서, 103-104유니트/kg 용량의 IL-2(약 2500유니트/마우스)와 60kg개체에서 대해 약 100-300mg에 상당하는 dsRNA(500㎍), 양 생물학적 제제를 마우스에게 매주 2회 투여했다. 투여이 목적은 사람에게 있어 각 생물학적 약제의 안전 용량을 설정하고, 이 안전 용량이 또한 효율을 나타내는지의 여부를 결정하기 위한 것이다.
제5도에 제시된 자료를 통해, dsRNA+IL-2로 치료한 동물에서 폐로의 전이(metastases) 현상이 상당히 감소되었음을 알 수 있는데, 이 결과는 상기 2종의 제제를 단독으로 투여하여 얻은 결과가 비교할 때 전혀 예상치 못했던 것이다. 이러한 폐 전의 감소는 또한 생존을 증가와도 연관된다(제6도의 자료 참조). 치료용 배합물중 무독성 성분-부정합 dsRNA-의 용량을 증가시킴으로써, 생존율을 무한히 증가시키는 것도 가능하다. 인터페론(알파) 20,000IRU를 사용하였을 때도 유사한 결과가 얻어졌는데, 여기에서도 배합물에 존재하는 부정합 dsRNA(500㎍씩 매주 2회)가 종양 억제율(p0.02)을 더욱 증진시켰다. 림포킨/dsRNA배합물이 동물에 있어 감지할 수 있을 정도의 독성을 나타내지 않는다는 사실은 중요하다. 이들에게 정상적인 영양 공급을 한 결과, 예상했던 체중을 얻었으며 정상적인 혈중 화학분석치를 나타냈다.
인체 차원에서 상기 치료학적 상승작용이 미치는 유리한 점을 조사했다. 제7도는 본 발명의 배합물 치료용법이 일반적으로 림포킨의 독성, 특히 임상 의학에 있어서 IL-2의 독성을 어느 정도로 감소시키는 지를 나타낸 것이다. IL-2에 관한 독성 자료는 리츠와 로젠버그(Litze and Rosenberg)에 의해 잘 알려진 바 있는 것이며, 연구 결과, IL-2를 dsRNA와 배합하여 사용하는 경우에는, 보통 103-104유니트/kg의 저 용량 범위에서도 효과적이나, 반면에 dsRNA와 배합하지 않은 경우에는 이러한 안전 용량에서 대개 비효과적임이 밝혀졌다.
바이러스성 질환에서도, 이미 언급한 이유 및 기타 이유로 인해 유사한 치료학적 잇점이 얻어진다. 예를 들면, HIV 감염질환에서 면역 결핍(IL-2 반응성) 만을 공격하는 치료제의 저해 현상 결과, 의도와는 다른 결과가 나타나기도 한다. TAC 수용체를 지닌 소위 T4 헬퍼 세포들은 림포킨 IL-2에 반응을 나타내지만, AIDS 환자에게 있어, IL-2는 HIV에 의해 직접 공격받기 쉬운 세포들을 팽창시켜, 질환을 약화시키는 결과를 야기시킨다(A. S. Fauci and H. C. Lane, Annals Institute Pasteur/Virology-Immunology, in press, 1987). 따라서, dsRNA를 IL-2에 신중하게 첨가함으로써, IL-2, 및 인터페론과 TNF 같은 기타 잠재적 림포킨의 유용한 항바이러스제로서의 적용범위도 항종양 반응의 경우와 마찬가지로 확대시키고 개선시킬 수 있다.
부정합 이중-가닥 RNA는 기지의 거대분자 RNA 형태로서(미합중국 특허 제4,024,22호 및 미합중국 특허 제4,130,641호 참조), 이중 나선이 불안정하여 염기쌍의 형성(base pairing)이 저해된 분자를 말한다.
부정합 dsRNA의 인터페론-유도 특성에 대해서는 잘 알려진 바 있으나, 이 특성은 인터페론 유도 현상 자체와는 관련이 없는 메커니즘을 나타낸다.
부정합 이중-가닥 RNA 중 통상적인 치료제의 구체예는 rIn·r(Cx, U 또는 G)n(상기에서 x는 4 내지 29의 수치임) 같은 폴리리보이노신산 및 폴리리보시티딜산/우리딜산의 복합체에 의해 형성된 합성 dsRNA로, 그 예로서는 본원에서 암플리겐
Figure kpo00001
(미합중국, 메릴랜드, 록크빌에 소재하는 헴 리서어취 인코오포레이티드의 등록 상표명)으로 지칭되는 rIn·r(C12, Un)이 있다. 암플리겐과 유사하게 작용하는 다수의 부정합 dsRNA 중합체에 대한 연구가 진행되어 왔다. 다른 형태의 천연 및/또는 합성 dsRNA에 비해 부정합 dsRNArk 지닌 중요한 치료학적 잇점은 이들이 동물 및 사람에게 감소된 독성을 나타낸다는 점이다. 예를 들면, 미합중국 특허 제3,666,646호(Lampson 등)에서 여러 가지 인터페론-관련 효과를 촉발시킬 수 있는 초기의 dsRNA 복합체에 대해 제시한 바 있으나, 이러한 화합물들은 그 독성으로 인해 암 및 또는 이와 관련된 질환의 치료에서 임상적 효율성이 없는 것이었다.
부정합 dsRNA(mismatched dsRNA)란 대응 가닥(counterpart strands)들 사이의 수소 결합(염기 적층=base stacking)이 비교적 완전한 것 즉, 매매 29개의 연속적인 염기 잔기중 평균 1개 이하의 염기 쌍에서 차단이 이루어져 있는 것을 의미한다. 이 용어 부정합 dsRNA는 본 명세서에서 이러한 의미로 이해되어야 한다.
dsRNA로는 일정 비율의 우라실 염기 또는 구아니딘 염기(예를 들면, 염기 5개중 1개 내지 30개중 1개)를 포함하는 폴리시티딜레이트와 폴리이노시네이트의 복합체(poly I·poly(C4-29, U 또는 G)가 가능하다. 부정합 dsRNA로 C 대 U의 비율이 약 13 : 1인 poly I·ploy C, U도 가능하며, 이때 poly I 및 ploy C, U의 침강 계수(sedimentation coefficients)는 각각 9유니트 이하 및 2유니트 이내이며, 약 6.5 내지 7.5가 바람직하다.
dsRNA로 일반식 rIn·(C12-13, U)n인 것도 가능하다. 기타 적당한 dsRNA의 실례에 대해서는 하기에서 논의하도록 하겠다.
본 발명에 사용하기 바람직한 부정합 dsRNA는 poly(Cx, U) 및 poly(Cx,G)(이때, x은 4 내지 29의 값을 갖는 정수임)중에서 선택된 코포리뉴클레이티드를 기초로 한 것으로, 폴리리보시티딜레이트(rCn) 가닥을 따라 짝지워지지 않는 염기(우라실 또는 구아닌)를 도입시킴으로써, rIn·rCn을 변형시켜 형성된 폴리리보이노신산과 폴리리보시티딜산의 복합체의 부정합 유사물들이 있다. 대안으로, dsRNA는 예를 들면 2'-O-메틸 리보실 잔기를 포함시키는 방법에 의해 폴리리보이노신산(rIn)의 리보실 골격을 변형시킴으로써, poly(I)·poly(C) dsRNA로부터 유도할 수도 있다. 이러한 rIn·rCn의 부정합 유사물들중에서 바람직한 것은 일반식 rIn·r(C12, U)n인 것으로, 이것은 미합중국 특허 제4,130,641호 및 제4,024,222호(상기 문헌들은 본 명세서에 참고로 인용된 것임)에서 Carter 및 Ts'o에 의해 제시된 것이다. 상기 문헌에 기술된 dsRNA를 일반적으로 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 것들이다.
본 발명에 사용되는 부정합 dsRNA의 구체적인 실례로는 다음과 같은 것들이 있다 :
poly(I)·poly(C4, U)
poly(I)·poly(C7, U)
poly(I)·poly(C13, U)
poly(I)·poly(C22, U)
poly(I)·poly(C20, G)
poly(I)·poly(C29, G) 및
poly(I)·poly(Cp)23Gp
본 발명에 따른 약학 조성물은 활성 성분으로서 dsRNA, 바람직하게는 부정합 dsRNA와 림포킨, 그리고 임의 성분으로 시클로옥시게나제 활성제를 억제하는 화합물을 일반적인 약학적 담체 또는 희석제와 함께 함유하고 있다. 본 발명에 의해 제시된 약학 조성물에는 적합한 약학적 부형제중에 비경구 투여용으로 적절히 제조한 조성물들이 포함된다.
예를 들면, 임의로 생리적 허용 염과 함께 용매/희석재로서 멸균수 또는 피로겐-부재수를 사용하여 공지의 약제 제조 기술에 따라 비경구 용액, 현탁액 및 분산액을 제조할 수 있다.
Figure kpo00002
Figure kpo00003

Claims (5)

  1. 동시 투여 또는 연속 투여되는 dsRNA와 인터류킨을 상대적인 농도로 함유하고 있으며, dsRNA 또는 인터류킨의 독성보다 과도한 증가된 독성을 나타내지 않고서도 유기체내에서 NK 및 LAK 세포의 양을 모두 증가시키는 것을 특징으로 하는, 향종양, 항바이러스 또는 면역조절 반응을 증진시키는 위한 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 시클로옥시게나제 활성제를 억제하거나, NK 세포 감소 조절 메카니즘을 저해하는 것으로, 인도메타신 및 프로스타글라딘 억제제중에서 선택된 물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 치료용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 dsRNA가 부정합 dsRNA인 것을 특징으로 하는 치료용 조성물.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 인터류킨이 인터류킨-2 또는 재조합 인터류킨-2인 것을 특징으로 하는 치료용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 부정합 dsRNA가 rIn·(C12, U)n인 것을 특징으로 하는 치료용 조성물.
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