DE3688817T2 - 5-azido-deoxyuridinverbindungen und deren herstellung. - Google Patents
5-azido-deoxyuridinverbindungen und deren herstellung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf 5- Azido-uracil enthaltende Nukleosid- und Nukleotid- Verbindungen sowie Verfahren zu deren Herstellung.
- Die Veröffentlichung "Chem. Soc. Rev.", Band 6 (1971) offenbart die Reaktion von wasserfreiem flüssigem Ammoniak mit 5-Bromuridin zur Herstellung des 5-Aminouridins. Eine nachfolgende Diazotierung erzeugt das 5- Diazouridin. Versuche zur Herstellung des 5-Azidouridins waren nicht erfolgreich.
- Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue photoaktive Nukleotide und Nukleoside herzustellen. Eine verwandte Aufgabe ist es, neue photoaktive Nukleotide und Nukleoside herzustellen, die die Photoaffinitätsmarkierung von Materialien gestatten, wie die Herstellung photoaktiver DNA. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung photoaktiver Nukleoside und Nukleotide zu schaffen, die die vorgenannten Eigenschaften haben.
- Gemäß den vorstehenden Aufgaben beruht die vorliegende Erfindung in neuen Nukleosiden, die die photoaktive Base 5-Azido-uracil enthalten und mehr im besonderen in den daraus hergestellten Nukleotiden 5-Azido-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat und 5-Azido-2'-desoxyuridin-5'-monophosphat. Ein neues Verfahren zum Herstellen der vorgenannten Nukleoside und Nukleotide schließt eine fünfstufige Synthese ein, die mit 5'-dUMP beginnt, aus dem als der ersten Stufe bei der Synthese 5-Nitro-dUMP hergestellt wird. Die Nitroverbindung wird dann zu 5-Amino-dUMP reduziert. Das 5-Amino-dUMP wird mit salpetriger Säure diazotiert und das Diazosalz unmittelbar mit Natriumazid unter Herstellung von 5-N&sub3;-dUMP in hoher Ausbeute umgesetzt.
- Zusätzliche Phosphatreste werden mit Diphenylchlorphosphataktiviertem 5-N&sub3;-dUMP unter Bildung von 5-N&sub3;-dUTP gekoppelt.
- Für ein vollständiges Verstehen der Erfindung wird auf die begleitende Zeichnung bezug genommen, in der zeigen:
- Fig. 1 eine diagrammartige Darstellung des Ultraviolettspektrums (U.V.) von 5-N&sub3;-dUMP,
- Fig. 2A eine diagrammartige Darstellung des kernmagnetischen Resonanz(NMR)-Spektrums der H&spplus;-Form von 5-N&sub3;-dUMP in D&sub2;O,
- Fig. 2B eine diagrammartige Darstellung des kernmagnetischen Resonanz (NMR)-Spektrums von 5'-dUMP,
- Fig. 3 eine diagrammartige Darstellung des Infrarot(IR)-Spektrums von 5-N&sub3;-dUMP und von dUMP.
- Nukleotide und Nukleoside, die die photoaktive Base 5-Azido-uracil enthalten, können nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Die verschiedenen 5-N&sub3;-Uracil-nukleotid- und -nukleosid-Verbindungen, die hergestellt werden können, sind durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben:
- worin: M&spplus; - irgendein einwertiges oder zweiwertiges Kation;
- n = 0-5;
- A = H oder OH;
- B = -O-[PO3]&sub1;&submin;&sub3;, H oder OH.
- Die Synthese des photoaktiven Nukleotids 5-Azido- 2'-desoxyuridin-5'-triphosphats (5-N&sub3;-dUTP) ist ein fünfstufiges Verfahren, das mit 5'-Desoxyuridin-monophosphat (5'-dUMP) beginnt. Die Reihenfolge der fünfstufigen Synthese wird schematisch folgendermaßen dargestellt:
- Die Synthese beginnt mit der Verbindung 5'-Desoxyuridinmonophosphat (manchmal als 5'-dUMP bezeichnet). Diese Verbindung ist ein bekanntes Nukleotid, das leicht erhältlich oder synthetisierbar ist. Die 5'-dUMP wird anfänglich durch Ionenaustausch in die H&spplus;-Form umgewandelt, gereinigt und getrocknet. Die getrocknete 5'-dUMP wird in eine Lösung in wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) überführt, der Nitrosyl(Nitrosonium)tetrafluorborad hinzugegeben wird, um das 5'-dUMP zu 5-Nitro-dUMP (5-NO&sub2;-dUMP) zu nitrieren.
- Eine angesäuerte Lösung von 5-NO&sub2;-dUMP wird in Gegenwart von metallischem Zink zu 5-Amino-dUMP (5-NH&sub2;-dUMP) reduziert. Das Aminoprodukt wird dann gereinigt. Die gereinigte Aminoverbindung wird dann dazu benutzt, das Azidoprodukt in zwei Stufen herzustellen. Zu diesem Zwecke wird das Aminoprodukt angesäuert, woraufhin Natriumnitrit (NaNO2) hinzugegeben wird, um das Diazosalz 5-N&sub2;&spplus;-dUMP herzustellen, das nicht isoliert wird. Die 5-N&sub2;&spplus;-dUMP enthaltende Reaktionsmischung wird dann mit Natriumazid (NaN&sub3;) behandelt, um die Azidoverbindung (5-N&sub3;-dUMP) in hoher Ausbeute herzustellen. Die Reaktionsmischung wird durch eine G-10 Sephadexsäule geführt. Das 5-N&sub3;-dUMP-Produkt wird eluiert und unter Vakuum konzentriert.
- Pyrophosphat wird nach einem bekannten veröffentlichten Verfahren mit gewissen Modifikationen mit dem 5-N&sub3;-dUMP gekoppelt. Speziell wird das TEA-Salz von 5-N&sub3;-dUMP mit Diphenylchlorphosphat in DMF aktiviert. Nach der Aktivierung wird die Reaktionsmischung zu einem Überschuß des Tetrabutylammoniumsalzes von Pyrophosphat hinzugegeben. Nachdem die Umsetzung für die richtige Zeitdauer abgelaufen ist, trennt man 5-N&sub3;-dUTP ab und gewinnt es.
- Das Folgende ist eine detaillierte Beschreibung des 5-stufigen Verfahrens:
- Stufe 1 - Synthese von 5-NO&sub2;-dUMP aus 5'-dUMP:
- Das Dinatriumsalz von 5'-dUMP (200 mg, 236/umol) wurde in 3ml H&sub2;O gelöst und auf eine Säule von Dowex 50w (H&spplus;-Form, 10cm · 3cm)-Harz gefüllt. Die H&spplus;-Form von 5-dUMP wurde mit destilliertem Wasser aus der Säule eluiert. Die H&spplus;-Form von 5'-dUMP wurde dann in einem Rundkolben angeordnet und unter verringertem Druck bei 50ºC zur Trockne verdampft. Das getrocknete Material wurde in Methanol (0,01 % H&sub2;O) dreimal resuspendiert und gemeinsam verdampft, um Wasser zu entfernen. Wasserfreies Dimethylforformamid (DMF) (5,0 ml) wurde zu dem trockenen 5'-dUMP hinzugegeben und die resultierende Lösung bei 25ºC gerührt, bis sie klar war. Nitrosyltetrafluorborat (176 mg, 2360umol) wurde unter Rühren zur 5'-dUMP-Reaktionsmischung hinzugegeben. Die Nitrierungsreaktion ließ man 5 Minuten lang ablaufen, woraufhin die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml H&sub2;O beendet wurde. Dann verdampfte man die Reaktionsmischung bei 40ºC fast zur Trockne, woraufhin 5,0 ml 1N HCl hinzugegeben wurden. Diese angesäuerte Lösung wurde unter verringertem Druck bei 30ºC fast zur Trockne verdampft. Dann verdampfte man das Produkt mehrere Male jeweils unter Einsatz von 5,0 ml H&sub2;O. Nach der letzten gemeinsamen Verdampfung in H&sub2;O wurde das Produkt mit H&sub2;O bis zu einem Endvolumen von etwa 3 ml mit Wasser verdünnt. Konzentrierte NH&sub4;OH wurde hinzugegeben, um den pH auf 7,0±1,0 anzuheben. Diese neutralisierte Probe wurde auf eine Säule aus DEAE-Zellulose (30 cm · 1,5 cm, HCO&sub3;&supmin;-Form) gefüllt und mit 400 ml eines linearen Gradienten von 0 bis 0,25 M Triethylammoniumbikarbonat (TEA-HCO&sub3;) eluiert. Das aus der Säule eluierte 5-NO&sub2;-dUMP wurde durch sein bekanntes UV-Spektrum (G. Huang und P.F.
- Torrence "J. Org. Chem." 42, 3821-3824, 1977) und durch seine Eigenschaften bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Zellulose unter Verwendung des Lösungsmittelsystems A: Isobuttersäure/NH&sub4;OH/H&sub2;O (66 : 1:33, Vol/Vol) identifiziert. Die 5-NO&sub2;-dUMP enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und die Lösung unter verringertem Druck bei 40ºC zur Trockne verdampft. Es wurde eine gemeinsame Verdampfung mit Methanol ausgeführt, bis kein TEA-HCO&sub3; mehr vorhanden war. Das Endprodukt wurde in destilliertem Wasser bei 10ºC gelagert, bis es für die Synthese von 5-NH&sub2;-dUMP eingesetzt wurde. Auf der Grundlage des UV-Spektrums der Reaktionsmischung vor der Säulenchromatographie betrug die Ausbeute 98 Prozent.
- Stufe 2 - Synthese von 5-NH&sub2;-dUMP aus 5-NO&sub2;-dUMP:
- Zinkmetall-Feilspäne (15 g) wurden für 10 Minuten in konzentrierte HCl gelegt. Die Feilspäne wurden dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Eine Lösung von 5-NO&sub2;-dUMP (5,0 ml, 100 umol) in Wasser wurde durch Zugabe von 250 ul von 1N HCl angesäuert. Diese 5-NO&sub2;-dUMP enthaltende angesäuerte Lösung wurde dann über die gereinigten Metall- Feilspäne gegossen und 5 Minuten lang bei 25ºC gerührt. Dann wurden nochmals 250 ul 1N HCl hinzugegeben und 5 Minuten lang umgesetzt. Die angesäuerte Lösung wurde von den Zn-Metall-Feilspänen durch Filtration abgetrennt und durch Verdampfung unter verrin-gertem Druck bei 40ºC zu einem Volumen von 1 bis 3 ml ein-gedampft. Die 5-NH&sub2;-dUMP enthaltende Lösung wurde dann mit NH&sub4;OH zu einem pH-Wert von 7,0±1,0 neutralisiert. Die neu-tralisierte Probe wurde auf eine DEAE-Zellulosesäule gefüllt und wie in Stufe 1 beschrieben eluiert. Das 5-NH&sub2;-dUMP-Produkt wurde durch sein bekanntes UV-Spektrum (R. Luhrmann, U. Schwarz und H.G. Gassen, "FEBS-Letters" 32, 55-58, 1973; M. Roberts und D.W. Visser "J.Am.Chem. Soc." 74, 668-669, 1975) identifiziert. Die 5-NH&sub2;-dUMP ent-haltenden Fraktionen wurden vereinigt und bei 40ºC zur Trockne verdampft. Die gemeinsame Verdampfung mit Methanol wurde zur Entfernung von TEA-HCO&sub3; benutzt. Das gereinigte Endprodukt wurde in destilliertem H&sub2;O bei 10ºC gelagert, bis es zur Herstellung von 5-N&sub3;-dUMP eingesetzt wurde. Ein UV-Spektrum des Endproduktes vor der Säulenchromatographie zeigte eine Ausbeute 96 Prozent aus 5-NO&sub2;-dUMP.
- Stufen 3 und 4 - Synthese von 5-Diazo-2'-Desoxyuridin-5'- monophosphat (5-N&sub2;&spplus;-dUMP) und 5-Azido-2'-Desoxyuridin-5' - monophosphat (5-N&sub3;-dUMP) aus 5-NH&sub2;-dUMP Das 5-N&sub2;&spplus;-dUMP wurde nicht isoliert, sondern direkt nach seiner Synthese zur Herstellung von 5-N&sub3;-dUMP benutzt. Das 5-NH&sub2;-dUMP (47 umol) in Wasser wurde in einen Rundkolben gefüllt und unter verringertem Druck bei 40ºC zur Trockne verdampft. 5,0 ml von 1N HCl wurden zum getrockneten 5-NH&sub2;-dUMP hinzugegeben und diese Reaktionsmischung 15 Minuten lang unter Rühren in einem Eiswasserbad angeordnet. 3,0 ml einer NaNO&sub2;-Lösung (18,4 mM, 55,2 umol) bei 5ºC wurde zu der gerährten Reaktionsmischung hinzugegeben, und man ließ die Umsetzung für weitere zwei Minuten ablaufen. Nach zwei Minuten wurden 1,5 ml einer 4M NaN&sub3;- Lösung bei 5ºC hinzugegeben und für eine Minute auf Eis gerührt. Nach einer Minute ordnete man die Reaktionsmischung in einem Wasserbad von 25ºC an und rührte 30 Minuten lang im Dunkeln. Nach 30 Minuten gab man 8N NaOH hinzu, um einen End-pH von 7,0±1,0 zu erhalten. Die neutralisierte Reaktionsmischung wurde durch Verdampfen bei verringertem Druck bei 20ºC zu einem Volumen von 1 bis 2 ml eingedampft und auf eine G-10 Sephadexsäule gegeben, die vorher in destilliertem Wasser äquilibriert worden war. Das 5-N&sub3;-dUMP-Produkt eluierte man mit destilliertem Wasser von der G-10 Säule. Die erste UV-absorbierende Fraktion aus der G-10 Säule enthielt das 5-N&sub3;-dUMP-Produkt. Die Ausbeute an 5-N&sub3;-dUMP, basierend auf den UV-Spektrum des photoaktiven Produktes aus der G-10 Säule, betrug 90 Prozent von 5-NH&sub2;-dUMP. Das photoaktive Produkt aus der G-Säule wurde zu einem Volumen von 1 bis 2 ml verdampft und auf eine BD- Zellulosesäule (HCO&sub3;&supmin;-Form) gegeben. Das 5-N&sub3;-dUMP wurde, wie in Stufe 1 beschrieben, von der BD-Zellulosesäule eluiert. Die 5-N&sub3;-dUMP enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne verdampft und mehrere Male mit Methanol gemeinsam verdampft, um TEA-HC&sub3; zu entfernen.
- Das UV-Spektrum von 5-N&sub3;-dUMP ist in Fig. 1 gezeigt. Der errechnete molare Extinktionskoeffizient (E) von 5-N&sub3;-dUMP bei pH 7,0 ist 6.210 bei 288 nm. Die Wirkung von UV-Licht auf das Absorptionsspektrum durch einminütiges Photolysieren mit einem in der Hand gehaltenen UV-Licht (254 nm UVS-II Mineralight, 6.000 uWatt/cm²) ist in Fig. 1 gezeigt.
- Das kernmagnetische Resonanz (NMR-Spektrum) wurde an der H&spplus;-Form von 5-N&sub3;-dUMP in D&sub2;O aufgenommen. Die Ergebnisse des NMR zeigen ein Verschwinden des 5-Protons von 5'-dUMP (Fig. 2). Die NMR-Ergebnisse zeigen auch, daß das 6-Proton, das einen Dublett-Peak in 5'-dUMP ergibt, für 5-N&sub3;-dUMP einen Singulett-Peak ergibt. Diese NMR-Daten zeigen, daß die 5-Position von 5'-dUMP in 5-N&sub3;-dUMP wie erwartet substituiert war.
- Das lnfrarot(lR)-Spektrum wurde an der H&spplus;-Form von 5-N&sub3;-dUMP in Dimethylformamid aufgenommen. Wie in Fig. 3 ersichtlich, gibt es einen charakteristischen Infrarot- Absorptionspeak bei 2.117 cm&supmin;¹, der die Azidogruppe (N=N=N) anzeigt. Fig. 4 zeigt die Wirkung von UV-Licht auf den Infrarot-Absorptionspeak bei 2.117 cm&supmin;¹. TLC auf Zellulose unter Einsatz des Lösungsmittelsystems A ergab einen Rf- Wert von 0,42 für 5-N&sub3;-dUMP, von 0,48 für 5-NO&sub2;-dUMP und von 0,44 für 5-NH&sub2;-dUMP. Das 5-N&sub3;-dUMP-Produkt ergab auch einen positiven Dische-Test (J.G. Buchanan, "Nature", 168, 1091; 1951), der die Anwesenheit von Desoxyribose anzeigt.
- Stufe 5 - Synthese von 5-N&sub3;-dUTP aus 5-N&sub3;-dUMP.
- Pyrophosphat wurde nach dem Verfahren von Michelson (A.M. Michelson "Biochim. Biophys. Acta" 91, 1-13, 1964) mit 5-N3-dUMP unter Anwendung der folgenden Änderungen gekuppelt. Das TEA-Salz von 5-N&sub3;-dUMP wurde mit Diphenylchlorphosphat in DMF bei 25ºC für eine Stunde im Dunkeln aktiviert. Nach der Aktivierung des 5-N&sub3;-dUMP gab man die Reaktionsmischung tropfenweise zu 1 ml DMF hinzu, das einen fünfzigfachen Überschuß des Tetrabutylammoniumsalzes von Pyrophosphat enthielt. Die Kupplungsreaktion ließ man eine Stunde bei 25ºC im Dunkeln ablaufen. 5-N&sub3;-dUTP wurde auf einer DEAE-Zellulosesäule (30 cm · 1,5 cm, HCO&sub3;&supmin;-Form) unter Anwendung von 400ml eines linearen Gradienten von 10 mM bis 0,5 M TEA-HCO&sub3; von Nebenprodukten abgetrennt. 5-N&sub3;-dUTP wurde durch sein UV-Spektrum, seine Eigenschaften bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Zellulose und durch seine Photoaktivität identifiziert.
- Wurde 5-N&sub3;-dUTP auf seine Verwendungsfähigkeit durch DNA-Polymerase 1 getestet, stellte man fest, daß es leicht anstelle von dTTP zur Herstellung photoaktiver DNA eingesetzt werde konnte. Dies zeigt, daß das Endprodukt wie erwartet definitiv drei Phosphate an der 5'-Position aufwies. TLC auf Zellulose unter Verwendung des Lösungsmittelsystems A ergab einen Rf-Wert von etwa 0,16 für 5-N&sub3;-dUTP. Wurde das 5-N&sub3;-dUTP vor seiner Zugabe zu einer DNA-Synthesereaktion in vitro mit UV-Licht photolysiert, fand keine DNA-Synthese statt, wie durch säureausfällbare Zählungen unter Verwendung von [a³²P]dATP als Markierung gemessen. Wurde die 5-N&sub3;-dUMP enthaltende DNA auf Photoaktivität getestet, wurde festgestellt, daß sie mit langwelligem UV- Licht sehr viel besser als eine Vergleichs-DNA ohne das 5-N&sub3;-dUMP in Zellulose-Filterpapier inkorporiert wurde.
Claims (9)
1. 5-Azido-2' -desoxyuridin-5' -triphosphat.
2. Nukleotide enthaltend die photoaktive Base
5-Azidouracil.
3. Nukleoside enthaltend die photoaktive Base
5-Azidouracil.
4. Das Verfahren zum Herstellen von
5-Azido-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat umfassend die Stufen:
(a) Umsetzen von 5'-Desoxyuridin-monophosphat mit
Nitrosyl (Nitrosonium) -tetrafluorborat zur Herstellung von
5-Nitro-2'-desoxyuridin-5'-monophosphat;
(b) Reduzieren des genannten
5-Nitro-2'-desoxyuridin-5'-monophosphats zu 5-Amino-2'-desoxyuridin-5'-
monophosphat in Gegenwart von metallischem Zink;
(c) Ansäuern des genannten 5-Amino-2'-desoxyuridin-
5'-monophosphats und Umsetzen des angesäuerten Produktes
mit Natriumnitrit zur Herstellung von
5-Diazo-2'-desoxyuridin-5'-monophosphat;
(d) Umsetzen des genannten 5-Diazo-2'-desoxyuridin-
5'-monophosphats mit Natriumazid zur Herstellung von
5-Azido-2'-desoxyuridin-5'-monophosphat;
(e) Aktivieren des genannten
5-Azido-2'-desoxyuridin-5'-monophosphats durch Umsetzung mit
Diphenylchlorphosphat und
(f) Umsetzen des genannten aktivierten 5-Azido-2'-
desoxyuridin-5'-monophosphats mit einem Überschuß des
Tetrabutylammoniumsalzes von Pyrophosphat zur Herstellung
von 5-Azido-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat.
5. 5-N3-Uracil-Verbindungen der allgemeinen Formel
worin:
M&spplus; = irgendein einwertiges oder zweiwertiges Kation;
n = 0 bis 5;
A = H oder OH;
B = -O-[P0&sub3;]&sub1;&submin;&sub3;, H oder OH.
6. 5-Azido-2'-desoxyuridin-5'-monophosphat.
7. Das Verfahren zum Herstellen von
5-Azido-2'-desoxyuridin-5'-monophosphat umfassend die Stufen:
(a) Umsetzen von 5'-Desoxyuridin-monophosphat mit
Nitrosyltetrafluorborat zur Herstellung von 5-Nitro-2'-
desoxyuridin-5'-monophosphat;
(b) Reduzieren des genannten
5-Nitro-2'-desoxyuridin-5'-monophosphats zu 5-Amino-2'-desoxyuridin-5'-
monophosphat in Gegenwart von metallischem Zink;
(c) Ansäuern des genannten 5-Amino-2'-desoxyuridin-
5'-monophosphats und Umsetzen des angesäuerten Produktes
mit Natriumnitrit zur Herstellung von
5-Diazo-2'-desoxyuridin-5'-monophosphat und
(d) Umsetzen des genannten 5-Diazo-2'-desoxyuridin-
5'-monophosphats mit Natriumazid zur Herstellung von 5-
Azido-2'-desoxyuridin-5'-monophosphat.
8. 5-Diazo-2'-desoxyuridin-5'-monophosphat.
9. Das Verfahren zum Herstellen von
5-Azido-2'-desoxyuridin-Nukleosid- und -Nukleotid-Verbindungen umfassend
die Stufen:
(a) Umsetzen einer 5'-Desoxyuridinverbindung mit
Nitrosyltetrafluorborat zur Herstellung einer
5-Nitrodesoxyuridinverbindung,
(b) Reduzieren der genannten
5-Nitro-desoxyuridinverbindung zu einer 5-Amono-desoxyuridinverbindung in
Gegenwart von metallischem Zink;
(c) Ansäuern der genannten
5-Amino-desoxyuridinverbindung und Umsetzen des angesäuerten Produktes mit
Natriumnitrit zur Herstellung einer
5-Diazo-desoxyuridinverbindung und
(d) Umsetzen der genannten
5-Diazo-desoxyuridinverbindung mit Natriumazid zur Herstellung einer
5-Azidodesoxyuridinverbindung.
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