Hintergrund der Erfindung
Technisches Gebiet
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum
Hydratisieren einer Nitridverbindung durch Einwirkung von
Nitrilase, die von einem Mikroorganismus hergestellt
worden ist, um die Nitrilverbindung in die
entsprechende Amidverbindung umzuwandeln. Insbesondere betrifft
die Erfindung das Verfahren zur Durchführung der
Hydratisierungsreaktion, das ohne Bestrahlung mit Licht
praktisch nicht abläuft, durch Bestrahlung der
Nitrilase mit Licht.
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Vor kurzem wurden Verfahren zur Durchführung von
chemischen Umsetzungen durch Verwendung von
Mikroorganismen oder von ihnen erhaltenen Enzymen entwickelt.
Allgemein sind die Umsetzungen mit Hilfe von
Mikroorganismen oder Enzymen deswegen vorteilhaft, weil
der Energieverbrauch für die Umsetzungen gering ist,
da die Umsetzung bei Raumtemperatur und
Atmosphärendruck durchgeführt werden kann, und weil die
gewünschten Produkte hoher Reinheit leicht erhältlich sind, da
die Selektivität der Umsetzung zu den gewünschten
Produkten sehr groß ist. Andererseits lassen sich
derartige Reaktionen hinsichtlich der Reaktionsaktivität
und der Lebensdauer der Mikroorganismen oder Enzyme
die als Katalysatoren verwendet werden, verbessern.
Insbesondere gibt es Schwierigkeiten, wenn die
Geschwindigkeit der gewünschten Umsetzung (d. h. die
Reaktionsaktivität) unter optimalen Bedingungen und
insbesondere bei optimaler Temperatur und bzw. oder
optimalem pH-Wert niedrig ist. In einem solchen Fall
ist die Produktivität im Verhältnis zur Menge an
verwendeten Bakterienzellen verringert, weil Reaktoren mit
großer Kapazität zufolge der niedrigen
Raumgeschwindigkeit
erforderlich sind, die Umsetzung wegen der
geringen Reaktionsgeschwindigkeit eine lange Zeit
beansprucht und auch die Reaktionsaktivität erniedrigt ist.
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Daher ist es von grundlegender Wichtigkeit, eine
hohe Reaktionsaktivität der zu verwendenden
Mikroorganismen oder Enzyme zu erreichen. Eine derartige
Reaktionsaktivität ist ein wichtiger wirtschaftlicher
Faktor der technischen Herstellung.
Stand der Technik
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Verfahren zum Hydratisieren von
Nitrilverbindungen zu den entsprechenden Amidverbindungen durch
Einwirkung der Nitrilase, die von Mikroorganismen
erzeugt worden ist, die eine enzymatische Aktivität
aufweisen, durch die eine Nitrilverbindung in die
entsprechende Amidverbindung hydratisiert wird
(Nitrilaseaktivität), sind aus den japanischen Patentschriften
17918/81 und 38118/81 sowie der japanischen
Offenlegungsschrift (Kokai) 86186/76 bekannt. Mikroorganismen
spielen bei diesen Umsetzungen eine wichtige Rolle,
und in den obigen Veröffentlichungen sind mehrere
Mikroorganismen beschrieben.
Schwierigkeiten
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Es wurde von den Erfindern gefunden, daß die
Nitrilaseaktivität nicht hinreichend zur Wirkung
gebracht werden kann, wenn ein großer Metallreaktor
verwendet wird, um die Hydratisierungsreaktion von
Nitrilverbindungen in großtechnischem Maßstab unter
Verwendung der Nitrilase durchzuführen, die von diesen
Mikroorganismen erzeugt worden ist. Es ist unsicher,
ob diese Erscheinung durch die Mikroorganismen selbst
oder das Material und den Bau des Reaktionsgefäßes
oder durch andere Gründe verursacht wird. Es war
somit erforderlich, diese Schwierigkeiten für die
großtechnische Durchführung eines mikrobiologischen
Verfahrens zur Herstellung von Amidverbindungen zu lösen.
Eine Lösung
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Als eine Lösung für die obigen Schwierigkeiten
hatten die Erfinder bereits eine Erfindung gemacht
(japanische Anmeldung 125588/83), die sich dadurch
auszeichnet, daß man dem zu verwendenden Mikroorganismus
eine bestimmte Menge Lichtenergie zuführt, indem man
die Hydratisierungsreaktion in einem Reaktionsgefäß
durchführt, das mindestens teilweise aus einem
lichtundurchlässigen Material besteht. Diese Erfindung
beruht auf der Erkenntnis, daß (i) die Mikrobenzellen
ohne Bestrahlung mit Licht keine Nitrilaseaktivität
aufweisen, (ii) die Nitrilaseaktivität, die durch
Bestrahlung mit Licht erzeugt wird, mit der Zeit
abnimmt und (iii) ein Ansteigen der Nitrilaseaktivität
(einschließlich des Anstiegs von 0 aus) durch
Bestrahlung mit Licht beobachtet wird.
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Zu dem Zeitpunkt, zu dem die Erfindung gemacht
worden ist, wurde von den Erfindern erkannt, daß die
Wirkung der Bestrahlung mit Licht gemäß der Erfindung
auf die Erhöhung der Geschwindigkeit des Substrats
(Nitril) und des Produkts (Amid), mit der diese durch
die Zellmembranen wandern, zurückzuführen ist.
Tatsächlich wurde ein Ansteigen der Nitrilaseaktivität
durch Bestrahlung mit Licht nicht beobachtet, wenn
die Nitrilaseaktivität einer Enzymprobe ausgenutzt
wurde, die keine Beziehung zu einer Wanderung durch
Zellmembranen hindurch aufweist. Weitere Forschungen
nach der Erfindung haben es jedoch klarwerden lassen,
daß die Nitrilaseaktivität einer Enzymprobe auch zum
erstenmal auftritt, wenn sie mit Licht bestrahlt wird,
und daß die Nitrilaseaktivität, wenn sie einmal
aufgetreten ist, kaum mit der Zeit abnimmt. Dies ist der
Grund dafür, warum die Erhöhung der Nitrilaseaktivität
der obigen Enzymprobe nicht beobachtet wurde. Die
Nitrilaseaktivität der Enzymprobe, die in dem Versuch
verwendet wurde, war bereits durch Bestrahlung mit
Licht bei der Herstellung der Enzymprobe erzeugt worden
und ohne Abfall aufrechterhalten geblieben, als der
Versuch durchgeführt wurde, und somit gab es keine
Möglichkeit zu einer weiteren Erhöhung der
Nitrilaseaktivität durch Bestrahlung mit Licht in dem Versuch.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung beruht auf der oben beschriebenen
Erkenntnis.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Hydratisierung einer Nitrilverbindung durch Einwirkung
von Nitrilase, die von einem Mikroorganismus hergestellt
worden ist, um die Nitrilverbindung in die entsprechende
Amidverbindung umzuwandeln, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man die Umsetzung unter Bedingungen durchführt,
unter denen
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(a) die von dem Mikroorganismus erzeugte Nitrilase
in Form von zerstoßenen Zellen des Mikroorganismus oder
in Form von intrazellulärer Substanz, die von dem
Mikroorganismus erhalten ist, vorliegt;
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(b) auf die von dem Mikroorganismus erzeugte
Nitrilase Lichtenergie von Licht einwirkengelassen wird,
das eine Wellenlänge von 100 bis 1000 nm aufweist,
entsprechend mindestens 10 uE/g Mikrobenzellen (umol
Photonen/g Mikrobenzellen), bevor die
Hydratisierungsreaktion beendet ist; wobei ausgeschlossen ist, daß
die aufgenommene Lichtenergie allein von natürlichem
Tageslicht geliefert wird; und
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(c) die Hydratisierungsreaktion in einem Gefäß
durchgeführt wird, das zumindestens teilweise aus
einem lichtundurchlässigen Material besteht.
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Gemäß der Erfindung werden zunächst die Vorteile
erzielt, die auf der oben erwähnten früheren Erfindung
der Erfinder beruhen. Das heißt, bei der
Hydratisierungsreaktion
einer Nitrilverbindung durch Einwirkung von
Nitrilase, die durch einen Mikroorganismus gemäß der
Erfindung erzeugt worden ist, kann (i) die
Hydratisierungsreaktion, die in einem Reaktionsgefäß aus einen
lichtundurchlässigen Material, in dem im wesentlichen
kein Licht vorhanden ist, praktisch nicht abläuft,
durch Bestrahlung der Nitrilase mit Licht ablaufen und
(ii) die Hydratisierungsreaktion, die in einem
Reaktionsgefäß, das teilweise aus lichtundurchlässigem
Material besteht, in dem eine gewisse Menge Licht
vorhanden ist, durch die Bestrahlung mit Licht merklich
ablaufen.
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Weiter besitzt die vorliegende Erfindung den
Vorteil, daß die Hydratisierungsreaktion dank der
Aufrechterhaltung der Nitrilaseaktivität, nachdem sie
durch Bestrahlung der zerstoßenen Zellen oder der
intrazellulären Substanz eines Mikroorganismus mit
Licht einmal erzeugt worden ist, an einem völlig
dunklen Ort durchgeführt werden kann. Angesichts der
Tatsache, daß Reaktionsbehälter für technische Zwecke
aus Metall hergestellt werden, ist es vorteilhaft für
die technische Durchführung der Hydratisierungsreaktion,
daß keine Vorrichtung zur Lichtbestrahlung bei
derartigen Behältern erforderlich ist.
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Es ist wohlbekannt, daß wertvolle Substanzen nach
mikrobiologischen Verfahren einschließlich der
Verwendung von Enzymen hergestellt werden. Jedoch die
Erzeugung oder Erhöhung der Aktivität von Mikroorganismen
oder ihren Enzymen durch Bestrahlung mit
elektromagnetischen Wellen, wie beispielsweise Licht, ist nicht
wohlbekannt gewesen. Im Gegenteil wird im allgemeinen
angenommen, daß die Bestrahlung mit Licht häufig
nachteilig ist. Somit kann gesagt werden, daß die Wirkung
der Bestrahlung mit Licht, die lediglich in dem oben
erwähnten Fall auftritt, angesichts der üblichen
Ergebnisse bei Bestrahlung von Mikroorganismen oder
ihren Enzymen mit Licht nicht erwartet werden konnte.
Beschreibung der Erfindung im einzelnen
Nitrilase, die von einem Mikroorganismus erzeugt wird
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Wie oben beschrieben, ist es bekannt, daß eine
Nitrilverbindung durch Einwirkung von Mikroorganismen
mit Nitrilaseaktivität oder von Nitrilase, die durch
die Mikroorganismen erzeugt worden ist, in die
entsprechende Amidverbindung umgewandelt wird. Die
Erfinder haben gefunden, daß die Mikroorganismen, die zu den
Arten gehören, die in den oben erwähnten japanischen
Patenten 17918/81 und 38118/81 sowie der japanischen
Offenlegungsschrift 86186/76 beschrieben sind, allgemein
eine verbesserte Aktivität durch ihre Bestrahlung mit
Licht aufweisen und daß die zerstoßenen Zellen der
Mikroorganismen und die intrazelluläre Substanz, die
aus den Zellen herausgenommen wird, bei der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können.
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Spezifische Beispiele für derartige Mikroorganismen,
sind Bakterien, die zu den folgenden Arten gehören:
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(a) Corynebacterium;
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(b) Nocardia;
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(c) Bacillus;
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(d) Bacteridium;
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(e) Microcossus; und
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(f) Brevibacterium.
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Spezifische Stämme, die zu diesen Arten gehören,
sind: Corynebacterium Stamm N-771 (FERM P 4445,
hinterlegt am 30. Mai 1978 bei der japanischen
Hinterlegungsstelle Fermentation Research Institute, Agency of
Industrial Science and Technology, 1,3-Higashi 1-chome,
Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, Japan, die im
folgenden FRI genannt wird), sowie der Stamm N-774
(FERM P 4446, hinterlegt am 30. Mai 1978 bei FRI) und
Nocardia Stamm N-775 (FERM P 4447, hinterlegt am
30. Mai 1978 bei FRI). Diese Stämme sind in den
japanischen Patentschriften 17918/81 und 38118/81
beschrieben.
Weitere Beispiele sind die Stämme des Genus
Bacillus und andere, die in der japanischen
Offenlegungsschrift 86186/76 beschrieben sind und von denen ausgesagt
ist, daß sie bei CBS*) und FRI hinterlegt worden sind.
Die bakteriologischen Eigenschaften dieser Stämme sind
in diesen Veröffentlichungen beschrieben.
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Die Nitrilaseaktivität, die gemäß der vorliegenden
Erfindung ausgenutzt wird, ist diejenige der zerstoßenen
Zellen der oben erwähnten Mikroorganismen oder diejenige
der intrazellulären Substanz, die aus den Mikroorganismen
erhalten wird. Die "zerstoßenen Zellen" bedeuten (i)
Zellen, die mittels einer französischen Presse oder anderen
mechanischen Einrichtungen zerstoßen worden sind, (ii)
Zellen, die durch osmotischen Druck in einem flüssigen
Medium, in dem die Zellmembranen und Zellwände zerrissen
werden, zum Platzen gebracht worden sind, und (iii) andere,
wobei die Nitrilase oder die intrazelluläre Substanz
mit Nitrilaseaktivität außerhalb der Zellen vorkommt
und der Rest der Zellmembranen und Zellwände noch nicht
entfernt ist. Wenn der Ausdruck "intrazelluläre Substanz,
die aus Mikroorganismen erhalten worden ist" verwendet
wird, bedeutet "intrazelluläre Substanz" mindestens
einen Teil der Gesamtsubstanz, das heißt konkret (i) die
oben erwähnten zerstoßenen Zellen, bei denen die
Zellmembranen und Zellwände entfernt worden sind, (ein Teil
der intrazellulären Substanz könnte auch bei der oben
erwähnten Entfernung mitentfernt worden sein), (ii)
Enzymproben, die von derartigen Substanzen, wie sie in
dem obigen Abschnitt (i) beschrieben sind, durch
herkömmliche Verfahren, wie beispielsweise als
Ammoniumsulfatfraktion erhalten worden sind (selbstverständlich
können sie verschiedene Nitrilasegehalte oder -titer
aufweisen), und (iii) andere.
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*) CBS=Centraal Bureau Voor Schimmelstructuren, Baarn, NL
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Aus Vereinfachungsgründen werden diese alle im
folgenden durch die allgemeine Bezeichnung "die
Zerstoßenen Zellen usw." bezeichnet.
Nitrilverbindungen und Amidverbindungen
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Die Nitrilverbindungen sind durch die allgemeine
Formel R-(CN)n gekennzeichnet und umfassen weite
Verbindungsklassen. Die Verbindungen umfassen
Mononitrile, wenn n=1 und Polynitrile, wenn n≥2. R ist
Wasserstoff oder ein gesättigter oder ungesättigter
Kohlenwasserstoffrest, der die unterschiedlichsten
Zahlen von Kohlenstoffatomen aufweisen und
geradkettig, verzweigtkettig oder zyklisch sein kann. Der
Kohlenwasserstoffrest kann weiter Aminogruppen,
Hydroxylgruppen, Halogenatome, Carboxylgruppen oder
andere Substituenten enthalten, die mit dem
verwendeten Mikroorganismus verträglich sind.
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Beispiele für bevorzugte Nitrilverbindungen sind
Acetonitril, Propionitril, n-Butyronitril,
Isobutyronitril, n-Valeronitril, Acrylnitril, Methacrylnitril,
Benzonitril, Cyanopyridin, Malononitril,
Succinonitril, Fumaronitril, Chloracetonitril,
β-Hydroxypropionitril, Aminoacetonitril und β-Aminopropionitril.
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Als Ergebnis von Versuchen mit vielen
Nitrilverbindungen, wurde, wie in den folgenden Beispielen
gezeigt, gefunden, daß die Nitrilaseaktivität ohne
Ausnahme durch die Bestrahlung mit Licht erhöht wird.
Somit kann gesagt werden, daß die vorliegende Erfindung
allgemein mit Nitrilverbindungen durchgeführt werden
kann.
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Das erhaltene Hydratisierungsprodukt ist die
entsprechende Amidverbindung, in der die CN-Gruppe des
Ausgangsnitrils zu einer CONH&sub2;-Gruppe hydratisiert
worden ist.
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Was die Nützlichkeit der Produkte angeht, so ist
mindestens derzeit die Herstellung von Acrylamid aus
Acrylnitril und von Nikotinsäureamid aus Cyanopyridin
wichtig.
Hydratisierungsreaktion
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Es ist bekannt, die Hydratisierung einer
Nitrilverbindung unter Einwirkung von Nitrilase, die durch
Mikroorganismen mit Nitrilaseaktivität erzeugt worden
ist, durchzuführen. Bei der vorliegenden Erfindung
kann die Hydratisierung in jeder gewünschten
Durchführungsform erfolgen, solange das Ziel der Erfindung
nicht beeinträchtigt wird. Es ist festzustellen, daß
durch die Bestrahlung mit Licht keine Veränderung der
Hydratisierungsreaktion selbst beobachtet worden ist.
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Die Methode der Hydratisierungsreaktion umfaßt
allgemein das Inkontaktbringen des Ausgangsnitrils mit
den zerstoßenen Zellen usw. in einem wäßrigen Medium
während einer vorherbestimmten Zeitdauer.
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Die zerstoßenen Zellen usw. können in Form von
zerstoßenen Zellen in einer flüssigen Kultur, weiter
als zerstoßene Zellen, die von dem Kulturmedium
abgetrennt worden sind, ferner als getrocknetes Produkt
von zerstoßenen Zellen oder schließlich als gewonnene
Enzymproben oder Enzymproben, die auf einem flüssigen
oder festen Träger festgehalten werden oder in einem
flüssigen oder festen Träger immobilisiert sind,
vorliegen. Die bevorzugte Form von zerstoßenen Zellen
usw. sind solche, die in einem polymeren Gel, wie
beispielsweise vernetztem Polyacrylamidgel oder
vernetztem Polyvinylalkohol, unbeweglich gemacht, d. h.
immobilisiert worden sind.
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Die Konzentrationen des Substrats (Nitril) und
der zerstoßenen Zellen usw. in dem wäßrigen Medium
kann in geeigneter Weise ausgewählt werden und
beträgt allgemein beim Substrat etwa 0,01 bis etwa 5
Gew.-% und bei den zerstoßenen Zellen usw. etwa
0,01 bis etwa 2 Gew.-%. Die Konzentration der
zerstoßenen Zellen usw. wird im vorliegenden Fall in
Form des Trockengewichts der ursprünglichen Zellen
ausgedrückt. Eine geeignete Umrechnung ist somit bei
Verwendung von Enzymproben als zerstoßene Zellen usw.
erforderlich. Die Reaktionstemperatur, der pH-Wert der
Umsetzung und andere Reaktionsbedingungen können je nach
der Art der zu verwendenden zerstoßenen Zellen usw.
bestimmt werden. Normalerweise liegt die
Reaktionstemperatur im Bereich von etwa 0 bis etwa 20ºC und der
pH-Wert in der Umgebung von etwa 7. Ein geeignetes
Puffermittel kann verwendet werden, um den pH-Wert auf
einer vorherbestimmten Größe zu halten.
Bestrahlung mit Licht
(1) Licht
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Die Bestrahlung mit Licht erfolgt auf die
zerstoßenen Zellen usw. vor Beendigung der
Hydratisierungsreaktion. Der Ausdruck "vor Beendigung der
Hydratisierungsreaktion" bedeutet jeden beliebigen Zeitpunkt vor
Beendigung der Hydratisierungsreaktion, wobei Beendigung
nicht immer die Umwandlung zu 100% bedeutet. Da die
Bestrahlung mit Licht auf die zerstoßenen Zellen usw.
erfolgt, umfaßt der Ausdruck "vor Beendigung der
Hydratisierungsreaktion" auch einen Zeitpunkt vor dem
Inkontaktbringen der zerstoßenen Zellen usw. mit einer
Nitrilverbindung. Demzufolge kann die Bestrahlung vor
und bzw. oder nach Inkontaktbringen der zerstoßenen
Zellen usw. mit einer Nitrilverbindung erfolgen.
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Das "Licht", mit dem gemäß der Erfindung bestrahlt
werden soll, kann jede beliebige Wellenlänge aufweisen,
sofern bei dieser Wellenlänge die Wirkung der
Bestrahlung auftritt. Jedoch wie in Anbetracht der Tatsache,
daß das Licht ein Bereich von elektromagnetischen
Wellen ist, leicht einzusehen ist, ist die Wirkung
gering, wenn das Licht in einem Bereich mit größerer
Wellenlänge, emittiert von einem niedrigeren atomaren
Energieniveau, vorliegt. Wenn andererseits die
Wellenlänge zu klein ist, ist ihre Energie zu groß, und die
Moleküle (Anordnung) der Enzyme wird zerstört. So
verlieren dann die zerstoßenen Zellen usw. ihre
enzymatische Aktivität.
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Gemäß den Untersuchungen der Erfinder in weiten
Wellenlängenbereichen besitzt Licht mit einer großen
Wellenlänge von über 800 nm keine abnorme Wirkung auf
die zerstoßenen Zellen usw., jedoch ist seine Wirkung
hinsichtlich der Erhöhung der enzymatischen Aktivität
nicht bemerkenswert. Wenn das Licht eine kurze
Wellenlänge von unter 100 nm aufweist, kann die Wirkung der
Erhöhung der Aktivität in einer kurzen Zeit erzielt
werden, jedoch erleiden dann die bestrahlten
zerstoßenen Zellen usw. eine nicht wiederherstellbare Abnahme
ihrer Aktivität. Somit liegt der bevorzugte
Lichtbereich gemäß der Erfindung bei einer Wellenlänge von
100 bis 1000 nm. In einzelnen kann ein derartiges
Licht beispielsweise aus einem Licht zur Sterilisierung
in einem Wellenlängenbereich von 200 bis 300 nm, einer
UV-Lampe in einem Wellenlängenbereich von 300 bis 400 nm
oder einem Licht zur allgemeinen Bestrahlung in einem
Wellenlängenbereich von 400 bis 800 nm erhalten werden.
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Die Bestrahlung mit Licht kann mit jeder beliebigen
Stärke oder Lichtmenge durchgeführt werden, solange
die Wirkung der Erhöhung der Aktivität beobachtet wird.
Im einzelnen sollte die Bestrahlung derart
durchgeführt werden, daß die zerstoßenen Zellen usw. eine
Lichtenergie von mindestens etwa 10 uE/g Zellen
erhalten. Die bevorzugte Menge an Lichtenergie variiert mit
der zur Bestrahlung angewandten Lichtwellenlänge. Im
einzelnen sollte die Bestrahlung derart durchgeführt
werden, daß die zerstoßenen Zellen usw. Lichtenergie
von mindestens etwa 10 uE/g Zellen, vorzugsweise
mindestens etwa 20 uE/g Zellen erhalten, wenn Licht mit
einer Wellenlänge von 300 bis 450 nm angewandt wird,
und mindestens etwa 50 uE/g Zellen, vorzugsweise
mindestens etwa 100 uE/g Zellen, wenn Licht mit einer
Wellenlänge von kaum 300 bis 450 nm angewandt wird.
Gelegentlich senkt die Verwendung von immobilisierten
zerstoßenen Zellen usw. die Reaktionsgeschwindigkeit
um etwa 1/2 bis etwa 1/3 im Vergleich zu der
Verwendung von nicht immobilisierten zerstoßenen Zellen usw.
von gleicher Konzentration. In diesem Falle erfordert
die Bestrahlung Lichtenergie, die etwa das 2- bis
3fache beträgt wie der oben erwähnte Wert. Was die
Lichtenergie anbetrifft, ist die Einheit "E"
diejenige Lichtenergiemenge, die der Energie von 1 mol
Photonen (hν) entspricht, d. h. die Energie hängt
von der Frequenz (ν) des bestrahlenden Lichts ab.
Die Einheit "g Zellen" betrifft das Trockengewicht,
ausgedrückt in Gramm, der ursprünglichen Zellen der
zerstoßenen Zellen usw., weshalb eine geeignete
Umrechnung für die Verwendung von Enzymproben notwendig
ist. Dies ist der Grund, warum der Ausdruck
"Lichtenergie, entsprechend . . ." in Anspruch 1 verwendet
wird. Der Ausdruck "Sekunde", der weiter unten
verwendet wird, bezieht sich auf die Zeitdauer der
Bestrahlung.
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Die Menge an Lichtenergie, die von den zerstoßenen Zellen
aufgenommen wird, ist größer als diejenige des Lichts der
Umgebung, die in einem Reaktionsgefäß oder anderen Reaktor
von normalem technischen Maßstab vorhanden ist, d. h. größer
als diejenige, die vom Raumlicht und bzw. oder in einem Raum
gestreuten Sonnenlicht geliefert wird. Insbesondere beträgt
die Lichtintensität auf technischen Produktionsanlagen gemäß
den Versuchen der Erfinder normalerweise etwa 100 Lux. Bei
einer derartigen Lichtintensität beträgt die Menge an
Lichtenergie, die von einem Reaktorgefäß mit einer Größe von
etwa 250 Liter Inhalt erhalten wird, weniger als die oben
definierten 10 uE/g Zellen, selbst wenn das Licht mehrere
Stunden lang strahlt und die Konzentration der zerstoßenen
Zellen und so weiter nur 1000 ppm beträgt sowie der obere
Abschnitt des Reaktionsgefäßes voll dem Licht ausgesetzt
ist.
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Daher ist es in großtechnischen Produktionsanlagen
schwierig, die erforderliche Menge an Lichtenergie selbst
unter der Bedingung, daß Zuganglichkeit gegenüber dem Licht
gegeben ist, zu befriedigen. Wenn die Bestrahlung mit Licht
gemäß der Erfindung durchgeführt wird, ist das Licht des
Raumes, das gegebenenfalls den zerstoßenen Zellen und so
weiter zugeführt wird, in der Gesamtmenge der Lichtenergie
von mindestens etwa uE/g Zellen eingeschlossen.
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Um die erforderliche Reaktionsgeschwindigkeit bei dem
Verfahren gemäß der Erfindung zu erzielen, wird die
Bestrahlung beispielsweise mit der niedrigsten Lichtenergie
von 10 uE/g Zellen durchgeführt.
(2) Bestrahlung
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Die Bestrahlung kann auf jede beliebige Weise durchgeführt
werden, solange die zerstoßenen Zellen und so weiter vor
oder während der Berührung mit einer Nitrilverbindung die
erforderliche Menge an Lichtenergie von einer Lichtquelle
zur Bestrahlung empfangen können.
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Der Ausdruck "eine Lichtquelle zur Bestrahlung der
zerstoßenen Zellen und so weiter" bedeutet eine Lichtquelle,
die innerhalb oder außerhalb der Reaktionsvorrichtung zur
Bestrahlung der zerstoßenen Zellen und so weiter mit Licht
angeordnet ist und außerdem etwas Licht einschließt, wie
beispielsweise gestreutes Sonnenlicht und bzw. oder
Raumlicht, das aus der Umgebung in die Reaktionsvorrichtung
gelangen kann. Gelegentlich, wenn der Raum, in dem eine
Reaktionsvorrichtung angeordnet ist, außerordentlich hell
ist, so daß beträchtliche Mengen Lichtenergie aus dem
Raumlicht in die Reaktionsvorrichtung gelangen kann, muß
eine derartige Lichtquelle als Lichtquelle zur Bestrahlung
gemäß der Erfindung angesehen werden.
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Insbesondere kann die Bestrahlung mit Licht dadurch
durchgeführt werden, daß man beispielsweise (a) eine
Lichtquelle in einem oberen Raum oberhalb eines Gefäßes
anordnet, das die zerstoßenen Zellen und so weiter enthält
(das heißt in einem Raum oberhalb der zerstoßenen Zellen und
so weiter oder oberhalb einer wäßrigen Suspension davon)
(b) die Bestrahlung durch ein Fenster, das an der Oberseite,
der Seitenfläche oder dem Bodenteil des Reaktionsgefäßes
angeordnet ist, von einer außen angeordneten Lichtquelle aus
erfolgen läßt, (c) die Bestrahlung mittels einer Lampe
erfolgen läßt, die innerhalb einer Flüssigkeit im
Reaktionsgefäß angeordnet ist, so daß das Gefäß auch als
photochemischer Reaktor verwendet werden kann, und (d)
andere Verfahren anwendet. In dem Maße, wie es notwendig
ist, und, sofern möglich, wird die Reaktionsflüssigkeit aus
dem Gefäß (insbesondere dem Reaktorgefäß), das die
zerstoßenen Zellen und so weiter enthält, ausgetragen, und
die Flüssigkeit wird anschließend in einem anderen Gefäß
nach einem Verfahren, wie oben erwähnt, bestrahlt. Das Gefäß
zur Bestrahlung kann in diesem Falle beispielsweise aus
einer oder mehreren durchsichtigen Glasröhren bestehen.
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Die Wirkung der Bestrahlung mit Licht gemäß der Erfindung
kann deutlich gezeigt werden, wenn ein Großgefäß mit den
zerstoßenen Zellen und so weiter oder Reaktionsgefäß von
technischem Maßstab verwendet wird, indem die einfallende
Lichtenergie aus gewöhnlichem Raumlicht die erforderliche
Menge an Lichtenergie unterschreitet. Ein derartiges großes
Behältnis oder Reaktionsgefäß besteht normalerweise aus
lichtundurchlässigem Material und insbesondere in seinen
hauptsächlichen Teilen aus Metall. In einem derartigen
lichtundurchlässigen Behältnis oder Reaktionsgefäß ist die
Lichtenergie, die von einer normalen Beleuchtung durch ein
Fenster oder eine Abdeckung des Gefäßes hindurch erhalten
wird, sehr gering. Somit ist eine Bestrahlung mit Licht
unabdingbar. Gelegentlich bedeutet der Ausdruck
"Reaktionsgefäß", im vorliegenden Zusammenhang einen Teil
einer Reaktionsvorrichtung, in der mindestens der Hauptteil
der Hydratisierungsreaktion durchgeführt wird.
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Abweichend von dem Fall, bei dem die Nitrilaseaktivität
durch die Verwendung von Mikroorganismen erzeugt wird, ist
die Bestrahlung mit Licht, wenn sie einmal durchgeführt
worden ist, in dem Fall ausreichend, bei dem die zerstoßenen
Zellen und so weiter als Bälle für die Nitrilase verwendet
werden, was ein bedeutendes Merkmal für eine derartige Nitrilasequelle
darstellt. Daher wird in einer bevorzugten Durchführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der das meiste aus
einem derartigen Merkmal gewonnen wird, die Bestrahlung mit
Licht in einer ausreichenden Menge vor oder beim Zerstoßen
der Zellen oder bei der Behandlung von zerstoßenen Zellen
(einschließlich der Herstellung von Enzymproben)
durchgeführt, und die Hydratisierungsreaktion selbst wird
ohne Rücksicht auf eine Bestrahlung durchgeführt.
Experimenteller Teil
Beispiel 1
(1) Kultivierung der Zellen
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Ein Medium (pH 7,2) aus Glukose 1%, Pepton 0,5%,
Hefeextrakt 0,3%, Malzextrakt 0,3% und Eisen (II) -
Sulfalt·7H&sub2;O 0,05% wurde in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben
eingebracht. Nach Sterilisierung wurde das Medium mit einer
Schlinge mit dem Stamm N-774 (Corynebakterium) beimpft und
zwei Tage bei 30ºC bebrütet.
(2) Herstellung von dunkelstehenden und hellstehenden Zellen
-
Gemäß einer üblichen Methode wurden die bebrüteten
Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und mit 0,05-M-
Phosphatpuffer (pH 7,7) gewaschen, und man erhielt
gewaschene Zellen. Die Zellen wurden in
0,05-M-Phosphatpuffer dispergiert, und man erhielt eine
Suspension der Zellen mit einer Konzentration von 17,3 g
getrocknete Zellen/Liter.
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Dunkelstehende Zellen: Die Zellsuspension wurde bei 0ºC an
einem dunklen Platz drei bis vier Tage lang stehengelassen,
um die dunkelstehenden Zellen herzustellen.
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Hellstehende Zellen: Die dunkel stehenden Zellen wurden eine
Stunde lang bei 0ºC unter Bestrahlung mit einer Lichtenergie
von 5,7 uE/g · Sekunde unter Verwendung einer
Tageslichtlampe (Modell DR 400/T von Tokyo Shibaura Denki
K.K., Japan, Wellenlänge: etwa 300 bis 800 nm)
stehengelassen, um hellstehende Zellen herzustellen.
(3) Herstellung von zerstoßenen Zellen und intrazellulärer
Substanz
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Zerstoßene Zellen: 100 ml einer Suspension der
dunkelstehenden (oder hellstehenden) Zellen wurden dreimal
mit Hilfe einer französischen Presse der Otake Seisakusho
K.K., Japan mit einem Druck von 1300 kg/cm² an einem dunklen
Platz beaufschlagt, um die Zellen zu zerstoßen, und etwa
90 ml einer Lösung, die die zerstoßenen Zellen enthielt,
wurden erhalten, die im folgenden als "Lösung von
zerstoßenen Zellen" bezeichnet wird.
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Intrazelluläre Substanz: Etwa 50 ml der Lösung zerstoßener
Zellen wurde mit 15000 Upm unter Verwendung einer
Hochgeschwindigkeitszentrifuge zentrifugiert, und man
erhielt etwa 45 ml eines flüssigen Extraktes, aus dem die
Zellen als Rückstand entfernt worden waren. Gemäß einer
herkömmlichen Methode wurde das flüssige Extrakt der
Entfernung der Nukleinsäure und der
Ammoniumsulfat-Fraktionierung unterzogen, und man erhielt
etwa 15 ml einer rohen Enzymlösung, die sich nach Dialyse als
zu einer Fraktion gehörig erwies, die durch 50- bis
60prozentige Sättigung an Ammoniumsulfat gegeben ist.
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Sämtliche obigen Operationen wurden rasch in einem
Tieftemperaturraum durchgeführt, in dem die Temperatur 4ºC
betrug und die Intensität der Lichtbestrahlung 0,02 uE/m²
Sekunde oder darunter ausmachte, sofern nicht anders
angegeben.
(4) Messung der Reaktionsgeschwindigkeit
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0,2 ml der Zellsuspension oder der Lösung zerstoßener
Zellen oder des flüssigen Extraktes oder der rohen
Enzymlösung und 4,8 ml einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH
7,7) wurden vermischt und mit 5ml 0,05M -Phosphatpuffer (pH
7,7) mit einem Gehalt von 5 Gewichtsprozent Acrylnitril
versetzt. Das Gemisch wurde bei 0ºC während einer
vorherbestimmten Zeitdauer reagieren gelassen. Nach
Beendigung der Umsetzung wurde das erzeugte Acrylamid
mittels Gaschromatographie der quantitativen Analyse
unterzogen, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu messen. Bei
der Umsetzung wurden lichtundurchlässige Reaktionsröhren,
die
mit einem schwarzen Band umwickelt waren, verwendet.
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Die Geschwindigkeit der Herstellung von Acrylamid (im
folgenden als AA bezeichnet) wird durch die Menge an
innerhalb von 10 Minuten gebildeten AA dargestellt.
Vergleichsdaten für die Geschwindigkeit für jede der
Nitrilasequellen, wie oben beschrieben, sind in der
folgenden Tabelle 1 angegeben
Tabelle 1
Zell-Art Für die Messung der Aktivität verwendete Substanz Menge an in 10 Minuten erzeugtem AA Dunkelstehende Zellen Zellen* Lösg. zerst. Zellen Flüssiger Extrakt Rohe Enzymlösung Hellstehende Zellen Zellen* Lösg. zerst. Zellen Flüssiger Extrakt *Vergleichsbeispiel
Beispiel 2
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Dunkelstehende Zellen, eine Lösung zerstoßener
dunkelstehender Zellen sowie ein flüssiges Extrakt und eine
rohe Enzymlösung, die beide aus den genannten Zellen
erhalten worden waren, wurden hergestellt, wie in Beispiel 1
beschrieben. Jedes dieser Ausgangsmaterialien wurde 10
Minuten lang mit Licht bestrahlt, wobei die Tageslichtlampe
gemäß Beispiel 1 verwendet wurde, und die Menge an AA, die
innerhalb von 10 Minuten erzeugt wurde, wurde gemessen. Ein
Vergleich der obigen Menge mit derjenigen, die erhalten
wurde, wenn die obigen Substanzen unbestrahlt bei der
Umsetzung verwendet worden waren, ergibt die in Tabelle 2
zusammengefaßten Ergebnisse.
Tabelle 2
Für die Messung der Aktivität verwendete Substanz Menge an in 10 Minuten erzeugtem AA Vor Bestrahlung Nach Bestrahlung Zellen* Lösung zerstoßener Zellen Flüssiger Extrakt Rohe Enzymlösung *Vergleichsbeispiel
Beispiel 3
-
Jedes der Materialen (mit Licht bestrahlte Zellen, flüssiges
Extrakt und rohe Enzymlösung), die gemäß Beispiel 2
hergestellt worden waren, wurde bei 0ºC an einem dunklen
Platz stehengelassen, wonach das Verhältnis der restlichen
Aktivität gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3
dargestellt, worin die Menge an AA, die in 10 Minuten
erzeugt worden war, wenn die obigen Materialien unmittelbar
nach der Bestrahlung verwendet wurden, mit 100% und das
Verhältnis der restlichen Aktivität mit dem relativen Wert
bezeichnet sind.
Tabelle 3
An dunklem Ort stehengelassene Substanz Verhältnis der restlichen Aktivität Dunkelstehende Periode (Tag) Zellen Flüssiger Extrakt Rohe Enzymlösung
Beispiel 4
-
Je 5ml des flüssigen Extraktes aus dunkel stehenden Zellen,
hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in
50-ml-Stahlgefäße eingebracht und mit Licht einer
Wellenlänge von 300 bis 400 nm drei Minuten lang unter
Verwendung einer UV-Lampe (Modell FL-4BL-G der Tokyo
Shibaura Denki K.K., Japan) bestrahlt, wobei die
Lichtenergie durch die Verwendung von Filtern mit
unterschiedlichen optischen Flächen, die an einem oberen
Abschnitt des Gefäßes angeordnet waren, gesteuert wurde.
Dabei wurden mehrere Proben von flüssigem Extrakt
hergestellt, der unterschiedliche Gesamtmengen an
Lichtenergie aufgenommen hatte, und die
Reaktionsgeschwindigkeit wurde gemessen, wie in Beispiel 1
beschrieben.
-
Der Einfluß der Gesamtmenge an Lichtenergie auf die
Reaktionsgeschwindigkeit wird durch ein Verhältnis zu 1
ausgedrückt, das ein relativer Wert ist, der die
Reaktionsgeschwindigkeit in Bezug auf den Fall ausdrückt,
bei dem auf den flüssigen Extrakt keine Lichtenergie
einwirken gelassen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4
zusammengefaßt.
Tabelle 4
Gesamte angewandte Lichtenergie Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten
Beispiel 5
-
Je 5ml von flüssigem Extrakt aus dunkelstehenden Zellen,
hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in
50-ml-Stahlgefäße eingebracht und mit Licht unter Verwendung
der Tageslichtlampe gemäß Beispiel 1 bestrahlt, wobei der
Lichtanteil eine Wellenlänge unter etwa 430 nm durch die
Verwendung gefärbter Glasfilter (Modell Y45, von Tokyo
Shibaura Denki K.K., Japan), von denen jeder dieselbe
optische Fläche aufwies und die an einem oberen Abschnitt
des Gefäßes angebracht waren, entfernt wurde; die
Bestrahlungszeit war für jede Probe unterschiedlich. Die
Reaktionsgeschwindigkeit für jede der Proben, die jede
unterschiedliche Gesamtmengen an Lichtenergie aufgenommen
hatten, wurde gemessen, wie in Beispiel 1 beschrieben.
-
Der Einfluß der Gesamtmenge an Lichtenergie auf die
Reaktionsgeschwindigkeit wird durch ein Verhältnis zu 1
ausgedrückt, das ein relativer Wert ist, der die
Reaktionsgeschwindigkeit im Verhältnis zu dem Fall
ausdrückt, in dem der flüssige Extrakt keine Lichtenergie
zugeführt erhielt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5
zusammengefaßt.
Tabelle 5
Gesamte angewandte Lichtenergie Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten
Beispiel 6
-
Flüssige Extrakte, hergestellt, wie in Beispiel 1
beschrieben, aus den dunkelstehenden Zellen verschiedener
Arten, nämlich von Bacillus (CBS-494), Bacteridium
(CBS-496), Micrococcus (CBS-497), Brevibacterium (CBS-717)
und Nocardia (N-775) wurden mit Licht bestrahlt, wie in
Beispiel 2 angegeben. Die Reaktionsgeschwindigkeit wurde
sowohl für bestrahlte als auch für nichtbestrahlte Extrakte
der obigen Art gemessen.
-
Die Reaktionsgeschwindigkeit für die mit Licht bestrahlten
Extrakte wird als relativer Wert im Verhältnis zu 1
ausgedrückt, wobei der Wert 1 die Geschwindigkeit für
nichtbestrahlten Extrakt darstellt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 6 zusammengefaßt.
Tabelle 6
Zell-Arten Stämme Reaktionsgeschwindigkeit für mit Licht bestrahlte Extrakte Bacillus Bacteridium Micrococcus Brevibacterium Nocardia
Beispiel 7
-
Unter Verwendung jedes der flüssigen Extrakte aus
dunkelstehenden Zellen des Stamms N-774, hergestellt, wie in
Beispiel 1 beschrieben, und eines derartigen Extraktes, der
mit Licht bestrahlt worden war, wie in Beispiel 2
beschrieben, wurden gemäß den in Tabelle 7 dargestellten
Formulierungen Reaktionslösungen hergestellt. Die Umsetzung
wurde bei 0ºC während einer vorbestimmten Zeitdauer an einem
dunklen Ort durchgeführt. Die Reaktionsgeschwindigkeit für
jedes in Tabelle 7 dargestellte Substrat wurde gemessen,
indem man die Menge an verbrauchtem Ausgangsnitril oder die
Menge des erzeugten entsprechenden Amids bestimmte, wobei
man Gaschromatographie oder
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie anwandte. Das Verhältnis der
Reaktionsgeschwindigkeit für den mit Licht bestrahlten
Extrakt zu derjenigen für nicht bestrahlten Extrakt ist in
Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7
Ausgangs-Nitril Flüssiger Extrakt 0.05M-Phosphat-Puffer pH Reaktionsgeschwindigkeit für mit Licht bestrahlten Extrakt Acetonitril Methacrylnitril n-Valeronitril Cyanopyridin Benzonitril Propionitril n-Butyronitril Malononitril Succinonitril Fumaronitril Chloracetonitril β-Hydroxypropionitril β-Aminopropionitril