DE3686376T2

DE3686376T2 - Signalverarbeitungsverfahren zur bestimmung der basissequenz von nukleinsaeure.

Info

Publication number: DE3686376T2
Application number: DE8686111432T
Authority: DE
Inventors: Makoto C O Fuji Photo Fil Hara
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1985-08-19
Filing date: 1986-08-19
Publication date: 1993-01-28
Anticipated expiration: 2006-08-20
Also published as: US4802101A; EP0213537A3; JPS6242057A; DE3686376D1; EP0213537B1; JPH0462344B2; EP0213537A2

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Signalverarbeitungsverfahren zum Bestimmen der Basensequenz von Nukleinsäuren.

Beschreibung des Standes der Technik

Es ist wichtig, die von Organismen getragene genetische Information zu ermitteln, um die Eunktions- oder Reproduktionsmechanismen der Organismen im Bereich der Molekularbiologie, welche sich in den letzten Jahren schnell entwickelt hat, aufzuklären. Insbesondere ist es wichtig, die Basensequenz von Nukleinsäuren, wie zum Beispiel DNA (oder ein DNA-Fragment; im folgenden wird darauf Bezug genommen), welche spezifische genetische Information tragen, zu bestimmen.
Das Maxam-Gilbert-Verfahren und das Sanger-Coulson-Verfahren sind als typische Verfahren zum Bestimmen der Basensequenz von Nukleinsäuren, wie zum Beispiel DNA und RNA, bekannt. Bei dem früheren Maxam-Gilbert-Verfahren wird eine ein radioaktives Isotop, wie zum Beispiel ³²P enthaltende Gruppe an einem Kettenmolekül einer DNA oder eines DNA-Fragments an einem Ende angebracht, uin es mit dem radioaktiven Element zu markieren, und dann wird die Bindung zwischen den Struktureinheiten des Kettenmoleküls basenpezifisch durch eine chemische Reaktion aufgespaltet. Eine Mischung aus den resultierenden basenspezifischen DNA-Spaltprodukten wird durch Gelelektrophorese aufgelöst (entwickelt), um ein aufgelöstes Muster (nicht sichtbar) zu erhalten, wobei jedes der zahlreichen Spaltprodukte auf dem Gelträgermedium aufgelöst wird. Das aufgelöste Muster wird auf einem radiographischen Film, wie zum Beispiel einem Röntgenstrahlenfilm, sichtbar gemacht, um davon einen Autoradiographen als ein sichtbares Bild zu erhalten. Die Basen in bestimmten Positionsbeziehungen zu dem Ende des mit dem radioaktiven Element versehenen Kettenmoleküls können sequentiell entsprechend dem sichbar gemachten Autoradiographen und den angewandten basenspezifischen Abspaltungsmitteln bestimmt werden. Auf diese Weise kann die Sequenz für alle Basen der DNA-Probe bestimmt werden.
Bei dem späteren Sanger-Coulson-Verfahren werden synthetische DNA-Produkte, welche zu den Kettenmolekülen der DNA oder des DNA-Fragments komplementär und radioaktiv markiert sind, basenspezifisch durch Verwendung einer chemischen Reaktion synthetisiert, und die erhaltene Mischung aus zahlreichen synthetischen DNA-Produkten wird auf einem Trägemedium durch Gelelektrophorese aufgelöst, um ein aufgelöstes Muster zu erhalten. In einer Weise, die der oben beschriebenen ähnlich ist, kann die Basensequenz von DNA entsprechend dem sichtbar gemachten Autoradiographen bestimmt werden.
Zum Zwecke der Durchführung der Basensequenzbestimmung von Nukleinsäuren auf einfache Weise durch Radiographie dienen die in den US-Patentanmeldungen Nr. 837 037 und Nr. 664 405 beschriebenen autoradiographischen Methoden, welche ein Stranlungsbildaufzeichnungs- und -reproduktionsverfahren unter Verwendung einer stimulierbaren Phosphorfolie anstelle der oben erwähnten herkömmlichen, ein strahlungsempfindliches Material, wie zum Beispiel einen Röntgenstrahlenfilm, verwendenden Radiographie benutzen. Die stimulierbare Phosphorfolie umfaßt einen stimulierbaren Phosphor und weist solche Eigenschaften auf, daß, wenn sie einer Strahlung ausgesetzt wird, der stimulierbare Phosphor einen Teil der Strahlungenergie absorbiert und dann bei Anregung mit einer elektromagnetischen Welle (stimulierende Strahlen), wie zum Beispiel sichtbaren oder infraroten Lichtstrahlen, entsprechend der darin gespeicherten Strahlungsenergie Licht emittiert (stimulierte Emission). Entsprechend diesem Verfahren kann die Expositionsdauer wesentlich verkürzt werden, und es besteht keine Gefahr, daß Probleme wie beim Stand der Technik, wie zum Beispiel die chemische Zerstörung der Emulsion, auftreten. Ferner kann, da der Information über radioaktiv markierte Substanzen aufweisende Autoradiograph in der Phosphorfolie als Strahlungsenergie gespeichert ist und dann als stimulierte Emission in zeitlicher Folge ausgelesen wird, Information in Form von Zahlenangaben und/oder Symbolen zusätzlich zu dem Bild dargestellt werden.
Die Basensequenz der Nukleinsäuren wurde herkömmlich durch visuelle Beurteilung einzelner aufgelöster Positionen der basenspezifischen Spaltungsprodukte oder der basenspezifischen synthetischen Produkte der radioaktiv markierten Nukleinsäure (im folgenden einfach als basenspezifische Fragmente von Nukleinsäure bezeichnet) auf dem Autoradiographen und durch Vergleichen dieser zwischen ihren aufgelösten Reihen bestimmt. Die Analyse des Autoradiograhpen wird nämlich durch Beobachten des sichtbar gemachten Autoradiographen mit den Augen durchgeführt, und eine solche visuelle Analyse erfordert viel Zeit und Arbeit.
Da die visuelle Analyse des Autoradiographen ferner entsprechend der Erfahrung der die Untersuchung durchführenden Person variiert oder schwankt, ändern sich die Resultate der Bestimmung der Basensequenz von Nukleinsäure abhängig von der die Untersuchung durchführenden Person, und die Genauigkeit der Information ist in einem bestimmten Umfang begrenzt.
Um die Genauigkeit der Information zu verbessern, sind in den US-Patentanmeldungen Nr. 568 877 und Nr. 730 034 Verfahren zum automatischen Bestimmen der Basensequenz von DNA durch Ermitteln des Autoradiographen als digitale Signale und geeignete Verarbeitung der Signale vorgeschlagen worden. Die dem Autoradiographen entsprechenden Digitalsignale können entweder durch Sichtbarmachen des Autoradiographen auf einem radiographischen Film und photoelektrisches Auslesen des sichtbaren Bildes auf dem Film mit Hilfe von reflektiertem oder hindurchtretendem Licht, wenn die konventionelle Radiographie angewendet wird, oder durch direktes Auslesen der stimulierbaren Phosphorfolie ohne die Sichbarmachung des Autoradiographen, wenn das Strahlungsbildaufzeichnungs- und -reproduktionsverfahren verwendet wird, ermittelt werden.
Das aufgelöste Muster, das durch Auflösen (Entwickeln) radioaktiv markierter Substanzen auf einem Trägermedium durch Elektrophorese oder ähnliches erhalten wird, neigt jedoch dazu, verschiedene Verzerrungen und Störungen aufzuweisen. Zum Beispiel tendieren Bänder (aufgelöste Teile), welche die Form einessich senkrecht zu der Auflösungsrichtung erstreckenden Rechtecks aufweisen, dazu, sich nicht genau senkrecht (horizontal) zur Auflösungsrichtung zu erstrecken, sondern infolge der Unebenheit eines Trägermediums an sich, wie zum Beispiel Zerstörungen oder Löchern auf seiner Oberfläche, infolge von Schwankungen der Gelkonzentration oder Kontamination mit Verunreinigungen, oder Deformation der Formen der Schlitze (Probeneinführungsöffnungen) geneigt zu sein. Wenn einmal eine Neigung eines Bandes während der Auflösung auftritt, haben die Bänder, die nach diesem Band aufgelöst und getrennt werden, auch die Tendenz, mit der ähnlichen Neigung beobachtet zu werden. In einem solchen Fall sind die Auflösungspositionen der Bänder schwer genau zu bestimmen und die verzerrten Bänder bewirken einen Fehler bei der Bestimmung der Sequenz über die aufgelösten Reihen, die auf den Bandpositionen basiert.
Entsprechend ist es im hohen Maße wünschenswert, die Basensequenz von Nukleinsäuren mit hoher Genauigkeit automatisch zu bestimmen, indem digitale Signale, die dem Autoradiographen entsprechen, einer effizienten Signalverarbeitung, sogar wenn eine solche Bandverzerrung vorliegt, unterzogen werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Der Erfinder hat herausgefunden, daß sich die Basensequenz von Nukleinsäuren automatisch einfach und genau durch geeignete Verarbeitung der digitalen Signale, die dem Autoradiographen in dem die Autoradiographie verwendenden Verfahren für die automatische Bestimmung der Basensequenz entsprechen, bestimmen läßt, sogar wenn das aufgelöste Muster die Bandverdehung oder Bandverzerrung aufweist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Signalverarbeitungsverfahren zum Bestimmen der Basensequenz von Nukleinsäuren zur Verfügung, bei dem digitale Signale einer Signalverarbeitung unterworfen werden, wobei die digitalen Signale einem Autoradiographen eines aufgelösten Musters entsprechen, welches durch Auflösen einer Mischung von basenspezifischen, mit einem radioaktiven Element markierten DNA- oder RNA-Fragmenten in eindimensionaler Richtung auf einem Trägermedium gebildet ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
(1) Erzeugen von wenigstens zwei eindimensionalen Wellenformen für jedes Band, wobei die Position entlang der aufgelösten Reihe als Abzisse und der Signalpegel als Ordinate dient;
(2) Erfassen von Positionen, bei welchen der Signalpegel ein Maximum auf jeder Wellenform ist; und
(3) Vergleichen der auf den mehreren Wellenformen für jedes Band erfaßten Positionen mit einem maximalen Signalpegel, um eine Position dieses Bandes zu bestimmen.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann die Basensequenz einer Nukleinsäure einfach mit hoher Genauigkeit durch Verarbeiten digitaler Signale bestimmt werden, welche dem Autoradiographen des aufgelösten Musters entsprechen, welches auf einem Trägermedium durch Auflösen einer Mischung von basenspezifischen Fragmenten der Nukleinsäure gebildet ist, wobei eine geeignete Signalverarbeitungsschaltung verwendet wird, welche eine Funktion derart aufweist, daß sie in der Lage ist, Korrekturen der Verzerrung oder Verdrehung von Bändern durchzuführen, wenn das aufgelöste Muster die Bandverzerrung aufweist.
Genauer werden digitale Signale in einer solchen Weise erfaßt, daß viele Signale in Längsrichtung (Richtung der Breite) eines Bandes erhalten und dann einer geeigneten Signalverarbeitung, wie zum Beispiel einem Vergleichsverarbeitungsprozeß, unterworfen werden, wodurch die Positionen der Bänder genau bestimmt werden können, sogar wenn die einzelnen Bänder nicht senkrecht zu der Auflösungsrichtung stehen, sondern geneigt sind. Auf der Basis der bestimmten Bandpositionen werden die Bänder entlang der aufgelösten Reihe verglichen, um die Basensequenz der Nukleinsäure leicht und mit hoher Genauigkeit zu bestimmen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig.1 ist eine Teilansicht, welche ein Beispiel eines elektrophoretischen Musters zeigt, bei welchem örtlich die Neigung von Bändern vorliegt.
Fig.2 zeigt eindimensionale Wellenformen für den zweiten Schlitz.

Detaillierte Beschreibun der Erfindung

Beispiele von in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Proben enthalten Mischungen aus basenspezifischen Fragmenten von Nukleinsäuren, wie zum Beispiel DNA und RNA, welche mit einem radioaktiven Element markiert sind. Mit der Bezeichnung "Fragmente" von Nukleinsäuren sind Teile eines Langkettenmoleküls gemeint. Zum Beispiel kann eine Mischung aus basenspezifischen DNA-Spaltungsoprodukten, welche eine Art einer Mischung aus basenspezifischen DNA-Fragmenten darstellt, durch basenspezifisches Spalten der radioaktiv markierten DNA entsprechend dem vorangehend erwähnten Maxam-Gilbert-Verfahren erhalten werden. Eine Mischung von synthetischen basenspezifischen DNA-Produkten kann durch Synthetisieren aus radioaktiv markierten Desoxynukleosid-Triphosphaten und DNA-Polymerase unter Verwendung von DNA als einer Schablone entsprechend dem vorangehend erwähnten Sanger-Coulson-Verfahren hergestellt werden.
Mischungen basenspezifischer RNA-Fragmente können auch als eine Mischung von Spaltprodukten oder eine Mischung von synthetischen Produkten in zu den DNA-Verfahren ähnlicher Weise erhalten werden. DNA ist aus vier Arten von Basen, nämlich Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin als ihre strukturellen Einheiten, zuammengesetzt, und RNA ist aus vier Arten von Basen, nämlich Adenin, Guanin, Uracil und Cytosin zusammengesetzt. Diese Substanzen können mit radioaktiven Elementen, wie zum Beispiel ³²P, ¹&sup4;C, ³&sup5;S, ³H oder ¹²&sup5;I durch irgendein geeignetes Verfahren markiert werden.
Eine Probe, welche eine Mischung aus den mit einem radioaktiven Element markierten basenspezifischen Fragmenten einer Nukleinsäure darstellt, kann auf einem bekannten Trägermedium, wie zum Beispiel einem Gelträgermedium, durch irgendeine herkömmliche Auflösungsmethode (Entwicklungsmethode), wie zum Beispiel Elektrophorese, Dünnschichtchromatographie, Säulenchromatographie und Papierchromatographie, aufgelöst (entwickelt) werden.
Das Trägermedium, auf welchem die radioaktiven Substanzen aufgelöst werden, wird mit Hilfe der herkömmlichen Radiograhpie unter Verwendung eines strahlungsempfindlichen Materials oder des Strahlungsbildaufzeichnungs- und -reproduktionsverfahrens unter Verwendung einer stimulierbaren Phosphorfolie autoradiographisch untersucht. Die digitalen Signale, die dem Autoradiographen entsprechen, werden dann mit Hilfe eines geeigneten Auslesesystems erhalten.
Wenn die herkömmliche Radiographie verwendet wird, werden das Trägermedium und ein strahlungsempfindliches Material, wie zum Beispiel ein Röntgenstrahlenfilm, zusammen in Schichten bei niedriger Temperatur von -90 bis -70ºC über eine lange Zeitperiode (mehrere 10 Stunden) angeordnet, um den radiographischen Film zu exponieren. Der radiographische Film wird dann entwickelt, um den Autoradiographen der radioaktiv markierten Substanzen auf dem Film sichtbar zu machen, und der sichtbar gemachte Autoradiograph wird Hilfe eines Bildauslesesystems ausgelesen. Zum Beispiel wird der Film mit einem optischen Bündel bestrahlt, und das durch diesen hindurchgetretene oder von diesem reflektierte Bündel wird photoelektrisch erfaßt, wodurch der sichbar gemachte Autoradiograph in elektrische Signale umgewandelt werden kann. Die elektrischen Signale werden ferner durch A/D-Umwandlung in digitale Signale umgewandelt, welche dem Autoradiographen entsprechen.
Wenn das Strahlungsbildaufzeichnungs- und -reproduktionsverfahren verwendet wird, werden das Trägermedium und die stimulierbare Phosphorfolie zusammen in Schichten bei Umgebungstemperatur über einen kurzen Zeitraum (mehrere Minuten oder mehrere 10 Minuten) angeordnet, um Stranlungsenergie, welche von den radioaktiv markierten Substanzen ausgestrahlt wird, in der Phosphorfolie zu speichern, wodurch der Autoradiograph in Form eines latenten Bildes (Energiespeicherbild) auf der Phosphorfolie aufgezeichnet wird. Die stimulierbare Phosphorfolie weist zum Beispiel eine Basisstruktur auf, in der ein einen Plastikfilm umfassender Träger, eine Phosphorschicht, die einen stimulierbaren Phosphor, wie zum Beispiel einen divalenten, europiumaktivierten Bariumbromidphosphor (BaFBr:Eu²&spplus;) umfaßt, und ein transparenter Schutzfilm in dieser Reihenfolge laminiert sind. Der stimulierbare Phosphor kann, wenn er mit einer Strahlung, wie zum Beispiel Röntgenstrahlung, bestrahlt wird, Strahlungsenergie absorbieren und speichern und die gespeicherte Strahlungsenergie danach als stimulierte Emission abgeben, wenn er mit sichtbaren oder infraroten Strahlen angeregt wird.
Dann wird der gespeicherte und auf der stimulierbaren Phosphorfolie aufgezeichnete Autoradiograph unter Verwendung eines Auslesesystems ausgelesen. Zum Beispiel wird die Phosphorfolie mit einem Laserstrahl abgetastet, um die in dem stimulierbaren Phosphor gespeicherte Strahlungsenergie als Lichtemission freizusetzen, und das emittierte Licht wird photoelektrisch erfaßt, so daß der Autoradiograph direkt in Form elektrischer Signale ohne seine Sichtbarmachung erhalten werden kann. Die elektrischen Signale werden ferner durch A/D-Umwandlung in digitale Signale umgewandelt, welche dem Autoradiographen entsprechen.
Die oben erwähnten Verfahren zum Messen des Autoradiographen und zum Ermitteln der diesem entsprechenden digitalen Signale sind genauer in den vorangehend erwähnten US-Patentanmeldungen Nr. 837 037 und Nr. 568 877 beschrieben.
Während die Verfahren zum Ermitteln der dem Autoradiographen entsprechenden digitalen Signale unter Verwendung herkömmlicher Radiograhpie und des Strahlungsbildaufzeichnungs- und -reproduktionsverfahrens oben beschrieben sind, ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt, und durch andere Verfahren erhaltene digitale Signale können bei dem Signalverarbeitungsverfahren nach der Erfindung angewendet werden, vorausgesetzt, daß sie dem Autoradiographen entsprechen.
Bei den oben erwähnten Verfahren ist es nicht immer notwendig, den Auslesevorgang des Autoradiographen auf der gesamten Oberfläche des radiographischen Films oder der stimulierbaren Phosphorfolie durchzuführen. Es braucht nur der Bildbereich der Auslesung unterzogen zu werden.
Bei der vorliegenden Erfindung kann vorhergehend Information über den Ort von jeder aufgelösten Reihe und die Breite des Bandes, um Auslesebedingungen voreinzustellen, eingegeben und dann eine Abtastung bei einer Abtastliniendichte derart, daß jedes Band bei dem Auslesevorgang von wenigstens zwei Abtastlinien bei dem Auslesevorgang durchquert wird, durchgeführt werden, um so die Auslesezeit zu verkürzen und effizient die notwendige Information zu erhalten. Die dem Autoradiographen entsprechenden digitalen Signale umfassen gemäß der Erfindung auch die auf diese Weise erhaltenen digitalen Signale.
Die erhaltenen digitalen Signale Dxy umfassen eine Koordinate (x, y), welche durch ein Koordiantensystem repräsentiert ist, das fest mit dem radiographischen Film oder der stimulierbaren Phosphorfolie verbunden ist, und einen Signalpegel (z) bei dieser Koordinate. Der Signalpegel repräsentiert die Dichte des Bildes bei der Koordinate, d.h., die Menge der radioaktiv markierten Substanzen. Entsprechend enthält eine Serie von den digitalen Signalen (nämlich digitalen Bilddaten) Information über eine zweidimensionale Ortsverteilung der markierten Substanzen.
Die digitalen Signale, die dem Autoradiographen der radioaktiv markierten Substanzen, die auf einem Trägermedium aufgelöst sind, entsprechen, werden einer Signalverarbeitung unterworfen, um die Basensequenz der Nukleinsäure entsprechend der Erfindung zu bestimmen, wie im folgenden genauer beschrieben wird.
Nun wird das Signalverarbeitungsverfahren nach der vorliegenden Erfindung beschrieben, indem auf ein Beispiel eines elektrophoretischen Musters Bezug genommen wird, welches aus einer Kombination der folgenden vier Gruppen von basenspezifischen DNA-Fragmenten, die mit einem radioaktiven Element markiert sind, gebildet wird:
(1) Guanin (G) - spezifische DNA-Fragmente,
(2) Adenin (A) - spezifische DNA-Fragmente,
(3) Thymin (T) - spezifische DNA-Fragmente,
(4) Gytosin (C) - spezifische DNA-Fragmente.
Jede Gruppe dieser basenspezifischen DNA-Fragmente ist aus basenspezifischen Spaltprodukten oder synthetischen Produkten zusainmengesetzt, welche verschiedene Längen haben und die gleiche Base an Enden aufweisen.
Fig. 1 zeigt teilweise einen Autoradiographen des elektrophoretischen Musters, das jeweils durch Elektrophoresebehandlung der oben erwähnten vier Gruppen der basenspezifischen DNA-Fragmente in vier Schlitzen erhalten wird.
Die dem Autoradiographen entsprechenden digitalen Signale werden zeitweilig in einer Speichereinrichtung der Signalverarbeitungsschaltung gespeichert (d . h. in einer nicht flüchtigen Speichereinheit, wie zum Beispiel einem Pufferspeicher, einer Magnetplatte usw.).
Zuerst werden wenigstens zwei eindimensionale Wellenformen für jedes Band auf jeder elektrophoretischen Reihe (Streifen) vorbereitet. Die eindimensionale Wellenform ist eine Kurve mit der Position in der Elektrophoreserichtung als Abzisse und dem Signalpegel als Ordinate. Wenn die Erfassung der digitalen Signale durch Abtasten mit dem Laserstrahl entlang jedes Streifens mit einer solchen Abtastdichte, daß wenigstens zwei Abtastlinien jedes Band, wie oben beschrieben (siehe:. Fig. 1; 1: elektrophoretisches Band, 2: Abtastlinie), überqueren, durchgeführt wird, kann die eindimensionale Wellenform mit dem Signalpegel (z) als vertikale Achse und der Position (y) als horizontale Achse direkt für jede Abtastlinie erzeugt werden.
Fig. 2 zeigt teilweise eindimensionale Wellenformen a bis f für den zweiten Schlitz. Die Wellenformen repräsentieren ein Querschnittsbild, das erhalten wird, wenn Bänder entlang der Elektrophoreserichtung geschnitten werden.
Zweitens werden Positionen (Peak-Positionen), wo der Signalpegel ein Maximum ist, erfaßt. Zum Beispiel werden die Peak-Positionen dadurch erfaßt, daß Punkte herausgefunden werden, wo das Vorzeichen einer Differenz im Signalpegel umgedreht wird (siehe: Fig. 2; 3: Peak-Position).
Drittens werden die Peak-Positionen, die auf den mehreren eindimensionalen Wellenformen für jedes Band erfaßt sind, verglichen, um eine Position des Bandes zu bestimmen. Zum Beispiel werden die erfaßten Peak-Positionen jeder Wellenform aufeinanderfolgend numeriert, und dadurch können die Peak-Positionen, welche die gleiche Nummer aufweisen und zueinander benachbart sind, als zu dem gleichen Band gehörend angesehen werden. Genauer gesagt werden Wellenformen (zum Beispiel die Wellenformen c und d in Fig. 2), welche hohe Signalpegel aufweisen, und eine oder zwei weitere Wellenformen auf jeder Seite davon betrachtet und eine mittlere Position, eine Maximumposition oder eine Minimumposition der Peak-Positionen mit gleicher Nummer auf diesen Wellenformen wird berechnet.
In der Fig. 2 zeigt A Positionen auf den Bändern an, welche letztlich bestimmt wurden, indem ein Mittelwert der Peak-Positionen auf den Wellenformen b bis e für jedes Band verwendet wurde.
Vom Standpunkt der Genauigkeit aus betrachtet, ist es gewöhnlich vorzuziehen, den Mittelwert von Peak-Positionen als die Bandposition zu verwenden. Wenn die feinen Löcher, die in dem Gelträgermedium erzeugt werden, oder die darin aufgenommenen Verunreinigungen die Probe örtlich daran hindern, daß die Elektrophorese ordnungsgemäß verläuft, ist das Maximum von Peak-Positionen (die Position mit der größten Verschiebungsdistanz bzw. Migrationslänge dazwischen) vorzugsweise als Bandposition zu verwenden. Alternativ kann, wenn der Schlitz zu der elektrophoretischen Richtung geneigt ist, daß Minimum von Peak-Positionen (die Position mit der kleinsten Verschiebungsdistanz) als die Bandposition genommen werden.
So können die Bandpositionen, sogar wenn die Bänder geneigt sind, einzeln bestimmt werden.
Wenn das Elektrophoresemuster verschiedene Veränderungen und Störungen aufweist, wie zum Beispiel ein "smiling-Phänomen", eine Versatzverzerrung und eine Kombination von Bändern, so können die digitalen Signale zu deren Korrektur vor oder nach der oben beschriebenen Verarbeitung für die Korrektur der Bandverzerrungen einer Signalverarbeitung unterzogen werden.
Das "smiling-Phänomen" ist ein Phänomen, bei welchem die Verschiebungsdistanzen der radioaktiv markierten Substanzen auf beiden Seiten des Trägermediums kürzer als diejenigen in der Nähe seiner Mitte sind. Das "smiling-Phänomen" wird durch den Wärmeausbreitungseffekt (sogenannter Randeffekt), usw. während der Elektrophorese bewirkt. Die Versatzverzerrung ist ein Phänomen, bei welchem die Positionen der Streifen gänzlich voneinander abweichen, und wird durch einen Unterschied zwischen den Schlitzen in der Elektrophoresestartposition oder Startzeit von Proben bewirkt, was auf die Unebenheit der Formen von Schlitzen usw. zurückzuführen ist. Die Kombination von Bändern ist ein Phänomen, bei welchem zwei oder drei Bänder kombiniert sind, um ein breites Band zu bilden, und die Kombination wird durch ungenügende Elektrophorese bewirkt. Gewöhnlich neigen kombinierte Bänder dazu, daß sie im oberen Bereich des Musters nahe der Elektrophoresestartposition auftreten.
Die Signalverarbeitungsverfähren zur Korrektur des "smiling-Phänomens", der Versatzverzerrung und der Kombination von Bändern sind in unseren mit dieser Anmeldung anhängigen japanischen Patentanmeldungen Nr. 60 (1985) -74899, Nr. 60(1985)-75900, Nr. 60(1985)-85275, Nr. 60(1985)-85276, Nr. 60(1985)-111186 und Nr. 60(1985)-111187 (deren gesamter Inhalt den US-Patentanmeldungen Nr. 849,187, Nr. 854,381 und Nr. entspricht) beschrieben.
Alle dieser Bänder werden direkt durch Vergleichen der ermittelten Bandpositionen miteinander in eine Reihenfolge gebracht. Die Sequenz kann leicht auf der Basis der Tatsache bestimmt werden, daß zwei oder mehrere Bänder nicht in der gleichen Position der Streifen erfaßt werden können, da eine Kombination der oberen vier Gruppen der basenspezifischen DNA-Fragmente miteinander ausgeschlossen ist. Die vier Schlitze (1) bis (4) enthalten Information über die Endbase von (G), (A,), (T) bzw. (C), so daß die Substitution der Bandsequenz mit Basen, die den Schlitzen, welche zu den einzelnen Bändern gehören, entsprechen, die Basensequenz von DNA ergibt. Zum Beispiel kann die Basensequenz erhalten werden als:
A - G - C - T - A - A - G - ......
Auf diese Weise kann die Basensequenz von einem Kettenmolekül der DNA bestimmt werden. Der Darstellungsmodus der Information über die Basensequenz von DNA ist auf keinen Fall auf die oben beschriebene Art und Weise beschränkt, und andere Darstellungsweisen können wahlweise verwendet werden. Zum Beispiel kann die Intensität (z') von jedem Band zusammen als die relative Menge der radioaktiv markierten Substanzen bezeichnet werden, wenn das gewünscht wird. Die Basensequenz der beiden zwei Kettenmoleküle der DNA kann auch dargestellt werden.
Die Information kann auch als ein Bild auf der Basis der oben verarbeiteten digitalen Signale angezeigt werden. Zur gleichen Zeit kann der ursprüngliche Autoradiograph als sichtbar gemachtes Bild angezeigt werden. Auf diese Weise kann eine mit der Untersuchung befaßte Person schließlich die DNA-Sequenz auf der Basis des angezeigten Bildes ermitteln.
In dem oben beschriebenen Beispiel ist der Fall beschrieben, daß die ausschließliche Kombination der Mischung (G, A, T, C) von basenspezifischen DNA-Fragmenten als Beispiel verwendet wird, aber das Signalverarbeitungsverfahren nach der vorliegenden Erfindung ist auf keinen Fall auf diese Kombination beschränkt und andere Kombinationen können verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Kombination von (G, G+A, T+C, C) verwendet werden. Ferner kann das Signalverarbeitungsverfahren nach der vorliegenden Erfindung auch auf Mischungen von basenspezifischen RNA-Fragmenten angewendet werden (zum Beispiel eine Kombination von G, A, U, C). Darüber hinaus ist die Korrektion der Bandveränderungen nicht auf einen Satz aufgelöster Reihen von basenspezifischen Fragmenten einer Nukleinsäure beschränkt, sondern kann bei allen aufgelösten Reihen, die gleichzeitig auf einem Trägermedium aufgelöst sind, ausgeführt werden.
Es ist möglich, die Verarbeitung der genetischen philologischen Information, wie zum Beispiel den Vergleich zwischen der erhaltenen Basensequenz von der DNA und den Basensequenzen einer anderen DNA, welche bereits aufgezeichnet und in einer geeigneten Einrichtung gespeichert worden ist, durchzuführen.
Die durch die oben beschriebene Signalverarbeitung bestimmte Information über die Basensequenz von DNA wird von der Signalverarbeitungsschaltung ausgegeben und nachfolgend direkt oder wahlweise über Speicherung in einer Speicherungseinrichtung, wie zum Beispiel einer Magnetplatte oder einem Magnetband, zu einer Aufzeichnungseinrichtung übertragen.
Verschiedene, auf unterschiedlichen Systemen basierende Aufzeichnungseinrichtungen können zum Aufzeichnen der Information verwendet werden, zum Beispiel ein Gerät zum optischen Sichtbarmachen durch Abtasten eines photoempfindlichen Materials mit einem Laserstrahl usw., eine Displayeinrichtung zum elektrischen Sichtbarmachen auf einer Bildröhre usw., eine Einrichtung zum Drucken von auf einem Bildschirm dargestellten Drucksymbolen und/oder Zahlen mit Hilfe eines Videodruckers und eine Einrichtung zum Sichtbarmachen auf einem wärmeempfindlichen Aufzeichnungsmaterial unter Verwendung von Wärmestrahlen.

Claims

1. Ein Signalverarbeitungsverfahren zum Bestimmen der Basissequenz von Nucleinsäuren, bei dem digitale Signale einer Signalverarbeitung unterworfen werden, wobei diese digitalen Signale einem Autoradiographen eines aufgelösten Musters entsprechen, welches durch Auflösen einer Mischung von mit einem radioaktiven Element markierten basisspezifischen DNA-Fragmenten oder basisspezifischen RNA-Fragmenten in einer Richtung auf einem Trägermedium gebildet ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

(1) Erzeugen von wenigstens zwei eindimensionalen Wellenformen für jedes Band, wobei die Position entlang der aufgelösten Reihe als Abszisse und der Signalpegel als 0rdinate dient;

(2) Erfassen von Positionen, bei welchem der Signalpegel ein Maximum auf jeder Wellenform ist; und

(3) Vergleichen der auf den mehreren Wellenformen für jedes Band erfaßten Positionen mit einem maximalen Signalpegel, um eine Position dieses Bandes zu bestimmen.

2. Das Signalverarbeitungsverfahren nach Anspruch 1, wobei die digitalen Signale durch Abtasten des Autoradiographen in einer solchen Weise ermittelt werden, daß jedes Band durch wenigstens zwei Abtastlinien quer durchlaufen wird, und in dem Schritt (1), die eindimensionalen Wellenformen für die einzelnen Abtastlinien erzeugt werden.

3. Das Signalverarbeitungsverfahren nach Anspruch 1, wobei die Position des Bandes als ein Mittelwert der Positionen mit einem maximalen Signalpegel, der auf den mehreren Wellenformen erfaßt wird, in dem Schritt (3) ermittelt wird.

4. Das Signalverarbeitungsverfahren nach Anspruch 1, wobei die Position des Bandes aus den jeweiligen Positionen mit einem maximalen auf den mehreren Wellenforinen erfaßten Signalpegel als die Position, die die größte Verschiebungslänge aufweist, in dem Schritt (3) bestimmt wird.

5. Das Signalverarbeitungsverfahren nach Anspruch 1, wobei die Position des Bandes aus den jeweiligen Positionen mit einem maximalen auf den mehreren Wellenformen erfaßten Signalpegel als die Position mit der kleinsten Verschiebungslänge in dem Schritt (3) bestimmt wird.

6. Signalverarbeitungsverfahren nach Anspruch 1, wobei die Mischung aus den basisspezifischen DNA-Fragmenten aus den vier Gruppen besteht:

(1) guanin-spezifische DNA-Fragmente;

(2) adenin-spezifische DNA-Fragmente;

(3) thymin-spezifische DNA-Fragmente;

(4) cytosin-spezifische DNA-Fragmente;

und das aufgelöste Muster aus vier Reihen besteht, welche durch Auflösen von jeder der vier Gruppen der basisspezifischen DNA-Fragmente auf dem Trägermedium gebildet sind.

7. Das Signalverarbeitungsverfahren nach Anspruch 1, wobei die digitalen Signale, die dem Autoradiographen entsprechen, durch Anordnen des Trägermediums und einer stimulierbaren, einen stimulierbaren Phosphor umfassenden Phosphorfolienplatte zusammen in Schichten, um den Autoradiographen des aufgelösten Musters auf der Phosphorfolienplatte als ein Energiespeicherbild aufzuzeichnen, durch Bestrahlen der Phosphorfolienplatte mit stimulierenden Strahlen und durch photoelektrisches Erfassen des Autoradiographen als stimulierte Emission ermittelt werden.

8. Das Signalverarbeitungsverfahren nach Anspruch 1, wobei die digitalen Signale, die dem Autoradiographen entsprechen, durch Anordnen des Trägermediums und eines strahlungsempfindlichen Materials zusammen in Schichten, um den Autoradiographen des aufgelösten Musters auf der strahlungsempfindlichen Schicht als ein sichtbares Bild aufzuzeichnen, und durch photoelektrisches Auslesen des Autoradiographen, der auf dem radioempfindlichen Material sichtbar gemacht ist, bestimmt werden.