DE69123701T2

DE69123701T2 - Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz

Info

Publication number: DE69123701T2
Application number: DE1991623701
Authority: DE
Inventors: Hidehiko Fujii
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1990-10-30
Filing date: 1991-07-25
Publication date: 1997-04-10
Anticipated expiration: 2011-07-26
Also published as: EP0483460B1; EP0483460A1; JPH04166759A; DE69123701D1; JP2508404B2

Description

Allgemeiner Stand der Technik

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz für ein Online-System, um Nucleinsäurefragmentproben, die durch das Sangersche Verfahren unter Verwendung von fluoreszierenden Startermolekülen (durch chemisches Binden von fluoreszierenden Materialien als Markiersubstanzen erhaltene Startermoleküle) vorbehandelt sind, in einen Probeneinbringteil eines scheibenartigen Gels, das in einer Gel-Elektrophoresevorrichtung in Einheiten von Endbasen vorgesehen ist, einzubringen, simultan die Proben zu elektrophorisieren und während der Elektrophorese Fluoreszenz durch optische Anregungs- und Detektiersysteme, die in einer zu der Elektrophoreserichtung senkrechten Richtung abgelenkt werden, zu detektieren, wobei auf diese Weise von einer Datenverarbeitungseinheit eine Basensequenzbestimmung durchgeführt wird.

Beschreibung des Standes der Technik

In einer Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz für ein Online-System, die ein scheibenartiges Gel verwendet, werden Nucleinsäurefragmente, die vorher mittels des Sangerschen Verfahrens behandelt worden sind, in verschiedenen Elektrophoresespuren als Antwort auf die Arten A (Adenin), G (Guanin), T (Thymin) und C (Cytosin) der Endbasen derselben elektrophorisiert.
Im allgemeinen verursacht eine Gel-Elektrophoresevorrichtung das sogenannte "Smiling" d.h. ein derartiges Phänomen, daß die Elektrophoresegeschwindigkeiten mit den Elektrophoresespuren variieren. Wenn Signale nacheinander von den Elektrophoresespuren für die Endbasen A, G, T und C gelesen werden und die Proben trotz des "Smiling" direkt hinsichtlich ihrer Basensequenz bestimmt werden, ist die Sequenz umgekehrt, was zu einem falschen Ablesen führt.
Man nimmt an, daß das "Smiling" hauptsächlich durch Temperaturverteilungen in den Elektrophoresespuren verursacht wird, die durch Joule-Wärme resultieren, die infolge der Elektrophorese erzeugt wird. Um ein derartiges "Smiling" zu verhindern, ist ein Verfahren wie in der japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 2-143145 (1990) offenbart, vorgeschlagen worden, bei dem eine Metallplatte mit einer Elektrophoreseplatte in dichtem Kontakt gebracht wird, um auf diese Weise die Temperatur zu vereinheitlichen, oder die Elektrophoreseplatte in einem schließbarem Behälter aufbewahrt und mit Luft versorgt wird, die auf einer konstanten Temperatur gehalten wird, woum die Temperatur zu vereinheitlichen.
Während die Mobilitätsdifferenz zwischen z.B. 500 Basen und 501 Basen 0,2 % (= 1/500) beträgt, ist es notwendig, Temperaturunregelmäßigkeiten derart zu steuern, daß sie weniger als 0,1ºC betragen, um die Mobilitätsdifferenz, die durch "Smiling" verursacht wird, durch eine Temperatursteuerung auf weniger als 0,2 % zu bringen. Dies ist in der Praxis schwierig.
Andererseits enthält ein Elektrophorese-Gel elektrolytisches Ammoniumpersulfat als einen Katalysator, der zu der Seite eines externen Elektrodenpuffers der Elektrophorese als Folge herauskommt. Wenn die Konzentration dieses Elektrolyts mit den Positionen variiert, wird zwischen den Elektrophoresespuren eine Ionenstärkedifferenz verursacht, die als Ergebnis ein "Smiling" verursacht. Ein auf heterogener Konzentration des Elektrolyts basierendes "Smiling" kann durch eine Temperatursteuerung nicht verhindert werden.
Zusätzlich zu dem obengenannten "Smiling" wird ein falsches Ablesen der Basensequenz auch durch heterogene Probeneinbringschlitze der Elektrophoresespuren verursacht. Im allgemeinen betragen Elektrophoreseentfernungen (Entfernungen zwischen Probeneinbringschlitzen und einem Nachweisteil) einer Online- System-Vorrichtung zur Bestimmung der Sequenz von fluoreszierender DNA ungefähr 200 bis 500 mm. Bei den Probeneinbringschlitzen können die Probenpositionen leicht um 1 bis 2 mm voneinander durch mindere Horizontalität bei der Gelformation, Eindringen von Harnstoff in die Schlitze und dergleichen verschoben werden. Die Differenz von 1 mm bei den Probeneinbringschlitzen entspricht 0,2 % (1/500), wobei dies für die Annahme gilt, daß die Elektrophoreseentfernung 500 mm beträgt. Dies entspricht der Mobilitätsdifferenz zwischen 500 Basen und 501 Basen. Es ist natürlich unmöglich, eine derartige Mobilitätsdifferenz durch eine Temperatursteuerung zu verhindern.
Das Dokument EP-A-0 198 403 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Basensequenz von Nudeinsäure, das ein durch ein "Smiling" verursachtes falsches Ablesen durch Verarbeiten von digitalen Signalen, die einem Autoradiogramm entsprechen, zu verhindern versucht. Die Neigung wenigstens einer Bande in jeder elektrophoretischen Reihe zu der elektrophoretischen Richtung wird detektiert, eine relative Position der geneigten Bande in einer Standardreihe wird bestimmt und die Wanderrichtung von dem Elektrophoresestartpunkt zu der Position der Bande wird auf der Basis der relativen Position in jeder Spur korrigiert.
Um aber dieses Verfahren zu verwenden, muß der radiographische Film belichtet und entwickelt werden, um das Autoradiogramm sichtbar zu machen oder, wenn das Strahlungsbildaufnahme- und -wiedergabeverfahren verwendet wird, muß die Strahlungsenergie, die von den radioaktiv gekennzeichneten Substanzen abgestrahlt wird, in einer Phosphorschicht gespeichert werden, was einen enormen Zeitaufwand erfordern wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung zur Online-Bestimmung der Basensequenz bereitzustellen, die Basensequenzen, sogar wenn durch "Smiling" oder dergleichen eine Mobilitätsdifferenz zwischen den Spuren verursacht ist, auf einem direkten Weg korrekt bestimmen kann, ohne ein Autoradiogramm zu verwenden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Kalibrierkoeffizienten für Zeitbasen jeweiliger Elektrophoresespuren anhand der Differenz zwischen Positionen von bereits abgegebenen Signalen in einem derartigen Bereich, daß keine Sequenzumkehr verursacht wird, und Positionen in im wesentlichen regelmäßigen Intervallen festgelegt, um ursprünglich Signale auszugeben und nachfolgende Zeitbasen für die jeweiligen Elektrophoresespuren mit den Kalibrierkoeffizienten zu kalibrieren, um auf diese Weise die korrekte Basensequenz zu erhalten.
Wie in Fig. 1 gezeigt, umfaßt eine Datenverarbeitungseinheit für die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz eine Signalspeichereinrichtung 40 zum Speichern von Signalen von jeweiligen Elektrophoresespuren bezüglich Zeiten, eine Maximalsignalzeitnachweiseinrichtung 42 zum Nachweisen von Zeiten, die Maximalwerte der Signale hinsichtlich der jeweiligen Elektrophoresespuren liefern, eine Maximalsignalzeitspeichereinrichtung 44 zum Speichern der Maximalsignalzeiten, eine Auftrittszeitauswerteeinrichtung 46 zum Berechnen von Auftrittszeiten von Maximalsignalen der Elektrophoresespuren, mit Ausnahme einer Referenzspur, die aus vier Elektrophoresespuren ausgewählt ist, zwischen zwei Maximalsignalen der Referenzpur, unter der Annahme, daß es keine Mobilitätsdifferenz zwischen den Elektrophoresespuren gibt, eine Kalibrierkoeffizientenberechnungseinrichtung 48 zum Berechnen von Kalibrierkoeffizienten anhand der Verhältnisse der Maximalsignalzeiten der drei Elektrophoresespuren, die in der Auftrittszeitauswerteeinrichtung 46 berechnet worden sind, zu den tatsächlichen maximalen Signalzeiten, eine Zeitbasenkalibriereinrichtung 50 zum Kalibrieren der Zeitbasen der drei Elektrophoresespuren mit den Kalibrierkoeffizienten, und eine Einrichtung zur Bestimmung der Basensequenz 52 zur Durchführung der Bestimmung der Basensequenz anhand der Maximalsignalzeiten der Referenzspur und der drei Elektrophoresespuren auf der Grundlage der kalibrierten Zeitbasen.
Die Auftrittszeitauswerteeinrichtung 46 führt eine Rechnung unter der Annahme durch, daß die Maxinalsignale der drei Elektrophoresespuren zwischen z.B. zwei Maximalsignalen der Referenzspur in regelmäßigen Intervallen auftreten.
Um die Kalibrierkoeffizienten zu aktualisieren, wird ein Kalibrierkoeffizient immer dann, wenn ein Maximalsignal in der Referenzspur auftritt, zwischen diesem Signal und einem Maximalsignal berechnet, das in der Referenz kurz vor demselben auftritt. Dann können die Zeitbasen der verbleibenden drei Elektrophoresespuren, die gelten, bis ein nächstes Maximalsignal in der Referenzspur auftritt, mit dem aktualisierten Kalibrierkoeffizienten kalibriert werden.
In einer Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz für ein Online-System treten die Signale in längenmäßiger Reihenfolge, d.h. von einem kurzen Nucleinsäurefragment zu einem langem Nucleinsäurefragment mit einer zeitlichen Pause auf. Während die Signale selbst breit sind und ein falsches Ablesen der Sequenz, d.h. eine Sequenzumkehr durch "Smiling" in hintereinander auftretenden langen Nucleinsäurefragmenten leicht verursacht werden kann, sind die Signale in vorher auftretenden kurzen Nucleinsäurefragmenten scharf und tritt, sogar wenn "Smiling" stattfindet, keine Sequenzumkehr auf, was zu keinem falschen Ablesen führt. Wenn bereits kurze Nucleinsäurefragmente aufgetreten sind, wird jedoch, wenn auch keine Sequenzumkehr verursacht wird, eine Verschiebung aus Positionen des echten Auftretens (Positionen, die in regelmäßigen Zeitintervallen liegen) festgestellt, wenn "Smiling" stattfindet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine der Elektrophoresespuren für A, G, T und C als eine Referenzspur ausgewählt, so daß die Zeitbasen der verbleibenden drei Elektrophoresespuren unter Bezugnahme auf die Entfernung zwischen zwei Peaks der Referenzspur kalibriert werden. Somit ist es möglich, sogar wenn eine Differenz zwischen Elektrophoresegeschwindigkeiten der Elektrophoresespuren durch "Smiling" oder dergleichen verursacht wird, eine korrekte Basensequenzbestimmung vorzunehmen.
Außerdem kann das erfinderische Verfahren mit zwischenzeitlichen Änderungen der Elektrophorsezustände fertig werden.
Die vorliegende Erfindung kann auch mit "Smiling" fertig werden, das aus einem anderen Grund als Temperaturverteilungen resultiert.
Die vorliegende Erfindung kann außerdem mit einem System erfolgreich zurechtkommen, das Daten aufnimmt und Basensequenzen anhand von Daten bestimmt, die in einem Mehrprogrammbetrieb erhalten wurden.
Die vorliegende Erfindung kann mit einem Verfahren zum Vereinheitlichen der Temperaturen durch Umgebungsluftsteuerung kombiniert werden. In diesem Fall wird die Genauigkeit weiter verbessert.
Die vorangehenden und weiteren Aufgaben, Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen ersichtlicher werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Blockdiagramm, das die Funktionen eines Signalverarbeitungs-Mikrocomputers in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
Fig. 2 ist eine perspektivische Ansicht, die die Ausführungsform schematisch zeigt;
Fig. 3 stellt mit der Ausführungsform gemessene Signale jeweiliger Elektrophoresespuren dar;
Fig. 4 ist ein Flußdiagramm, das das Verfahren zur Berechnung von Kalibrierkoeffizienten zeigt;
Fig. 5 stellt Beispiele für Maximalwertdaten und maßgebliche Basensequenzen dar.
Fig. 6 ist ein Flußdiagramm, das ein Verfahren zur Vorbearbeitung bei diskontinuierlichen Elektrophoresebedingungen zeigt; und
Fig. 7 stellt Beispiele für Detektionssignale in Bezug auf fluoreszierende Startermoleküle dar.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Fig. 2 ist eine allgemeine Ansicht, die eine Ausführungsform der Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Ein scheibenartiges Elektrophorese-Gel 2 ist aus einem Polyacrylamid-Gel hergestellt. Beide Enden des Elektrophorese-Gels 2 sind in Elektrodenschichten 4 und 6 eingetaucht, die elektrolytische Lösungen enthalten. Eine Elektrophorese-Spannungsquelle 8 legt eine Elektrophorese-Spannung über die Elektrodenschichten 4 und 6.
In einem Ende des Elektrophorese-Gels 2 sind Probeneinbringschlitze 10 vorgesehen, um Proben einzuspritzen. Proben jeweiliger Endbasen werden in vorgeschriebene Positionen der jeweiligen Schlitze 10 eingebracht. Diese Proben sind aus vier Arten von DNA-Fragmenten hergestellt, die durch ein bekanntes Verfahren mit FITC, einem fluoreszierenden Material, gekennzeichnet und derart behandelt sind, daß jeweilige Basen A, G, T und C durch das Sangersche Verfahren zu den Enden kommen. Das FITC wird mit einem Argonlaserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm angeregt und erzeugt Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 520 nm.
Wenn die Spannungsquelle 8 die Elektrophorese-Spannung anlegt, werden die Proben in dem Elektrophorese-Gel 2 mit der Zeit in eine Elektrophoreserichtung 14 als Elektrophorese-Banden 16 elektrophorisiert und getrennt, um einen Meßbereich zu erreichen.
Der Meßbereich ist mit einem Anregungssystem zum Anwenden von Anregungslicht von einen Argonlaser 18, der einen Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm über eine Kondensorlinse 20 und einen Spiegel 21 emittiert, und einem Detektionssystem zum Sammeln von Fluoreszenzlicht, das von fluoreszierenden Materialien erzeugt wird, die die an von dem anregenden Laserstrahl bestrahlten Positionen befindlichen Elektrophorese-Banden 16 bilden, durch eine Objektivlinse 22 und zum Detektieren des Fluoreszenzlichts durch einen Photomultiplier 28 über ein Interferenzfilter 24 bei 520 nm, eine Kondensorlinse 26 und einen Lichtwellenleiter 27 versehen. Die optischen Anregungs- und Detektionssysteme mit der Kondensorlinse 20, dem Spiegel 21, der Objektivlinse 22, dem Intereferenzfilter 24, der Kondensorlinse 26 und dem Lichtwellenleiter 27 sind auf einem Abtasttisch 30 vorgesehen, der sich mechanisch bewegt, um auf einer Meßlinie in einer Richtung (Abtastrichtung 29) abzutasten, in der die mit dem Anregungslichtstrahl bestrahlte Position sich mit der Elektrophoreserichtung 14 in konstanten Abständen schneidet.
Die Detektionssignale (Fluoreszenzsignale) von dem Photomultiplier 28 werden über einen Verstärker und einen A/D-Wandler 32 zu einem Signalverarbeitungsmikrocomputer 31 gebracht, der eine Datenverarbeitungseinheit ist. Der Mikroprozessor 31 nimmt auch Signale, die Positionen entsprechen, die mit dem Anregungsstrahl an der Meßposition des Elektrophorese-Gels 2 bestrahlt werden, als Abtastdaten auf. Somit werden die gesamten Fluoreszenzsignale, die durch Abtasten der optischen Anregungs- und Detektionssysteme in der Abtastrichtung erhalten werden, mit Positionsinformation in dem Mikrocomputer 31 aufgenommen.
Die Arbeitsweise dieser Ausführungsform wird nun unter Bezugnahme auf die Fig. 3, 4 und 5 beschrieben.
Fig. 3 zeigt Beispielsignale, die in der in Fig. 2 gezeigten Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz erhalten wurden. Die Symbole A, G, T und C entsprechen den jeweiligen Elektrophoresespuren, während das Symbol Nt die Anzahl der von den optischen Systemen in der Abtastrichtung durchgeführten Abtastungen darstellt.
Fig. 3 zeigt Bereiche mit relativ kurzen Basenlängen, und es wird, sogar wenn "Smiling" stattfindet, keine Umkehr der Signalreihenfolge, d.h. kein falsches Ablesen der Sequenz verursacht, da die Differenz zwischen Elektrophoresegeschwindigkeiten pro Basenlänge relativ groß ist. Unter genauerer Bezugnahme auf Fig. 3 ergibt sich jedoch, daß sich acht Peaks von G, T und C zwischen dem elften und dem zwanzigsten Peak von A befinden. Wenn Linien unter der Annahme gezogen werden, daß acht Peaks zwischen zwei Peaks von A in regelmäßigen Abständen auftreten, ist es verständlich, daß die Peaks von G gegenüber den Linien verzögert sind und die Peaks von T etwas vor den Linien auftreten, obwohl die Peaks von C im wesentlichen auf den Linien liegen.
Wenn die Proben mit einer konstanten Spannung elektrophorisiert werden, werden die Peaks nicht genau in regelmäßigen Abständen in der in Fig. 2 gezeigten Struktur auftreten. Wenn jedoch die Zeitbasen zwischen zwei Peaks einer bestimmten Referenzelektrophoresespur kalibriert werden, d.h. in diesem Fall die Spur von A, wie es in Fig. 3 gezeigt ist, ist die Näherung derartiger regelmäßiger Abstände ausreichend, da der Abstand zwischen den zwei Peaks der Referenzspur höchstens ungefähr 20 bis 30 Basen beträgt.
Hinsichtlich der in Fig. 3 gezeigten Signale ist es ersichtlich, daß die Reihenfolge des Auftretens in kurzer Zeit umgekehrt wird, wodurch Fehler beim Bestimmen der Basensequenz verursacht werden, da die Peaks von G verglichen mit denjenigen von A und C verzögert sind und diejenigen von T vorangehen.
Das Verfahren zum Kalibrieren der Zeitbasen wird nun unter Bezugnahme auf ein in Fig. 4 gezeigtes Flußdiagramm beschrieben.
In einem Anfangszustand liegen die in Fig. 3 gezeigten detektierten Signale von A, G, T und C in Sequenzen RA(16000), RG(16000), RT(16000) und RC(16000) vor. Die Sequenz RA(16000) beginnt bei RA(0). Dies gilt auch für die anderen Sequenzen RG, RT und RG. Die Sequenzen RG, RT und RG werden jedoch mit dem Voranschreiten des Programms neugeschrieben. Die Anfangswerte der Sequenzen A(1000), G(1000), T(1000) und C(1000) zum Speichern von Maximalwerten sind Null, und die Peaks sind so numeriert, daß ein bei G auftretender M-ter Peak G(M) ist. Die Anfangswerte der Kalibrierkoeffizienten Kg, Kt und Kc sind auf 1 eingesetzt. Die Signale mit kalibrierten Zeitbasen für die Elektrophoresespuren von G, T und C werden zeitweilig in den Sequenzen RG1(16000), RT1(16000) und RC1(16000) gespeichert, deren Anfangswerte an die gemessenen Werte angepaßt werden. Die Sequenz SEQ$(1000) ist gestaltet, um maßgebliche Basensequenzen zu speichern, deren Anfangswerte 0 sind.
Eine Sequenzzahl NSEQ wird anfänglich auf 1 gesetzt, und eine Zeitzahl Nt wird auf 2 gesetzt (Schritte S1 und S2). Das Symbol Nt stellt Abtastzahlen in dieser Ausführungsform dar.
Die Elektrophoresespur von A wird als Referenzspur angenommen, und es wird eine Bestimmung vorgenommen, ob ein Signal A ein Maximalsignal ist oder nicht (Schritt S3). Wenn das Signal A ein Maximalsignal ist, wird angenommen, daß SEQ$(NSEQ) = A und A(NSEQ) = Nt als Basissequenz ist (Schritt S4). Es wird eine Bestimmung vorgenommen, ob es ein Maximalsignal von A vor diesem Maximum gibt oder nicht, und wenn dieses Maximum das erste ist, wird 1 zu der Sequenzzahl NSEQ sowie zu der Zeitzahl Nt addiert (Schritte S5, S6, S7, S8 und S9), und das Verfahren kehrt zu dem Schritt S3 zurück, um die Verarbeitung zu wiederholen.
Wenn das Signal A nicht ein Maximalsignal ist, wird in den Schritten S10 bis S12 eine Bestimmung vorgenommen, ob es Maximalsignal in G, T oder C gibt oder nicht, und wenn es kein Maximalsignal gibt, wird 1 zu der Zeitzahl Nt addiert (Schritte S8 und S9), und wird derselbe Vorgang noch einmal wiederholt. Wenn ein Maximalsignal in G, T oder C festgestellt wird, wird eine Basenbestimmung vorgenommen (Schritte S13, S14 und S15) und 1 zu der Sequenzzahl NSEQ sowie der Zeitzahl Nt addiert (Schritte S16, S8 und S9), und das Verfahren kehrt zu dem Schritt S3 zurück, um die Verarbeitung zu wiederholen.
Wiederum Bezug nehmend auf Fig. 3 tritt der elfte Peak A bei Nt = 2020-ste Abtastung und der 20-ste Peak A bei Nt = 2200- ste Abtastung auf, und die Peaks anderer Elektrophoresespuren werden auch detektiert, um, wie in Fig. 5 gezeigt, Maximalwerte auszuwerten. Die Basissequenz SEQ$(1000) wird, wie in Fig. 5 gezeigt ist, zu AGTTC ... ... bestimmt.
Die in Fig. 4 gezeigten Schritte S17 bis S22 sind geeignet, um Kalibrierkoeffizienten auszuwerten. In dem in Fig. 3 gezeigten Beispiel schreitet das Verfahren nach Auftreten des 20-sten Peaks A zu dem Schritt S17 voran, um die Abtastzahlen von eingeschlossenen Peaks in Fig. 5, d.h. die Abtastzahlen des 19- ten Peaks C, des 18-ten Peaks G und des 17-ten Peaks T in proportionaler Verteilung als Werte zu berechnen, die unter der Annahme erzielt worden sind, daß die Peaks in regelmäßigen Abständen (dies entspricht vertikalen Linien in Fig. 3) auftreten und Verhältnisse derselben zu gemessenen Abtastzahlen zu nehmen, wodurch Kalibrierkoeffizienten der jeweiligen Elektrophoresespuren von G, T und C berechnet werden.
In Bezug auf die in Fig. 3 gezeigten Signale ist die Peakzeit (Abtastzahl) des tatsächlichen Signals für die Elektrophoresespur G 2170, und die in proportionaler Verteilung unter der Annahme berechnete Peakzeit, daß die Peaks in regelmäßigen Abständen auftreten, 2160, wodurch der Kalibrierkoeffizient Kg für G sich wie folgt ergibt:
Kg = 2160/2170 = 0,99539.
Für die Elektrophoresespur T wird der Kalibrierkoeffizient Kt in ähnlicher Weise berechnet wie folg:
Kt = 2140/2135 = 1,0023419.
Für die Spur C ist der Kalibrierkoeffizient Kc gleich 1.
Die jeweiligen in der obengenannten Weise ausgewerteten Kalibrierkoeffizienten werden mit den Zeiten der jeweiligen Sequenz von RG, RT und RC, die 2200 folgen, multipliziert, um Daten für RG, RT und RC neu zu schreiben und dieselben für RG1, RT1 und RC1 einzuführen.
Dieses Verfahren wird jedesmal wiederholt, wenn der Peak A auftritt.
Das in Fig. 4 gezeigte Flußdiagramm beruht auf der Voraussetzung, daß die Elektrophorese-Bedingungen wenigstens vom Auftreten von Signalen nach dem Beginn der Elektrophqrese an konstant sind, z.B. konstante Spannung, konstanter Strom und konstante Energie, während eine Korrektur erforderlich ist, wenn die Elektrophoresebedingungen sich zum Beispiel während der Elektrophorese ändern. Fig. 6 zeigt ein beispielhaftes Datenvorbearbeitungsverfahren in Bezug auf eine diskontinuierliche Änderung der Elektrophoresebedingungen. In dem in Fig. 6 gezeigten Beispiel wird ein Datenzug letztendlich in Elektrophoresedaten bei einer konstanten Spannung von 1 KV umgewandelt.
Als erstes werden aus den gemessenen Elektrophoresespannungsdaten RV(J) (Einheit: kV) für die jeweiligen Zeiten Daten aus Zeit-Spannung-Produkten wie folgt erzeugt: Einheit: Abtastwert
wobei SV(J) eine monotone ansteigende Funktion von J darstellt.
Um jeweilige Daten RA1(M), RG1(M), RT1(M) und RC1(M) (M = 1 ... ... 16000) aus Umwandlungswerten mit einer konstanten Spannung von einem 1 kV auszuwerten, kann der Wert von J, der den ersten SV(J) liefert, der z.B. größer als M ist, ausgewertet werden, um Werte von ursprünglichen Signalen in Bezug auf J zu verwenden. Z.B. RA1(M) = RA(J), RG1(M) = RG(J), ... ... .
Nachdem die Vorbearbeitung gemäß dem in Fig. 6 gezeigten Flußdiagramm durchgeführt worden ist, schreitet das Verfahren mit dem in Fig. 4 gezeigten Schritt S1 voran.
Der erste Peak der Referenzspur kann ein fluoreszierendes Startermolekül sein. In diesem Fall treten gleichzeitig Peaks bei A, G, T und C der ersten Sequenzzahlen auf, wie es z.B. in Fig. 7 gezeigt ist. In diesem Fall erfordert das in Fig.4 gezeigte Flußdiagramm keine Änderung, sondern bewirkt es dieselbe Funktion.
In dem in Fig. 4 gezeigten Flußdiagramm werden die Kalibrierkoeffizienten jedesmal berechnet, wenn ein Peak in der Elektrophoresespur A, die die Referenzspur ist, auftritt, um eine Kalibrierung der Zeitbasen der verbleibenden drei Spuren zu wiederholen. Alternativ können, wenn z.B. die Kalibrierkoeffizienten in Bereichen mit relativ kurzen Basenlängen berechnet worden sind, diese auch für Bereiche mit langen Basenlängen verwendet werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben und dargestellt worden ist, ist es verständlich, daß dieselbe nur zur Darstellung und als Beispiel dient und nicht als Beschränkung anzusehen ist, wobei der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche begrenzt wird.
Die in der vorangehenden Beschreibung, in der Zeichnung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

1. Eine Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz zum Auftrennen von markierten Nucleinsäurefragmentproben in vier Elektrophoresespuren als Antwort auf Arten von Endbasen und gleichzeitigem Gel-Elektrophoresieren der Proben, während von den Nucleinsäurefragmentproben abgegebene Signale in einer zu der Elektrophoreserichtung (14) senkrechten Richtung zum Erlangen der Signale in Online-Echtzeit abgetastet werden, und auf diese Weise die Basensequenzen in einer Datenverarbeitungseinheit (31) bestimmt werden, dadurch gekennzeichnet, daß

die Datenverarbeitungseinheit (31) umfaßt:

eine Signalspeichereinrichtung (40) zum Speichern von Signalen der jeweiligen Elektrophoresespur bezüglich Zeiten;

eine Maximalsignalnachweiseinrichtung (42) zum Nachweisen von Zeiten, die Maximalwerte der Signale hinsichtlich der jeweiligen Elektrophoresespuren liefern;

eine Maximalsignalzeitspeichereinrichtung (44) zum Speichern der Maximalsignalzeiten;

eine Auftrittszeitauswerteeinrichtung (46), die eine der vier Elektrophoresespuren als eine Referenzspur auswählt und an-. nimmt, daß es keine Mobilitätsdifferenz zwischen den Elektrophoresespuren gibt, zum Berechnen von Auftrittszeiten von Maximalsignalen der restlichen drei Elektrophoresespuren, die zwischen zwei Maximalsignalen der Referenzspur auf der Zeitbasis der Referenspur auftreten;

eine Kalibrierkoeffizientenberechnungseinrichtung (48) zum Berechnen von Kalibrierkoeffizienten anhand der Verhältnisse der Maximalsignalzeiten der drei Elektrophoresebahnen , die in der Auftrittszeitauswerteeinrichtung (46) berechnet worden sind, zu den tatsächlichen Maximalsignalzeiten;

eine Zeitbasenkalibriereinrichtung (50) zum Kalibrieren der Zeitbasen der drei Elektrophoresespuren mit den Kalibrierkoeffizienten; und

eine Einrichtung zur Bestimmung der Basensequenz (52) zum Bestimmen der Basensequenzen anhand der Maximalsignalzeiten der Referenzspuren und der drei Elektrophoresespuren auf der Grundlage der kalibrierten Zeitbasen.

2. Eine Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Auftrittszeitauswerteeinrichtung (46) eine Berechnung unter der Annahme durchführt, daß die Maximalsignale der drei Elektrophoresespuren zwischen zwei Maximalsignalen der Referenzspur in regelmäßigen Zeitintervallen auftreten.

3. Eine Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenzen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kalibrierkoeffizientenberechnungseinrichtung (48) die Kalibrierkoeffizienten immer dann berechnet, wenn ein Maximalsignal in der Referenzspur zwischen dem Signal und einem vorangehenden Maximalsignal der Referenzbahn auftritt, und die Zeitbasenkalibriereinrichtung (50) die Zeitbasen der drei Elektrophoresespuren kalibriert, die gelten, bis ein nächstes Maximalsignal in der Referenzspur auftritt.

4. Eine Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kalibrierkoeffizientenberechnungseinrichtung (48) die Kalibrierkoeffizienten einmal in Abschnitten mit kurzen Basenlängen berechnet und die Zeitbasenkalibriereinrichtung (50) die Zeitbasen mit den Kalibrierkoeffizienten bezüglich Abschnitte mit langen Basenlängen kalibriert.

5. Eine Vorrichtung zur Bestimmung der Basensequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem für den Fall, daß die Elektrophoresebedingungen geändert werden, eine Einrichtung zum Umwandeln der Zeitbasen in derartige Zeitbasen umfaßt, daß die Elektrophoresebedingungen konstant sind.