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Die Erfindung betrifft Formulierungen zur gesteuerten
in vivo-Abgabe von therapeutischen Mitteln. Gemäß einem
anderen Aspekt betrifft sie Bläschen und insbesondere
Phospholipid-Bläschen.
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Sowohl beim Menschen als auch bei niederen Tieren gibt
es eine Vielzahl von Bedingungen, die auf in vivo gegebene
Arzneimittel oder andere therapeutische Mittel ansprechen.
Um brauchbar zu sein, müssen diese Mittel mit einer Dosis
gegeben werden, die zum Verursachen des gewünschten
Effektes hoch genug ist, und diese Dosis muß über einen
genügenden Zeitraum aufrechterhalten werden, um diesen Effekt zu
erreichen. Viele dieser therapeutischen Mittel werden
routinemäßig durch intramuskuläre Injektion mit Dosen
verabreicht, die so berechnet sind, daß sie eine Konzentration
des Mittels im Kreislaufsystem ergeben, die wirksam ist.
Danach werden die Injektionen so wiederholt, wie es zum
Aufrechterhalten des therapeutisch wirksamen Werts
erforderlich ist.
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Es ist oft der Fall, daß der therapeutisch wirksame
Wert des Mittels im Kreislauf wegen eines Zusammenbruchs
des Mittels durch die Abwehrmechanismen des Wirts gegen
Fremdsubstanzen nach der Injektion nur kurzzeitig
aufrechterhalten wird. Daneben kann das Mittel selbst nicht
hinnehmbare Nebeneffekte bis zu letalen Nebeneffekten
aufweisen, wenn es in Mengen verabreicht wird, die den
therapeutisch brauchbaren Wert wesentlich überschreiten. Deshalb
wird ein Verlängern der wirksamen Konzentration des Mittels
im Körper durch Erhöhen der Dosis immer durch die Toxizität
begrenzt. Selbst bei niedriger Toxizität kann die Größe
einer Injektion durch die Größe des Bolus begrenzt werden,
die sicher verabreicht werden kann.
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Im Hinblick auf solche Probleme wurden Anstrengungen
zum Entwickeln von Abgabesystemen für therapeutische Mittel
unternommen, die in vivo verabreicht werden und die nach
der Verabreichung das Mittel allmählich in ihre Umgebung
abgeben, um die Zeitspanne zu verlängern, während der die
wirksame Konzentration des Mittels in dieser Umgebung
aufrechterhalten wird. Auf diese Weise kann die Zeitspanne
zwischen Verabreichungen des Mittels erhöht und in einigen
Fällen die Notwendigkeit für weitere Gaben beseitigt
werden.
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Ein solcher Ansatz zum Erreichen einer verlängerten
oder andauernden Abgabe (Langzeitabgabe) bestand darin, das
therapeutische Mittel in einem "Bläschen" zu verkapseln.
Soweit hier verwendet, bezieht sich der Begriff Bläschen
auf ein mizelluläres Teilchen, welches üblicherweise eine
sphärische Form aufweist und welches häufig mit einem Lipid
erhalten wird, das eine Zweischicht-Membran bildet und als
"Liposom" bezeichnet wird. Verfahren zum Herstellen solcher
Bläschen sind im Stand der Technik bekannt. Typischerweise
werden sie hergestellt aus einem Phospholipid wie
beispielsweise einem Distearoylphosphatidylcholin oder
Lecithin, und sie können andere Materialien wie
beispielsweise positiv oder negativ geladene Verbindungen
einschließen. Aus Phospholipiden hergestellte Bläschen werden
allgemein einfach- als "Phospholipid-Bläschen" bezeichnet.
In Abhängigkeit von den Verfahren zu ihrer Herstellung kann
ein Bläschen als einfache Zweischichtenschale
(unilamellares Bläschen) ausgebildet sein, oder es kann vielschichtig
ausgebildet sein (multilamellares Bläschen).
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Nach der Verabreichung - typischerweise als Suspension
in physiologischer Kochsalzlösung - geben die Bläschen das
verkapselte therapeutische Mittel allmählich ab, welches
dann seine erwarteten Wirkungen entfaltet. Vor der Abgabe
bzw. Freisetzung zeigt das Mittel jedoch keine
pharmakokinetische Eigenschaften und ist durch das Bläschen vor
metabolischem Abbau oder vor anderem Angriff durch den
Abwehrmechanismus des Wirts gegen Fremdsubstanzen geschützt.
Demgemäß kann das Mittel in verkapselter Form sicher in einer
genügend hohen Dosis verabreicht werden, die bei direkter
Verabreichung an den Wirt zu ernsthaften Nebenwirkungen
oder sogar zum Tod führen könnte.
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Die Zeitspanne, über die eine wirksame Konzentration
des therapeutischen Mittels nach Verabreichung als
Bläschenverkapselung aufrechterhalten wird, wird im allgemeinen
als Funktion der Geschwindigkeit angenommen, mit der es vom
Bläschen aus freigesetzt wird und als Funktion der
Geschwindigkeit, mit der es vom Punkt der Verabreichung nach
Abgabe absorbiert wird. Weil sich ersteres mit dem Aufbau
des Bläschens und letzteres auf Grund der Eigenschaften des
Mittels verändern können, kann die Zeitspanne, über die die
brauchbare Konzentration eines Mittels im Kreislauf
erhalten wird, in weiten Bereichen variieren. Allgemein wird
angenommen, daß die Abgabegeschwindigkeit aus dem Bläschen
für die meisten Verbindungen steuernd ist, und es wird
gewöhnlich eine Langzeitabgabe von verkapselten Arzneimitteln
über einen Zeitraum von 6 bis 8 Stunden beobachtet; siehe
F.J.T. Fields (1981), Liposomes: From Physical Structure to
Therapeutic Applications; Research Monographs in Cell and
Tissue Physiology, Band 7, C.G. Knight, Hrsg., Elsevier/
North Holland, N.Y., S. 51ff und R.W. Stevenson et al,
Diabetologia, 19, 217 (1980). Intramuskuläre Injektionen von
bläschenverkapseltem Interferon haben bei Mäusen jedoch zu
lokalisierten Interferonwerten geführt, die nach 3 Tagen
den Werten äquivalent waren, die über 2 bis 4 Stunden nach
Injektion von freiem Interferon beobachtet wurden; D.A.
Eppstein et al, J. Virol., 41, 575. Diese längere Zeit der
Langzeitabgabe bzw. Langzeitfreisetzung spielt vermutlich
die geringere Mobilität dieses Biomakromoleküls von der
Stelle der Injektion aus wider.
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Unbesehen der Fortschritte bei der
Langzeitfreisetzung, die bei Verwendung von Bläschen als
Verkapselungsmittel erreicht worden sind, ist eine weitere Verbesserung bei
den Zusammensetzungen für die Langzeitfreisetzung
wünschenswert, um das Intervall zwischen der Verabreichung des
therapeutischen Mittels noch weiter herabzusetzen. Selbst
eine Langzeitabgabe über einen Zeitraum von 6 bis 8 Stunden
macht die Behandlung eines Außerhauspatienten schwierig,
wenn nicht unmöglich, und längere Intervalle würden die
Arbeitsbelastung des klinischen oder anderen medizinischen
Personals verringern, völlig zu schweigen von der
Beeinträchtigung der Unbequemlichkeit beim Patienten. Obwohl
durch Verkapselung mit Bläschen der Zeitraum, während
dessen eine wirksame Konzentration von therapeutischen Mitteln
aufrechterhalten werden konnte, ausgedehnt wird, ergibt
sich weiter aus der Verkapselung selbst kein wirksames
Mittel zum Steuern der Freisetzungsgeschwindigkeit.
Dementsprechend bleibt ein bisher unerfüllter Wunsch nach
Formulierungen zur Langzeitfreisetzung von therapeutischen
Mitteln, die das Intervall noch weiter ausdehnen, über das
eine wirksame Konzentration des Mittels aufrechterhalten
werden kann.
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Die EP-A-0 072 234 offenbart, daß die in
vitro-Stabilität gewisser Liposome, die ein therapeutisches Mittel
enthalten, verbessert werden kann, indem man die Liposome
in einer kontinuierlichen Phase suspendiert, die eine
pharmazeutisch verträgliche Salzlösung enthält, die mindestens
isotonisch mit menschlichem Blut ist. Dies ergibt bei
tropischem Klima eine verbesserte Lagerzeit ohne Kühlung.
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Die EP-B-0 021 337 betrifft ebenfalls die in vitro-
Stabilität von Liposomen, die ein therapeutisches Mittel
enthalten, in dem eine mindestens 0,4-molare Konzentration
eines Zuckers in der Liposomlösung verwendet wird.
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Bittmann et al, Chemistry and Physics of Lipids, 28
(1981) 323-335 bezieht sich auf Seite 324 auf
vorangegangene Beobachtungen, daß die Initialgeschwindigkeiten des
osmotischen Quellens, die beim Suspendieren isotonischer
oder hypertonischer Nichtelektrolytlösungen beobachtet
wird, einen Hinweis auf die Eindringeschwindigkeiten der
gelösten Bestandteile durch die äußerste zweifache
Lipidschicht geben.
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Vorliegend wurde gefunden, daß durch Steuern der
Konzentration der gelösten Bestandteile in der
kontinuierlichen Phase eines injizierbaren Liposoms, welches ein
therapeutisches Mittel trägt und in einer kontinuierlichen
wäßrigen Phase suspendiert ist, sich eine Möglichkeit zum
Steuern der Geschwindigkeit ergibt, mit der das
therapeutische Mittel aus dem Bläschen nach in vivo-Verabreichung
durch Injektion freigesetzt wird.
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Demgemäß stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur
gesteuerten, andauernden in vivo-Abgabe eines
therapeutischen Mittels nach subkutaner oder intramuskulärer
Injektion in einen Wirt zur Verfügung, welches eine Lösung des
in Bläschen verkapselten therapeutischen Mittels aufweist,
wobei die Bläschen in einer Lösung suspendiert sind, zu der
eine ausreichende Menge eines gelösten Stoffes zugesetzt
worden ist, der ausgewählt ist aus Zuckern und
Polypeptiden, so daß die suspendierende Lösung hypertonisch
bezüglich der Lösung innerhalb der Bläschen ist und eine größere
Osmolarität als physiologische Kochsalzlösung aufweist.
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Die Freisetzungsgeschwindigkeit des therapeutischen
Mittels aus den Bläschen nach Verabreichung ist eine
Funktion des anfänglichen osmotischen Drucks. Infolgedessen
verlangsamt sich die Freisetzung des therapeutischen
Mittels, wenn die Osmolarität der suspendierenden Lösung
relativ zur Lösung innerhalb der Bläschen weniger hypotonisch
wird. Die geringste Freisetzung erhält man, wenn sich die
suspendierende Lösung an eine isotonische oder sogar
hypertonische Beziehung bezüglich der Lösung innerhalb der
Bläschen annähert. Verglichen mit den gemäß dem Stand der
Technik in Bläschen verkapselten und als Suspensionen in
physiologischer Kochsalzlösung verabreichten Mitteln zeigen
die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ein längeres
Intervall,
während dessen die Langzeitfreisetzung des Mittels
aufrechterhalten wird.
Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1: Übergangstemperaturen (Stabilität) von
Bläschenformulierungen bei in vitro-Studien mit Einsatz der
PAC-Spektroskopie.
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DSPC:Chol (1 : 1) -
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(2 : 1) -
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(7 : 1) -
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DSPC:DPPC:Chol (1 : 1 : 1) -
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(1,5 : 0,5 : 1) -
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DSPC:SA:Chol (1,5 : 0,5 : 1) -
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DSPC:DCP:Chol (1,5 : 0,5 : 1) -
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Jeder Datenpunkt ist das Mittel aus einem Minimum von
drei-Inkubationen über 15 Minuten in Anwesenheit von
Rattenplasma.
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Fig. 2: Auswirkungen der Membranfluidität der
Bläschen auf die verlängerte Freisetzung von 2-PAMCl
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A DSPC:DPPC:Chol (1 : 1 : 1)
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B DSPC:DPPC:Chol (1,5 : 0,5 : 1)
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C DSPC:Chol (2 : 1)
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Dosierung: 12 mg 2-PAMCl/Ratte (250 g); 2-PAMCl:
Bläschenlipid.
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Jeder Datenpunkt ist das Mittel aus zwei
Beobachtungen.
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- Plasma; - Vollblut.
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Fig. 3: Auswirkungen der Zusammensetzung des
Bläschenlipids und Veränderungen auf die verlängerte
Freisetzung von 2-PAMCl
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A DSPC:DCP:Chol (1,5 : 0,5 : 1), negativ
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B DSPC:SA:Chol (1,5 : 0,5 : 1), positiv
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C DSPC:Chol (2 : 1), neutral
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Dosierung: 12 mg 2-PAMCl/Ratte (250 g); 2-PAMCl:
Bläschenlipid (12 : 5)
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- Plasma; - Vollblut.
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Jeder Datenpunkt ist das Mittel aus zwei Messungen.
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Fig. 4: Auswirkungen des Cholesteringehalts im
Bläschen auf die verlängerte Freisetzung von 2-PAMCl auf die
verlängerte Freisetzung von 2-PAMCl
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A DSPC:Chol (1 : 1) (50 Mol-% Cholesterin)
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B DSPC:Chol (2 : 1) (33 Mol-% Cholesterin)
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C DSPC:Chol (7 : 1) (12,5 Mol-% Cholesterin)
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- Plasma; - Vollblut.
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Jeder Datenpunkt ist das Mittel aus zwei Messungen.
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Fig. 5: Verlängerte Freisetzung von 2-PAMCl durch
multilamellare (MLV) und große unilamellare (REV) Bläschen
hergestellt durch Umkehrphasenverdampfung. Beide
Präparationen waren aus DSPC:Chol (2 : 1) aufgebaut.
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Dosierung: 12 mg 2-PAMCl/Ratte (250 g); 2-PAMCl:
Bläschenlipid (12 : 5). Die gezeigten Werte sind
Vollblut-Konzentrationen des 2-PAMCl.
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Jeder Datenpunkt ist das Mittel aus zwei Messungen.
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Fig. 6: Wirksame Formulierungen zum Verlängern der
therapeutischen Plasmawerte von in Muskel injiziertem 2-
PAMCl.
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A: 12 mg 2-PAMCl in Salzlösung pro Ratte.
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B: 60 mg verkapseltes 2-PAMCl, resuspendiert in
Glukose-Kochsalzlösung.
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C: 12 mg 2-PAMCl-Lösung, der 2,5 mg Lipid zugesetzt
wurde und aus der MLV hergestellt wurden.
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D: 12 mg 2-PAMCl-Lösung, der 5,0 mg Lipid zugesetzt
wurde und aus der MLV hergestellt wurden.
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E: 60 mg 2-PAMCl-Lösung, der 5,0 mg Lipid zugesetzt
wurde und aus der unter Verwendung einer
Hochverkapselungstechnik MLV hergestellt wurden. Zu
beachten ist der hohe Anfangsblutwert von 2-PAMCl.
Äquivalente Dosen für freies 2-PAMCI oder MLV-
verkapselte Formulierungen mit kleinerer
Verkapselungswirkung waren für alle Ratten tödlich.
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- Plasma; - Vollblut.
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Jeder Datenpunkt ist das Mittel aus zwei Messungen.
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Wie vorstehend erwähnt, stellt die Erfindung ein
Verfahren zum Steuern der Freisetzungsgeschwindigkeit in vivo
eines therapeutischen Mittels aus einer
Bläschenverkapselung zur Verfügung, bei dem der osmotische Druck zwischen
der Lösung des therapeutischen Mittels in der Kapsel und
der Lösung eingestellt wird, in der die Bläschen zur
parenteralen Verabreichung suspendiert sind.
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Ohne Wunsch einer Bindung an eine spezielle Theorie
kann die Intervallverlängerung der Langzeitfreisetzung, die
erhalten wird, wenn die Osmolarität der suspendierenden
Lösung durch Zusatz des spezifischen Lösungsbestandteils
relativ zur Lösung innerhalb der Bläschen hypertonisch
gemacht wird, von dem Umstand herrühren, daß - solange die
Konzentration des Lösungsbestandteils in der
suspendierenden Lösung so ist, daß die Lösung hypertonisch ist - der
innere osmotische Druck nicht groß genug ist, um ein
Wandern des Lösemittels der suspendierenden Lösung in die
Bläschen zu verursachen, was den hydraulischen Druck
innerhalb der Bläschen erhöhen und dazu führen würde, daß sie
zusammenbrechen oder einen Teil ihres Inhalts freisetzen.
Nach der Verabreichung wird jedoch die Konzentration des
flüssigen Mediums um die Bläschen herum bezüglich der
Lösung innerhalb der Bläschen allmählich hypotonischer, und
zwar beispielsweise durch Absorption des
Lösungsbestandteils aus der suspendierenden Lösung durch den Körper. Wenn
dies geschieht, verursacht der osmotische Druck zwischen
den Bläschen und dem hypotonischen flüssigen Medium, daß
Flüssigkeit - insbesondere Wasser - in die Bläschen
einwandert und zur Freisetzung des therapeutischen Mittels führt.
Die Arbeitsweise des Standes der Technik, bei der das
therapeutische Mittel in Bläschen verabreicht wird, die in
physiologischer Kochsalzlösung suspendiert sind, die für
die Bläschen bereits hypotonisch ist, führt im Gegensatz
dazu zu einer schnelleren Freisetzung des Bläscheninhalts.
Dementsprechend wird das therapeutische Mittel auch
schneller freigesetzt. Durch Einstellen der Osmolarität zwischen
der Lösung des therapeutischen Mittels und der
suspendierenden Lösung kann jedoch die Freisetzungsgeschwindigkeit
variiert werden, was dazu führt, daß eine Steuerung dieser
Geschwindigkeit in einem bisher nicht erreichten Ausmaß
möglich ist.
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Bei der praktischen Durchführung der Erfindung wird
das therapeutische Mittel in einem geeigneten Lösemittel
gelöst, beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung, und
zwar an oder nahe dem Sättigungspunkt im Falle von Mitteln
beschränkter Löslichkeit und in einem geeigneten Bläschen
verkapselt. Verfahren dafür sind im Stand der Technik
bekannt und bedürfen hier keiner detaillierten Beschreibung.
Im Augenblick bevorzugt für den erfindungsgemäßen Einsatz
sind multilamellare Phospholipidbläschen, obwohl
unilamellare Bläschen und Bläschen aus anderem Material als aus
Phospholipiden verwendet werden können, wobei das
wesentliche Grundkriterium das ist, daß das Bläschenmaterial vom
Wirt in den verabreichten Mengen vertragen wird.
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Die zum Suspendieren der Bläschen verwendete Lösung
ist bevorzugt physiologische Kochsalzlösung (ca. 0,15 M
Nacl), der der Zucker oder das Polypeptid zugesetzt wurde,
um die Konzentration dieser Lösung auf einen hypertonischen
Wert einzustellen, der zu der gewünschten
Freisetzungsgeschwindigkeit führt. Diese Konzentration wird so
eingestellt, daß die Osmolarität der suspendierenden Lösung mit
der Lösung innerhalb der Bläschen hypertonisch ist. Weil
somit der Lösungsbestandteil der suspendierenden Lösung
zugesetzt wird, wird deutlich, daß die suspendierende Lösung
eine größere Osmolarität hat als diejenige physiologischer
Kochsalzlösung.
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Der zugesetzte Lösungsbestandteil ist ein Zucker wie
beispielsweise Dextrose oder Hexosen wie beispielsweise
Glukose und Polypeptide, die keine signifikanten
biologischen Wirkungen zeigen. Augenblicklich bevorzugt ist
Glukose, weil sie leicht als Sterilsubstanz zur Verabreichung
an Menschen verfügbar ist und vom Körper leicht absorbiert
wird.
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Als Teil der Erfindung kann jedes beliebige aus einem
weiten Bereich therapeutische Mittel eingesetzt werden.
Unter diesen sind Antibiotika, metabolische Regulatoren,
Immunmodulatoren, Toxin-Antitoxine etc. zu erwähnen. Die
Erfindung ist beispielsweise geeignet für die gesteuerte
Freisetzung von Antitoxinen gegenüber
Cholesterinesteraseinhibitoren.
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Zur Demonstration der Vorteile der Erfindung folgt
eine Beschreibung von Versuchen, die durchgeführt wurden
mit in Bläschen verkapseltem 2-Pralidoximchlorid (2-PAMCl),
ein Mittel, welches ein bekanntes und gründlich studiertes
Antitoxin gegenüber toxischen Organophosphaten ist, die
Cholesterinestease inhibieren. Personen, die solchen
Intoxikanten in letalen Mengen ausgesetzt werden, erleiden
Herzinsuffizienz oder respiratorische Paralyse, die zum Tod
führt. Mittel wie 2-PAMCl reaktivieren Cholinesterase, wenn
sie rechtzeitig gegeben werden. Jedoch können
2-PAMCl-Dosen, die ausreichend sind, den therapeutischen Wert
genügend lange aufrechtzuerhalten, nicht gegeben werden, weil
dies zu unerwünschten Nebenwirkungen und selbst zum Tod
führen kann.
Experimentelle Ergebnisse
A. Materialien
L-α-Distearoylphosphatidylcholin (DSPC)
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L-α-Dipalmitoylphosphatidylchol in (DPPC) von
Calbiochem und Cholesterin (Chol), Stearylamin (SA) und
Dicetylphosphat (DCP) von Sigmar Chemical Company wurden zum
Herstellen der Bläschen ohne weitere Reinigung verwendet. 2-
Pyridinaldoxim (2-PAM), Pralidoximchlorid (2-PAMCl) und
Iodmethan wurden von Aldrich Chemical Company erhalten, und
AG 1·8-Ionenaustauschharz wurde von BioRad Laboratories
(Richmond, CA) erhalten. Ultrareines InCl&sub3; wurde von der
Ventron Corporation (Danvers, MA) erhalten.
[³H]-Cholesterinoleat (spezifische Aktivität 52 Ci/mol) und
[¹&sup4;C]-Iodmethan (spezifische Aktivität 10 Ci/Mol) wurden von New
England Nuclear erhalten. Trägerfreies ¹¹¹InCl&sub3; wurde von
Medi-Physics (Glendale, CA) erhalten und gemäß dem
Verfahren
von Hwang and Mauk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74,
4991 (1977) gereinigt. Das Ionophor A23187 stammte von Eli
Lilly and Co. Sprague-Dawley-Ratten im Bereich von 200 bis
250 g wurden von Charles River Laboratories erhalten und
vor Verwendung für die Versuche eine Woche lang in einem
AAALAC-zugelassenem Labor gehalten.
B. Methoden
Herstellung von Bläschen
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Kleine unilamellare Bläschen (SUV) wurden hergestellt,
indem das Lipidgemisch in phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS) die entweder Nitrilotriessigsäure (NTA) oder 2-PAMCl
enthielt, mit einer Sonde beschallt wurden; siehe Mauk et
al, Anal. Biochem., 94, 302, 307 (1979). Dem Lipidgemisch
wurde als Markierer für die Lipidphase eine Tracermenge
[³H] Cholesterinoleat zugesetzt. Mach der Beschallung, dem
Tempern und einer Zentrifugation bei niedriger
Geschwindigkeit wurde die NTA außerhalb der Bläschen entfernt, indem
die Präparation über eine Sephadex G-50-Säule geleitet
wurde, die mit mit PBS äquilibriert war.
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Mit dem Verfahren der Umkehrphasenverdampfung (REV)
welches von Szoka und Papahajopoulos, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 75, 4194 (1978) beschrieben wird, wurden große
unilamellare Bläschen (LUV) hergestellt. REV-Bläschen
bilden sich, wenn ein wäßriger Puffer, der das zu verkapselnde
Material enthält, in ein Gemisch aus Phospholipid und
organischem Lösemittel eingeleitet wird und das organische
Lösemittel anschließend durch Verdampfen bei vermindertem
Druck entfernt wird. Die REV-Bläschen werden dann durch
eine Gelpermeations-Säule zum Entfernen des
Lösemittelrückstands und des nicht verkapselten Arzneimittels geleitet.
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Multilamellare Bläschen (MLV) wurden hergestellt durch
Rühren des trockenen Lipidfilms mit dem zu verkapselnden
Material. Freie, nicht verkapselte Materialien können von
MLV-verkapseltem Material durch Zentrifugieren bei 12.000 ·
g entfernt werden. Bei unserer Präparation der MLV für die
in vivo-Injektion wurden 40 mg DSPC:Chol (molares
Verhältnis 2 : 1) (oder andere Zusammensetzungen wie angegeben) ½
Stunde lang in einem Rundkolben mit 1 bis 2 ml PBA gerührt,
welches wie angegeben 0,5 M 2-PAMCl oder 3 M 2-PAMCl
enthielt.
Synthese von [¹&sup4;C] 2-PAMCl
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Radiomarkiertes 2-PAMCL für den Einsatz in diesen
Studien konnte von keiner Quelle erhalten werden. Das
radiomarkierte Arzneimittel wurde deshalb synthetisiert.
[¹&sup4;C]markiertes 2-Pralidoximiodid (2-PAMI) wurde zuerst
synthetisiert, indem 2-Pyridinaldoxim (2-PAM) mit
[¹&sup4;C)-Methyliodid in Nitrobenzol drei Stunden lang bei 75 bis 80ºC am
Rückfluß gehalten wurde. Die Reaktion wurde dann
abgebrochen, und der gelbe Niederschlag von 2-PAMI wurde filtriert
und aus Methanol umkristallisiert. Diese gelben Kristalle
von 2-PAMI wurden dann in einer geringen Menge Wasser
gelöst-und durch eine anionische Austauschersäule (BioRad AG
1·8) geleitet. Das Chloridsalz des 2-PAM wurde isoliert,
indem die Lösung in einem Rotationsverdampfer getrocknet
und in dem im Anschluß daran aus Methanol umkristallisiert
wurde. Es wurden etwa 1,5 g reines [¹&sup4;C)-markiertes 2-PAMCl
mit einer spezifischen Aktivität von 25 uCi/Mol erhalten.
Die chemische Identität dieses Materials wurde bestätigt
durch (1) den Schmelzpunkt der Verbindung, für den 232 bis
234ºC gefunden wurde (Literaturwert 235ºC) und (2) die
charakteristische Absorption einer sauren Lösung von 2-
PAMCl bei etwa 295, 245 und 210 nm; und (3) durch die Co-
Migration bei der Dünnschichtchromatographie der
¹&sup4;C-markierten Verbindung mit 99% reinem 2-PAMCl.
Bläschenstudien in vitro
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Die chemische Struktur von Bläschen wurde geändert,
indem die Länge ihrer Phosphatiylcholin-Kohlenstoffkette,
der Cholesteringehalt und die Oberflächenladung verändert
wurden. Die Stabilität der Bläschenformulierungen in vitro
wurde durch Röntgen-PAC-Spektroskopie (pertubed angular
correlation spectroscopy, PAC) studiert, wie beschrieben
von Hwang and Mauk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4991
(1977). Vor den PAC-Messungen wurden die Bläschen mit
¹¹¹InCl&sub3; beladen. Typischerweise wurden 1,0 mg Bläschen mit
innerhalb der Zweifachschicht eingebautem Ionophor A23187
45 Minuten lang bei 80ºC inkubiert. Während der Inkubation
lief das ¹¹¹In durch das Ionophor und komplexierte mit NTA
im Inneren der Bläschen. Das verbleibende ¹¹¹In außerhalb
der Bläschen wurde anschließend mit EDTA komplexiert und
von den belasteten Bläschen abgetrennt, indem das Gemisch
auf einer Sephadex G-50-Säule chromatographiert wurde, die
mit PBS äquilibriert war. Die nunmehr mit ¹¹¹In-NTA
beladenen Bläschen wurden dann in einer 1 : 1-Lösung aus
physiologischer Kochsalzlösung und Rattenplasma suspendiert.
Es wurde dann die Röntgen-PAC-Spektroskopie eingesetzt, um
die strukturelle Integrität aufzuzeichnen, indem die
Taumelrate von ¹¹¹In&spplus;³ gemessen wurde.
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An Nitrilotriessigsäure chelatiertes ¹¹¹In&spplus;³ zeigt
eine schnelle Taumelrate. Beim Zerbersten der Bläschen
bindet sich das freigesetzte ¹¹¹In&spplus;³ schnell mit
Markomolekülen im umgebenden Medium und zeigt eine merkbar
herabgesetzte Taumelrate. Wiederholte PAC-Messungen mit jeder
Bläschenformulierung wurden dazu verwendet, die
Bläschenstabilität auf der Grundlage des Zeitverlaufs für die
Freisetzung von ¹¹¹In abzuschätzen.
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In ähnlicher Weise wurden identische, mit [¹&sup4;C]-2-
PAMCl beladene Bläschenformulierungen zum Messen der
Freisetzungsgeschwindigkeit von 2-PAMCl verwendet. Aus jeder
Präparation wurden periodisch Aliquote abgezogen und freies
2-PAMCl vom mikroverkapselten Arzneimittel durch
Gelfiltrationschromatographie abgetrennt, wie es beschrieben ist von
Huang, Biochem., 8, 344 (1969). Die in den Bläschen
verbleibende Menge an [¹&sup4;C)-2-PAMCl wurde durch
Flüssigscintillationszählen gemessen.
Bläschenstudien in vivo
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Die Freisetzungsgeschwindigkeit von [¹&sup4;C]-2-PAMCl aus
unterschiedlichen Bläschenformulierungen wurde in vivo
gemessen unter Verwendung von männlichen
Sprague-Dawley-Ratten, die von Charles River Inc. erhalten wurden.
Dosierungen im Bereich von 5 bis 240 mg/kg Körpergewicht (BW) des
freien und verkapselten [¹&sup4;C]-2-PAMCl wurden in den
Oberschenkelmuskel
injiziert. Die einzelnen Injektionsvolumina
überschritten 0,15 ml in keinem Fall. Zu vorgeplanten
Zeiten nach der Injektion wurden die Ratten entweder getötet
oder durch die Augenhöhle ausgeblutet. Radiomarkiertes 2-
PAMCl wurde in Blut und in Plasma durch
Flüssigscintillationszählung gemessen unter Verwendung des New England
Nucelar-Verfahrens zum Zählen von markiertem biologischen
Naterial; siehe L.S.C. Note # 44, New England Nucelar
Application Laboratory, Boston, NA.
C. Ergebnisse
Bläschenstabilität in vitro
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Wie im vorangegangenen Abschnitt angedeutet, kann die
Freisetzungsgeschwindigkeit von ¹¹¹In aus Bläschen in
Gegenwart von Plasma mit Hilfe der PAC-Spektroskopie
aufgezeichnet werden. Fig. 1 zeigt die verkapselt bleibenden
Prozente des ¹¹¹In für sieben Bläschenformulierungen, die
bezüglich der Cholesterinkonzentration, der Länge der
Kohlenstoffkette und der Oberflächenladung variierten. Mit
Ausnahme der negativ geladenen DCP-Bläschen zeigen alle
Bläschenformulierungen mit 33 Mol-% oder mehr Cholesterin
die gleiche Übergangstemperatur, wie durch die
¹¹¹In-Freisetzung gezeigt wird. Die DCP-Formulierung erzeugte
Bläschen mit einer Übergangstemperatur (¹¹¹In-Freisetzung) die
etwa 10ºC höher war als andere Bläschenformulierungen, die
die gleiche Menge Cholesterin enthielten.
Ergebnisse in vivo
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Bei den nachfolgenden Ergebnissen werden die Daten als
die 2-PAMCI-Konzentration als Funktion der Zeit für
unterschiedliche Bläschenformulierungen angegeben. Die
Zeitabhängigkeit für eine Standardinjektion von freiem 2-PAMCI
zeigt, daß die Blutkonzentration in 2 bis 3 Stunden (Fig.
6A) unter den therapeutischen Wert (therapeutic level, TL)
abfällt. Wie gezeigt werden wird, zeigten alle
Bläschenformulierungen mit verkapseltem 2-PAMCl erweiterte Blutwerte.
Die therapeutischen Werte von Arzneimitteln wurden
typischerweise 6 bis 8 Stunden für diejenigen Formulierungen
aufrechterhalten, die als suspendierendes Medium nur
gepufferte
Salzlösung hatten. Bläschen, die in einem Medium
hoher Osmolarität suspendiert sind, zeigten dramatisch
längere therapeutische Werte.
Auswirkung einer Veränderung der chemischen
Zusammensetzung der Bläschenmembran
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Ein Verändern der Membranfluidität durch Veränderung
der Lipidzusammensetzung zeigte keine Auswirkung auf die
mit allen Bläschenformulierungen (Fig. 2) erreichte
verlängerte Freisetzungszeit. In ähnlicher Weise ergab eine
Veränderung der Lipidzusammensetzung und der Ladung der
Bläschenmembran ebenfalls keine signifikante Veränderung der
Freisetzungszeit (Fig. 3).
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Unter den studierten Bläschenzusammensetzungen und
Ladungsvariablen war der Cholesteringehalt der einzige
Faktor,der eine Auswirkung auf die
Freisetzungsgeschwindigkeit für 2-PAMCl zeigte. Eine Zunahme des
Cholesteringehalts der Bläschenmembranen von 12,5 bis 50,0 Mol-% schien
geringfügig die Zeitspanne zu verlängern, über die
therapeutische Werte von 2-PAMCl im Kreislauf verblieben (Fig.
4).
Auswirkungen einer Veränderung der physikalischen
Struktur von Bläschen
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Die Auswirkung der Bläschenstruktur auf die
verlängerte Freisetzung von 2-PAMCl wurde unter Verwendung von
multilamellaren Bläschen (MLV) und großen unilamellaren
Bläschen (LUV) untersucht, die mit Hilfe von
Umkehrphasenverdampfung (REV)-Bläschen hergestellt waren. Wie in Fig. 5
gezeigt ist, zeigten DSPC:Cholesterin-Bläschen, die die
zwei bestimmten Strukturen aufwiesen, im wesentlichen
identische Eigenschaften im Hinblick auf die
2-PAMCl-Freisetzung. Infolgedessen wurden bei den nachstehend
beschriebenen Studien mit hoher Osmolarität MLV verwendet, die 30
Mol-% Cholesterin enthielten.
Auswirkungen einer Veränderung des verkapselten
Volumens und des Einsatzes von Suspendierungslösung mit
hoher Osmolarität
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Die obigen Daten zeigen, daß es für die getesteten
Formulierungen vergleichsweise geringe Änderungen an der
Zeitabhängigkeit von 2-PAMCl-Blutwerten gibt. Die
Ergebnisse deuten darauf hin, daß eine einfache Manipulation an
der Bläschenzusammensetzung und -morphologie wahrscheinlich
keine verlängerte Freisetzung jenseits von 6 bis 8 Stunden
ergeben. Diese Ergebnisse sind konsistent mit anderen
veröffentlichten Beobachtungen, die mäßige verlängerte
Freisetzungszeiten zeigen.
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Die nachfolgenden Ergebnisse zeigen, daß die Blutwerte
von 2-PAMCl dramatisch verlängert werden können, wenn man
die Osmolarität des Mediums erhöht, indem die Bläschen
suspendiert sind. Weiter können proportional höhere
Konzentrationen des Arzneimittels verkapselt werden, ohne aus den
Bläschen auszutreten.
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Die wirksamsten Bläschenformulierungen zum Verlängern
der therapeutischen Plasmawerte (4,0 ug/ml Plasma) in
Ratten wurden in einem 2 : 1 DSPC:Cholesterin-Lipidgemisch
aufgefunden, welches als MLV ausgebildet und eine 3-molare
Lösung [¹&sup4;C]-2-PAMCl verkapselt hatte, die in einer
isomolaren Glukose-physiologische Kochsalzlösung (Glukose 3M)
suspendiert war, nach Aufarbeiten der Mutterlauge. In diesem
Fall beträgt die Osmolarität des suspendierenden Mediums
etwa 60% der Osmolarität des verkapselten Arzneimittels.
Intramuskuläre Injektionen (0,15 ml) dieser
Bläschenformulierungen verlängerten den therapeutischen Plasmawert des
Arzneimittels von den mit der herkömmlichen
Kochsalzformulierung erhaltenen 2 ¼ Stunden (Fig. 6A) auf mindestens 40
Stunden (Fig. 6B). Tiere, die die isomolare
Bläschenformulierung erhielten, zeigten keine toxischen Symptome, und
ihre Blutwerte des Arzneimittels überstiegen niemals den 20
ug/ml-Wert, den die Vergleichstiere erreichten, die die
Standard - 12 mg 2-PAMCI-Kochsalzformulierung erhielten
(Fig. 6A).
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Die Verlängerung therapeutischer Blutwerte hängt mit
der Menge des verkapselten Arzneimittels zusammen. Alle
Verkapselungsverfahren verlängerten den aufrechterhaltenen
therapeutischen Wert des Arzneimittels. Ein Verdoppeln des
verkapselnden Lipidmaterials von 2,5 auf 5,0 mg durch
Verdoppeln der Lipidmenge (und dadurch Erhöhen des
verkapselten Volumens der Arzneimittellösung) erhöhten die Zeit,
über die die therapeutischen Werte aufrechterhalten wurden,
von 2,5 auf 7,0 Stunden (Fig. 6, C, D). In ähnlicher Weise
verhinderte eine Zunahme der Arzneimittelmenge, die aus
einer Kochsalzlösung verkapselt wurde, welche 60 mg 2-PAMCl
enthielt, alle akuten toxischen Symptome und verlängerte
die therapeutischen Bluttiter auf 15 Stunden (Fig. 6E).
Alle Tiere, die ähnliche 60 mg-Injektionen von 2-PAMCl
erhielten-, welches in Kochsalzlösung verkapselt war oder mit
einem Verfahren verkapselt war, welches die
Verkapselungseffektivität herabsetzt, starben innerhalb von 30 Minuten
nach- der Injektion.
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Diese Daten zeigen, daß das verkapselte Arzneimittel
als dritter Bereich wirkt, aus dem dessen langsame
Freisetzung den Spitzen-Blutwert erniedrigt, den man sieht, wenn
gleiche, nicht verkapselte Dosierungen injiziert werden.