DE3447720A1 - Verfahren zum behandeln cerebraler ischaemie - Google Patents

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Yoshio Hosobuchi, 116 Kinross Avenue, San Rafael, California 94901, U.S.A.; Nancy M. Lee, 1830 Funston Avenue, San Francisco, California 94116, U.S.A.; Horace H. Loh, 54 Mendosa, San Francisco, California 94116, U.S.A.; Jaw-Kang Chang, 90 Curtis Court, San Carlos, California 94070, U.S.A.

Verwendung eines opiumartigen Peptids als Mittel zur Behandlung von cerebraler Ischämie

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer wirksamen Menge eines opiumartigen Peptids als Mittel zur Behandlung von cerebraler Ischämie.

Allgemein bezieht sich die vorliegende Erfindung also auf die Verwendung eines opiumartigen Peptids als Mittel zur

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BOEHMERT & BOEHMERT

NACHOrf .-!LlCHTj

Behandlung von Ischämie, insbesondere auf den Einsatz von Dynorphin bei der Umkehr neurologischer Defizite und bei der Verlängerung der Überlebenszeit nach cerebraler Ischämie.

Nach dem viele Infektionskrankheiten durch die medizinische Wissenschaft steuerbar wurden oder eliminiert worden sind, blieben chronische Krankheiten, wie Herzanfälle, Schlaganfälle und Krebs als Hauptursachen des Todes. Wenn aufgrund eines Schlaganfalles nicht der Tod eintritt, ist das Opfer häufig schwer behindert. Die .Todesrate für Schlaganfallopfer liegt in den Vereinigten Staaten über 2 pro 1000. Die Japaner, die einen der niedrigsten Todesindizes von Herzkrankheiten haben, besitzen einen der höchsten aufgrund von Schlaganfällen.

Es sind verschiedene unterschiedliche Verbindungen als nützlich bei der Behandlung von Schlaganfällen vorgeschlagen worden. Beispielsweise scheint es, daß Aspirin das Risiko von vorübergehenden ischämischen Anfällen, oder kleinen Schlaganfällen, und Todesfällen aufgrund von Schlaganfällen reduzieren kann. Das US-Patent 4 256 883, Erfinder Nicolaou et al,

herausgegeben am 17. Mai 1981, umfaßt Prostacyclinanaloga, van denen behauptet wird, daß sie bei vasculären Verengungen und bei mit essentiellem Hochdruck auftretenden cerebralen Schlaganfällen nutzbringende Eigenschaften besäßen. Das US-Patent 4 364 951, Erfinder Skruballa et al, herausgegeben am 21. Dezember 1982, beschreiben Prostacycline, von denen behauptet .wird, sie besäßen unter anderem zur Behandlung van Schlaganfällen nützliche Eigenschaften. Das US-PS 4 394 385, Erfinder Cragoe, herausgegeben am 19. Juli 1983, umfaßt die Verwendung von Benzofuranyl-CKvessigsäuren und enzündungshenmenden Steroiden, von denen behauptet wird, daß sie bei der Steuerung von Ödemen aus ischämischen Schlaganfällen einsetzbar seien.

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BOEHMERT & BOEHMERT

NACH«3EREICHTJ

Es ist kürzlich mitgeteilt worden, daß der Opiat antagonist Naloxon neurologische Defizite, die sekundär bei cerebraler Ischämie auftreten, umkehren kann,.während Morphin diese verschlimmert. Baskin und Hosobuchi "Naloxone reversal of ischaemic neurological deficits in man". Lancet 2, Seiten 272 bis 275 (1981). Es ist auch berichtet worden, daß neurologische Defizite, die durch eine unilaterale Carotis-Unterbrechung in qerbilles hergestellt werden, durch i nt r ape ri t onea I e Gabe von Naloxon reversibel sein kämen. Eosobuchi et al "Reversal of induced ischemic neurologic deficit in gerbils by the opiate antagonist naloxone" Science 215, Seiten 69 bis 71 (1982).

Levy und al haben nun berichtet, daß die Behandlung mit Naloxon keine verbesserten neurologischen Funktionen brachte oder Infarktgröße in gerbillis veränderte, die einem zeitweiligen Ca rotisversehIuß unterzogen worden waren, ("Failure of naloxone to limit clinical or morphological brain damage in gerbils with unilateral carotis artery occlusion". Abstracts of the 12th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, Seite 248 (1982).) In ähnlicher Weise haben HoLaday und D'Amato berichtet, daß Naloxon keinen günstigen Effekt auf das überleben oder die neurologische Funktion in verschiedenen unterschiedlichen Modellen eines Schlaganfalls bei gerbillees hatte ("Naloxone or TRH fails to improve neurologic deficits in gerbil models of 'stroke¹," Life Science 31, Seiten 385 bis 392 (1982).)

BOEHMERT & BOEHMEKT-

■ — & —

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Möglichkeit zur Behandlung von an Ischämie, wie akuter oder nicht akuter Cerebralischämie, leidenden Patienten zu schaffen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die beanspruchte Verwendung nach dem Hauptanspruch gelöst.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.

Es ist bevorzugt, dem Patienten zur Behandlung aufeinanderfolgende Dosen des vorgeschlagenen Mittels zu geben. Besonders bevorzugte opiumartige Peptide sind Dynorphin (1-13) und Dynorphin (1-10) Amid. Die Durchführung der vorliegenden Erfindung mit an akuter fokaler cerebraler Ischämie leidenden Patienten ist einsetzbar zur Verlängerung der Überlebenszeit, und es wird angenommen, daß es besonders nützlich bei der partiellen Reversibilität neurologischer Schaden, die von cerebraler Ischämie stammen, ist.

Seit der Entdeckung von Opiatrezeptoren im Zentralnervensystem ist angenommen worden, daß endogene Opiat-Liganden der Funktion des Zentralnervensystems sowohl bei gesunden als auch bei kranken Zuständen eine Rolle spielen. Die Aufmerksamkeit der Forschung hat sich dabei hauptsächlich auf die Rolle dieser Substanzen bei der Modulation der Wahrnehmung von Schmerz-Stimuli konzentriert, sie hat sich aber auch mit der Hypophysen-Funktion, epileptischen Störungen und Geisteskrankheit beschäftigt.

BOEHMERT & BOEHMERT

NAOHQEREIOHl

Opiutnartige Peptide werden im Kreislaufsystem, wahrscheinlich von der Hypophyse (Imura et al, Ann Rev. Physiol. A3, Seiten 265 bis 278 (1981), Nebennierenmark (Viveros et al, Adv. Biochem. Psychopharmaco I . 22, Seiten 191 bis 2OA (1980), Herz (Lang et al, Life Sei. 32, Seiten 399 bis A06 (1983) und Darm (Eide et al, Neuroscience 1, Seiten 3A9 bis 357 (1976); Polak et al. Lancet 1, Seiten 972 bis 97A (1977); ALumets et al, Hi stochem.56, Seiten 187 bis 196 (1978)), stammend, gefunden.

Die überwiegende Theorie ist, daß die meisten Wirkungen opiumartiger Drogen im Zentralnervensystem eintreten (das heißt, innerhalb des Gehirn oder des Rückenmarkstranges). Nichtsdestoweniger gibt es Beweise, daß endogene opiumartige Peptide die Empfindlichkeit der peripheren Nerven gegenüber Stimuli, die Herzrate und Blutdruck beeinflussen, gefunden wurden, und es wird angenommen, daß zirkulierende opiumartige Peptide unter normalen Bedingungen die Steuerung der Empfindlichkeit dieser peripheren Orte des autonomen Nervensystems gegenüber solchen endogenen Substanzen bewirken.

Endogene opiumartige Peptide können in3" Klassen gruppiert werden: beta-Endorphiη und bestimmte ähnliche Verbindungen; die Enkephaline, welche die kleinsten opiumartigen Peptide sind; und Dynorphine, a Ipha-Neo-Dynorphiη und ihre verwandten Peptide. Vjan diesen drei Typen scheint beta-Endorphin

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BOEHMEIU & HOEH M£Ri*

-JS-

dasjenige mit den nor phinähnIichen Effekten am meisten verwandte zu sein. Intracerebroventrikuläre (i.c.v.) Gabe dieses Peptids führt zu Schmerz Iosigkeit, wobei sowohl sich die Toleranz als auch die physische Abhängigkeit nach verlängerter Behandlung entwickeln; außerdem wird Kreuztoleranz und Kreuzabhängigkeit ähnlich wie bei Morphin beobachtet. Im Gegensatz dazu ist über die Gabe der natürlichen Enkephaline, Leucin-(leu) und Methionin-(met)EnkephaIiη geschrieben worden, daß sie nur eine sehr schwache oder keine analgesische Wirkung, wenn sie i.c.v. gegeben werden, besitzen.

Dynorphin wurde zuerst aus den Hypophysendrüsen isoliert und die Sequenz seiner ersten 13 N-terminalen Aminosäuren bestimmt; dieses Fragment ist synthetisiert worden und seine Eigenschaften wurden gemeinsamen mit denjenigen der vollständigen 17 Aminosäuresequenz der natürlichen Verbindung untersucht. Die ersten 13 Aminosäuren von Dynorphin, oder Dynorphin (1-13) haben die Sequenz:

TYR-GLY-GLY-PHE-LEU-ARG-ARG-ILE-ARG-PRO-LYS-LEU-LYS 1 2 3 A 5 6 7 8 9 10 11 12 13

i
Das N-terminale Ende enthält L EU-Enkephalin (die Aminosäuren, die mit 1 bis 5 numeriert wurden), gefolgt durch die C-terminale Jjp rt seizing (die mi-fc—is bi s 13 numerierten Aminosäuren). Der Einschluß von LEU-Enkephalin. wurde für notwendig als biologisc~he"s "ho'mi ng-devi ce" für die Akt i vi iSt gehailten, wobei angenommen wurde, daß die Länge der Fortsetzung nachLEU-Enkephalin kritisch für seine Wirksamkeit sei.

Dynorphin besitzt wenig oder keine ana Igetise hen Wirkungen bei Mäusen. Während dieses Fehlen einer Wirkung ursprünglich raschem Abbau des Dynorphins im Gehirn zugeschrieben wurde, ist gezeigt worden, daß Dynorphin andere pharmakoIogise he Wirkungen zeigte, die anzeigten ,daß es lang genug zum Hervorrufen einer Schmerzlosigkeit intakt bleiben sollte. Demzufolge

BOEHMERT & BOEHMEKT

NACHQITREiCHr

beschreibt das US-PS A 361 553, Erfinder: Loh et al, herausgegeben am 30. November 1982, daß obwohl Dynorphin das analgetische Antwortsverhalten auf Morphin und beta-Endorphiη verhindert oder als ihr Antagonist wirkt, den ept gegengesetzten Effekt bei toleranten Tieren hat. D.h., daß Dynorphin die analgetische Wirkung sowohl von Morphin als auch von beta-Enordphin bei morphintoleranten Tieren potenziert. Dynorphin benimmt sich somit weder als klassicher Agonist noch als Antagoni st.

Es ist kürzlich berichtet worden, daß Dynorphin (1-10) Amid nicl· gegen die narkotische SchmerzIosigkeit bei nicht toleranten Tieren (wie Dynorphin(1-17) und Dynorphin(1-13)wirkt, obwohl dieses die analgetische Wirkung in toleranten Wirten potenziert. Woo et al, Life Sciences 31, Seiten 1817 bis 1882 (1982) als Antagonist wirkt.

Im Gegensatz zu den in vivo opiumartigen Eigenschaften eines opi uma rt i-gen-Pept-ids wie -Dynorphin, benimmt-s i ch Naloxon (17-AlIyL-A-5 <k -Epoxy-3,14-Dihydroxymorphinan-6-on) als klassischer narkotischer Antagonist. Andere nichtpeptidisehe Narkotika umfassen Naltrexon, Nalorphin, Diprenorphin, Lavallorphan, Pentazocin, Metazocin, Cyclazocin und Etazocin.

Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zur Behandlung von an cerebraler Ischämie leidenden Patienten durch die Gabe eines opiumartigen Peptids. Geeignete erfindungsgemäße opiumartige Peptide umfassen Dynorphin, Dynorphinanaloga und Dynorphinamidanaloga.

Bevorzugte opiumartige Peptide für die Durchführung der vorliegenden Erfindung sind die Polypeptide mit der Aminosäuresequenz TYR-GLY-GLY-PHE-LEU-ARG-ARG-AA⁸-AA⁹-AA¹⁰-(AA¹¹) ,

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wobei AA TYR, ILU, LEU oder LYS ist, AA ARG oder PRO ist,

AA PRO oder LYS ist, AA¹¹ LYS, LYS-LEU oder LYS-LEU-LYS ist, w 0 oder 1 ist, und wobei das Polypeptid in Säure-oder amidierter Form vorliegt. Zwei besonders bevorzugte Ausfüh-

BOEft^ERT & 1"

rungsformen für die Durchführung der vorliegenden Erfindunq sind Dynorphin (1-13) und Dynorphin (1-10) Amid.

Die Herstellung geeigneter Dynorphin-und Dynorphin-verwandter Peptide für die Durchführung der vorliegenden Erfindung kann durch Verfahren und Vorrichtungen, die aus Stand der Technik für die Peptidsynthese bekannt sind, durchgeführt werden, wobei das untenstehende Beispiel I (Herstellung von Dynorphin 1-10 Amid) zur Erläuterung dient.

Beispiel I

Dynorphin (1-1O)-NHp wurde auf einem festen Träger von Boc-Pro-BHA (Benzyhydry I amin) Harz (2 mM/4,5 g Harz) synthetisiert. Mittels des Merrifield-Verfahrens auf einem Peninsula manuellen Festphasenpeptidsynthetisierer wurden die entsprechenden Boc-geschut ζten Aminosäuren auf das Boc-Pro-BHA-Harz gegeben: Arg(Tos), ILe, Arg(Tos), Arg(Tos), Leu, Phe, GIy, GIy und Tyr(o-Br-Z).Ei η 5,0 molarer Überschuß jeder geschützten Aminosäure wurde eingesetzt. Der Erfolg der Kopplungsrekation wurde durch den semi-quantitativen Ninhydrintest überwacht. Die nachfolgenden Schritte wurden durchgeführt, um die Boc-geschützte Aminosäure an Boc-Pro-BHA-Harζ anzub i nden:

1) Waschen mit CH₂Cl₂ (3x 100 ml)

2) Vorwaschen mit 3 3 %- ig er Trifluoressigsäure in C H _? C I ρ mit 1 % Indol (1 χ 100 ml)

3) Abspalten der Schutzgruppe mit 33%-iger Trifluoressigsäure in CHpCl mit 1% Indol ( 1 χ 100 ml), 20 Minuten

4) Waschen mit CH Cl, (1 χ 100 ml)

5) Waschen mit Ethylalkohol (1 χ 100 ml)

BOEHNiERT & BOEHM EßT : -

6) Waschen mit CH₂Cl₂ (2 χ 100 ml)

7) Vorwaschen mit 10%-igem Et₃N in CH₂Cl₂ (1x 100 ml)

8) Neutralisieren mit 10%-igem Et₃N in CH₂CIp (1 χ 100 ml), 10 Mi nuten

9) Waschen mit CH₃Cl₂ (3 χ 100 ml)

10) Zugabe von geschützter Aminosäure (5 ,, 0 molarer Überschuß) in Dimethylformamid (10 ml) und CHpCl- (50 ml)

11) Es wurde DCC in CH₂Cl₂ (o,5 M, 20 ml) zugegeben; die Reaktionszeit betrug bis zu drei Stunden.

12) Waschen mit CHpCU (3 χ 100 ml)

Das entstehende geschützte Boc-Tyr(0-Br-Z)-GIy-GIy-Phe-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-I le-Arg(Tos)-Pro-BHA-Harz wurde gut mit 33%-iger Trifluoressigsäure in CHpCIp, C H _? C I _? und Methylalkohol gewaschen. Nach Trocknen unter Vakuum über Nacht wurde das Peptid-Harz durch HF (30 ml/g Harz) in Gegenwart von Anisol (3 ml/g Harz) über eine Stunde bei 0 C gespalten. Die Reaktionsmischung wurde unter Vakuum getrocknet und mit wasserfreiem Äther gewaschen. Das erwünschte Peptid wurde in 10%-iger Essigsäure gelöst und das Harz abgefiltert. Das Filtrat wurde unter Erhalt von rohem Dynorphin(1-10)-NH_ I yophiIisiert. Das Peptid wurde durch Verteilungschromatographie unter Verwendung von N-Butylalkohol : Py rid in : HpO (11:5:3) als E lutions lösungsmi11e I und Carboxymethy l-.celLuloseionenaustauschchromat'ographie gereinigt, um reines Dynorphin (1-10)-NfL zuerhalten.

-sr- M'

Es wird angenommen, daß die Faktoren, die das Antwort ν erhalten gegenüber einer Therapie bei cerebraler Ischgrrie gemäß der vorliegenden Erfindung die Dosierung, beeinflussen, die jj Anwendung und die Dauer der Therapie umfassen.

Der Blutdruck scheint kein Faktor zu sein, der das Therapie-Antwort ve rha I t en bei cerebraler Ischämie gemäß der vorliegenden Erfindung beeinflußt, da eine Blutdruckbeobachtung während der Durchführung der Erfindung keine Änderungen im Herzminutenvolumen, dem systemisehen Blutdruck oder dem cerebralen Blutfluß zeigte.

Bei der Behandlung von an akuter fokaler cerebraler Ischämie leidender Patienten gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Therapie durch Gabe einer Dosis eines geeigneten opiumartigen Peptids begonnen und anschließend die Gabe darauffolgender Dosen weitergeführt.

Die Anfangsdosis kann zwischen etwa 1,0 /jg pro Kilogramm Patientengewicht bis zu etwa 10 mg pro Kilogramm Patientengewicht liegen, bevorzugter bei etwa 100 μg pro Kilogramm Patientengewicht, und kann durch unterschiedliche Mittel, die in Fachgebiet bekannt sind, gegeben werden, wie beispielsweise durch intravenöse Injektion ("I.V."). Nachfolgende Dosen können auch durch verschiedene Mittel, die in dem Gebiet bekannt sind, gegeben werden, wie durch Injektionen oder äußerliche Anwendungen gemeinsam mit einem Arzneimittelträger ; wie Dimethylsulfoxid oder Azon (erhältlich von Nelson Labo- ; ratories). Es ist aber bevorzugt, daß die nachfolgenden Do- ^: sen im wesentlichen kontinuierlich gegeben werden, solange sich der Patient in einer lebensbedrohenden Situation befindet," oder bis .sich der Zustand des Patienten stabilisiert, ^! und m.it einer. Rate zwischen etwa 0,01 μ§ pro Stunde bis etwa j

100 μg pro Stunde durchgeführt wird. Beispielsweise kann kon- ί tinuierliche Infusion durch Verwendung einer implantierten [ Minipumpe oder durch I.V. erfolgen. Wenn sic-h-des Patienten ^!

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BOh FI .NfERT «Κ: BOEHMtTCT*: -

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Zustand stabilisiert können die Dosen schrittweise reduziert oder titriert werden. Abhängig von der Art der Gabe kann das opiumartige Peptid mit einer großen Vielzahl physiologisch akzeptabler Trägermateria Lien, wie wässrige Salzlösung und phosphatgepufferte Salzlösung formuliert werden und kann physiologisch verträgliche Träger, wie Glukose, Mannitol oder ähnliches, einschließen.

Die nachfolgenden experimentellen Verfahren, Materialien und Resultate werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung beschrieben. Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung sind dem Fachmann, an welchen sich die Erfindung richtet, offensichtlich.

Experimentel les

Auf Basis einer Zufallszahltafel wurden erwachsene männliche Katzen einer von sechs Gruppen zugeordnet, die mit: 1. Salzlösung (12 Katzen), 2. Naloxon (13 Katzen), 3. Naltrexon (10 Katzen), A. Diprenorphin (13 Katzen), 5. Dynorphin (1-13) (10 Katzen), und 6. Dynorphin (1-10)Amid (5 Katzen) behandelt werdi Die Katzen wurden mit 50 mg Ketamin, das intramuskulär gegeben wurde, sediert. Anesthäsie wurde durch eine Mischung von Halothan, Stickoxid und Sauerstoff über eine Maske durchgeführt. Anschließend wurde die Trachea intubiert, aber der Katze Spontanatmung ermöglicht. Anschließend wurde 1 000 000 Einheiten Penizillin G intramuskulär gegeben und die Katzen in einen stereotaktischen Apparat gesetzt. Unter Verwendung der bei Katzen zuerst durch O'Brien und Waltz beschriebenen Technik ("Transorbital approach for occluding the middle cerebral artery without craniectomy", Stroke A, Seiten 201 bis 206 (1973).) wurde ein die Orbitalwand durchdringender Verschluß der rechten mittleren cerebralen Arterie (MCA) durchgeführt.

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Es wurde im supraorbitalen Bereich unter Verwendung von aseptischen Verfahren ein Schnitt angelegt, und die Präparation wurde in einer subperiostealen Ebene entlang der oberen Orbitalwand durchgeführt. Der Augapfel wurde eingeschnitten und sein Inhalt entfernt. Die Ciliararterien υ"·d die ophthalmischen Gefäße wurden mit einer bipolaren C ο a gulationszange bei Vergrößerung mit dem chirurgischen Mikroskop coaguliert. Es wurden gerade und gebogene Mikroscheren verwendet, um die Orbita-Präparation zu vervollständigen, der Augenhöh I eninha 11 wurde herausgesaugt. Ein mikrochirurgischer Bohrer wurde zur Entfernung des optischen Stranges eingesetzt, wodurch das optische ForaKHi vergrößert wurde. Es wurde ein Schnitt in die Dura gelegt und die Carotis-Gabelung freigelegt. Es wurde ein spinnetzartiger Schnitt ausgeführt, um die inneren Carotis-, mittleren Cerebralen, die hintere Verbindungs-(posteriοr communication) und vorderen Cerebra larterien freizulegen. Das Segment der mittleren Cerebralarterie (MCA) proximaL den Lenticulostriatenarterien (MI) wurde mit der bipolaren Zange coaguliert und mit der Mikroschere durchgeschnitten. Der Orbit wurde ausgespült und mit Zahnzement, um Auslaufen von Cereborospina IfIüssigkeit zu verhindern, gefüllt. Die Wunde wurde vernäht, geschlossen und als Verband Colloidinspray aufgebracht.

In der Mittellinie des Lumbarbereichs wurde ein kleiner Schnitt angelegt und eine subkutane Tasche für späteren Einsatz einer osmotischen Pumpe hergestellt, die zur Abgabe von Arzneimittel bei konstantem Volumen ausgelegt war. Dieser Schnitt wurde leicht unter Verwendung eines Vorderstiches vernäht. Es wurde der-Katze erlaubt, aufzuwachen und über 6 Stunden nach dem Verschluß der mittleren Cerebralarterie überwacht. Die neurologische Funktion wurde unabhängig durch zwei Personen überwacht, die keine Kenntnis vom experimentellen Protokoll hatten.

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ΒΟΕΗΜΕκΤ & rtOEHMbRT

Bei einer Blindstudie enthielten die Katzen sodann eine int raperitoneaIe Injektion einer der folgenden Lösungen: 2 ml steriler normaler Salzlösung; 2 ml einer 10 mg pro Kilogramm Lösung Naloxon, gelöst in steriler normaler Salzlösung; 2 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 500 μg Diprenorphin, gelöst in steriler normaler Salzlösung; 2 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 10 mg pro Kilogramm NaL-trexon, gelöst in steriler normaler Salzlösung; 2 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 10 mg pro Kilogramm Dynorphin (1-13), gelöst in steriler normaler Salzlösung; und von 2 ml einer Lösung mit einem Gehalt von 10mg pro Kilogramm Dynorphin (1-10) Amid, gelöst in einer sterilen normalen Salzlösung. 20 Minuten später wurde eine zweite neurologische Bestimmung durchgeführt.

Die Katzen wurden sodann mit 50 mg intramuskulär gegebenem Ketamin sediert und unter Verwendung einer sterilen Technik wurde eine osmotische Pumpe (erhältlich von ALZA Corp., PaIo Alto, CA) in die vorher hergestellte subkutane Tasche im Lumbarbereich implantiert, um entweder Salzlösung mit 15ul P^ro Stunde, Diphenorphen mit 100 pg pro Stunde, Naloxon mit 5 mg pro Kilogramm pro Stunde, Naltrexon mit 1 mg pro Kilogramm pro Stunde, 50 /ug pro Stunde Dynorphin (1-13) oder 50 /ug pro Stunde Dynorphin (1-10) Amid abzugeben. Die Untersucher waren wiederum nicht darüber informiert, welche Behandlungsform gegeben wurde.

Neurologische Bestimmungen wurden täglich durchgeführt, solange die Katzen am Leben waren, oder bis sieben Tage abgelaufen waren. 1 000 000 Einheiten Penizillin G wurden täglich intramuskulär gegeben und subkutane Injektion einer hinreichend mit Milchzucker versehenen Ringerlösung lieferte eine angemessene tägliche Flüssigkeitserhaltung. Wenn eine Katze begann zu fressen oder zu trinken, wurde Jie subkutane Flüssigkeitsgabe beendet. Falls eine Katze tot gefunden wurde, wurde eine Kraniektomiedurchgeführt , das Gehirn

BOEHMERT & R0£tiME>X "·.·

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entfernt, und ein Koronar-Schnitt in der Höhe des optischen Chiasma angelegt. Nach sieben Tagen wurden die überlebenden Katzen getötet.

Die Coronarschnitte wurden in eine 2%-ige Lösung von 2,3,5 Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) 25 Minuten in kubiert. TTC ist umfangreich zur Demonstration der Gegenwart und des Ausmaßes eines akuten myocardi sehen Infarktes eingesetzt worden, und gibt eine lebhafte Anzeige des cerebralen Infarkts in akutem Stadium. Das Reaktionsprodukt von TTC und lebensfähigem Gewebe ist ein tiefrotes Formazan, welches normales graues Material tief färbt, während normales weißes Material sich mit geringerer Intensität färbt. Infarkt-Gewebe läßt sich nicht anfärben.

Es wurden Farbschnitte aus den angefärbten Gehirnen angefertigt. Ein Neuropathologe, welcher das experimentelle Protokoll nicht kannte, stellte Aufnahmen der gesamten betroffenen

Hemisphäre und des Infarktbereiches aus projizierten Bildern der Schnitte her. Unter Verwendung eines Digitalisierers wurde der Prozentsatz infarktgeschädigten Gewebes relativ zur gesamten Hemisphäre für beide Bereiche in jeder Katze berechnet, dieses definierte die Infarktgröße.

Die untere Tabelle erläutert die Mortalität in jeder Gruppe als Funktion der Zeit nach Verschluß der Cerebral arterie.

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BOEHNXERT & BOEHMERT- : -

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Tabelle I

weniger als 24-28 48-72 Lebte bis zu 24 Stunden Std. Std. Tagen

Salzlösung 100% 0% 0% 0%

Diprenorphin 84% 8% 8% 0%

Naloxon 54% 15% 0% 31%

Naltrexon 40% 10% 10% 40%

Dynorphin

(1-10) Amid 80% 0% 0% 20%

Dynorph i η

(1-13) 20% 20% 0% 60%

Wie durch die Daten der Tabelle I oben erläutert, starben alle Katzen der Blind- oder Salzlösungsgruppe in weniger als 24 Stunden. Die Gabe von Diprenorphin besaß eine geringfügig lebensverlängernde Wirkung. Sowohl Naloxon als auch Naltrexon verlängerten das überleben. Dynorphin (1-13) verlängerte die Überlebenszeit am besten von allen Gruppen. Obwohl die Mortalitätsratenergebnisse für Dynorphin (1-10) Amid bei der Verlängerung der ÜberLebenszeit weniger eindrucksvoll als für Naloxon, Naltrexon und Dynorphin (1-13) erscheinen, waren die Überlebensbedingungen von hoher Quali· tat und klinisch sehr signifikant.

Die Infarktgröße wurde nicht durch irgendeine angewandte Behandlung verändert und es war eine beträchtlich Ähnlichkeit in den Resultaten zwischen den Gruppen. D.h., es bestand

ΒΌΕΗ.λίΕ&Γ &

4?

kein statistisch signifikanter Unterschied in der Inierktgröße unter den Gruppen.

Während die Erfindung unter Bezugnahme auf eine spezifische Ausführungsform derselben beschrieben wurde, ist verständlich, daß sie we iterer Modifikation fähig ist, und diese Anmeldung soll alle Variationen, Verwendungen oder r-ji^dssunnon der Erfindung umfassen, welche allgemein die Prinzipien der Erfindung befolgen, eingeschlossen solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, die innerhalb bekannte oder übliche Ausführungsformen in dem Fachgebiet, auf welches sich die Erfindung bezieht, fallen, und wie sie auf grundlegende hierin beschriebene Merkmale anwendbar sind, und wie sie in dem Gegenstand der Erfindung und den Schutzbereich der anliegenden Ansprüche fallen.

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Claims (4)

BOEHMERT & BOEHMERT Patentanmeldung P 34 37 720.9 Yoshio Hosobuchi - HXM 1488 -i. Patentansprüche

1. Verwendung einer wirksamen Menge eines opiumartigen Peptids als Mittel zur Behandlung von cerebraler Ischämie.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das opiumartige Peptid die Aminosäuresequenz

TYR-GLY-GLY-PHE-LEU-ARG-ARG-AA⁸-AA⁹-AA¹°-(AA¹¹) , be-

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sitzt, wobei AA TYR, ILU, LEU oder LYS, AA ARG oder

PRO, AA¹⁰ PRO Oder LYS, AA¹¹ LYS, LYS-LEU oder LYS-LEU-LYS ist, w O oder 1 ist, und das opiumartige Peptid in Säure oder amidierter Form vorliegt.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das opiumartige Peptid Dynorphin(1-13) oder Dynorphin (1-10) Amid ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,

daß das Dynorphin die Aminosäuresequenz TYR-GLY-GLY-PHE-LEU-

ARG-ARG-AA⁸-AA⁹-AA^1O-(AA¹¹) , besitzt, wobei AA⁸ TYR, ILU,

q w in LEU oder LYS ist, AA ARG Oder PRO, AA PRO oder LYS ist, AA LYS, LYS-LEU oder LYS-LEU-LYS ist, und W O oder 1 ist, und in Säure oder amidierter Form vorliegt.

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