DE3346283A1

DE3346283A1 - Neue peptidartige verbindungen und ihre derivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie diese verbindungen enthaltende pharmazeutische mittel

Info

Publication number: DE3346283A1
Application number: DE19833346283
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Nagaokakyo Enomoto; Yoji Otsu Shiga Ezure; Katsushige Muko Ikai; Hiroyuki Shiga Kuroda; Teruya Kusatsu Shiga Nakamura; Susumu Sano
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd; Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd; Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1982-12-25
Filing date: 1983-12-21
Publication date: 1984-07-19
Also published as: US4554289A; GB8332164D0; IT8349565A0; FR2538387B1; GB2135668B; GB2135668A; FR2538387A1; IT1212908B

Description

Neue peptidartige Verbindungen und ihre Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Mittel

Die Erfindung betrifft neuartige physiologisch wirksame peptidartige Verbindungen, deren Derivate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie schließlich pharmazeutische Mittel, die diese Verbindungen als Wirkstoffe enthalten.

Die Erfindung ist somit auf Verbindungen der allgemeinen Formel (i) gemäß Patentanspruch"1 und ihre Salze sowie auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie auf pharmazeutische Mittel gerichtet, die diese enthalten. ·

Zu den Verbindungen der Formel (i) gehören Verbindungen der allgemeinen Formel (il) gemäß Patentanspruch 2, und diese wiederum sind in die Verbindung (ill) gemäß Patentanspruch und in Verbindung (iv) gemäß Patentanspruch k eingeteilt.

OR'

CH-Y

' ι

CO -NH-CH- CO-NH HC-OR⁵

i ^(I)

NtL-CH

CO-NH-

CONH_r

OCH

NH-CH
² '

CH-COOH

CO-NH-CH-CO-NH

CHOH
t

CONH- (III)

CO-NH-CH-CO-NH' CHOH CONH,

CH-COOH

(IV)

COPY

Im Rahmen der Erfindung wurden neuartige physiologisch wirksame Substanzen gesucht, die von Mikroorganismen produziert werden, und es wurde gefunden, daß neue physiologisch wirksame Substanzen, die die Aminopeptidase-B-Aktivität in hohem Maße unterdrücken, nämlich wasserlösliche und amphotere Substanzen vom Peptidtyp der vorstehenden allgemeinen Formel (il) mit der Bezeichnung QY^h^h^ von aus dem Erdboden isolierten Mikroorganismen der Gattung Penicillium produziert werden.

Fegen seiner OF4°-^9 produzierenden Eigenschaften wurde der vorliegende Mikroorganismus erfindungsgemäß als "Penicillium rugulosum OF49^9" bezeichnet. Der Mikroorganismus wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry in Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-203 hinterlegt.

Erfindungsgemäß wurden weitere Untersuchungen durchgeführt, die zur Abtrennung von zwei ähnlichen, aber doch unterschiedlichen Substanzen führten, nämlich der Verbindung (ill) (of4949-I) und der Verbindung (iv) (OF4949-II), die aus der obigen Verbindung (il) resultieren. Aufgrund der physikalischen chemischen und biologischen Eigenschaften konnte sichergestellt werden, daß die Verbindung (ill) und die Verbindung (IV) neue physiologisch wirksame Substanzen mit derselben chemischen Struktur sind,mit Ausnahme eines Substituenten. Sodann wurden verschiedene Derivate davon synthetisiert, und es wurde erfindungsgemäß sichergestellt, daß die Verbindung (il) und ihre Derivate eine inhibitorische Wirkung gegen Aminopeptidase und eine das Immunsystem beeinflussende Wirkung gegen lebende Organismen aufweisen.

In neuerer Zeit wurde die Anwendung sogenannter das Immunsystem beeinflussender Therapien bei solchen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen (wie Nephritis, rheumatischer Arthritis, allgemeinem Lupus erythematodes u. dgl.) und malignen Tumoren, untersucht und für solche Anwendungen geeignete Arzneimittel erforscht. Beispielsweise wird von Levamisole berichtet, daß

COPV

es als immuntherapeutisches Mittel bei Krebs und als Heilmittel bei Autoimmunerkrankungen, wie rheumatischer Arthritis, einige Wirksamkeit aufweist.

Es wurden noch viele andere das Immunsystem beeinflussende Mittel entwickelt. Hierbei ist jedoch problematisch, daß die meisten von ihnen bei der Langzeitanwendung unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen, so daß zur Zeit zufriedenstellende Therapeutika noch nicht verfügbar sind.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Verbindung (il) und ihre Derivate im Versuch unter Anwendung der verzögerten Hypersensibilität, wie sie durch Inokulieren von Schaferythrozyten als Antigen in die Hinterpfoten von Mäusen verursacht wird, in bemerkenswerter Weise die Zellularimmunität potenzieren. Somit zeigen die Verbindung (il) und ihre Derivate eine das Immunsystem beeinflussende Wirkung und verbessern die Immunitätswerte (immunological computence), so daß sie bei malignen Tumoren und anderen Erkrankungen eingesetzt werden können.

Außerdem weisen die Verbindung (il) und ihre Derivate eine Anti-Aminopeptidase-B-Wirkung auf und wirken entzündungshemmend und inhibitorisch auf die Bradykininbildung, so daß sie als Heilmittel bei zahlreichen entsprechenden Erkrankungen eingesetzt werden können.

Repräsentative Stämme, die die Verbindung (il) (Ο produzieren, wurden erfindungsgemäß in der Präfektur Kyoto in Japan aus dem Erdboden isoliert. Ihre mykologisehen Eigenschaften sind wie folgt:

(1) Wachstum auf verschiedenen Kulturmedien (2k C, 2 Wochen)

1. Malzextrakt-Agar

Dae Wachstum ist langsam, und der Durchmesser der Kolonien beträgt in zwei Wochen 2,0 bis 2,5 cm. Die Oberflächen der

Kolonien sind dunkelgrün bis blaugrün gefärbt. Die Zentren der Kolonien sind etwas erhöht. Die Umrandungen der Kolonien sind flach und bilden ein samtartiges Myzel. Die Kanten der Kolonien sind 1 bis 2 mm breit und weiß. Einige Teile der Rückseite sind gelb, aber es wird keine Pigmentbildung ins Agar beobachtet.

2. Kartoffelglukose-Agar

Das Wachstum ist langsam, und der Durchmesser der Kolonien beträgt in zwei Wochen 2,5 bis 3»0 cm. Die Zentren der Kolonien sind weiß bis graugrün. Die Umrandungen sind gelb bis gelblichgrün und bilden ein samtartiges Myzel. Au-f den Oberflächen der Kolonien finden sich strahlenartige Kanäle. Die Rückseiten sind blaßgelb bis gelborange mit schw_achen Fimbrien, und es wird kein Pigment ins Agar gebildet.

3. Czapek-Agar

Das Wachstum ist sehr langsam, und Aussehen und Wachstum der Konidiensporen sind auch nicht gul. Die Durchmesser der Kolonien betragen in zwei Wochen 1,5 h±s 2,0 cm. Auf den Oberflächen werden blaßgelbe bis gelborangefarbene und samtartige Myzelien ausgebildet. Sie sind manchmal weiß bis grau in einigen Teilen. Die Rückseiten sind nicht gefärbt und bilden kein Pigment ins Agar.

4. Mit Czapek-Agar versetzte Korneinweichflüssigkeit (corn steep liquor)

Das Wachstum ist langsam, und die Durchmesser der Kolonien betragen in zwei Wochen 2,0 bis 2,5 cm. Auf der Oberfläche werden gelblichgrüne bis dunkelgrüne und samtartige Myzelien gebildet. Die Zentren der Kolonien können manchmal Fimbrien bilden. Die Kanten der Kolonien sind 1 bis 2 mm breit und weiß. Die Rückseiten sind nicht gefärbt und bilden kein Pigment ins Agar.

5. Malzsaft-Agar

Das Wachstum ist gut, und die Durchmesser der Kolonien betragen in zwei Wochen 3t0 bis ^,0 cm. Die Zentren der Kolonien sind etwas erhöht und samtartig mit dunkelgrüner bis blaugrüner Farbe. Die Umrandungen sind gelb bis gelbgrün. Sowohl Oberflächen als auch Rückseiten bilden zahlreiche Fimbrien. Die Rückseiten haben eine geIborange bis gelbbraune Farbe und bilden kein Pigment ins Agar.

(2) Morphologische Daten

Die Myzelien sind farblos und septiert. Die meisten Penicilli sind zweifach quirlständig, manchmal auch einfach quirlständig, symmetrisch angeordnet. Die Konidien sind elliptisch mit 3>0 bis k,0 /um Länge und 2,5 bis 3»0 /um Breite. Die Größe der Ketten der Konidien beträgt 50 bis 80 /um. Die Sterigmata sind lanzettförmig mit spitzen Enden und werden in Gruppen von etwa vier bis acht parallel gebildet. Die Länge beträgt 10,0 bis 13>0 /um und die Breite 2,0 bis 2,5/um. Die Metulae befinden sich in Gruppen von etwa 2 bis 8 eng beeinander oder etwas ausgebreitet. Die Länge beträgt 10 bis 13 /um und die Breite 2,5 bis 3»0/um. Die Konidiophoren sind 50 bis 80/um lang und 2,5 bis 3»0/um breit. Viele von ihnen reichen nicht aus dem Luftmyzel oder dem vegetativen Myzel heraus, wenn sie auch eine entsprechende Tendenz haben. Einige dagegen reichen aus dem Myzel heraus.

(3) Wachstumsbedingungen

pH-Wert: Innerhalb eines pH-Wertbereiches von 2 bis 12 wird Wachstum beobachtet; der für das Wachstum optimale pH-Wert beträgt 3 bis 6.

Temperatur: Wachstum ist möglich innerhalb eines Temperaturbereiches von 6 bis 33° C, wobei der Optimalbereich 18 bis 28° C beträgt.

COPY

Aus den Ergebnissen der vorstehenden Beobachtungen wird der vorliegende Mikroorganismus als Penicillium rugulosum identifiziert. Die mykologischen Eigenschaften von P. rugulosum sind im einzelnen in "Manual of the Penicillia" von Raper und Thorn (Hafner, I968), in "Fungi in Agrisultural Soils" von Domsh und Gams (Longman, 1972)» und in Journal of General and Applied Microbiology, Band 2, Seite 1, 1956» von Abe erläutert.

Vas den erfindungsgemäß anwendbaren Mikroorganismus angeht, so ist der vorstehend genannte hinterlegte lediglich ein repräsentatives Beispiel. Außer diesem können alle zur Gattung Penicillium gehörenden Mikroorganismen verwendet werden, solang· sie OF49^+9 (Verbindung (il) produzieren. Außerdem produzieren auch natürliche und künstliche Mutanten davon, die beispielsweise durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht oder durch Behandlung mit die Mutation von Mirkroorganismen auslösenden Substanzen, wie Nitrosoguanidin, erhalten werden, manchmal OF49^9, und solche Mutanten können natürlich ebenfalls erfindungsgemäß angewendet werden.

Zum Kultivieren der vorliegenden Mikroorganismen kann das verwendete Medium flüssig oder fest sein, wobei im allgemeinen ausgehend von flüssigen Medien eine Schüttelkultur oder eine belüftete Kultur unter Rühren durchgeführt wird. Alle Arten von Medien können benutzt werden, solange sie für das Wachstum von Pilzen geeignet sind und OF49^9 produzieren. So können als Kohlenstoffquelle Kohlenhydrate, wie beispielsweise Glukose, Fruktose, Maltose, Saccharose, Laktose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Sorbitol u. dgl., und pflanzliche Öle und Fette, wie beispielsweise Sojabohnenöl, verwendet werden. Beispiele für Stickstoffquellen sind Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenpulver, Korneinweichflüssigkeit, Malzextrakt, Aminosäuren (wie Glutaminsäure, Asparaginsäure, Tyrosin, Phenylalanin, u. dgl.) und deren Salze, Harnstoff, Ammoniumsalze, Nitrate usw. Daneben können auch Mikronährstoffe, wie

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anorganische Salze (wie Magnesiumphosphat, Kalium-, Natrium-, Calcium-, Eisen-, Mangansalze asv.) und Vitamine (wie Vitamin B₁ , Calciumpentothenat u. dgl.) in angemessenem Umfang ebenfalls zugesetzt werden.

Wenn große Quantitäten kultiviert werden, ist es wünschenswert, in flüssigem Medium zu kultivieren.

Die Kulturbedingungen, wie der pH-¥ert des Mediums, die Kulturtemperatur usw., können innerhalb eines solchen Bereiches schwanken,daß Verbindung (il) (OF49^9) produziert wird. Jedoch bei der Schüttelkultur oder der belüfteten Kultur unter Rühren mit Verwendung eines flüssigen Mediums kann der pH-Wert vorzugsweise 4 bis 7 und die KuItürtemperatur vorzugsweise 25 bis 30, C betragen, und die Kulturdauer vorzugsweise 2 bis 10 Tage. Bei der so erhaltenen Kultur ist Verbindung (il) (OF49^9) angesammelt .

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind sowohl im KuIturfiltrat als auch im Myzel vorhanden und können aus beiden abgetrennt werden. Beim Abtrennen der gewünschten Substanzen aus KuIturfiltrat oder Myzel können zahlreiche gebräuchliche Maßnahmen, wie sie zum Isolieren von Mikroorganismen angewendet werden, in Abhängigkeit von den Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen durchgeführt werden. Dazu gehören beispielsweise Adsorptions Chromatographie unter Verwendung von Aktivkohle oder nichtionischer adsorbierenderHarze, Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschern, Trennchromatographie unter Verwendung von Cellulose u. dgl., und Umkehrphasentrennchromatographie unter Verwendung von Silikagel kombiniert mit Alkylgruppen.

Genauer gesagt wird das KuIturfiltrat, ein wäßriger Acetonextrakt des Myzels oder eine die erfindungsgemäßen Substanzen enthaltende Lösung durch eine mit Aktivkohle (z.B. hergestellt von Wako Pure Chemicals), Diaion HP-20 (Mitsubishi Chen. Ind.) usw. gefüllte Säule geschickt, und die adsorbierten Substanzen

werden mit Säure, Alkali, Wasser, Methanol, Äthanol und/oder Aceton eluiert. Das Eluat wird dann durch eine Säule geschickt, die mit Dowex 5OW (H -Typ, Dow Chemicals) und einem weiteren stark sauren Kationenaustauscher oder mit Dowex 1x2 (OH~-Typ, Dow Chemicals) und einem anderen stark basischen Anionaustauscher gefüllt ist, und die adsorbierten Substanzen werden mit Säure, Alkali oder einer Salzlösung eluiert.

Man kann die Verunreinigungen auch entfernen, indem man die Lösung durch eine Dowex 1x2-Säule (Cl-Typ) schickt. Die erhaltene Lösung wird mit Diaion HP-20 od. dgl. behandelt, wie vorstehend beschrieben, um die gewünschten Substanzen zu adsorbieren, mit einem Lösungsmittel zu eluieren oder zu entsalzen und im Vakuum einzuengen, wobei das gewünschte Produkt von gelblichbrauner Farbe erhalten wird. Dieses Rohprodukt wird einer Behandlung mit einer Säule mit kristalliner Avicel-Cellulose (Funakoshi Co.), LiChroprep (Silikagel kombiniert mit Alkylgruppen ; Waters Co.) od. dgl. unterzogen und dann mit Säure, Alkali, Wasser, Puffer, Methanol, Acetonitril, Propanol, N-Butanol und/oder dgl. entwickelt, um das reine Produkt zu erhalten.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen (ill) und (iv) sind wie folgt:

(1) Summenformeln:

Verbindung (ill) C₃₃H₂₆OgN₄

Verbindung (iv) C₂₂H₂₄OgN₄

(2) Elementaranalysen

Verbindung (ill) für C₂₃H₂₆OgN^-2H₂Or

Berechnet C = 52,30 56 H = 5, k6 $ N = 10,64 ^ Gefunden C = 52,87 °,Ό H = 5,79 °/o N = 10,72 %

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Verbindung (iv) für

Berechnet C = 51 , 6o ⁿ/o H = 5, 48 °/o N = 11,06 «6 Gefunden C = 51,97 $ H = 5,55 $ N = 11,02 $

(3) Molekulargewichte

Die Molekulargewichte wurden mittels SIMS (Sekundär-Ionenmassenspektrometrie) gemessen und betragen 486 für Verbindung (ill) und 472 für Verbindung (iv).

(4) Schmelzpunkte

Sowohl Verbindung (ill) als auch Verbindung (iv) schmelzen bei etwa 280 C unter Zersetzung.

(5) Spezifische Drehung

Verbindung (ill) : [fC]^? - -64,8° (c = 1,0, Wasser)

Verbindung (iv) : [o{ J ²^ = -42,6° (c = 1,0 Wasser)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektren

w
Die Wellenlängen und die E₁' -Werte, die die maximalen Absorptionen zeigen, wenn Verbindung (ill) und Verbindung (iv) in den folgenden Lösungsmitteln gelöst werden, sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Einheit:/. nm (e]'° ) max ^x 1cm'

Lösungsmittel Verbindung (ill) Verbindung (iv)

Wasser 213(304), 230 (Schulter 236) 214(282), 272(57)

273(^6), 283 (Schulter 4o) 279(58)

0,05n HCl 212(302, 228(Schulter 227) 213(279), 272(56)

273(46), 283(Schulter 4θ) 279(57)

0,05n NaOH 214(308), 273(47) 218(313), 242(Schulter (Schulter 40 ) 297(68) "[75

(.7) Infrarotabsorptionsspektren

Die ¥ellenXängen, die die mit Kaliumbromidtabletten von Verbindung (ill) und Verbindung (iv) gemessenen maximalen Absorptionen zeigen, sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

— 1

Einheit: cm

Verbindung (ill) Verbindung (iv)

3400, 1650, 158O, 150O₉ 1380, 3400, 1650, 1580, 1500, 1430, 1260, 1225/1160, 1120, 1100, 1380, 1270, 1250, 1225, 1160, 1120,

(8) Löslichkeiten

Die Verbindungen (ill) und (iv) sind löslich in Wasser, wäßrigem Alkali und Dimethylsulfoxid, schwer löslich in Methanol und Äthanol und unlöslich in n-Propanol, n-Butanol, Aceton, Äthylacetat, Chloroform, Äther, Benzol und Hexan.

(9) Farbreaktionen;

Sowohl Verbindung (ill) als auch Verbindung (iv) zeigen eine positive Ninhydrinreaktion, Kaliumpermanganatreaktxon, Rydon-Smith-Reaktion und Jodreaktion; negativ: Sakaguchi-Reaktion, Prochazka-Reaktion, Hanes-Reaktion und Anthronreaktion. Verbindung (iv) zeigt eine positive FeCl„-Reaktion.

(10) Neutrale, saure und basische Eigenschaften

Sowohl Verbindung (ill) als auch Verbindung (iv) sind amphotere Substanzen.

(11) DünnschichtChromatographie

Die R -Werte auf Silikalgelplatten (Merck) sind in Tabelle 3 angegeben«,

Tabelle

R - ¥erte

Lösungsmittel Verbin- Verbindung (III) dung (IV)

n-Butanol, Essigsäure und Wasser (3:1 :1 )

n-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser (3:4:3:1)

n-Propanol und 28 °/oiges Ammoniakwasser (2:1 )

Äthanol und 28 "folges Ammoniakwasser (2:1 )

0,32	0,32
0,35	0,35
0,41	0,32
0,54	0,48

(12) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Retentionsvolumina und -zeiten von Verbindung (ill) und Verbindung (iv) unter Verwendung von Nucleosil 5C₁Q (Macherey-Nagel Co.) sind in Tabelle 4 angegeben.

Maße der Säule: Füllung: Lösungsmittel:

Flüssigkeitsgeschwindigkeit Identifikation: 0 4,0 mm χ 150,0 mm Nucleosil 5C₁O 0,1 m Zitratpuffer (pH 5,7) und Acetonitril (90:10)

0,5 ml/min UV 275 nm

Tabelle

Verbindung

(in)

Ve rb indung (IV)

Retentionszeit Retentionsvolumen 9,9 Minuten 5,0 ml

4,2 Minuten 2, 1 ml

(13) Farbe der Substanzen

Sowohl Verbindung· (ill) als auch Verbindung (iv) sind farblos® Pulver

(14) Protonenresonanzspektren

Chemische Verschiebungen, Protonenzahlen und Multiplizitäten von Verbindung (ill) und Verbindung (iv), gemessen in schwerem Ammoniakwasser, sind wie folgt:

Einheit; Chemische Verschiebung (ppm) Innerer Standard: DSS

Verbindung (ill): 2,66 (1H, t), 2,75-3,00 (2H, m), 3,37 (IH, dd), 3,70 (IH, dd), 3,93 (3H, s), 4,42 (1H, d), 4,48 (1H, dd), 5,83 (1H, d), 6,87 (2H, m), 7,07 (2H, m), 7,26 (1H₅ dd), 7,46 (1H, dd)

Verbindung (iv): 2,65 (1H, t) 2,70-2,95 (2H, m), 3,36 (1H, dd), 3,67 (1H, dd), 4,40 (1H, d), 4,46 (1H, dd), 5,78 (IH, d), 6,67 (IH, d), 6,85 (1H, dd), 7,05 (1H, dd), 7,22 (1H, dd), 7,41 (IH, dd)

(15) C-Kernmagnetische Resonanzspektren

Chemische Verschiebungen von Verbindung (ill) und Verbindung (iv) in 0,06 η schwerem Ammoniakwasser sind wie folgt;

Einheits Chemische Verschiebung (ppm) Innerer Standards p-Dioxan (67,4 ppm)

Verbindung (ill): 178,7, 176,0, 174,9, 168,3, 153,4, 149„4₅ 148,0_s 136,5, 132,9, 131,5, 128,2, 125,0, 123,1, 122,1, 116,2, 113,0, 72,9, 57,9, 56,7, 55,1, 53,8, 39,7, 38,9

Verbindung (iv): 178,8, 176,0, 175,8, 168,3, 154,1, 149,0, 145,6, 136,1, 132,8, 131,4, 127,3, 125,2, 123,1, 122,0, 117,0, 116,8, 73,0, 57,9, 55,1, 54,0, 39,7, 39,1

Wie vorstehend dargelegt wurde, sind Verbindung (ill) und Verbindung (iv) ähnliche Substanzen mit ähnlichen Eigenschaften. Es handelt sich somit um neue Stoffe mit gleicher Struktur, nur mit der Ausnahme, daß Verbindung (iv) eine phenolische Hydroxylgruppe aufweist, während Verbindung (ill) an dieser Stelle durch eine Methoxygruppe substituiert ist.

Selbstverständlich umfaßt die vorliegende Erfindung nicht nur die Verbindungen (ill) und (iv), sondern auch ihre Salze mit Metallen, organischen Basen, Mineralsäuren und organischen Säuren.

Von den esrfindungsgeraäßen Verbindungen (ill) und (iv) können neue Derivate hergeleitet werden. Die Strukturen von repräsentativen Derivaten der Verbindung (ll) sind in Tabelle 5 angegeben, und ihre Infrarotabsorptionsspektren und Protonenresonanzspektren sind in Tabelle 6 angegeben. Soweit diese Derivate Salze bilden können, gehören solche Salze mit Metallen, organischen Basen, Mineralsäuren und organischen Säuren ebenfalls in den Erfindungsbereich, mit der Einschränkung, daß diese Salze pharmakologisch verträglich sind.

OR

R«>-f

CO -NH-CH- CO
HC-OR⁵

(D

Verbandung 1

- 19 Tabelle 5

1	H	H	H	H	H	CONH₂	COOCH₃
2	H	H	H	H	H	COOH	COOH
3	H	H	H	H	H	COOCH₃	COOCH₃
4	H	H	H	H	H	CONH₂	CH₂OH
5	H	H	H	H	H	CH₂OH	CH₂OH
6	H	H	CHO	H	H	CONH₂	COOH
7	H	H	CHO	H	H	CONH₂	COOCH₃
8	H	H	COCH₃	H	H	CONH₂	COOH
9	H	H	COCH₃	H	H	CONH₂	COOCH₃
10	H	. H	CH₃	CH₃	H	CONH	COOH
Il	\ H	H	C₂H₅	H	H ■	CONH₂	COOH
12	H	H	C₂H₅	C₂K₅	H	CONH₂	COOH
13 (XIl)	CH₃	H	H	H	H	CONH₂	COOH
14.	CH₃	H	H ■	H	H	CONH₂	COOCH₃
15	CH₃	H	H	H	H	CONH₂	COOC₇H₀ 4 9
16	CH₃	H	H	H	H	CONH₂	C00CH„C_£H_
17	CH₃	H	H	H	H	CONH₂	CONH₂
18	CH₃	H	H	H	H	COOH	COOH
19	CH₃	H	H	H	H	COOCH₃	COOCH₃
20	CE₃	H	H	H	H	COOH	CONH₂
21	CH₃	H	H	H	H	CH₂OH	CH₂OH
22	^CH3	H	CHO	H	H	CONH₂	COOH
23	CH₃	H	CHO	H ·	H	CONH₂	COOCH₃
24	CH₃	H	CHO	H	H	CONH₂	COOC-H_n 4 9
25	CH₃	H	COCH₃	H	H	CONH₂	COOH
26	CH₃	H	COCH₃	H	H	CONH₂	COOCH₃
27	CH₃	H	COCH	H	COCH	CONH₂	COOCH₃
28	CH₃	H	C₂H₅	^:B	H	CONH₂	COOH
29	CH₃	Br	H	H	H	CONH₂	COOH
30	CH₃	Br	H	H	H	COOH	COOH
31	^C4^H9	H	H	H	H	CONH₂	COOH
32	COCH₃	H	H	H	COCH₃	CONH₂	COOH

Tabeli-e

Verb. Infrarotabsorptions- Protonenresonanzspektren Nr. spektren (cm"¹) . ( <^-¥erte)

1	3400, 1730 1430, 1275	, 1670 , 1225	, 1500, , 1110
2	3350, 1630, 1395, 1230,	1590, 1115,	1500 960
3	3400, 1735, 1430, 1270,	1650, 1225,	1500 1120
4	3400, 1640, 1110	1270,	1225,
5	3400, 1640, 1270, 1225,	1590, 1110	1500,
6	3400, 1720, 1380, 1270,	1660, 1225,	1500, 1110
7	3450, 1735, 1430, 1275,	1670, 1230,	1500, 1110
8	3400, 1720, 1430, 1275,	1660, 1225,	1505, 1110
9	3400, 1735, 1430, 1275,	1670, 1225,	1505, 1110
10	3400, 1670, 1390, 1220,	1590, 1115	1505,
11	3350, 1660, 1390, 1250,	1580,- 1220,	1500, 1120
12	3400, 1650, 1390, 1225,	1590, 1120	1500,
13	3400, 1660, 1380, 1260, 1020	1580, 1225,	1500, 1120,
14	3400, 1740, 1270, 1240,	1680, 1130,	1510, 1020
15	3400, 1735, 1265, 1235,	1670, 1130,	1500 1020
16	3400, 1740, 1265, 1230,	1650, 1160,	1500, 1120
17	3400, 1670, 1235, 1130,	1510, 1020	1270,
18	3400, 1720, 1265, 1235,	1660, 1130,	1500, 1020
19	3400, 1730, 1430, 1260, 1020	1650, 1225,	1500, 1125,
20	3400, 1650, 1265, 1230,	1600, 1120,	1500, 1020

3.70 (OCH₃), 392 (CH), 4.58 (CE), 4.67 (CH), 5.85 (CH), 6.5-7.4(CHx6)

2.5-3.0 (CH₂), 3.34, 3.62(CH₂), 4.16(CH), 4.48(CH), 5.75(CH), 6.5-7.5(CHx6)

3.56(OCH3), 3.7O(OCH3), 4.05(CH), 4.5-4.8(CHx2), 5.81(CH), 6.1-7.4(CHx6)

3.71(CH₂), 4.16 (CH), 5.80 (CH), 6.6-7.5 (CH χ 6)

3.45(CH₂), 3.56(CH₂), 4.34 (CB), 5.77 (CH), 6.6-7.5 (CH χ 6)

4.30 (CH), 5.95 (CH), 6.5-7.5 (CHx6), 8.10 (CHO)

3.72 (OCH₃), 3.95(CH), 5.80 (CH), 6.2-7.4 (CH χ 6), 7.94 (CHO)

1.97 (CH₃CO), 4.30(CH), 5.98 (CH), 6.4-7.6 (CH χ 6)

1.95 (CH.CO), 4.25(CH), 5.92 (ClO, 6.4-7.5 ICH χ 6)

2.52(ε%χ2), 4.25(CH), 6.30 (CH), 6.5-7.5 (CH χ 6)

1.20(CH₃), 3.90 (CH), 4.32 (CH), 5.98(CH), 6.7-7.6 (CH χ 6)

1.06 (CH₃x2), 4.27 (CH), 6.40 (CH), 6.6-7.5 (CH χ 6)

2.6-3.0 (CH₂), 3.38, 3.70 (CH₂), 3.93 (OCH₃), 4.42(CH), 5.82 (CH), 6.8-7.5 (CH χ 6)

3.70(OCH₃), 3.80 (OCH₃), 3.93(CH), 4.60(CH), 4.67(CH), 5.86 (CH), 6.6-7.4 (CH χ 6)

0.97 (CH₃), 3.86 (OCH₃), 4.80 (CH), 5.92(CH), 6.7-7.5 (CH χ 6)

3.87(OCH₃), 5.22(CH2), 5.98 (CH), 6.5-7.5 (CH χ 6), 7.41 (5H)

3.78(OCH₃), 5.77 (CH), 6.5-8.1 (CHx 6, CONH₂ χ 2, CONH χ 2)

3.83 (OCH₃), 4.56(CH), 4.66 (CH), 5.82 (CH), 6.6-7.4 (CH χ 6)

3.72(OCH₃), 3.30 (OCH₃), 3.88 (OCH₃), 4.34 (CH), 6.7-7.4 (CH χ 6)

3.79 (OCH₃), 4.24 (CHx 2), 6.54 (CH), 6.9-7.1(CHx 6), 7.17, 7.35(C0NH2)

(wird fortgesetzt)

Tabelle 6 (Fortsetzung)

Verb«, Infrarotabsorptions-Nr₅, spektren (cm )

Protonenresonanzspektren ( ^f-Wer te )

21	3400, 1230,	1650, 1130,	1505, 1020	1260,
22	3400, 1505,	1720, 1270,	1680, 1230,	1645, 1130
23	3400, 1265,	1740, 1230_a	1640, 1125,	1500, 1020
24	3350, 1500, 1030	2950, 1265,^	1735, 1235,	1680, 1130,
25	3350, 1265,	1730, 1230,	1670, 1130,	1500, 1020
26	3400, 1435,	1740, 1265,	1660, 1235,	1500, 1130
27	3350, 1425, 1120,	1730, 1360, 1020	1650, 1260,	1500, 1220,
28	3300, 1390, 1020	1680, 1265,	1590, 1235,	1510, 1130,
29	3400, 1385,	1670, 1260,	1600, 1225,	1500, 1145
30	3400.	1630.	1495,	1390,

1220, 1170, 1145, 1020

31 3400, 1660, 1505, 1390, 1260, 1235, 1130

32 3400, 1740, 1680, 1500, 1370, 1265, 1210, 1115

3.4-3.6(CH₂), 3.6-3.8 (CH₂), 3.94 (OCH₃), 4.53( CH), 5.81(CH), 6.8-7.5 (CHx6)

3.84 (OCH₃), 4.43(CH), 5.85 (CH), 6.5-7.6 (CH χ 6), 8.07 (CHO)

3.72(0CH3), 3.80 (OCH₃), 4.00 (CH), 5.78 (CH), 6.4-7.5 (CHx 6), 7.95(CHO)

0.8-1.1(CH₃), 3.76(OCH3), 5.92 (CH), 6.5-7.5 (CH χ 6), 8.04 (CHO)

1.99 (CH₃CO), 3.87 (OCH3), 4.30 (CH), 5.90 (CH), 6.5-7.5 (CH χ 6)

1.99 (CH₃CO), 3.78 (OCH₃), 3.84 (OCH₃), 4.23 (CH), 5.88 (CH), 6.5-7.5 (CH χ 6)

1.82 (CH₃CO), 2.07 (CH₃CO), 3.70 (OCH₃), 3.78 (OCH₃), 5.78 (CH), 6.4-7.4 (CH χ 6)

0.9-1.3 (CH₃), 4.14 (CH), 4.70 (CH), 5.88 (CH), 6.5-7.5 (CH χ 6)

3.91(OCH₃), 4.21 (CH), 5.96 (CH), 6.8-7.5 (CH χ 5)

3.87 (OCH₃), 4.42 (CH), 5.94 (CH), 6.7-7.5 (CH χ 5)

1.96 (CH₃), 1.4-1.8 (CH₂x2), 4.04(CH₂), 4.18(CH), 4.66(CH), 5.82(CH), 6.6-7.4(CHx6)

2.18 (CH₃CO), 2.35 (CH₃CO), 4.95 (CH), 6.0 (CH), 6.7-7.6 (CH χ 6)

Die vorstehenden Verbindungen gemäß P'ormel (i) können mit Ausnahme der Verbindungen (ill) und (iv) aus der Verbindung (ill) und der Verbindung (iv) nach den folgenden, gegebenenfalls kombinierten Methoden erhalten werden:

(i) Die Verbindung (i), in der R eine niedere Alkylgruppe ist, kann durch gebräuchliche Alkylierung einer Verbindung (i), bei der R ein Fasserstoffatom an der phenolischen Hydroxylgruppe ist, erhalten werden. Beispiele für geeignete Alkylierungsmittel sind Alkylhalogenide, Alkylsulfate, Alkyl-p-toluolsulfonate oder Diazoparaffine oder -alkohole in Gegenwart von sauren Katalysatoren oder von Dehydrierungsmitteln, wie Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid. Fas die Reaktionsbedingungen angeht, so werden Reaktionstemperaturen, Reaktionszeit und Lösungsmittel ent-

sprechend den verwendeten Materialien, den angewendeten Alkylierungsmitteln und den gewünschten Verbindungen geeignet ausgewählt. In einigen Fällen wird die Umsetzung durch Zusatz von Basen verbessert. Beispielsweise werden beim Alkylieren des Materials mit Alkylhalogeniden dann Methylhalogenid und Butylhalogenid bei der Herstellung von Verbindungen verwendet, die in R die Methylgruppe bzw. die Butylgruppe enthalten. Bei diesen Umsetzungen werden Lösungsmittel, wie Dirnethylsulfoxid, Ν,Ν-Dimethylformamid, 1,2-Dimethoxyäthan, Tetrahydrofuran usw., verwendet, und Basen, wie Natriumamid, Kaliumcarbonat, Triäthylamin, Natriumhydroxid, Bariumhydroxid, Silberoxid, Natriumhydrid usw., werden eingesetzt.

Die Umsetzung wird gewöhnlich bei einer zwischen Raumtemperatur und 6o C liegenden Temperatur durchgeführt, wobei Raumtemperatur am günstigsten ist. Die Reaktionszeit schwankt entsprechend dem verwendeten Ausgangsstoff, den eingesetzten Alkylierungsmitteln, den Reaktionstemperaturen und den Lösungsmitteln; in den meisten Fällen ist die Umsetzung innerhalb von etwa ."30 Minuten bis 50 Stunden beendet.

COPY

Nach der Umsetzung kann das gewünschte Produkt auf bekannte Weise, -wie Einengen, Extrahieren mit Lösungsmittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren, Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie und Trennchromatographie, aus dem Reaktionsgemisch isoliert und gereinigt werden.

(2) Die Verbindungen (i), bei denen R eine niedere Acylgruppe ist, können durch bekannte Acylierungsverfahren aus Verbindung (i) erhalten werden, bei der R ein Wasserstoffatom ist.

Beispiele für solche Acylierungsmethoden sind die Umsetzung mit Carbonsäure in Gegenwart von Dehydrierungsmitteln, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, die Umsetzung mit Säurehalogeniden in Gegenwart von Basen, wie Pyridin, Dimethylanilin, Tetramethylharnstoff, metallischem Magnesium usw., und die Umsetzung mit Säureanhydriden in Gegenwart von Katalysatoren, wie Schwefelsäure, p-Toluolsulfonsäure, Zinkchlorid, Natriumacetat und Pyridin.

Die Reaktionsbedingungen schwanken in Abhängigkeit von den verwendeten Stoffen und den eingesetzten Acylierungsmitteln und werden ebenfalls aus einer geeigneten Kombination von Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und Lösungsmittel in Abhängigkeit von dem gewünschten Produkt ausgewählt. Beispielsweise wird Verbindung (i), bei der in R eine Acetylgruppe vorhanden ist, unter Verwendung von Essigsäureanhydrid in.Gegenwart von Katalysatoren, wie Schwefelsäure, p-Toluolsulfonsäure, Zinkchlorid, Natriumacetat oder Pyridin, hergestellt. Die Reaktions temperatur beträgt gewöhnlich 0 bis 60 C, wobei Raumtemperatur am vorteilhaftesten ist. Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von Ausgangsstoff, Katalysator, Reaktionstemperatur usw. und beträgt gewöhnlich etwa 50 Minuten bis 50 Stunden. Nach der Umsetzung wird das angestrebte Produkt aus dem Reaktionsgemisch mittels üblicher Methoden, wie Einengen, Extrahieren mit Lösungsmittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch-, Adsorptions- und Trennchromatographie abgetrennt und gereinigt.

COPY.

(3) Verbindungen (i), bei denen R ein Halogenatom ist, können durch ein bekanntes Halogenierungsverfahren für aromatische Verbindungen hergestellt werden, ausgehend von einer Verbindung (i), in der R ein Wasserstoffatom ist. Beispiele für solche Halogenierungsverfahren sind die Umsetzung mit Halogen in Gegenwart von Katalysatoren, wie Eisen, Lewissäure, Jod usw., und die Umsetzung mit solchen Halogenierungsmitteln, wie N-Bromsuccinimid, Oxalylchlorid, Sulfurylchlorid, tert.-Butylhypochlorit, tert.-Butylhypobromit usw. Die Reaktionsbedingungen schwanken in Abhängigkeit von den eingesetzten Stoffen und angewendeten Halogenierungsmitteln und werden ebenfalls aus einer geeigneten Kombination von Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und Lösungsmittel je nach dem angestrebten Produkt ausge-

2 wählt. Beispielsweise wird die Verbindung, bei der in R Brom anwesend ist, durch Umsetzung mit N-Bromsuccinimid in polaren Lösungsmitteln, wie Wasser, Alkohol u. dgl., erhalten. Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich zwischen 0 und 80 C und beträgt vorzugsweise Raumtemperatur. Die Reaktionszeit beträgt gewöhnlich 50 Minuten bis zu einigen Stunden. Nach der Umsetzung wird das erhaltene Produkt auf bekannte Weise aus dem Reaktionsgemisch isoliert und gereinigt, wie beispielsweise durch Einengen, Extrahieren mit einem Lösungsmittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch-, Adsorptions- und Trennchromatographie.

(4) Die Verbindungen (i), bei denen R eine niedere Acylgruppe ist, können aus einer Verbindung (i), bei der R ein Wasserstoffatom ist, durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden, bei dem die Aminogruppe acyliert wird. Beispiele für Acylierungsmethoden sind die Kondensation mit Carbonsäure unter Verwendung eines geeigneten Mittels, wie Carbodiimid, Siliciumtetrachlorid/wasserfreies Pyridin, Titanchlorid u. dgl., die Umsetzung mit Säurehaiogeniden in Gegenwart von Basen, wie tertiären Aminen, Natriumhydroxid, Natriumacetat, Alkalicarbonaten, Pyridin u. dgl., und die Umsetzung mit Säureanhy.drid erforderlichenfalls in Gegenwart von Reaktionsbeschleunigern, wie Schwefelsäure oder Natriumacetat. Die Reaktionsbedingungen

copy

schwanken in Abhängigkeit von den Ausgangsstoffen und den eingesetzten Acylierungsmitteln und werden ebenfalls aus einer für das gewünschte Produkt geeigneten Kombination von Reaktions temperatur, Reaktionszeit und Lösungsmittel ausgewählt, Bei-

3 spielsweise werden Verbindungen, bei denen in R eine Formylgruppe anwesend ist, durch Umsetzung mit Ameisensäure/

3 Essigsäureanhydrid und solche, bei denen in R eine Acetylgruppe anwesend ist, durch Umsetzung mit Essigsäure/Wasser, Essigsäureanhydrid/Methanol, Essigsäureanhydrid/Pyridin, Essigsäureanhydrid/Natriumacetat u. dgl. erhalten. Die Reaktion temperatur liegt gewöhnlich zwischen 0 und 60 C und beträgt vorzugsweise Raumtemperatur. Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit vom Ausgangsstoff und der angewendeten Reaktionstemperatur und beträgt gewöhnlich 50 Minuten bis zu 50 Stunden. Nach der Umsetzung werden die angestrebten Produkte aus dem Reaktionsgemisch auf bekannte "Weise isoliert und gereinigt, wie durch Einengen, Extrahieren mit Lösungsmittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch Adsorptions- und Trennchromatographie.

(5) Verbindungen (i), bei denen R und/oder R eine niedere Alkylgruppe sind, werden aus Verbindung (i), bei der sowohl R als auch R Wasserstoffatome sind, durch ein bekanntes Alkyliefungsverfahren erhalten. Beispiele für solche Alkylierungsmethoden sind die Umsetzung mit Alkylhalogeniden, die Umsetzung mit Alkylsulfaten (wie Dimethylsulfat) oder mit Alkylsulfonaten die reduktive Alkylierung mit Aldehyden u. dgl. Die Reaktionsbedingungen schwanken in Abhängigkeit von den Ausgangsstoffen und den angewendeten Alkylierungsmitteln und werden aus einer Kombination von Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und Lösungsmittel geeignet ausgewählt. Die Verbindungen, bei denen entwedeT

3 h
R oder R eine niedere Alkylgruppe ist, werden durch eine adäquate Steuerung der Menge an Alkylierungsmittel, Reaktionstemperatur und Reaktionszeit hergestellt. Wenn diese Bedingungen forciert werden, werden Verbindungen erhalten, bei denen

3 k
beide Gruppen R^ und R umgesetzt.sind.

COPY

Bei der reduzierenden Alkylierung für die Herstellung von N-Methyl-, N-Äthyl- u. dgl. Verbindungen ist es angebracht, Aldehyde, wie wäßrige Formalinlösung oder Acetaldehyd, zu verwenden, die Zwischenprodukte dann mit Lithiumaluminiumhydrid, Natriumcyanoborhydrid, Natriumborhydrid u. dgl. zu reduzieren. Am zweckmäßigsten ist die Anwendung von Natriumcyanoborhydrid. Beispiele für verwendbare Lösungsmittel sind Wasser, Alkohol und Acetonitril. Die Reaktionstemperatur beträgt gewöhnlich . 0 bis 6o° C, zweckmäßig Raumtemperatur. Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von den Ausgangsstoffen und den eingesetzten Aldehyden. Bei längerer Reaktionszeit wird zunächst ein

3 4 Produkt erhalten, bei dem eine der Gruppen R und R eine niedere Alkylgruppe ist, und dieses wird dann in ein Produkt

3 4 umgewandelt, bei dem beide Gruppen R und R niedere Alkylgruppen sind. Folglich kann die Reaktion abgestoppt werden, wenn eine adäquate Menge des gewünschten Produktes erzeugt worden ist. Die Reaktion ist gewöhnlich innerhalb von etwa 50 Minuten bis 50 Stunden beendet. Nach der Umsetzung wird das erhaltene Produkt auf bekannte Weise, wie durch Einengen, Extrahieren mit einem Lösungsmittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch-, Adsorptionsund Trennchromatographie aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt und gereinigt werden.

(6) Verbindungen (i), bei denen R eine, niedere Acylgruppe ist, werden nach einem bekannten Verfahren zum Acylieren von Hydroxylgruppen hergestellt, ausgehend von einer Verbindung (i), bei der R ein Wasserstoffatom ist. Beispiele für solche Acylierungsverfahren sind die Umsetzung mit Säurehaiogeniden in Gegenwart von Katalysatoren, wie Pyridin, Dirnethylanilin, Tetramethylharnstoff, metallischem Magnesium und anderen Basen, die Umsetzung mit Säureanhydriden in Gegenwart von Katalysatoren, wie Schwefelsäure, p-Toluolsulfonsäure, Zinkchlorid, Natriumacetat und Pyridin. Die Reaktionsbedingungen schwanken in Abhängigkeit von den Ausgangsstoffen und den verwendeten Acylierungsmitteln und können je nach dem gewünschten

Produkt aus einer geeigneten Kombination von Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und Lösungsmittel ausgewählt werden.

5 Beispielsweise werden Verbindungen, bei denen in R eine Acetyl— gruppe anwesend ist, durch Umsetzung mit Essigsäureanhydrid/ Schwefelsäure, Essigsäureanhydrid/p-Toluolsulfonsäure oder Essigsäureanhydrid/Pyridin hergestellt. Die Verwendung von Essigsäureanhydrid und Pyridin ist am zweckmäßigsten. Die Reaktionstemperatur beträgt gewöhnlich 0 bis 100 C, wobei ein Bereich von Raumtemperatur bis 6o° C zu bevorzugen ist. Die Reaktionszeit hängt von dem Ausgangsstoff, dem Reaktionspartner und der Reaktionstemperatur ab und beträgt gewöhnlich etwa 50 Minuten bis 50 Stunden. Nach der Umsetzung wird das angestrebte Produkt aus dem Reaktionsgemisch auf bekannte Weise abgetrennt und gereinigt, wie durch Einengen, Extrahieren mit einem Lösung^· mittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch-, Adsorptions- und Trennchromatographfe.

(7) Verbindungen (i), bei denen X eine Carbonsäuregruppe ist, werden beispielsweise aus einer Verbindung (l), bei der X eine Carbonsäureamidgruppe ist, nach einem bekannten Verfahren zum Umwandeln eines Carbonsäureamids in eine Carbonsäure hergestellt Beispiele für solche Verfahren sind die Hydrolyse mit Säure oder Alkali, die Hydrolyse Natriumperoxid oder die Nitrosierung mit einem Säureamid und nachfolgender Zersetzung in die Carbonsäure. Beispiele für Nitrosierungsmittel sind Nitrite, Alkylnitrite, Nitrosylchlorid, Stickstoffdioxid u. dgl. Die Reaktionsbedingungen schwanken in Abhängigkeit von dem Ausgangsstoff und dem verwendeten Reaktionsmittel und können aus einer Kombination von Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und Lösungsmittel je nach dem gewünschten Produkt ausgewählt werden.

¥enn beispielsweise die Verbindung (i), bei der X eine Carbonsäureamidgruppe und X eine Carbonsäuregruppe ist, bei 50 bis 100 C für etwa 50 Minuten bis 50 Stunden, vorzugsweise bei 100 C für zwei bis acht Stunden, in 2 η Salzsäure erhitzt wird,

wird eine Verbindung (l) erhalten, bei der sowohl X als auch Y Carbonsäuregrupper. sind. Nach der Umsetzung wird das gewünschte Produkt aus dem Reaktionsgemisch auf bekannte Weise isoliert und gereinigt, wie durch Einengen, Extrahieren mit einem Lösungsmittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch-, Adsorptions- und Trennchromatographie .

(8) Verbindungen (i), bei denen X ein Carbonsäureester ist, werden nach bekannten Veresterungsmethoden aus Verbindungen (i) hergestellt, bei denen X ein Carbonsäurerest ist.

Beispiele für solche Veresterungsreaktionen sind die Dehydrierung mit einem Alkohol unter Verwendung eines Katalysators, wie Mineralsäuren (Schwefelsäure, Salzsäure usw.), organischen Säuren (aromatischen Sulfonsäuren usw.), Lewissäuren (Borfluoridätherat usw.) und Kationaustauschharzen, die Umsetzung mit O-Alkylierungsmitteln, wie Diazomethan, die Umsetzung mit Dialkylsulfaten oder mit Alkylhalogeniden usw. Die Reaktionsbedingungen schwanken in Abhängigkeit von dem verwendeten Ausgangsstoffe und den eingesetzten Veresterungsmitteln, und je nach der angestrebten Verbindung kann eine geeignete Kombination von Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und Lösungsmittel ausgewählt werden.

Beispielweise wird eine Verbindung (i), bei der X eine Methylestergruppe ist, durch Behandeln in Methanol mit einem Katalysator, wie Mineralsäure (Schwefelsäure oder Salzsäure), organischer Säure (wie aromatischer SuIfonsäure), Lewissäuren (Borfluoridätherat), Kationaustauschharzen usw. erhalten. Die Reaktionstemperatur beträgt 0 bis 60° C, vorzugsweise Raumtemperaturtur. Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von der Art des Ausgangsstoffes und beträgt gewöhnlich etwa 50 Minuten bis 50 Stunden. Nach der Umsetzung wird das gewünschte Produkt aus dem Reaktionsgemisch auf bekannte Weise isoliert und gereinigt, wie durch Einengen, Extrahieren mit einem Lösungs-

.j^aa^= ■■"

mittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch-, Adsorptions- und Trennchromatographie.

(9) Verbindungen (l), bei denen X die CH₂OH-Gruppe ist, werden durch Reduzieren von Verbindungen (l) erhalten, bei denen X eins Carbonsäureestergruppe ist, mit einem Reduktionsmittel, das keine anderen Teile als die Carbonsäureestergruppe angreift. Beispiele für solche Reduktionsmittel sind Alkoxylithiumaluminiumhydrid, Natriumborhydrid, Lithiumborhydrid, Natriumborhydridaluminiumchlorid, Lithiumbromid, Diboran u. dgl., wobei die Verwendung von Lithiumborhydrid zu bevorzugen ist. Die Reaktionsbedingungen schwanken in Abhängigkeit von dem Ausgangsmaterial und dem verwendeten Reduktionsmittel, und je nach dem gewünschten Produkt kann eine geeignete Kombination von Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und Lösungsmittel ausgewählt werden. Beispiele für Lösungsmittel sind Äthyläther, Tetrahydrofuran und Dioxan. Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von Ausgangsstoff und Lösungsmittel und Reduktionsmittel und liegt gewöhnlich zwischen 0° C und dem Siedepunkt des verwendeten Lösungsmittels. Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von dem Reduktionsmittel und der Reaktionstemperatur, und in dem emisten Fällen läuft die Umsetzung während etwa 50 Minuten bis etwa 50 Stunden ab. Nach der Umsetzung wird das gewünschte Produkt aus dem Reaktionsgemisch auf bekannte Weise abgetrennt und gereinigt, wie durch Einengen, Extrahieren mit einem Lösungsmittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch-, Adsorptions- und Trennchromatographie.

(1O) Verbindungen (i), bei denen Y eine Carbonsäureestergruppe ist, werden durch Behandeln von Verbindungen (i), bei denen Y eine Carbonsäuregruppe ist, mit bekannten Veresterungsmitteln erhalten. Beispiele für anwendbare Veresterungsreaktionen sind die Dehydrierung mit einem Alkohol in Gegenwart eines Katalysators, wie beispielsweise organischen Säuren (wie aromatischen Säuren), anorganischen Säuren (wie Schwefelsäure, Salzsäure u. dgl.) Lewissäuren (wie Borfluoridätherat), Kationaustauschharzeη

cöpv

u. dgl., die Umsetzung mit O-Alkylierungsmitteln, vie Diazomethan, die Umsetzung mit Dialkylsulfaten oder mit Alkylhalogeniden usw. Die Reaktionsbedingungen schwanken in Abhängigkeit von Ausgangsstoff und eingesetztem Veresterungsmittel, und je nach dem gewünschten Produkt kann eine geeignete Kombination von Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und Lösungsmittel ausgewählt werden. Beispielsweise wird eine Verbindung (i) mit einer Methylestergruppe oder einer Benzylestergruppe bei Y erhalten durch Behandeln mit Methanol bzw. Benzylalkohol als Lösungsmittel in Gegenwart von Katalysatoren, wie Mineralsäuren (wie Schwefelsäure, Salzsäure), organischen Säuren (wie aromatischen Sulfonsäuren), Lewissäure (wie Borfluoridätherat) und Kationaustauschharzen. Die Reaktionstemperatur beträgt gewöhnlich Raumtemperatur bis 100 C, und die Reaktionszeit hängt vom Ausgangsstoff und vom verwendeten Alkohol ebenso ab wie die Reaktionstemperatur, beträgt aber gewöhnlich etwa 50 Minuten bis 50 Stunden. Nach der Umsetzung wird das angestrebte Produkt aus dem Reaktionsgemisch auf bekannte Weise abgetrennt und gereinigt, wie durch Einengen, Extrahieren mit einem Lösungsmittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch-, Adsorptions- und Trennchromatographie .

(ii) Verbindungen (i), bei denen Y eine Carbonsäureamidgruppe ist, werden beispielsweise aus Verbindungen (i), bei denen Y eine Carbonsäureestergruppe ist, durch bekannte Methoden zum Umwandeln einer Carbonsäureestergruppe in eine Carbonsäureamidgruppe erhalten. Beispielsweise wird die Verbindung (i), bei der Y eine Carbonsäureestergruppe ist, mit konz. Ammoniakwasser oder flüssigem Ammoniak behandelt, wodurch eine Verbindung (i) erhalten wird, bei der Y eine Carbonsäureamidgruppe ist. Die Umsetzung wird beschleunigt durch Zusatz eines Katalysators, wie Ammoniumchlorid, Natriummethoxid, Natriumamid oder Butyllithium zu dem Reaktionsgemisch. Die Reaktionstemperatur beträgt gewöhnlich -70 C bis Raumtemperatur. Die Reaktionszeit hängt von Ausgangsstoff, Lösungsmittel und verwendetem Katalysator

ab und ist. in den meisten Fällen innerhalb von etwa 5Q Minuten bis 50 Stunden beendet. Nach der Umsetzung wird das angestrebt? Produkt von dem Reaktionsgemisch auf bekannte Weise abgetrennt und gereinigt, wie durch Einengen, Extrahieren mit einem Lösungsmittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch-, Adsorptions- und Trennchromatographie .

(12) Verbindungen (i), bei denen Y die CHpOH-Gruppe ist, werder beispielsweise erhalten aus Verbindungen (i), bei denen Y eine Carbonsäureestergruppe ist, mittels eines Reduktionsmittels, das keinen anderen Teil als die Carbonsäureestergruppe angreift Beispiele für verwendbare Reduktionsmittel sind Alkoxylithiumaluminiumhydrid, Natriumborhydrid, Natriumborhydridaluminiumchlorid, Lithiumbromid oder Diboran, wobei die Verwendung von Lithiumborhydrid zu bevorzugen ist. Die Reaktionsbedingungen schwanken in Abhängigkeit von Ausgangsstoff und verwendetem Reduktionsmittel, und je nach dem angestrebten Produkt wird eine geeignete Kombination von Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und Lösungsmittel ausgewählt. Beispiele für einsetzbare Lösungsmittel sind Äthyläther, Tetrahydrofuran und Dioxan. Die Reaktionstemperatur schwankt in Abhängigkeit von Ausgangsstoff und Lösungsmittel und liegt gewöhnlich zwischen 0 C und dem Siedepunkt des eingesetzten Lösungsmittels. Die Reaktionszeit hängt von dem verwendeten Reduktionsmittel und der REaktionstemperatur ab. Gewöhnlich ist die Reaktion nach etwa 50 Minuten bis 50 Stunden beendet. Nach der Umsetzung wird das angestrebte Produkt aus dem Reaktionsgemisch auf bekannte Weise abgetrennt und gereinigt, wie durch Einengen, Extrahieren mit einem Lösungsmittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch-, Adsorptions- und Trennchromatographie.

(13) Verbindungen (i) können auch hergestellt werden, indem man zwei oder mehrere der unter (1) bis (i2) beschriebenen Methoden kombiniert. Ein oder mehrere Substituent(en) des erhaltenen Produktes wird/werden.auf bekannte Weise entfernt,

um ein gewünschtes Endprodukt zu erhalten. Bei den unter (i) bis (12) beschriebenen Methoden könen eine oder mehrere funktioneile Gruppen in der Verbindung (i) in Abhängigkeit von dem gewünschten Produkt vor der Umsetzung durch eine bekannte Schutzgruppe geschützt werden, wobei diese Schutzgruppe dann wieder entfernt wird.

Beispielsweise wird eine Verbindung (i), bei der beide Gruppen

3 4 7

R und R Wasserstoffatome sind und R ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe ist, in der Weise behandelt, daß auf bekannte Weise eine Schutzgruppe in die Aminogruppe eingeführt wird, nach eine Verbindung (v), bei der P eine Schutz-

7
gruppe für die Aminogruppe und R ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe ist, erhalten wird. Diese Verbindung wird dann nach einer bekannten Methode zum Alkylieren einer phenolischen Hydroxylgruppe alkyliert, wie vorstehend unter (i) angegeben, und erforderlichenfalls wird die Schutzgruppe von der Aminogruppe entfernt und/oder der Ester hydrolysiert, wobei eine Verbindung (Vl) erhalten wird, bei der R eine niedere

31
Alkylgruppe, R ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe

71
für die Aminogruppe und R ein Wasserstoffatom oder eine

niedere Alkylgruppe ist.

OH

.111

P-NH-CH

CO -NH-CH - CO CHOH CONH_n

CH₉
O₁ 1 ^z '71

R³¹-NH-CH CH-COOR

I «

CO- NH -CH - CO-NH CHOH' CONH₀

Verbindung (v)

Verb indung (VI)

" ³³ " 33Λ6283

Beispiele für hier verwendbare Schutzgruppen für die Aminogruppe sind die vom Urethantyp (wie die Benzyloxycarbonylgruppe), die vom Acyltyp (wie die Formylgruppe) und andere bekannte Schutzgruppen.

Das Entfernen der Schutzgruppe kann je nach ihrer Art auf bekannte und geeignete Weise erfolgen. Eine Benzyloxycarbonylgruppe kann beispielsweise durch katalytische Reduktion und eine Formylgruppe durch Behandeln mit Säure oder Alkali entfernt werden. Die Esterhydrolyse kann unter Einsatz eines Lösungsmittels (wie Wasser und seiner Gemische mit wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie Äthanol, Methanol, Ν,Ν-Dimethyl·-· formamid usw.) in Gegenwart eines basischen Katalysators, wie Natriumhydroxid, Kaliumcarbonat u. dgl., vorgenommen werden.

Beispielsweise wird die Verbindung (iv) mit einem Gemisch von Ameisensäure und Essigsäureanhydrid N-formyliert, dann mit Alkalihalogenid in Gegenwart eines Lösungsmittels (wie N, N-Dimethylformamid) und einer Base (wie Kaliumcarbonat) umgesetzt, dann wird das erhaltene Zwischenprodukt mit 4 η Natriumhydroxidlösung behandelt, so daß sowohl die N-Formylgruppe als auch die Alkylestergruppe gleichzeitig hydrolysiert werden, wonach eine Verbindung (Vl) erhalten wird, bei der R eine niedere

31 71 Alkylgruppe ist und beide Gruppen R und R Wasserstoffatome

Wenn bei der vorstehenden Methode Methyljodid als Alkylhalogenid verwendet wird, wird ausgehend von Verbindung (iv) die Verbindung (ill) (Verbindung 13) erhalten.

Nach der Umsetzung kann das angestrebte Produkt aus dem Reaktionsgemisch auf bekannte Weise abgetrennt und gereinigt werden, wie durch Einengen, Extrahieren mit einem Lösungsmittel, Überführen in ein anderes Lösungsmittel, Kristallisieren und Ionenaustausch-, Adsorptions- und Trennchromatographie.

Biologische Wirksamkeit

Die Verbindungen der Formel (il) und ihre Derivate wirken dahingehend physiologisch, daß sie die Aminopeptidase-B-Aktivität der EhrlichschenKrebszellen in bemerkenswertem Maße unterdrücken.

Als Meßmethode für die Aminopeptidase B wird die Methode nach V.K. Hops et al. (V.K. Hops, K.K. Makinen, G.G. Glenner: Archives of Biochemistry and Biophysics, ikk, 557, I966) modifiziert und verbessert. Hierfür werden zu 0,1 m Hanks-Lösung (hergestellt von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), in der 3 niM Arginin-ß-naphthylamid gelöst sind, 0,7 ml Hanks-Lösung zugesetzt, die die zu messende Probe enthält, das Gemisch wird 3 Minuten lang auf 37° C erhitzt, 0,2 ml Ehrlichsche Krebszellensuspension wird zugesetzt, so daß die Zellenkonzentration 2,5 x 10 /ml beträgt, dann wird das Gemisch 30 Minuten lang bei 37 C gehalten, 1,0 m Essigsäurepuffer (pH 4,2) wird zugesetzt, der 0,3 mg/ccm Garnet GBC (Diazoniumsalz von o-Aminotoluol, hergestellt von Sigma Co.) und 3 /° Tween 20 (Wako Drugs Co.) enthält, dann wird das Gemisch 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen, und die Extinktion (a) bei 5^-5 ™ der überstehenden Flüssigkeit wird gemessen.

Gleichzeitig wird die Extinktion (b) einer Vergleichslösung gemessen, die nur Hanks-Lösung ohne die zu prüfende Probe ist, und das Inhibitionsverhältnis von Aminopeptidase B wird nach der folgenden Formel berechnet:

b - a
χ 100

Die hier verwendeten Ehrlichschen Krebszellen wurden durch Tochterkultur in der Bauchfellhöhle von 4 bis 6 Wochen alten Mäusen vom ddY-Stamm erhalten und abgetrennt, indem 2 χ 10

■ . 33Λ6283'

Zellen in die Bauchfellhöhle von Mäusen eingebracht und anschließend aus dem Bauchwasser nach 7 bis IO Tagen isoliert wurde. Die Zellsuspension wird durch Behandeln des die Ehrlichschen Krebszellen enthaltenden Bauchwassers mit Trisammoniumchloridlösung (pH 7,2), Entfernen der Erythrozyten daraus, dreimaliges Waschen mit Hänks-Lösung und Verdünnen mit Hankslösung bis auf eine bestimmte Zellkonzentration bereitet. Dies ist eine einheitliche Zellgruppe, die nicht weniger als ⁰Jo lebende Zellen des Ehrlichcarcinoms enthält.

Auf die vorstehend erläuterte Testmethode wird das Inhibitionsverhältnis von Verbindung (il) und ihren Derivaten bei verschiedenenKonzentrationen berechnet, wonach die jeweilige ^-Inhibitions-Konzentration gemessen wird. Die Ergebnisse von repräsentativen anmeldungsgemäßen Verbindungen sind in der nachfolgenden Tabelle 7 zusammengestellt.

Tabelle 7

Verb in- 50 ⁰Jo- Inhibit ions -Konzendung Nr. tration ( /ug/ml) .

(III) 0.0054

(IV) 0.0048

1 ' 0.0056

2 1.35

3 0.095 4. 0.025

• 5 0.54

6 3.6

11 12.5

14 0.0052

15 0.0117

16 0.0155

17 0.016

18 · 0.25

19 0.040 21 0.30 •22 2.2

28 10.6

29 0.86

30 14.0

31 0.025

32 0.156

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen ebenfalls eine potenzierende Wirkung auf die Zellimmunität, gemessen anhand der verzögerten Hypersensibilität (nachstehend abgekürzt DHT), wie sie durch Impfen von Schaferythrozyten in die Hinterpfoten von Mäusen hervorgerufen wird. Hierfür werden Schaferythrozyten als Antigen verwendet, und 1 χ 10 davon werden intravenös an 10 Wochen alte weibliche Mäuse vom CDF₁-Stamm injiziert (8 Tiere pro Gruppe), und unmittelbar nach der Sensibilisierung wird eine Lösung von einer Verbindung (il) oder ihrer Derivate in sterilem Wasser intraperitoneal in Dosen von 5f 50 oder

500/ug/kg injiziert. Nach vier Tagen werden 10 Schaferythrozyten subkutan in die linken Hinterpfoten der Mäuse injiziert. Nach 2k Stunden wird der ödemgrad (d.h. die Dicke der Pfoten zu diesem Zeitpunkt) an den Hinterpfoten beobachtet und mit einer Schublehre gemessen. Die Versuchsergebnisse von repräsentativen erfindungsgemäßen Verbindungen sind in der nachfolgenden Tabelle 8 zusammengestellt.

	Dosis Cug/kg)	Tabelle 8	100 132 163 126
Verbindun gen	Vergleich 5 50 500		100 127 147 124
Versuch 1 Verb, (ill)	Vergleich 5 50 500	Dicke des Ödems (xO,1 mm) Potenzierungs- (Mittelwert + Standard- verhältnis fehler) "" gegenüber Vergleich (#)	100 116 114 128
Versuch 2 Verb, (iv)	Vergleich 5 50 500	7.2 ± 0.3 9.5 ± 0.6 11.7 ± 1.5 9.1 ± 0.5	100 126 120 121
Versuch 3 Verb. 2	Vergleich 5 50 500	9.2 ± 1.0 11.7 * 1.9 13.5 ± 1.2 11.4 ± 2.6	117 121 107
Versuch 4 Verb. 17	5 50 500	8.0 ± 0.5 9.3 ± 1.2 9.1 ± 1.1 10.2 ± 0.9	111 111 124
Verb. 18	5 50 500	7.0 ± 0.3 8.8 ± 0.7 8.4 ± 0.7 8.5 ± 0.7
Verb. 21	8.2 ± 0.7 8.5 ± 0.7 7.5 ± 0.6
	7.8 ± 0.8 7.8 ± 0.7 8.7 + 0.8

Alle erfindungsgemäßen Verbindungen haben eine geringe Toxizitat und können als Arzneimittel eingesetzt werden. Die Ergebnisse der akuten Toxizitätsprüfung durch intraperitoneale Injektion von 300 mg/kg repräsentativen erfindungsgemäßen Verbindungen in Mäuse vom ICR-Stamm sind in Tabelle 9 angegeben.

	Tabelle 9
Ve rb indung	Versuchsergebnis
(in)	Keine Toxizität
(IV)	It Il
17	Il Il
21	Il Il
22	ti it
28	ti ti
29	ti Il

Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen als Arzneimittel verabreicht werden, wird die Verbindung an sich oder ein Gemisch, das die erfindungsgemäße Verbindung in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5 ⁰Jo oder vorzugsweise 0,3 bis 90 fo enthält, in einem pharmazeutisch verträglichen, nichttoxischen und inerten Träger an Lebewesen, einschließlich Menschen, verabreicht.

Als Träger können ein oder mehrere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und andere Hilfsmittel für pharmazeutische Zubereitungen eingesetzt werden. Es ist erwünscht, daß die pharmazeutischen Zubereitungen in dosierbarer Form vorliegen. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen werden oral, ins Gewebe, lokal (wie percutan) oder intrarektal verabreicht. Selbstverständlich ist die für die jeweilige Verabreichung geeignete Zubereitungsform auszuwählen. Beispielsweise sind Injektionen besonders empfehlenswert.

Wie die Dosen als das Immunitätssystem beeinflussendes Mittel auszuwählen sind, ist je nach dem Status des Patienten (wie Alter, Körpergewicht usw.), dem Verabreichungsweg, der Art und Schwere der Erkrankung usw. in Rechnung zu stellen. Gewöhnlich werden als effektive Menge an erfindungsgemäßer Verbindung pro Tag 0,1 bis 1000 mg gegeben. In einigen Fällen kann eine geringere Menge ausreichend sein, während wiederum in anderen Fällen eine größere Menge erforderlich sein kann. Wenn eine große Menge gegeben wird, ist es wünschenswert, diese auf mehrere tägliche Gaben einzuteilen.

Dei oraler Gabe kann eine fesixe oder flüssige dosierbare Zubereitung, wie beispielsweise reines Pulver, verdünntes Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln, Granalen, Suspensionen, Flüssigkeiten, Sirups, Tropfen, Subüngualtabletten usw. zum Einsatz kommen.

Reines Pulver kann hergestellt werden, indem man den Wirkstoff in einen geeigneten Feinheitsgrad überführt. Verdünntes Pulver kann hergestellt werden, indem man diesen ausreichend feinen Wirkstoff mit fein gepulverten pharmazeutischen Trägerstoffen, wie beispielsweise Stärke, Mannitol oder anderen eßbaren Kohlenhydraten, mischt. Erforderlichenfalls können andere Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel, Dispergiermittel, Farbstoffe, Duftstoffe u. dgl. zugefügt werden.

Kapseln werden hergestellt, indem man zunächst das reine Pulver oder sein Gemisch mit Verdünnungsmitteln oder Granalen herstellt (die bei der Erläuterung von Tabletten noch beschrieben werden) und dann in Kapselsäckchen, wie solchen aus Gelatine, einfüllt. Gleitmittel und Verflüssigungsmittel, wie kolloidale Kieselerde, Talkum, Magnesiumstearat, Calciumstearat, festes Polyäthylenglykol u. dgl., können mit der gepulverten Substanz gemischt und das Gemisch dann eingekapselt werden. Wenn Zerteilungsmittel oder Aufschlußmittel,· wie Carboxymethylcellulose, Calciumcarboxymethylcellulose, Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Hydroxypropylcellulose mit geringerem Substitutionsgrad u. dgl.

zugesetzt werden, ist es möglich, die Effektivität des Arzneimittels bei Gabe von Kapseln zu verbessern.

Außerdem kann das Pulver aus erfindungsgemäßer Verbindung in pflanzlichen Ölen, Polyäthylenglykol, Glycerin, grenzflächenaktiven Mitteln u. dgl. fein suspendiert und dispergiert und dann mit Gelatine eingekapselt werden.

Tabletten werden hergestellt, indem man Pulvermischungen bereitet, sie zu Granalen oder Rohlingen verarbwitet, dann Zerteilungsmittel oder Gleitmittel zusetzt und schließlich zu Tabletten verpreßt.

Pulvermischungen werden bereitet, indem man fein gepulverte Substanz mit den vorstehend genannten Verdünnungsmitteln oder Grundstoffen mischt und erforderlichenfalls mit Bindemitteln (wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Alginaten, Gelatine 5 Polyvinylpyrrolidin, Polyvinylalkohol usw.), Löslichkeitsverzögerern (wie Paraffin), Reabsorptionsmitteln (wie quaternären Salzen) und/ der Adsorbiermitteln (wie Bentonit, Kaolin, Dicalciumphosphat usw.) versetzt. Die erhaltenen Pulvermischungen werden zunächst mit der Lösung eines Bindemittels (wie Sirup, Stärkepaste, Gummi arabicum oder Cellulose) oder mit einer Polymerlösung angefeuchtet und dann zwangsweise durch Siebe zu Granalen passiert. Anstatt zu granulieren, können die Pulver auch zunächst tablettiert und die erhaltenen Rohlinge uneinheitlicher Größe dann pulverisiert und in gewünschter Weise granuliert werden.

Zu den als solche hergestellten Granalen werden Gleitmittel, wie beispielsweise Stearinsäure, Stearate, Talkum und Mineralöl, zugesetzt, so daß die Verklebung-der Granalen verhindert wird.

Diese gleitfähig gemachten Gemische werden dann zu Tabletten verpreßt.

Außerdem können die Arzneimittel auch mit flüssigen und inerten Trägerstoffen gemischt und dann direkt tablettiert werden. Durchsichtige oder halbdurchsichtige Schutzüberzüge, wie aus Schellack, Zucker oder Polymeren, oder ein Glanzüberzug können ebenfalls aufgebracht werden.

Andere Arten von oral verabreichbaren Formen sind beispielsweise Flüssigkeiten, Sirups, Elixiere u. dgl., die in dosierbaren Formen die definierte Menge des Arzneimittels in einer bestimmten Menge Zubereitungsform enthalten. Sirups werden hergestellt durch Auflösen der Verbindung in einer geeignet gesüßten wäßrigen Lösung. Elixiere werden durch Verwendung von nichttoxischen alkoholischen Trägerstoffen zubereitet. Suspensionen werden durch Dispergieren der Verbindung in nichttoxischen Trägern hergestellt. Erforderlichenfalls können auch Aufschlußmittel, Emulgatoren (wie äthoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyäthylensorbitolester u. dgl.), Konservierungsmittel, Geschmacksstoffe (wie Pfefferminzöl, Saccharin u. dgl.) ebenfalls zugesetzt werden.

Erforderlichenfalls kann die dosaarbare, oral verabreichbare Zubereitung auch in Form von Mikrokapseln vorliegen. Diese Formen können auch mit Polymeren beschichtet oder in Wachse eingebettet sein, um so die Wirkungsdauer zu verlängern oder die Freigabe des Arzneimittels zu verlangsamen.

Zur parenteralen Verabreichung können dosierbare Zubereitungen durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion in Form von Lösungen oder Suspensionen angewendet werden. Solche dosjarbaren Zubereitungen werden hergestellt, indem eine bestimmte Menge Verbindung in einer Flüssigkeit, d.h. wäßrigem oder öligem und nichttoxischem Lösungsmittel, gelöst oder suspendiert und die Lösung oder Suspension sodann sterilisiert wird. Alternativ kann eine bestimmte Menge Verbindung in eine Ampulle gegeben und diese samt Inhalt sterilisiert und verschlossen werden. Um unmittelbar vor der Verabreichung lösen oder mischen zu können, kann zusammen mit Hilfsampullen und Trägern gepulver-

*-¹SiB

ter lyophilsierter Wirkstoff hergestellt werden. Nichttoxisches Salz oder Salzlösung können zugesetzt werden, um die Injektionslösung isotonisch zu machen. Es ist auch möglich, andere Hilfsmittel, wie Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Emulgatoren u. dgl., zuzusetzen.

Die rektale Verabreichung kann durch Verwendung von Suppositoriej erfolgen, die durch Mischen der Verbindung mit niedrigschmelzenden und wasserlöslichen oder -unlöslichen Feststoffen, wie beispielsweise Polyäthylenglykol, Kakaobutter, höheren Estern (wie Myristylpalmitat) oder Gemischen daraus hergestellt werden.

Zu den pharmazeutischen Zubereitungen von erfindungsgemäßen Verbindungen können andere Arzneimittel, wie beispielsweise Cytosinarabinosid, Adriamycin und Mitomycin, zugesetzt werden, oder solche Arzneimittel können auch gleichzeitig gegeben werden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung von einigen erfindungsgemäßen Verbindungen, jedoch ist die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

Herstellung von Verbindung (il) (Stufe 1)

Penicillium rugulosum OF4°-49 (PERM BP No. 3) wird 7 Tage lang auf Malzextrakt-Agar-Schrägkultur kultiviert. Eine Platinöse voll Sporen davon wird auf 500 ml Medium inokuliert, das 2 ^c/o Glukose, 0,5 fo Polypepton, 0,1 fo Hefeextrakt, 0,05 ^r/° Kaliumdihydrogenphosphat und 0,05 °/° Magnesiumsulfat enthält, das zuvor in einen 2-1-Kolben gegeben und bei 120° C 20 Minuten lang sterilisiert worden ist. Dieses Medium wird dann 6 Tage lang bei 2? C unter Schütteln bei 190 Umdrehungen pro Minute kultiviert. Die erhaltene Kultur wird in Anteilen von 1 1 pro Behälter in 15 Fermentierbehälter (30 1 Fassungsvermögen) aus rostfreiem Stahl inokuliert, die 20 1 sterilisiertes Medium

enthalten, welches 2 fo Glukose, 0,5 °/o Polypepton, 0,1 ⁰Jo Hefeextrakt, 0,03 °/° Kaliumdihydrogenphosphat und 0,05 f° Magnesiumsulfat enthalten. Die Inkubation wird durchgeführt, indem bei 27° C mit 20 l/min belüftet und 300 Umdrehungen pro Minute gedreht wird. Erforderlichenfalls wird während der Inkubation ein Entschäumungsmittel zugesetzt. Es wird vier Tage lang inkubiert, dann wird die Kultur entnommen, vom Myzel abfiltriert, um das Kulturfiltrat zu erhalten, wobei 6,5 1 Myzel (zusammengepreßtes Volumen) und 300 1 Kulturfiltrat erhalten werden.

Beispiel 2

Herstellung von Verbindung (il) (Stufe 2)

Das gemäß Beispiel 1 erhaltene Myzel wird dreimal mit 2k 1 50 ^igem Aceton-Wasser extrahiert, und die vereinigten Extrakte (72 l) werden im Vakuum zur Entfernung des Acetons auf 30 1 eingeengt. Diese 30 1 Konzentrat und 300 1 des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrats werden durch eine Aktivkohlesäule gegeben, die Säule wird mit 80 1 Wasser gut gewaschen und mit 150 1 Salzsäurelösung· (pH 2), die 50 ^c/o Aceton enthält, eluiert. Die Fraktion (80 l), die aminopeptidase-unterdrückende Wirkung zeigt, wird zur Entfernung des Acetons im Vakuum auf 30 1 eingeengt, die 30 1 Konzentrat werden durch eine Säule (1,2 1 von stark basischem Anionaustauscherharz Dowex 1x2 (Cl -Form gegeben, und die Säule wird mit Wasser eluiert. Das Eluat (80 l) wird auf pH 3 eingestellt, in einer Säule (2,0 l) von stark saurem Kationaustauschharz Dowex 5OW (H -Form) adsorbiert, die Säule wird mit 10 1 Wasser gewaschen und 100 1 1,0 η Ammoniakwasser eluiert. Die aktive Fraktion (60 l) wird mit 2 η Salzsäure neutralisiert und mit 2 1 nichtionischem Adsorptionsharz Diaion HP-20 adsorbiert. Das Harz wird mit 20 1 Wasser gewaschen und mit 20 1 50 ^igem Methanol/Wasser eluiert. Die erhaltene aktive Fraktion wird im Vakuum eingeengt, wobei 28,8 g Rohsubstanz erhalten werden.

Beispiel 3

Herstellung von Verbindung (il) (Stufe 3).

30 g kristalline Cellulose (Avicel) werden über 28,8 g Rohsubstanz, erhalten gemäß Beispiel 2, gesprüht, das Gemisch vird im Vakuum gut getrocknet und in den oberen Teil einer 1-1-Säule mit Avicel eingefüllt. Es vird mit 12 1 Entwickler (1 η Ammoniakwasser und n-Butanol, 15:85) entwickelt, wobei eine aktive Fraktion, die im wesentlichen aus Verbindung (ill) besteht, und dann eine weitere aktive Fraktion, die im wesentlichen aus Verbindung (iv) besteht, erhalten wird. Jede aktive Fraktion wird mit 1 η Salzsäure neutralisiert, im Vakuum eingeengt, dann noch einmal in Wasser gelöst und an 5OO ml Diaion IIP-20 adsorbiert.' Das Harz wird mit Wasser gewaschen, mit 2 1 50 ^igem Methanol/Wasser eluiert, und die erhaltene aktive Fraktion wird im Vakuum eingeengt, wobei 3»T g rohe Verbindung (ill) bzw. 4,1 g rohe Verbindung (iv), beide in Pulverform, erhalten x^erden.

Beispiel h

Herstellung von Verbindung (il) (Stufe h)

3,1 g rohe pulverförmige Verbindung (il), erhalten gemäß Beispiel 3j werden in 15 ml Wasser gelöst, und die Lösung wird der Trennchromatographie mit Phasenumkehrung unter Anwendung der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie für große Mengen (System 500» Waters Co.) unter der Bedingung unterzogen, daß als Entwickler 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril (9Ο:1θ) und eine Säule (C₁Q, Waters Co.) (cartridge column) eingesetzt werden, um die Aminopeptidase-B-inhibitorische Wirkung nachzuweisen. Die aktive Fraktion wird an 200 ml Diaion HP-20 adsorbiert, das Harz wird mit Wasser gewaschen und mit 1 1 50 ^igem Methanol/Wasser eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, im Vakuum eingeengt und lyophilisiert, wobei ^55 mg der Verbindung (II.T) erhalten werden.

Das andere gemäß Beispiel 3 erhaltene Rohpulver (4,1 g der Verbindung (iv)) wird in gleicher ¥eise der Cg-Trennchromatographie mit Phasenumkehrung unter Verwendung von 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril (95*5) als Entwickler unterzogen, wonach Säulenchromatographie mit Diaion HP-20 zur Gewinnung von 671 mg Verbindung (iv) folgt.

Beispiel 5

Herstellung von Verbindung 2

223,7 mg der Verbindung (iv) werden in 10 ml 1 η Salzsäure gelöst, die Lösung wird in ein geschlossenes Rohr gegeben und 7 Stunden lang auf 100 C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird bis zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit 10 ml Wasser aufgenommen und durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil 30 C-o-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und einem Gemisch von 0,1 m Zitronensäurepuffei" und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 2 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Die Fraktion wird dann mit 250 ml stark saurem Kationaustauscherharz Dowex 5OW (H -Form) adsorbiert, die Säule wird mit Wasser gewaschen und mit 1 η Ammoniakwasser eluiert. Das Verbindung 2 enthaltende Eluat wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand mit 5 ml Wasser aufgenommen, mit einer Nucleosil 30 C.._o-S$ule

I ο

(2,0 x 25,0 cm) adsorbiert und mit Wasser eluiert. Das erhaltene Verbindung· 2 enthaltende Eluat wird eingeengt und ergibt 78,8 g Verbindung 2 als farbloses Pulver.

Beispiel 6

Herstellung von Verbindung 10

50 mg der Verbindung (iv) werden in 5 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, 100/ul Formalin werden zugesetzt, das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, wonach eine weitere Stunde bei Raumtemperatur mit 30 mg Natriumcyanoborhydrid gerührt

wird. Das Reaktionsgemisch wird durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil 30 C₁O-SaUIe (2,0 χ 25,0 cm) und einem Gemisch von 0,1 m Zitronensäurepuffer (pH 5,7) und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine Verbindung 10 enthaltende Fraktion erhalten wird. Diese Fraktion wird eingeengt, das Konzentrat wird an 20 ml Diaion HP-20 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, mit 50 tigern Methanol/ Wasser eluiert und das Eluat bis zur Trockne eingeengt, wodurch 24,6 mg Verbindung 10 als farbloses Pulver erhalten werden.

Beispiel 7

Herstellung von Verbindung 12

60 mg der Verbindung (iv) werden in 5 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7jO) gelöst und die Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 50/Ul Acetaldehyd gerührt. Dann werden 30 mg Natriumcyanoborhydrid zugesetzt, und das Gemisch wird eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit einer Nucleosil-30 C g-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und einem Gemisch von 0,1 m Zitronensäurepuffer (pH 5,7) und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 12 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Diese Fraktion wird eingeengt, das Konzentrat wird an 20 ml Diaion HP-20 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen und dann mit 50 $igem Methanol/Wasser eluiert, und das Eluat wird bis zur Trockne eingeengt, wobei 31»^· nig der Verbindung 12 als farbloses Pulver erhalten werden.

Beispiel 8

Herstellung der Verbindungen 7, 23 und 13

Zu 267 mg der Verbindung 6 werden 20 ml Ν,Ν-Dimethylformamid, 200 mg Kaliumcarbonat und 200/ul Methyljodid zugesetzt, und das Gemisch wird 2k Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die

Reaktionslösung wird neutralisiert und mittels Hochleistungs-Flüssigkeit schromatographie mit einer Nucleosil 30 C-n-Säule (2,0 x 25»0 cm) und einem Gemisch aus 0,1 m Zitronensäurepuffer (pH 5t7) und Acetonitril als Entwickler entwickelt. Es werden zwei Fraktionen erhalten, die Verbindung 7 bzw. Verbindung 23 enthalten.

Jede dieser Fraktionen wird eingeengt, die Konzentrate werden an 20 ml Amberlite XAD-2 (Organo) adsorbiert, das Harz wird mit Wasser gewaschen, mit Methanol eluiert und die Eluate bis zur Trockne eingeengt. Es werden 52,3 mg der Verbindung 7 und 137»2 mg der Verbindung 23, jeweils als farbloses Pulver, erhalten.

Zu 42,2 mg der pulverförmigen Verbindung 23 werden 20 ml 4 η Natriumhydroxidlösung zugesetzt, das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit 2 η Salzsäure neutralisiert, an 20 ml Diaion HP-20 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, mit 50 %igem Methanol/Wasser eluiert und das Eluat bis zur Trockne eingeengt, wobei39>O mg der Verbindung 13 als farbloses Pulver erhalten \irerden, die mit Verbindung (ill) identisch ist.

Beispiel 9

?Ierstellung der Verbindungen 14, 1, 3 und 19

Zu 67,8 mg der Verbindung (llj) werden 10 ml 0,2 η Salzsäure in Methanol zugesetzt, das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und darn bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser aufgenommen und die Lösung mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit einer Nucleosil 30 C₁Q-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und einem Gemisch von 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 14 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Diese Fraktion wird eingeengt, das Konzentrat wird an 20 ml Amberlite XAD-2 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, dann

mit 50 ^igem Methanol/Wasser eluiert und das Eluat bis zur Trockne eingeengt, wobei 30,6mg Verbindung 14 als farbloses Pulver erhalten werden.

In gleicher Weise werden 74,3 mg der Verbindung 1 aus 91 mg der Verbindung (iv), 5515 mg der Verbindung 3 aus 90,4 mg der Verbindung 2 und 22,3 mg Verbindung 19 aus 33_f8 mg der Verbindung 18 erhalten.

Alternativ werden 11 mg der Verbindung (ill) in 10 ml eines Gemisches aus gleichen Volumina Methanol und Äther suspendiert, Diazomethan wird durch die Lösung geschickt, und wenn sich die Kristalle darin gelöst haben, wird das Gemisch bis zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird mit 0,5 ml Wasser aufgenommen und die Lösung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und Amberlite XAD-2 wie vorstehend gereinigt, wobei 3,6 mg der Verbindung 14 als farbloses Pulver erhalten werden. In gleicher Weise werden 1,9 mg der Verbindung 19 aus 10,5 mg der Verbindung 18 erhalten.

Beispiel 10

Herstellung von Verbindung 15

Zu 200 mg der Verbindung (iv) werden 10 ml N,N-Dimethylformamid und 10 ml 2 η Salzsäure in Butanol zugesetzt, und das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Realctionslösung wird in 200 ml Wasser gelöst, die Lösung wird an 20 ml Amberlite XAD-2 adsorbiert, das Harz wird mit Wasser gewaschen und mit 50 ?6igem Methanol/Wasser eluiert. Die Verbindung 15 enthaltende Fraktion wird bis zur Trockne eingeengt, wobei 72,9 mg der Verbindung 15 als farbloses Pulver erhalten werden.

Beispiel 11

Herstellung von Verbindung 16

Zu 200 mg der Verbindung (ill) werden 10 ml 2 η Salzsäure in Benzylchlorid zugesetzt und das Gemisch über Nacht bei Raumtempe-

ratur gerührt. Die Reaktionslösung wird mit 50 ml eines 1:1-Gemisches von Hexan und Chloroform versetzt, und der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wobei 196,2 mg Masse erhalten werden. Diese wird in 1 ml Dimethylsulfoxid gelöst und die Lösung mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit einer Nucleosil 30 C-n-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und einem Gemisch von Acetonitril und 0,1 m Zitronensäurepuffer als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 16 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Diese wird eingeengt, das Konzentrat an 20 ml Amberlite XAD-2 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen und dann mit Methanol eluiert, und das Eluat wird zur Trockne eingeengt, wobei 19,1 mg der Verbindung i6 als farbloses Pulver erhalten werden.

Gemäß einer alternativen Verfahrensweise werden 200 mg der Verbindung (ill) mit 10 ml Benzylalkohol gemischt, 20 ml Benzol und 100 mg p-Toluolsulfonsäure werden zugesetzt und das Gemisch h Stunden am Rückfluß erhitzt. Der Reaktionslösung werden 100 ml eines Äther/Hexan-Gemisches (1:1) zugesetzt, der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wobei 3^-3»7 mg Masse erhalten werden. Diese wird in 2 ml Dimethylsulfoxid gelöst und die Lösung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit einer Nucleosil 30 C₁Q-SaUIe (2,0 χ 25,0 cm) und einem Gemisch von Acetonitril und 0,1 m Zitronensäurepuffer als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 16 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Diese Fraktion wird eingeengt, das Konzentrat wird an 20 ml Amberlite XAD-2 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, dann mit Methanol eluiert und das Eluat bis zur Trockne eingeengt, wobei 83,8 mg der Verbindung 16 als farbloses Pulver erhalten werden. ;

Beispiel 12

Herstellung von Verbindung 17

Zu 102 mg der Verbindung 1k werden 5 ml konz. Ammoniakwasser zugesetzt und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird mit 6 η Salzsäure neutralisiert und der Hochleistungs-Flüssigke'itschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil 30 C _g-Säule (2,0 χ 25,0 cm) unterzogen und mit einem Gemisch von 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 17 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Diese wird eingeengt, das Konzentrat an 20 ml Diaion HP-20 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, dann mit 50 foigem Methanol/Wasser eluiert und das Eluat bis zur Trockne eingeengt, wobei 48,3 mg der Verbindung 17 als farbloses Pulver erhalten werden.

In gleicher Weise werden 30,8 mg der Verbindung 17 aus 59»6 mg der Verbindung 19 erhalten.

Beispiel 13

Herstellung der Verbindung 18

1,0 g der Verbindung (ill) wird in 20 ml 1 η Salzsäure gelöst und in einem verschlossenen Rohr 7 Stunden bei 100 C erhitzt. Die Reaktionslösung wird bis zur Trockne eingeengt, der Rückstand mit 10 ml Wasser aufgenommen und die Lösung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer PrepPAK-500/C..g-Säule (Waters) und eines Gemisches von 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 18 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Diese wird eingeengt, das Konzentrat mit 6 η Salzsäure auf einen pPI-Wert von 3 eingestellt, an Diabn HP-2O (70 ml) adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, dann mit 50 ^igem Methanol/Wasser eluiert und das Eluat eingeengt. Die erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, wodurch 345,4 mg der· Verbindung 18 in Form farbloser Säulen erhalten werden. Sie hat keinen klaren Schmelzpunkt bis 300 C.

Elementaranalyse für C₂_H₂_N„0_q·2Η_0:

Berechnet C = 52,77 Io H = 5,58 % N = 8,03 # Gefunden C = 53,01 °/o H = 5,83 °/o N = 8,09 Io

Beispiel 14

Herstellung von Verbindung 20

Zu 59,6 mg der Verbindung 19 werden 3 ml konz. Ammoniakwasser zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wird mit 3 ml Wasser verdünnt und durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil 30 C. „-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und eines Gemisches von 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 20 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Diese wird eingeengt, das Konzentrat an 20 ml Diaion HP-20 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen und mit 50 $ig"^em Methanol/Wasser eluiert. Das Eluat wird bis zur Trockne eingeengt, wobei 9,2 mg der Verbindung 20 als farbloses Pulver erhalten werden.

Beispiel 15

Herstellung der Verbindungen 21, 4 und 5

Zu 462,2 mg der Verbindung 19 werden 40 ml Tetrahydrofuran zugesetzt und das Gemisch mit 5OO mg Lithiumborhydrid 6 Stunden

1"VJDVL

-SA-

am Rückfluß erhitzt. Zu der Reaktionslösung wird dann 2 η Salzsäure in Methanol zugesetzt, so daß ein Überschuß an Lithiumborhydrid verbraucht wird. Dann wird das Gemisch bis zur Trockne eingeengt, der Rückstand mit 10 ml Wasser aufgenommen und die Lösung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil 30 C₁Q-SaUIe (2,0 χ 25,0 er und eines Gemisches von 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 21 enthaltende. Fraktion erhalten wird. Diese wird eingeengt, das Konzentrat an 20 ml Diaion HP-20 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, mit 50 folgern Methanol/Wasser eluiert und das Eluat bis zur Trockne eingeengt, wobei 233»6 mg der Verbindung 2"} als farbloses Pulver erhalten werden. In gleicher Weise werden 6,1 mg der Verbindung 4 aus 37 mg der Verbindung 1 sowie .12,0 mg der Verbindung 5 aus k0 mg der Verbindung 3 hergestellt.

Beispiel i6

Herstellung der Verbindungen 22 und 6

Zu 100 mg der Verbindung (ill) werden 5 ml 9S fo±ge Ameisensäure zugesetzt, und unter Eiskühlung und Rühren werden 5 nil Essigsäureanhydrid zugetropft. Dann wird das Gemisch 30 Minuten unter Eiskühlung gerührt und eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Zu der erhaltenen Reaktionslösung werden 10 ml Wasser zugesetzt, das Gemisch wird 10 Minuten gerührt und eingeengt. Das Konzentrat wird durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil 30 C „-Säule und eines Gemisches von 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 22 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Diese wird eingeengt, das Konzentrat an 20 ml Diaion HP-20 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen und mit 50 ^igem Methanol/Wasser eluiert. Das erhaltene die Verbindung 22 enthaltende Eluat wird eingeengt und abfiltriert, wobei 42,2 mg

der Verbindung 22 in Form farbloser Mikronadeln erhalten werden. Sie zeigen keinen klaren Schmelzpunkt bis 300 C.

Elementaranalyse für C₀I₁H₀Z-Ni₁O₀:

Berechnet C = 56,03 <fo H = 5,09 °/o N = 10,89 °/o Gefunden C = 55,87 °/o H = 5,08 % N = 10,94 ?έ

In gleicher Weise werden 24.1 mg der Verbindung 6 aus 60 mg der Verbindung (iv) hergestellt.

Beispiel 17

Herstellung von Verbindung 24

Zu 13^,0 mg der Verbindung 22 werden 10 ml N,N-Dimethylformamid, 100 mg Kaliumcarbonat und 200/ul n-Butylbromid zugesetzt, und das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird neutralisiert und durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil-30 C-g-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und eines Gemisches von 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 24 enthaltende Fraktion erhalten wird. Diese wird eingeengt, das Konzentrat an Amberlite XAD-2 (20 ml) adsorbiert, das .Harz mit Wasser gewaschen und mit Methanol eluiert. Das Eluat wird bis zur Tro.ckne eingedampft, wobei 59,0 mg der Verbindung 24 als farbloses Pulver erhalten werden.

Beispiel 18

Herstellung der Verbindungen 25 und 8

200 mg der Verbindung (ill) werden in 20 ml Wasser gelöst, wonach unter Eiskühiung und Rühren 10 ml Essigsäureanhydrid zugetropft werden. Das Gemisch wird 15 Minuten lang unter Eiskühlung und dann noch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird mit 100 ml ¥asser verdünnt, an 20 ml

COPY

Diaion HP-20 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, mit 50 ^igern Methanol/Wasser eluiert, das die Verbindung 25 enthaltende Eluat bis zur Trockne eingeengt, wobei 15^,9 mg der Verbindung 23 als farbloses Pulver erhalten werden.

In gleicher Weise werden 44,9 mg der Verbindung 8 aus 50 mg der Verbindung (iv) erhalten.

Beispiel 19

Herstellung der Verbindungen 26 und 9

Zu 100 mg der Verbindung (ill) werden 10 ml Methanol und 5 ml Essigsäureanhydrid zugesetzt und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird bis zur Trockne eingeengt, der Rückstand mit 7 ml eines Wasser/Dimethylsulfoxid-Gemisches aufgenommen und die Lösung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil-30 C „-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und eines Gemisches von 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 26 enthaltende Fraktion erhalten wird.' Diese wird eingeengt, das Konzentrat an 20 ml Amberlite XAD-2 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, mit 50 ^igem Methanol/Wasser aluiert und das Eluat bis zur Trockne eingeengt, wobei 57»0 mg der Verbindung 26 in Form eines farblosen Pulvers erhalten wird.

In gleicher Weise werden 23,3 mg der Verbindung 9 aus 50 mg der Verbindung (iv) erhalten.

Beispiel 20

Herstellung der Verbindung 27

Zu 30,6 mg der Verbindung 15 werden 1 ml Pyridin und 100 ;ul Essigsäureanhydrid zugesetzt und das Gemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wird mit 2 ml Wasser

versetzt und durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil 30 C-n-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und eines Gemisches aus 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 27 enthaltende Fraktion erhalten wird. Diese wird eingeengt, das Konzentrat an 20 ml Amberlite XAD-2 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen und ansteigend mit Methanol von Wasser eluiert, wobei eine die Verbindung 27 enthaltende Fraktion erhalten wird. Diese wird eingeengt, und die erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, wobei 12,9 mg der Verbindung 27 in Form farbloser Kristalle erhalten werden.

Beispiel 21

Herstellung der Verbindungen 28 und 11

200 mg der Verbindung (ill) werden in 10 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7»0) gelöst, und die Lösung wird 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 40/ul Acetaldehyd gerührt. Das Gemisch wird mit 100 mg Natriumcyanoborhydrid versetzt und bei Raumtemperatur 20 Minuten gerührt. Dann wird die Lösung zur Trockne eingeengt, der Rückstand in Wasser gelöst und die Lösung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil-30 C g-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und eines Gemisches von 0,1 m Phosphatpuffer (pH 5»7) und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wodurch eine die Verbindung 28 enthaltende Fraktion erhalten wird. Diese wird eingeengt, das Konzentrat an 20 ml Diaion HP-20 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, mit 50 folgern Mefchanol/Wasser eluiert und das Eluat bis zur Trockne eingeengt, wobei 128,9 mg der Verbindung 28 als farbloses Pulver erhalten werden.

In gleicher Weise werden 28,6 mg der Verbindung 11 aus 50 mg der Verbindung (iv) erhalten.

BeisOxel 22

Herstellung der Verbindungen 29 und 30

20Ö mg der Verbindung (ill) werden in 20 ml Wasser gelöst, und die Lösung wird eine Stunde bei Raumtemperatur mit 250 mg N-Bromsuccinimid gerührt. Der in der Reaktionslösung gebildete Niederschlag wird durch Zusatz weniger Tropfen 4 η Ammoniakwasser aufgelöst, und die Lösung wird durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil-30 C „-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und eines Gemisches von 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wobei eine die Verbindung 29 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Diese wird eingeengt, das Konzentrat an 20 ml Amberlite XAD-2 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, mit 50 ^igem Methanol/Wasser eluiert, das die Verbindung 29 enthaltende Eluat eingeengt und die abgeschiedenen Kristalle abfiltriert, wobei 75,8 mg der Verbindung 29 in Form farbloser Säulen erhalten werden. Das Produkt zeigt keinen klaren Schmelzpunkt bis 300° C.

Elementaranalyse für C₀₀H₀-N, 0_oBr«H_o0:

Berechnet C = 47,35 1» H = 4,67 °/o N = 9,60 $> Gefunden C = 46,91 $ H = 4,93 °/o N = 9,57 ^c/o

In gleicher Weise werden 38,6 mg der Verbindung 30 aus 4i,0 mg der Verbindung 18 erhalten.

Beispiel 23

Herstellung der Verbindung 31

Zu 278,7 mg der Verbindung 6 werden 20 ml Ν,Ν-Dimethylformamid, 200 mg Kaliumcarbonat und 500/ul n-Butylbromid zugesetzt, und das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die

-SG-

Reaktionslösung wird neutralisiert und durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil-30 C_i8-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und eines Gemisches von 0,1 m Zitronensäurepuffer und Acetonitril als Entwickler entwickelt, wodurch eine die n-butylierte Substanz enthaltende Fraktion erhalten wird. Diese wird eingeengt und der erhaltene Niederschlag abfiltriert, wobei 52,0 mg Pulver erhalten werden. Zu diesem werden 2 ml k η Natriumhydroxidlösung zugesetzt, das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, neutralisiert und gereinigt durch erneute Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, so daß eine die Verbindung 31 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Diese wird eingeengt, das Konzentrat an 20 ml Amberlite XAD-2 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen und mit 50 ^aigem Methanol/Wasser eluiert. Das die Verbindung 31 enthaltende Eluat wird eingeengt, und die erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, wobei 25,5 mg der Verbindung 31 in Form von farblosen Mikronadeln erhalten werden.

Elementaranalyse für C₂/-HL_?N> On:

Derechnet C = 59,08 'fo H = 6,10 fo N= 10,60 ^c/o Gefunden C = 58,55 fo H = 6,36 ^ N = 10,40 fo

Beispiel Zh

Herstellung der Verbindung 32

Ein Gemisch aus 300 mg der Verbindung (iv) und 100 mg Natriumbicarbonat wird in 10 ml Wasser gelöst, die Lösung mit 5 ml Äther und 200 /ul Carbobenzoxychlorid versetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur gerührt. Nach zwei Stunden wird das Gemisch mit 2 η Salzsäure auf den pH-Wert 3 eingestellt, der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wobei 365 mg eines farblosen Pulvers erhalten werden.

Zu diesen 3^5 »Ο mg farblosem Pulver werden 10 ml Essigsäureanhydrid und 100 mg Katriumacetat zugesetzt, das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann über Eiswasser gegossen und der erhaltene Niederschlag abfiltriert, wobei 383»9 eines farblosen Pulvers erhalten werden.

104,2 mg dieses Pulvers werden in 10 ml eines Gemisches aus Methanol, Essigsäure und Wasser (8:2:1 ) gelöst. Die Lösung wird mit 25 mg 10 ^iger Palladiumkohle versetzt und Wasserstoffgas unter Rühren eingeleitet. Nach 3 Stunden wird die Reaktionslösung abfiltriert und das Filtrat bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit 1 ml Methanol aufgenommen und die Lösung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Nucleosil 30 C „-Säule (2,0 χ 25,0 cm) und eines Gemisches von Acetonitril und 0,1 m Zitronensäurepuffer entwickelt, wobei eine die Verbindung 32 enthaltende Fraktion erhalten wird.

Diese wird eingeengt, das Konzentrat an 20 ml Amberlite XAD-2 adsorbiert, das Harz mit Wasser gewaschen, mit 50 ^r/o±gem Methanol/Wasser eluiert und das Eluat bis zur Trockne eingeengt, wobei 22 mg der Verbindung 32 in Form eines farblosen Pulvers erhalten werden.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnung im einzelnen erläutert. In der Zeichnung ist:

Fig. 1 ein Diagramm der Ultraviolettabsorptionsspektren der Verbindung (ill); darin ist

die Absorption bei dem Lösungsmittel Wasser, die Absorption bei dem Lösungsmittel 0,05 η

Salzsäure und

-—-—.~die Absorption bei dem Lösungsmittel 0,05 η Natriumhydroxid;

Fig. 2 ein Diagramm der Infrarotabsorptionsspektren der Verbindung (ill), geraessen in Kaliumbromid

Fig. 3 ein Diagramm der Protonenresonanzspektren der Verbindung (ill), gemessen in 0,06 η schwerem Ammoniakwasser (innerer Standard: DSS);

1 3

Fig. H die C-kernmagnegischen Resonanzspektren der Verbindung (ill), gemessen in 0,06 η schwerem Ammoniakwasser (innerer Standard: p-Dioxan 67,4 ppm);

Fig. 5 ein Diagramm der Ultraviolettabsorptionsspektren der Verbindung (iv); darin ist

die Absorption bei dem Lösungsmittel ¥asser,

————— die Absorption bei dem Lösungsmittel 0,05 ¹^

Salzsäure und

___.—- — die Absorption bei dem Lösungsmittel 0,05 η Natriumhydroxid;

Fig. 6 ein Diagramm der Infrarotabsorptionsspektren der Verbindung (iv), gemessen in Kaliumbromid;

Fig. 7 ein Diagramm der Protonenresonanzspektren der Verbindung (iv), gernessen in 0,06 η schwerem Ammoniakwasser (innerer Standard: DSS);

Fig. 8 die C-kernmagnetischen Resonanzspektren der Verbindung (iv), gemessen in 0,06 η schwerem Ammoniakwasser (innerer Standard: p-Dioxan 67,4 ppm).

- Leerseite -

Claims

PATENTANWÄLTE

, ^/ve

ey

8O0O MÜNCHEN 22 · Wl D EN MAYERSTRASS E 49

10OO BERLIN-DAHLEM 33 · PODBIELSKIALLEE 68

BERLIN: DIPL.-ING. R. MÜLLER-BÖRNER

MÜNCHEN: DIPL.-ING. HANS-HEINRICH WEY

DIf=L.-ING. EKKEHARD KÖRNER

Takara Shuzo Co., Ltd., und Nippon Shinyaku Co», Ltd.

32 244

Patentansprüche

«\ Peptidartige Verbindungen der allgemeinen Formel

OR¹

(D,

CO -NH-CH- CO-NH

HC-OR⁵ t

. X

•j
in der R ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Acylgruppe mit 1 bis 6

Kohlenstoffatomen; R ein Wasserstoff- oder Halogenatom;

3
R ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl- oder Acylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; R ein

MÜNCHEN: TELEFON (08S) 2SOOSB
KABEL: PROPINDUS · TELEX: 524244

BERLIN: TELEFON (03O) 831 2088 KABELiPROPINDUS-TELEX: 184Ο57

Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; X die C0NH_o-Gruppe, eine ,Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder COOR (wobei R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist); und Y die CONH„-Gruppe, eine Hydroxyalkylgruppe

7 mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder die COOR -Gruppe ist

ty

(wobei R ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder die Benzylgruppe ist), sowie ihre Salze.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die allgemeine Formel

CO-NH-

CH-COOH t

CHCO-IiH

CHOH

CONH_n

(II)

haben, wobei R ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe,

2 3 4 *>
R , R , R und R^ jeweils Wasserstoffatome, X die Gruppe und Y die COOH-Gruppe ist, und ihre Salze.

3. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Formel

OCH

NH₂-CH

CO-NH-CH-CO-NH'
CHOH

hat, und ihre Salze. CONH₂

CH-COOH

(III)

k. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Formel

OH

NH-CH

?^H2

CH-COOH

(IV)

CO-NH-CH-CO-NH CHOH
CONH

hat, und ihre Salze.

Verfahren zum Herstellen der physiologisch aktiven Substanzen der Formel (ill) nach Anspruch 3 oder der Formel (iv) nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein eine Verbindung (il) gemäß Anspruch 2 produzierender Mikroorganismus der Gattung Penicillium in einem Medium kultiviert und aus diesem dann die gewünschte Verbindung (ill) und/oder (iv) gewonnen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß der eine Verbindung (il) produzierende, zur Gattung Penicillium gehörende Mikroorganismus P. rugulosum ist.

7« Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der allgemeinen Formel

CO- NH -CH - CO-NH CHOH
CONH„

(VI),

in der R eine Alkylgruppe rait 1 bis 10 Kohlenstoffatomen,

31
R ein Vasserstoffatom oder eine Acylgruppe mit 1 bis

71
6 Kohlenstoffatomen und R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der allgemeinen Formel

OH

CH

' 7

P-NH-CH CH-COOR

CO -NH-CH - CO - NH (^v)t

CHOH
CONH₂

in der P ein ¥asserstoffatom oder eine Schutzgruppe für

die Aminogruppe und R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, mit einem zum Alkylieren von phenolischen Hydroxylgruppen geeigneten Alkylierungsmittel umgesetzt wird und daß je nach dem gewünschten Endprodukt die Schutzgruppe der Aminogruppe abgespalten und/oder die Estergruppe hydrolysiert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Endprodukt (Vl) eine Verbindung der Formel (ill) ist, wobei bei dem Produkt (Vl) R eine Methylgruppe und

31 71
R und R jeweils Wasserstoffatome sind.

9. Das Immunsystem beeinflussendes Mittel, enthaltend eine peptidartige Verbindung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 als Wirkstoff.

10. Mittel nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff eine Verbindung der allgemeinen Formel (i) ist, bei der R ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe,

R , Η-³^ R und R^ jeweils Wasserstoffatome, X die Gruüpe und Y die COOH-Gruppe ist, oder ihre Salze.