DE3232034C2

DE3232034C2 -

Info

Publication number: DE3232034C2
Application number: DE3232034A
Authority: DE
Inventors: Ronald Eugene Westfield Ind. Us Chance; Bruce Hill Frank; John Allison Indianapolis Ind. Us Galloway
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1981-08-27
Filing date: 1982-08-27
Publication date: 1991-04-11
Also published as: BE894185A; GB2104382B; IE54119B1; IE822064L; AU8759482A; CA1176158A; NL192192C; IT8223017A0; SE460334B; NL192192B; ZA826159B; IT1153182B; NZ201682A; FR2513126A1; CH650679A5; AU551879B2; PH19361A; FR2513126B1; ZW17482A1; SE8204873L

Description

Diabetes mellitus ist eine Stoffwechselstörung, die sich darin äußert, daß das Körpergewebe Kohlenhydrate nicht mehr im normalen Ausmaß oxidieren kann. Sein wichtigster Faktor ist ein Mangel an Insulin. Seit etwa 60 Jahren werden Diabetiker durch Verabreichung bestimmter Mengen an Insulin behandelt. Das hierzu benötigte Insulin wird aus der Bauchspeicheldrüse von Tieren isoliert, und zwar im allgemeinen von Rindern oder Schweinen. Sowohl Rinderinsulin als auch Schweineinsulin unterscheiden sich in ihrer Struktur vom Insulin, das von der Bauchspeicheldrüse des Menschen gebildet wird. Seit kurzem läßt sich durch Rekombinations-DNA-Methodologie auch Insulin erzeugen, das mit dem von der Bauchspeicheldrüse des Menschen gebildeten Insulin identisch ist. Die Verwendung eines solchen Insulins ermöglicht dem Diabetiker eine engere Nachahmung des natürlichen Systems als unter Einsatz der anderen Insuline.

Unabhängig davon ist seit langem bekannt, daß eine Verabreichung von Insulin an einen Diabetiker allein nicht ausreicht, um den normalen Stoffwechselzustand wieder herzustellen und/oder aufrechtzuerhalten. Insulin beeinflußt zwar eindeutig den Metabolismus von Kohlenhydraten, doch sind mit Diabetes mellitus weitere Störungen verbunden, die großteils oder überhaupt insgesamt von der Struktur und Funktion der Blutgefäße abhängen. Die zu diesen Störungen führenden Mängel lassen sich nur selten durch herkömmliche Behandlung mit Insulin vollständig korrigieren.

Die in Verbindung mit Diabetes auftretenden Gefäßabnormitäten werden häufig als Komplikationen von Diabetes bezeichnet. Sie bestehen im allgemeinen in mikroangiopathischen Veränderungen, die zu Schädigungen der Retina und der Niere führen. Neuropathie ist eine weitere Diabeteskomplikation, die mit den beobachteten mikroangiopathischen Veränderungen direkt oder indirekt in Beziehung stehen kann oder auch nicht. Zu Beispielen für spezifische Erscheinungsformen von Diabeteskomplikationen gehören (1) Augenerkrankungen unter Einschluß von Retinopathie, Kataraktbildung, Glaukom und extraocularen Muskellähmungen, (2) Munderkrankungen unter Einschluß von Zahnfleischentzündungen, erhöhtem Zahnkariesbefall, periodontaler Erkrankungen und erhöhter Resorption des Alveolarknochens, (3) motorische, sensorische und autonome Neuropathie, (4) Erkrankung großer Blutgefäße, (5) Mikroangiopathie, (6) Erkrankungen der Haut unter Einschluß von Xanthoma diabeticorum, Necrobiosis lipoidica diabeticorum, Furunkulose, Mykosen und Hautjucken, (7) Erkrankungen der Nieren unter Einschluß diabetischer Glomerulosklerose, arteriolarer Nephrosklerose und Pyelonephritis und (8) Problemen während der Schwangerschaft unter Einschluß der Zunahme der Bildung zu großer Kinder, der Totgeburten, der Fehlgeburten, des Neugeborenensterbens und der angeborenen Defekte.

Manche und möglicherweise sogar alle diabetischen Komplikationen sind eine Folge des Fehlens von Insulin allein, so daß der Körper sein natürliches hormonelles Gleichgewicht nicht mehr bilden kann.

Aufgabe der Erfindung ist nun die Bereitstellung eines pharmazeutischen Mittels, durch das sich die natürliche hormonale Homöostase in einem diabetischen Zustand besser angenähert erreichen und aufrechterhalten läßt als durch Verabreichung von Insulin allein.

Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß gelöst durch ein pharmazeutisches Mittel aus einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger und einer Wirkstoffkombination, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Wirkstoffkombination Human-Insulin und Human-C-Peptid in einem Molverhältnis von etwa 1 : 4 bis etwa 4 : 1 enthält.

Die beiden wesentlichen Bestandteile des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittels sind Human-Insulin und Human-C-Peptid.

Human-Insulin ist über eine Reihe verschiedener Wege zugänglich, beispielsweise durch organische Synthese, Isolierung aus der Bauchspeicheldrüse von Menschen, Umwandlung von Human-Proinsulin, Umwandlung von isoliertem tierischem Insulin und seit neuem auch durch Rekombinations- DNA-Methodologie.

Unter Anwendung der Rekombinations-DNA-Methodologie läßt sich Human-Insulin durch getrennte Expression und Isolierung der A-Kette von Human-Insulin und der B-Kette von Human-Insulin und anschließende geeignete Bildung der Disulfidbindung herstellen. Wahlweise kann das bei der Rekombinations- DNA-Expression erhaltene Produkt auch direkt Human-Proinsulin oder ein Vorläufer für Human-Proinsulin sein, der in Human-Proinsulin umgewandelt wird. Durch anschließende enzymatische Spaltung des Proinsulins, beispielsweise mittels Trypsin oder Carboxypeptidase B gelangt man zu Human-Insulin.

Human-Insulin läßt sich ferner auch aus Schweineinsulin herstellen. Human-Insulin unterscheidet sich von Schweineinsulin durch eine einzige Aminosäure, nämlich durch die an der endständigen Carboxylgruppe der B-Kette befindliche Aminosäure. Zu diesem Zweck ersetzt man die bei Schweineinsulin vorhandene B-30-Aminosäure, nämlich Alanin, durch Threonin. Im einzelnen wird hierzu auf US-PS 32 76 961 hingewiesen.

Der andere aktive Bestandteil des erfindungsgemäßen Mittels, nämlich das Human-C-Peptid, ist ein Teil eines Peptids, das bei Human-Proinsulin vorhanden ist und über die die Ketten A und B des Insulins miteinander verbunden sind. Dieses Peptid, das auch als Verknüpfungspeptid bezeichnet wird, wird während der Bildung von Human-Insulin aus Proinsulin entfernt. Das bei Human-Insulin vorhandene Verknüpfungspeptid hat die folgende Formel

Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu- Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu- Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg.

Das im erfindungsgemäßen Mittel enthaltene Human-C-Peptid unterscheidet sich vom Verknüpfungspeptid durch das Fehlen von vier Aminosäuren, nämlich von zwei Aminosäuren an jedem Ende. Das Human-C-Peptid hat daher folgende Struktur

Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly- Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly- Ser-Leu-Gln.

Das als Bestandteil beim erfindungsgemäßen Mittel benötigt Human-C-Peptid kann durch chemische Synthese hergestellt werden, und hierzu wird beispielsweise auf Diabetes 27 (Suppl. 1), 149 bis 160 (1978) hingewiesen, oder es läßt sich auch aus Human-Proinsulin durch Spaltung bei der Bildung von Human-Insulin erzeugen.

Die wirksamen Bestandteile des erfindungsgemäßen Mittels sind obigen Ausführungen zufolge daher über die verschiedensten Wege zugänglich, beispielsweise auch über Human-Insulin. Die Herstellung von Insulin unter Anwendung der Rekombinations-DNA-Mehtodologie erfordert die Bildung einer Sequenz einer DNA-Codierung für die Aminosäuresequenz von Human-Proinsulin, was sich entweder durch Isolierung, Konstruktion oder eine Kombination aus beidem erreichen läßt. Die Human-Proinsulin-DNA wird dann in Lesephase in einen geeigneten Clonierungs- und Expressionsträger eingesetzt. Der Träger dient zur Transformierung eines geeigneten Mikroorganismus, und der hierbei erhaltene transformierte Mikroorganismus wird dann Fermentationsbedingungen unterzogen, die (a) zur Bildung weiterer Kopien des proinsulingenhaltigen Vektors und (b) zur Expression von Proinsulin oder einem Proinsulinvorläufer führen.

Handelt es sich beim Expressionsprodukt um einen Proinsulinvorläufer, dann erhält ein solches Produkt im allgemeinen die Human-Proinsulinaminosäuresequenz, die an ihrer endständigen Aminogruppe an ein Bruchstück eines Proteins gebunden ist, das normalerweise bei der Gensequenz ausgedrückt wird, bei welcher das Proinsulin eingesetzt worden ist. Die Proinsulinaminosäuresequenz ist an das Proteinbruchstück über eine spezifisch spaltbare Stelle gebunden, bei der es sich normalerweise um Methionin handelt. Dieses Produkt wird gewöhnlich als verschmolzenes Genprodukt bezeichnet.

Die erhaltene Proinsulinaminosäuresequenz wird vom verschmolzenen Genprodukt mittels Cyanogenbromid abgespalten, worauf man die Cysteinsulfhydrylreste der Proinsulinaminosäuresequenz durch übliche Umwandlung in die entsprechenden S-Sulfonate stabilisiert.

Das erhaltene Proinsulin-S-sulfonat wird dann gereinigt, und im Anschluß daran überführt man das gereinigte Proinsulin- S-sulfonat in Proinsulin, indem man die drei erforderlichen Disulfidbindungen an den geeigneten Stellen bildet.

Nach entsprechender Reinigung wird das Proinsulin enzymatisch gespalten, und zwar gewöhnlich unter Verwendung von Trypsin und Carboxypetidase B, wodurch Human-Insulin und Human-C-Peptid gebildet werden.

Das erfindungsgemäße Mittel enthält Human-Insulin und Human-C-Peptid in einem Molverhältnis von etwa 1 : 4 bis etwa 4 : 1. Vorzugsweise beträgt das Molverhältnis von Humaninsulin zu Human-C-Peptid etwa 1 : 2 bis etwa 2 : 1, und insbesondere etwa 1 : 1 bis etwa 2 : 1.

Das erfindungsgemäße Mittel zeichnet sich, wie bereits erwähnt, vor allem dadurch aus, daß sich mit ihm eine natürliche hormonale Homöostase besser erreichen läßt, so daß hierdurch die bekannten Komplikationen von Diabetes unterbunden, wesentlich vermindert oder verzögert werden können. Die zur Aufrechterhaltung einer natürlichen hormonalen Homöostase oder zur Erzielung eines Zustands, der der natürlichen hormonalen Homöostase beim Diabetiker stärker angenähert ist, erforderliche Menge an zu verabreichendem errfindungsgemäßem Mittel ist natürlich abhängig von der Schwere des diabetischen Zustands. Die zu verabreichende Menge hängt u. a. auch vom jeweiligen Verabreichungsweg ab. Letztendlich ist die Menge an zu verabreichendem Mittel und die Häufigkeit einer solchen Verabreichung der Entscheidung des jeweiligen Arztes überlassen. Im allgemeinen wird jedoch ein Dosierungsbereich gewählt, der für etwa 0,02 bis etwa 5 Einheiten an Human-Insulin pro kg Körpergewicht und pro Tag sorgt und der vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 1 Einheiten an Human-Insulin pro kg Körpergewicht und pro Tag ergibt.

Das erfindungsgemäße Mittel wird parenteral verabreicht, beispielsweise subkutan, intramuskulär oder intravenös. Das Mittel enthält die Wirkstoffe, nämlich Human-Insulin und Human-C-Peptid, zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger hierfür und gegebenenfalls auch noch zusammen mit anderen therapeutischen Bestandteilen. Die Gesamtmenge an im erfindungsgemäßen Mittel vorhandenen Wirkstoffen macht etwa 99,99 bis etwa 0,01 Gew.-% aus. Der vorhandene Träger muß mit den anderen Bestandteilen des Mittels verträglich sein und darf natürlich auch zu keiner Beeinträchtigung des Patienten führen.

Erfindungsgemäße Mittel, die sich für eine parenterale Verabreichung eignen, sind am besten sterile wäßrige Lösungen und/oder Suspensionen der pharmazeutisch wirksamen Bestandteile, und diese Lösungen oder Suspensionen sind vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch gemacht, was sich im allgemeinen unter Verwendung von Natriumchlorid, Glycerin, Glucose, Mannit, Sorbit und ähnlicher bekannter Mittel erreichen läßt. Zusätzlich können die Mittel auch noch irgendeine Anzahl an Hilfsstoffen enthalten, wie Puffer, Konservierungsmittel, Dispergierungsmittel, Mittel zur Förderung eines raschen Wirkungsbeginns, Mittel zur Förderung einer verlängerten Wirkungsdauer oder andere bekannte Mittel. Typische Konservierungsmittel sind beispielsweise Phenol, m-Kresol oder Methyl-p-hydroxybenzoat. Beispiele für typische Puffer sind Natriumphosphat, Natriumacetat oder Natriumcitrat.

Ferner können auch entsprechende Mittel zur geeigneten Einstellung des pH-Werts vorhanden sein, beispielsweise Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, oder Basen, wie Natriumhydroxid. Der pH-Wert entsprechender wäßriger Mittel liegt im allgemeinen zwischen etwa 2 und 8, vorzugsweise etwa 6,8 und 8,0.

Andere geeignete Zusätze sind beispielsweise zweiwertige Zinkionen, die falls überhaupt vorhanden, im allgemeinen in einer Menge von etwa 0,01 bis 0,5 mg/100 Einheiten Human-Insulin anwesend sind, oder Protaminsalze, beispielsweise in Form des Sulfats, die, falls überhaupt, im allgemeinen in einer Menge von etwa 0,1 bis 2 mg/100 Einheiten Human-Insulin vorliegen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert.

Beispiel 1 Formulierung aus neutralem regulärem Human-Insulin und Human-C-Peptid (Molverhältnis von Human-Insulin zu Human-C-Peptid 1 : 4, 40 Insulineinheiten pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml dieser Formulierung vermischt man

Human-Zinkinsulin (28 E/mg)\|400 E
Human-C-Peptid	30 mg
Phenol, destilliert	20 mg
Glycerin	160 mg

Wasser und entweder 10%ige Chlorwasserstoffsäure oder 10%iges Natriumhydroxid in solcher Menge miteinander, daß sich eine Zusammensetzung mit einem Volumen von 10 ml und einem End-pH-Wert von 7,0 bis 7,8 ergibt.

Beispiel 2 Formulierung aus neutralem regulärem Human-Insulin und Human-C-Peptid (Molverhältnis von Human-Insulin zu Human- C-Peptid 1 : 1, 100 Insulineinheiten pro ml)

Zur Herstellung von 10 ml dieser Formulierung vermischt man

Human-Zinkinsulin (28 E/mg)\|1000 E
Human-C-Peptid	19 mg
Phenol, destilliert	20 mg
Glycerin	160 mg

Beispiel 3 Formulierung aus Protamin, human-Zinkinsulin und Human-C-Peptid (Molverhältnis von Human-Insulin zu Human-C-Peptid 1 : 1, 40 Insulineinheiten pro ml)

Zur Herstellung von 10 ml dieser Formulierung vermischt man

Human-Zinkinsulin (28 E/mg)\|400 E
Human-C-Peptid	8 mg
Phenol, destilliert	25 mg
Zinkoxid	0,78 mg
Glycerin	160 mg
Protaminsulfat	4,0 bis 6,0 mg
Natriumphosphat, Kristalle	38 mg

Wasser und entweder 10%ige Chlorwasserstoffsäure oder 10%iges Natriumhydroxid in solcher Menge miteinander, daß sich eine Zusammensetzung mit einem Volumen von 10 ml und einem End-pH-Wert von 7,1 bis 7,4 ergibt.

Beispiel 4

1

Formulierung aus Protamin, Human-Zinkinsulin und Human-C-Peptid (Molverhältnis von Human-Insulin zu Human-C-Peptid 2 : 1, 100 Insulineinheiten pro ml)

Zur Herstellung von 10 ml dieser Formulierung vermischt man

Human-Zinkinsulin (28 E/mg)\|1000 E
Human-C-Peptid	9 mg
Phenol, destilliert	25 mg
Zinkoxid	2,0 mg
Glycerin	160 mg
Protaminsulfat	10 bis 15 mg
Natriumphosphat, Kristalle	38 mg

Beispiel 5 Formulierung aus Isophanprotamin, Human-Zinkinsulin und Human-C-Peptid (Molverhältnis von Human-Insulin zu Human-C-Peptid 1 : 1, 40 Insulineinheiten pro ml)

Zur Herstellung von 10 ml dieser Formulierung vermischt man

Human-Zinkinsulin (28 E/mg)\|400 E
Human-C-Peptid	8 mg
m-Kresol, destilliert	16 mg
Phenol, destilliert	6,5 mg
Glycerin	160 mg
Protaminsulfat	1,2 bis 2,4 mg
Natriumphosphat, Kristalle	38 mg

Beispiel 6 Formulierung aus Isophanprotamin, Human-Zinkinsulin und Human-C-Peptid (Molverhältnis von Human-Insulin zu Human-C-Peptid 4 : 1, 100 Insulineinheiten pro ml)

Zur Herstellung von 10 ml dieser Formulierung vermischt man

Human-Zinkinsulin (28 E/mg)\|1000 E
Human-C-Peptid	5 mg
m-Kresol, destilliert	16 mg
Phenol, destilliert	6,5 mg
Glycerin	160 mg
Protaminsulfat	3,0 bis 6,0 mg
Natriumphosphat, Kristalle	38 mg

Beispiel 7 Zink-Humaninsulin-Suspension: Human-C-Peptid-Formulierung (Molverhältnis von Human-Insulin zu Human-C-Peptid 1 : 2, 40 Insulineinheiten pro ml)

Zur Herstellung von 10 ml dieser Formulierung vermischt man

Human-Zinkinsulin (28 E/mg)\|400 E
Human-C-Peptid	15 mg
Natriumacetat, wasserfrei	16 mg
Natriumchlorid, Granulat	70 mg
Methyl-p-hydroxybenzoat	10 mg
Zinkoxid	0,63 mg

Wasser und entweder 10%ige Chlorwasserstoffsäure oder 10%iges Natriumhydroxid in solcher Menge miteinander, daß sich eine Zusammensetzung mit einem Volumen von 10 ml und einem End-pH-Wert von 7,2 bis 7,5 ergibt.

Beispiel 8 Zink-Humaninsulin-Suspension: Human-C-Peptid-Formulierung (Molverhältnis von Human-Insulin zu Human-C-Peptid 1 : 1, 100 Insulineinheiten pro 100 ml)

Zur Herstellung von 10 ml dieser Formulierung vermischt man

Human-Zinkinsulin (28 E/mg)\|1000 E
Human-C-Peptid	19 mg
Natriumacetat, wasserfrei	16 mg
Natriumchlorid, Granulat	70 mg
Methyl-p-hydroxybenzoat	10 mg
Zinkoxid	1,6 mg

Beispiel 9 Formulierung aus neutralem regulärem Human-Insulin und Human-C-Peptid (Molverhältnis von Human-Insulin zu Human-C-Peptid 1 : 4, 40 Insulineinheiten pro ml)

Zur Herstellung von 10 ml dieser Formulierung vermischt man

Human-Natriuminsulin (28 E/mg)\|400 E
Human-C-Peptid	30 mg
Phenol, destilliert	20 mg
Glycerin	160 mg

Wasser und entweder 10%ige Chlorwasserstoffsäure oder 10%iges Natriumhydroxid in solcher Menge miteinander, daß sich eine Zusammensetzung mit einem Volumen von 10 ml und einem End-pH-Wert von 7,01 bis 7,8 ergibt.

Beispiel 10 Formulierung aus neutralem regulärem Human-Insulin und Human-C-Peptid (Molverhältnis von Human-Insulin zu Human-C-Peptid 1 : 1, 100 Insulineinheiten pro ml)

zur Herstellung von 10 ml dieser Formulierung vermischt man

Human-Natriuminsulin (28 E/mg)\|1000 E
Human-C-Peptid	19 mg
Phenol, destilliert	20 mg
Glycerin	160 mg

Wasser und entweder 10%ige Chlorwasserstoffsäure oder 10%iges Natriumhydroxid in solcher Menge miteinander, daß sich eine Zusammensetzung mit einem Volumen von 10 ml und einem End-pH-Wert von 7,07,1 bis 7,8 ergibt.

Claims

1. Pharmazeutisches Mittel aus einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger und einer Wirkstoffkombination, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoffkombination Human-Insulin und Human-C-Peptid in einem Molverhältnis von etwa 1 : 4 bis etwa 4 : 1 enthält.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von Human-Insulin zu Human-C-Peptid etwa 1 : 2 bis etwa 2 : 1 beträgt.

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von Human-Insulin zu Human-C-Peptid etwa 1 : 1 bis etwa 2 : 1 beträgt.

4. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zweiwertige Zinkionen enthält.

5. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Protaminsalz enthält.