SE460334B - Farmaceutiska preparat, innefattande humant insulin och human c-peptid - Google Patents

Description

460 334 , 2 barnen ökad frekvens av hög födelsevikt, dödfödda barn, missfall, un, neonatal död och medfödda defekter hos barnen.

Många och kanske alla komplikationerna av diabetes uppkommer på grund av att insulinet ensamt i sig självt icke förmår återstäl-. la den naturliga hormonbalansen i kroppen. I Föreliggande uppfinning avser farmaceutiska kompositioner, som bättre än insulin administrerat ensamt för sig självt förmår åstadkomma och upprätthålla naturlig hormonhomeostas hos en dia- betespatient. ' Uppfinningen avser således en farmaceutisk komposition, vilken tillsammans med en farmaceutiskt acceptabel bärare omfattar humant insulin och human C-peptid i ett molförhållande humant insulin : human C-peptid inom intervallet från ca lzü till ca Uzl.

De båda viktiga beståndsdelarna av de farmaceutiska kompo- sitioner, som avses enligt föreliggande uppfinning, är humant insu- lin och human C-peptid. i Humant insulin kan erhållas på olika sätt, bl.a. genom orga- niska synteser, isolering ur humana bukspottkörtlar, omvandling av humant proinsulin, omvandling av isolerat animaliskt insulin samt - sedan någon tid tillbaka - genom rekombinant-DNA-teknik.

Med användning av rekombinant-DNA-teknik kan humant insulin framställas genom separat expression och isolering av å ena sidan A-kedjan i humant insulin och å andra sidan B-kedjan i humant insu- lin, med efterföljande upprättande av deras speciella disulfidbryg- gor. Alternativt kan den medelst rekombinant-DNA-tekniken bildade produkten vara själva det humana proinsulinet som sådant eller en prekursor till humant proinsulin, vilken sedan omvandlas till humant proinsulin. Därefter spjälkas proinsulinet enzymatiskt, t.ex. med användning av trypsin och karboxipeptidas B, till bildning av hu- mant insulin.

Man kan även framställa humant insulin utgående från insulin från svin. Humant insulin skiljer sig från svin-insulinet med av- flseendefpå.en enda aminosyra, närmare bestämt i fråga om den amino- syra, som befinner sig vid B-kedjans karboxylände. Alanin, som är B-50 aminosyran i svin-insulin, avspjälkas och ersättes med treonin.

Se härtill exempelvis U.S.-patentet 3.276.961.

Den andra aktiva beståndsdelen i den enligt uppfinningen av- Ã sedda kompositionen,nämligen den humana C-peptiden, är en del av en peptid som ingår i humant proinsulin och till vilken insulinets M 460 334 5 A- och B-kedjor är knutna. Denna peptid; som kallas "förbindelse- peptid" (connecting peptide), avlägsnas i samband med att humant insulin framställes ur proinsulin. Förbindelsepeptiden i humant proinsulin har formeln _ Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu- ' Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu- Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg.

Den humana C-peptid, som ingår i kompositionen enligt före- liggande uppfinning, skiljer sig från förbindelsepeptiden genom att fyra aminosyror är eliminerade, två vid vardera änden. Den humana C-peptiden har sålunda följande struktur: Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly- Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala- Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln.4 Den humana C-peptiden, som ingår i kompositionen enligt upp- finningen, kan framställas genom kemisk syntes; se t.ex. N. Yanaihara, C. Yanaihara, M. Sakagami, N. Sakura, T. Hashimoto och T. Nishida i Diabetes gl (suppl. 1), 149-160 (1978). Den kan även framställas ur humant proinsulin, varvid den erhålles till följd av att den avspjälkas vid framställning av humant insulin.

De aktiva beståndsdelarna i kompositionen enligt uppfinning- en kan således erhållas på flera olika sätt, såsom ovan visats, bl. a. ur humant proinsulin. Framställning av insulin medelst rekombi- nant-DNA-teknik kan i generella ordalag sägas innebära följande: Man iordningställer eller bereder en DNA-sekvens, som kodar för human-proinsulinets aminosyrasekvens, varvid nämnda DNA-sekvens kan erhållas genom isolering, konstruktion eller en kombination av båda dessa tillvägagångssätt. Den för humant proinsulin kodande DNA insättes sedan i läsfas i en lämplig klonings- och expressions- bärare. Bäraren användes för transformering av en lämplig mikro- organism, varefter den transformerade mikroorganismen underkastas sådana jäsníngsbetingelser som resulterar i a) bildande av ytterli- gare exemplar (kopior) av den proinsulin-genen innehållande bäraren och b) expression (dvs. bildande) av proinsulin eller en proinsulin- prekursor.

Om nämnda expressionsprodukt enligt b) är en proinsulinpre- kursor, innefattar den i regel det humana proinsulinets aminosyra- sekvens bunden vid sin aminogruppände till ett fragment av ett pro- produkt". 460 334 s § 2 Ä g å tein, vars expression eller bildning normalt är kodad inom den gen- , sekvens, i vilken proinsulin-genen har insatts. Proinsulinets ami- nosyrasekvens är förbunden med ifrågavarande proteinfragment genom ett specifikt spjälkbart förbindningsställe, i typiska fall metionin.

Denna produkt kallas ofta "fused gene productÜ, (dvs. produktlfrån s.a.s. inbördes "hopsmålta" gener), i det följande förkortat "f.g.- Proinsulin-aminosyrasekvensen avspjälkas från f.g.-produkten med användning av cyanogenbromidfi varefter proinsulin-aminosyra- sekvensens cysteinsulfhydrylgrupper stabiliseras genom att de över- föres till motsvarande S-sulfonater: Det erhållna proinsulin-S-sulfonatet renas, och det renade proinsulin-S-sulfonatet omvandlas sedan till proinsulin genom upp- ' rättande av de tre disulfidbryggorna på deras rätta ställen.

När proínsulinet har renats spjälkas detsamma enzymatískt.

I typiska fall använder man härvid trypsin och karboxipeptidas B. E Man erhåller då humant insulin och human C-peptid.

I Kompositionerna enligt föreliggande uppfinning innehåller ; humant insulin och human C-peptid i ett molförhâllande inom området från ca lzü till ca Äzl. Företrådesvis ligger förhållandet humant insulin : human C-peptid i intervallet från ca 1:2 till ca 2:1, allra helst från ca 1:1 till ca 2:1. 1 g Såsom ovan angivits är kompositionerna enligt uppfinningen värdefulla för befrämjande av naturlig hormonhomeostas och därigenom Ä för förhindrande eller avsevärd minskning eller fördröjning av de fenomen, som befunníts vara komplikationer av diabetes. Beträffande den mängd av kompositionerna enligt uppfinningen, som behövs anting- en för upprätthållande av naturlig hormonhomeostas eller för upp- nående av ett sådant tillstånd hos diabetikern, vilket ligger närmare det naturliga hormonhomeostastillståndet, så gäller givetvis att denna mängd kommer att bli beroende av diabetessjukdomens svårhets- grad. Dessutom varierar mängden av kompositionen i beroende av Ü ådministreringssättet. Det blir i sista hand den enskilde läkaren, i som får avgöra i hur stor mängd och hur ofta kompositionen skall ad- ministreras. Dock kan sägas att doseringen i allmänhet kommer att ligga i det intervall, som ger från ca 0,02 till ca 5 enheter humant insulin per kg kroppsvikt per dygn, företrädesvis från ca 0,1 till e ca 1 enhet humant insulin per kg kroppsvikt per dygn. fu .ua 460 334 5 Kompositionen administreras parenteralt, inkl. subkutana, intramuskulära och íntravenösa adminístreríngar. Kompositionerna enligt uppfinningen omfattar de aktiva beståndsdelarna, dvs. humant insulin och human C-peptid, tillsammans med en farmaceutiskt accep-. tabel bärare för dem samt eventuellt andra terapeutiska bestånds- Den totala mängden aktiva beståndsdelar i kompositionen Bära- delar. ligger i intervallet från ca 99,99 till ca 0,01 viktprocent. ren måste vara acceptabel í den bemärkelsen att den är kompatibel med andra komponenter i kompositionen och icke skadar mottagaren.

Kompositioner enligt uppfinningen, vilka är lämpliga för parenteral administrering, kan lämpligen innefatta sterila vatten- lösningar och/eller -suspensioner av de farmaceutiskt aktiva be- ståndsdelarna, vilka lösningar eller suspensioner företrädesvis göres isotoniska med mottagarens blod; härvid användes vanligen natriumklorid, glycerol, glukos, mannitol, sorbitol och liknande kända medel. Dessutom kan kompositionerna innehålla vilka som helst bland olika valbara adjuvanter, såsom buffertar, konserveringsmedel, dispergeringsmedel, medel som befrämjar en snabbt inträdande verkan, medel som befrämjar långvarig verkan samt andra kända medel. Ty- piska konserveringsmedel är t.ex. fenol, m-kresol, metyl-p-hydroxi- bensoat m.m. Typiska buffertar är t.ex. natriumfosfat, natrium- acetat, natriumcitrat m.m.

Dessutom kan man för pH-inreglering använda en syra, såsom klorvätesyra, eller en bas, såsom natriumhydroxid. I regel ligger den vattenhaltiga kompositionens pH i intervallet från ca 2 till ca 8, företrädesvis i intervallet från ca 6,8 till ca 8,0.

Andra lämpliga tillsatser är exempelvis tvåvärd zinkjon, som vanligtvis ingår - om den ingår - i en mängd från ca 0,01 mg till ca 0,5 mg per 100 enheter humant insulin; samt protaminsalt (t.ex. i form av dess sulfat), som vanligtvis ingår - om det ingår - i en mängd från ca 0,1 mg till ca 2 mg per 100 enheter humant insulin.

Exempel på speciella farmaceutiska kompositioner enligt upp- finningen anges i nedanstående utföringsexempel. freparat med neutralt reguljärt humant insulinzhuman : human C-peptid Exempel 1: C-peptid (molförhålkufie humant insulin uppgår till 1:ü; Ä0 enheter insulin per ml) För beredning av 10 ml komposition blandas 460 534 " 6 humant zinkinsulin (28 enheter/mg) H00 enheter human C-peptid 30 mg I fenol, destillerad 20 mg glycerol - 160 mg vatten och antingen 10%-ig klorvätesyra eller 10%-ig natrium-' hydroxid i tillräckliga mängder för erhållande av en komposition vars volym är 10 ml och vars slutliga pH är 7,0-7,8. ;Éxempel 2:2 Preparat med neutralt reguljärt humant insulinzhuman C-peptid (molförhållande humant insulin : human C- _ peptid uppgår till 1:1; 100 enheter insulin per ml) För beredning av 10 ml komposition blandas humant zinkinsulin (28 enheter/mg) . 1000 enheter human C-peptid 19 mg fenol, destillerad ° 20 mg glycerol 160 mg vatten och antingen 10%-ig klorvätesyra eller 10%-ig natrium- hydroxid i tillräckliga mängder för erhållande av en komposition vars volym är 10 ml och vars slutliga pH är 7,0-7,8.

Exempel 3: Preparat med protamin, zink-humaninsulin : human C- peptid (molförhållande humant insulin : human C-peptid uppgår till 1:1; H0 enheter insulin per ml) För beredning av 10 ml komposition blandas humant zinkinsulin (28 enheter/mg) _ N00 enheter human Cfpeptid 8 mg fenol, destillerad _25 mg zinkoxid 0,78 mg glycerol- 160 mg protaminsulfat * ü,0-6,0 mg natriumfosfat, kristaller 38 mg vatten och antingen 10%-ig klorvätesyra eller 10%-ig natrium- hydroxid i tillräckliga mängder för erhållande av en komposition vars volym är 10 ml och vars slutliga pH är 7,1-7,H. gExempel¥H;; Preparat med protamin, zink-humaninsulin : human C- _peptid (molförhållande humant insulin : human C-peptíd iuppgår till 2:1; 100 enheter insulin per ml) För beredning av 10 ml komposition blandas (2- ...O 460 334 7 humant zinkinsulin (28 enheter/mg) 1000 enheter human C-peptid 9 mg fenol, destillerad 25 mg zinkoxid 2,0 mg glycerol . 160 mg ' protaminsulfat 10-15 mg natriumfosfat, kristaller 38 mg vatten och antingen 10%-ig klorvätesyra eller 10%-ig natrium- hydroxid i tillräckliga mängder'för erhållande av en komposition vars volym är 10 ml och vars slutliga pH är 7,1-7,ü.

Preparat med isofanšrotamin, zink-humaninsulin : human C-peptid (molförhållande humant insulinzhuman C-peptid uppgår till 1:1; 40 enheter insulin per ml) Exempel 5: För beredning av 10 ml komposition blandas humant zinkinsulin (28 enheter/mg) H00 enheter human C-peptid 8 mg m-kresol, destillerad 16 mg fenol, destillerad 6,5 mg glycerol 160 mg protaminsulfat 1,2-2,U mg natriumfosfat, kristaller 38 mg vatten och antingen 10%-ig klorvätesyra eller 10%-ig natrium- hydroxid i tillräckliga mängder för erhållande av en komposition vars volym är 10 ml och vars slutliga pH är 7,1-7,ü.

Preparat med isofaflprotamin, zink-humaninsulin : human C-peptid (molförhållande humant insulin : human C-pep- tid uppgår till ü:1; 100 enheter insulin per ml) Exempel 6: För beredning av 10 ml komposition blandas humant zinkinsulin (28 enheter/mg) 1000 enheter human C-peptid 5 mg m-kresol, destillerad 16 mg fenol, destillerad 6,5 mg glycerol 160 mg protaminsulfat 3,0-6,0 mg natriumfosfat, kristaller 38 mg vatten och antingen 10%-ig klorvätesyra eller 10%-ig natrium- hydroxid i tillräckliga mängder för erhållande av en komposition vars volym är 10 ml och vars slutliga pH är 7,1-7,H. 46-0 334 8 Exempel 7: Preparat med zink-humaninsulinsuspension : human C- peptid (molförhållande humant insulin : human C-peptid 'uppgår till 1:2; 00 enheter insulin per ml) För beredning av 10 ml komposition blandas~ humant zinkinsulin 28 enheter/mg) 400 enheter ' human C-peptid 15 mg natriumacetat, vattenfritt '16 mg natriumklorid; granulär 70 mg metyl-p~hydroxibensoat - * 10 mg zinkoxid 0,63 mg vatten och antingen 10%-ig klorvätesyra eller 10%~ig natrium- hydroxid i tillräckliga mängder för erhållande av en komposition *vars volym är 10 ml och vars slutliga pH är 7,2-7,5.

Exempel 8. Preparat med zink-humaninsulinsuspension : human C- peptid (molförhållande humant insulin : human C-peptid uppgår till 1:1; 100 enheter insulin per ml) För beredning av 10 ml komposition blandas humant zinkinsulin (28 enheter/mg) 1000 enheter human C-peptid ' 19 mg natriumacetat, vattenfritt 16 mg natriumklorid, granuläri 70 mg metyl-p-hydroxibensoat 10 mg zinkoxid ' 7 1,6 mg vatten och antingen 10%-ig klorvätesyra eller 10%-ig natrium- hydroxid i tillräckliga mängder för erhållande av en komposition vars volym är 10 ml och vars slutliga pH är 7,2-7,5.

Exempel 9: Preparat med neutralt reguljärt humant insulin : human C-peptid (molförhållande humant insulin : human C-peptid uppgår till 1:ü; 40 enheter insulin per ml) För beredning av 10 ml komposition blandas humant natriuminsulin (28 enheter/mg) H00 enheter human C-peptid ' 30 mg fenol,*destillerad 20 mg glycerol n1_ 160 mg vatten och antingen 10%-igiklorvätesyra eller 10%-ig natrium- hydroxid i tillräckliga mängder för erhållande av en komposition vars volym är 10 ml och.vars slutliga pH är 7,0-7,8.

(J nn'- Im u

Claims (5)

9 » 460 334 Exempel 10: Preparat med neutralt reguljärt humant insulin : human C-peptid (molförhållande humant insulin : human C-peptid uppgår till 1:1; 100 enheter insulin per ml) För beredning av 10 ml komposition blandas . humant natriuminsulin (28 enheter/mg) 1000 enheter human C-peptid ' 19 mg fenol, destíllerad 20 mg glycerol 160 mg vatten och antingen 10%-ig klorvåtesyra eller 10%-ig natrium- hydroxid i tillräckliga mängder för erhållande av en komposition vars_volym är 10 ml och vars slutliga pH är 7,0-7,8. P a t e n t k r a v

1. Farmaceutisk komposition, k ä n n e t e c k n a d a v att den tillsammans med en farmaceutiskt acceptabel härare såsom aktiva komponenter innehåller humant insulin och human C-peptid i ett molförhållande humant insulin : human C-peptid från 1:4 till 4:1.

2. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att molförhållandet humant insulin : human C-peptid är från 1:2 till 2:1.

3. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att molförhällandet humant insulin : human C-peptid är från 1:1 till 2:1.

4. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att den innehåller tvåvärd zinkjon.

5. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att den innehåller protaminsalt.