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Beschreibung
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Enzym-katalysierte Reaktionen weisen den Vorteil auf, daß sie mit
großer chemischer Spezifität unter relativ milden Bedingungen ablaufen und häufig
das vollbringen, was man als schwierig, wenn nicht unmöglich, findet, im Laboratorium
zu wiederholen. Aus diesen Gründen besteht ein wachsendes Interesse an der Verwendung
enzymatischer Verfahren in gewerblichen Maßstab. Ein Beispiel, das genannt werden
kann, ist die Umwandlung von Glucose in Fructose, unter Verwendung von Glucoseisomerase.
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Enzyme sind wasserlöslich und wenn sie nur in wässrigen Lösungen verwendet
werden, ist die Gewinnung von Enzymen zur Wiederverwendung s-chwierig und kostspielig.
Die nur einmalige Verwendung des Enzyms führt zu einem Verfahren, das relativ kostspielig
ist. Es wurden daher viele Techniken zur Immobilisierung des Enzyms derart entwickelt,
daß die wesentliche enzymatische Wirksamkeit entwickelt wird, während das Enzym
selbst in starrer Form an einen wasserunlöslichen Träger befestigt bleibt, wodurch
die Wiederverwendung des Enzyms während wesentlicher Zeiträume und für wesentliche
Beschickungsmengen
ermöglicht wird. Ein Beispiel für ein Verfahren
zur Immobilisierung eines Enzyms findet sich in der US-PS 4 141 857, wo ein Polyamin
an ein Metalloxid, wie Aluminiumoxid, absorbiertwird, mit einem Überschuß eines
bifunktionellon Reagens, wie Glutaraldehyd, behandelt wird, um das Amin zu vernetzen
und anschließend die Masse mit Enzym zur Bildung von kovalenten Bindungen zwischen
den anhängenden Aldehydgruppen und einer Aminogruppe des Enzyms in Kontakt gebracht
wird. Die Trägermatrix, die gemäß der vorstehenden Verfahrensweise hergestellt wird,
ist gut brauchbar zur Immobilisierung von reaktiven chemischen Einheiten,wobei Enzyme
nur eine Klasse derartiger chemischer Einheiten sind.
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Im allgemeinen werden immobilisierte Enzymsysteme hergestellt durch
Kontakt einer geeigneten Lösung, die das Enzym enthält, mit der Trägermatrix, Entfernen
des Überschusses an Enzymlösung und Wiedergewinnen des resultierenden immobilisierten
Enzymsystems. Aufgrund der relativ hohen Kosten der Enzyme ist es sehr günstig,
eine maximale Enzymverwertung zu erzielen. Unter den identifizierbaren Charakteristika,
die die Enzymverwertung in einem immobilisierten Enzymsystem bemessen, finden sich
die Aktivität und die Halbwertszeit des immobilisierten Enzymsystems sowie die Kupplungswirksamkeit
des Enzyms an die Trägermatrix. Im Rahmen der Erfindung hat es sich gezeigt, daß
die Vorbehandlung einer Trägermatrix mit einer Quelle für zweiwertige Magnesiumionen
die Verwertung und die Immobilisierung von Glucoseisomerase erhöht.
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Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Immobilisierung
von Glucoseisomerase an einer Trägermatrix. Eine Ausführungsform besteht darin,
die Trägermatrix mit einer Lösung in Kontakt zu bringen, die zwei-
wertige
Magnesiumionen enthält, den Überschuß der Lösung zu entfernen und die resultierende,
mit Magnesium imprägnierte Trägermatrix zu gewinnen. Gemäß einer spezielleren Ausführungsform
ist das Salz Magnesiumsulfat. Gemäß einer weiteren spezielleren Ausführungsform
wird die Trägermatrix mit mindestens 0,1 Millimol zweiwertigen Magnesiumionen pro
Gramm Trägermatrix imprägniert. Weitere Ziele bzw. Gegenstände und Ausführungsformen
der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
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Ein immobilisiertes Enzymsystem besteht aus einer Trägermatrix, an
die ein Enzym gebunden ist. Eine Trägermatrix ist eine Struktur, die durch gute
physikalische Integrität und günstige Eigenschaften bezüglich der Flüssigkeitsströmung
unter Bedingungen, die in Festbettreaktoren vorliegen, aufweisen und ist weiter
charakterisiert durch die Fähigkeit, Enzyme mit einer minimalen Störung der enzymatischen
Wirkung zu binden oder zu immobilisieren. Unter einem immobilisierten Enzymsystem
versteht man eine Struktur, die aus der Immobilisierung eines Enzyms an einer Trägermatrix
resultiert.
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Die Bindung oder Immobilisierung von Enzymen an Trägermatrices wird
durch die Extreme der physikalischen und chemischen Bindungskräfte repräsentiert.
Es versteht sich , daß in den meisten Fällen die Enzymimmobilisierung aus einer
Kombination derartiger Bindekräfte entsteht, obwohl häufig eine derartige Kraft
vorwiegt. Die Natur der Enzymimmobilisierung wird allgemein durch die Natur der
Trägermatrix bestimmt. Ist beispielsweise die Trägermatrix ein Harz, wie eines vom
Typ Phenol-Formaldehyd, so erfolgt die Bindung vorwiegend durch physikalische Kräfte,
Ein ähnliches Ergebnis erzielt man, wenn die
Trägermatrix vom Ionenaustauscher-Typ
ist. Besteht die Trägermatrix aus einem feuerfesten anorganischen Material, wie
anorganischen Oxiden, Glas und Keramikmaterialien, die organisches Material tragen
oder damit imprägniert sind, toispielsweise Polyamine, die entweder anhängende funktionelle
Gruppen selbst tragen, oder mit einem bifunktionellen Reagens vernetzt sind,das
anhängende funktionelle Gruppen ergibt, so wird die Enzymimmobilisierung hauptsächlich
durch chemische Reaktion einer Stelle des Enzyms mit der anhängenden funktionellen
Gruppe unter Bildung einer kovalenten Bindung bewirkt.
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In einem derartigen Fall erfolgt die Bindung zumindest vorwiegend
auf chemische Weise.
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Im Rahmen der Erfindung hat es sich gezeigt, daß die Imprägnierung
der Trägermatrix mit zweiwertigen Magnesiumionen, wie durch Kontakt der Trägermatrix
mit einer Lösung, die zweiwertige Magnesiumionen liefert, die anschließende Immobilisierung
von Glucoseisomerase an die Trägermatrix verstärkt, wobei die Verstärkung vorwiegend
in der erhöhten Halbwertszeit der immobilisierten Glucoseisomerase zum Ausdruck
kommt. Darüberhinaus kann die Vorbehandlung zu einer verringerten Immobilisierungszeit
für die Glucoseisomerase führen. Es ist ersichtlich, daß die Bewirkung einer verlängerten
Halbwertszeit sehr vorteilhaft ist und zu einer wesentlichen Verbesserung eines
immobilisierten Glucoseisomerasesystems führt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf sämtliche Trägermatrices ,
unabhängig von deren Natur, anwendbar. Es ist besonders anwendbar auf Trägermatrices,
die aus porösen feuerfesten anorganischen Oxiden, wie Aluminiumoxid, Thoriumoxid,
Magnesiumoxid, Siliciumdioxid und Kombinationen davon, Glas oder keramischen Materialien
bestehen,
die ein Polyamin tragen oder damit imprägniert sind,
das mit einem Überschuß eines bifunktionellen Reagens behandelt ist, um das Polyamin
zu vernetzen und zahlreiche funktionelle Gruppen zu bilden, die an dem gebildeten
Polymeren anhängen. Unter geeigneten Polyaminen finden sich Materialien, wie Polyäthylenimin,
Polypropylenimin, Tetraäthylenpentamin, Ethylendiamin, Diäthylentriamin, Triäthylentetramin,
Pentaäthylenhexamin, Hexamethylendiamin, Phenylendiamin und Amino-(polystyrol),
wobei Polyäthylenimin ein besonders bevorzugtes Polyamin ist. Unter den verwendeten
bifunktionellen Reagentien können genannt werden Glutaralaehyd, Succindialdehyd,
Terephthalaldehyd, und T5luoldiisocyanat, wobei Glutaraldehyd häufig das bifunktionelle
Reagens der Wahl darstellt.
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Kurz gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung die Imprägnierung
einer Trägermatrix mit zweiwertigen Magnesiumionen, wie durch Kontakt einer Trägermatrix
mit einer Lösung, die zweiwertige Magnesiumionen liefert, Entfernen des Überschusses
dieser Lösung und Wiedergewinnen der resultierenden mit Magnesium imprägnierten
Trägermatrix. Dieses Imprägnieren der Trägermatrix mit zweiwertigen Magnesiumionen
erfolgt vor der Immobilisierung von Glucoseisomerase darauf. Unter "vor der" ist
zu verstehen, daß die Imrpägnierung eine VerfahrensstuEe darstellt, die vor der
Immobilisierung des Enzyms erfolgt. Vorzugsweise wird die Imprägnierung unmittelbar
vor der Immobilisierung im Kontext einer Verfahrensstufe'und im Kontext mit der
Zeit durchgeführt. Es versteht sich jedoch, daß eine derartige Imprägnierung auch
früher im Kontext mit beiden erfolgen kann, sofern anschließende Maßnahmen nicht
die Menge der imprägnierten Magnesiumionen auslaugen oder auf andere Weise wsentlich:
verringern.
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Wie vorstehend erwähnt, wird die Trägermatrix mit zweiwertigen Magnesiumionen
imprägniert durch Kontakt dieser Matrix mit einer Lösung, die eine Quelle für Magnesiumionen
enthält. Anorganische und organische Salze sind eine geeigneLa Quelle für Magnesiumionen,
und ihre Natur ist, bezogen auf uen Erfolg der Erfindung, nicht kritisch, solange
sie nicht mit der Trägermatrix reagieren und nicht in die Aktivität des anschließend
gebundenen Enzyms eingreifen. Unter den Salzen, die verwendbar sind, finden sich
Magensiumhalogenide, wie Magnesiumchlorid, -bromid, und -jodid, Magnesiumsulfat,
Magnesiumnitrat, Magnesiumhypophosphit, Magnesiumfluorsilicat, Magnesiumacetat und
Magnesiumlactat, Magnesiumsulfat ist häufig aufgrund seiner großen Löslichkeit und
seiner relativ geringen Kosten bevorzugt.
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Die Konzentration an zweiwertigen Magnesiumionen in der Kontaktlösung
ist nicht kritisch und zumindest die obere Grenze kann durch die Löslichkeit der
Quelle für die zweiwertigen Magnesiumionen bestimmt sein. Konzentrationen von etwa
1 bis etwa 25 millimolar an Magnesiumionen haben sich als zweckmäßig zur Anwendung
erwiesen, obwohl sowohl höhere als auch niedrigere Konzentrationen nicht notwendigerweise
schädlich auf die Durchführung der Erfindung wirken.
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Von wesentlich größerer Bedeutung ist die Gesamtmenge an zweiwertigen
Magnesiumionen, die pro Gramm der Trägermatrix imprägniert wird. Diese Menge kann
von dem Typ der verwendeten Trägermatrix, der Kontakttemperatur und dem Aufbau der
angebotenen Enzymlösung unter anderen Faktoren abhängen. Falls im allgemeinen die
Trägermatrix nicht vorher in Kontakt mit zweiwertigen Magnesiumicnen gebracht wurde
oder nicht unabhängig zweiwertige Magnesiumionen enthält, so sollte
die
Trägermatrix mit mindestens 0,1 mMol zweiwertigen Magnesiumionen pro Gramm Trägermatrix
imprägniert werden.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Träger matrix mit
zweiwertigen Magnesiumionen in einer Menge von etwa 0,1 bis 2 mMol Ionen pro Gramm
Trägermatrix imprägniert. Es scheint keine obere Grenze für die Menge der Magnesiumionen-Imprägnierung
zu bestehen, die zur Durchführung der Erfindung notwendig ist, jedoch führt die
weitere Verstärkung der Imprägnierung nicht notwendigerweise zu einer weiteren Verbesserung
der vorteilhaften Wirkung.
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Die Kontaktzeit hängt ab von Faktoren, wie der Konzentration von Magnesium
in der Lösung, der verwendeten Trägermatrix und den relativen Mengen von Lösung
und Trägermatrix. Ist beispielsweise die Trägermatrix vom vernetzten Polyamintyp
und die Lösung ist eine 5 millimolare Magnesiumsulfatlösung und wird der Kontakt
durchgeführt durch Leiten der Lösung über ein Bett der Trägermatrix in einer derartigen
Geschwindigkeit, daß 1 Bettvolumen während etwa jeder 4 min vorliegt, so wird das
Gleichgewicht errecht, nachdem etwa 7 bis 8 Bettvolumen durchgelaufen sind. Im allgemeinen
wird ein ausreichend großer Überschuß an Lösung verwendet, so daß das Gleichgewicht
während etwa 15 bis 30 min erzielt werden kann. Unter Gleichgewicht versteht man
den Zustand, bei dem die Trägermatrix nicht länger Magnesium aus der Kontaktlösung
aufnimmt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der Praxis wie folgt durchgeführt.
Man stellt eine Lösung aus Material her, das eine Quelle für zweiwertige Magnesiumionen
ergibt. Wie vorstehend erwähnt, sind anorganische und organische Salze von Magnesium
die zweckmäßigste Quelle
für Magnesiumionen. Die Trägermatrix wird
anschließend mit dieser Lösung während ausreichender Zeitin Kontakt gebracht, um
eine Erzielung des Gleichgewichts der Imprägnierna mit Magnesiumionen sicherzustellen.
Die Temperatur schei keine bedeutende Wirkung zu haben; der Kontakt kann bei es
OOC bis etwa 900C durchgeführt werden und wird im allgemeinen bei Umgebungs- bzw.
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bei Raumtemperatur durchgeführt. Dieser Kontakt kann ansatzweise erfolgen,
wobei die Trägermatrix und die Lösung zumindest intermittierend vermischt werden.
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Alternativ kann die Lösung durch ein Festbett der Trägermatrix geleitet
werden. Andere Variationen, bei denen der Kontakt in einem fluidisierten Bett bzw.
Wirbelschichtbett, expandierten Bett und dgl. erfolgt, müssen dem Fachmann nicht
näher erläutert werden.
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Die Durchführung der Erfindung ist nicht auf einen speziellen Typ
der Trägermatrix begrenzt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Trägermatrix
ein anorganisches Oxid, das mit einem Polyamin imprägniert ist, das anschließend
mit einem Überschuß eines bifunktionellen Mittels vernetzt wird, um mehrere anhändende
funktionelle Gruppen zu liefern. Beispielsweise kann ein anorganisches Oxid, wie
t-Aluminiumoxid mit einer wässrigen Lösung eines Polyamins, wie Polyäthylenimin,
in Kontakt gebracht werden, in der das Polyamin in einer Konzentration von etwa
1 bis etwa 50 % vorhanden ist. Überschüssige Flüssigkeit wird in geeigneter Weise,
wie durch Dekantieren, entfernt. Das Oxid kann mit Wasser zur Entfernen von überschüssigem
Polyamin gewaschen werden, jedoch ist es bevorzugt, das Material durch Verdampfen
des Wassers lediglich zu trocknen.
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Eine wässrige Lösung von Vernetzungsmittel, wie Glutaraldehyd, die
etwa 1 bis etwa 25 % des bifunktionellen Reagens enthält, wird in ausreichender
Menge zugesetzt,
um einen Überschuß von etwa 3 bis etwa 50 oder
mehr Mol des bifunktionellen Reagens pro Mol Polyamid zu ergeben. Die Lösung wird
unter gelegentlichem Vermischen mit dem mit Polyamin überzogenen Oxid während ausreichender
Zeit in Kontakt gebracht, um ein Gleichgewicht zu sichern, im allgemeinen während
etwa 5 min bis etwa 5 h. Die Flüssigkeit wird anschließend von dem Oxidträger in
geeigneter Weise entfernt, wie durch Dekantieren, und der feste Träger wird gut
mit Wasser gewaschen, um anhaftendes, jedoch nicht chemisch gebundenes bifunktionelles
Reagens zu entfernen.
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Wenn die bevorzugte Trägermatrix verwendet wird, kann die Magnesiumimprägnierung
wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden. Eine Variante besteht jedoch darin,
eine Quelle, die zweiwertige Magnesiumionen liefert, in die Lösung des bifunktionellen
Reagens einzuarbeiten, so daß die Vernetzung, die zu zahlreichen anhängenden funktionellen
Gruppen führt und die ImDrägnierung mit Magnesiumionen gleichzeitig durchgeführt
werden.
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Das immobilisierte Enzymsystem, wie ein Glucoseisomerasesystem, kann
hergestellt werden durch Kontakt der mit Magnesium imprägnierten Trägermatrix mit
einer Lösung, die Glucoseisomerase enthält, bei einer Temperatur von 0 0 etwa 0°C
bis etwa 70°C , während ausreichender Zeit, um eine vollständige Immobilisierung
zu sichern. Der Kontakt kann durchgeführt werden durch intermittierendes Vermischen,
wenn der Arbeitsgang ansatzweise erfolgt.
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Alternativ kann der Kontakt erfolgen durch Leiten der Enzymlösung
durch ein Festbett oder fluidisiertes Bett bzw. Wirbelschichtbett der Trägermatrix.
Die Immobilisierung auf andere Weise, wie mittels eines expandierten Betts, ist
ebenfalls möglich, ergibt sich dem Fach-
mann aufgrund der aufgezeigten
Lehre von selbst und derartige alternative Methoden werden durch die vorliegende
Erfindung umfaßt. Die Immobilisierung ist im allgemeinen innerhalb etwa 30 h vollständig,,abhängig
von der Tempera'llr, dem Immobilisierungs-Arbeitsgang, der Konzentration des Enzyms
in der eingesetzten Lösung, der Trägermatrix usw. Nach beendeter Immobilisierung
wird anhaftendes, jedoch nicht gebundenes Enzym entfernt durch Waschen des Systems
mit beispielsweise entionisiertem Wasser, einer Lösung eines starken Elektrolyten
oder Beschickungsmaterial.
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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne
sie zu beschränken.
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Beispiele 1 und 2 Trägermatrices wurden auf folgende Weise hergestellt.
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400 g Aluminiumoxid von 0,250/0,177 mm (60/80 mesh), ABD 0,3, wurden
mit einer 1,5 Gew.-% Lösung von Polyäthylenimin.in Wasser in ausreichender Menge
zur Erzielung von 0,117 g Polyamin pro Gramm Aluminiumoxid vermischt. Nach sorgfältigem
Vermischen wurde das Wasser verdampft und das mit Polyamin imprägnierte Aluminiumoxid
wurde in eine Glassäule von 5 cm Innendurchmesser eingebracht.
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Eine wässrige Lösung von Glutaraldehyd, 2,5 Gew.-%, mit einem Gesamtvolumen
von 8 1, wurde aufwärtsströmend zu 40 ml pro min während 18 min zirkuliert und anschließend
abwärtsströmend zu 400 ml pro min während 60 min recyclisiert. Das Bett wurde anschließend
mit
entionisiertem Wasser gewaschen, das in Abwärtsrichtung zu
400 ml pro min während 4 h 40 min strömte, um überschüssigen Glutaraldehyd sorgfältig
zu entfernen.
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Am Ende dieser Wäsche ergibt der Abstrom einen negativen Fuchsin-Aldehyd-Test.
Die so hergestellte Trägermatrix befindet-sich in einem Zustand bereit zur Immobilisierung
von Enzym.
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Bei der Herstellung nach den vorstehenden Angaben ist die Matrix relativ
frei von Magnesium. Zur Herstellung einer mit Magnesium imprägnierten Matrix wurde
die Wäsche mit entionisiertem Wasser ersetzt durch eine Lösung eines Magnesiumsalzes.
Beispielsweise wurde eine Lösung von 0,005 m Magnesiumsulfat abwärtsströmend zu
400 ml pro min während 4 h 40 min zirkuliert. Nach etwa 30 min war sehr wenig zusätzliches
Magnesium an der Matrix abgelagert, was sich dadurch zeigte, daß der Abstrom-Gehalt
an Magnesium etwa der gleiche wie der der urspranglichen Lösung war. Die resultierende
Trägermatrix enthielt 0,13 STol Magnesium pro Gramm Trägermatrix.
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Wurden höhere Konzentrationen an Magnesiumsulfat in der Waschlösung
verwendet, so wurde ein höherer Gehalt der Magnesiumimprägnierung erzielt. Beispielsweise
ergab die Verwendung einer 0,010 m Magnesiumsulfatlösung eine Matrix, die 1,3 mMol
Magnesium pro Gramm Trägermatrix enthielt.
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Beispiele 3 und 4 Immobilisierte Glucoseisomerase-Systeme wurden hergestellt
aus einer magnesiumfreien Trägermatrix und einer, die mit 0,13 mMol Magnesium pro
Gramm Matrix imprägniert
war, wobei in folgender Weise vorgegangen
wurde.
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Insgesamt 8,5 l einer wässrigen Lösung von 600C, die 350C Einheiten
Glucoseisomerase pro Gramm Trägermatrix enthielt, werde aufwärtsströmend durch ein
Bett der Trägermatrix von-4' q Aluminiumoxid während 25 min zu 400 ml pro min recyclisiert.
Die Strömung wurde anschließend umgekehrt, und die Enzymlösung wurde im Abwärts
strom während 23 h recyclisiert. Überschüssiges anhaftendes, jedoch nicht gebundenes
Enzym wurde entfernt durch Wäsche mit einer Salzlösung, die hergestellt worden war
durch Auflösen von 12 g Magnesiumsulfat und 20 g Natriumsulfit in 20 1 entionisiertem
Wasser, durch Wäsche des Betts mit 6 1 dieser Lösung im Abwärtsstrom zu 400 ml pro
min während 15 min. Die Säule wurde weiter mit 4 1 Salzlösung gewaschen, die im
Aufwärtsstrom 30 min zu 400 ml pro min recyclisiert wurde, worauf jede Lösung verworfen
wurde, und der Waschvorgang drei weitere Male wiederholt wurde, bis die gesamte
Salzlösung verwendet war.
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Beispiele 5 und 6 Die Üiagnesiumfreien und mit Magnesium imprägnierten
immobilisierten Glucoseisomerase-Systeme, die wie vorstehend beschrieben hergestellt
wurden, wurden als Festbettreaktoren zur Umwandlung von Glucose in Fructose verwendet.
Die Beschickung war eine Cerelose-Beschickung von 45 Gew.-% Trockenfeststoffen und
die Umwandlungen wurden bei 600C unter Stickstoff und bei einem pH-Wert von 8,0
bis 8,3 auf einen Gehalt von 42 % Fructose in dem Abstrom durchgeführt. Die ursprünglichen
Aktivitäten beider Systeme betrugen 2000-2100 Einheiten pro Gramm.
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Die Halbwertszeit des maanesiumfreien Systems betrug 58 Tage, wohingegen
die des mit 0,13 mMol Magnesiumionen pro Gramm Trägermatrix imprägnierten Systems
78 Tage betrug. So ist ersichtlich, daß die Magnesiumimprägnierung bei diesem Gehalt
die Halbwertszeit des immobilisierten Glucoseisomerase-Systems über 34 % erhöhe.