FR2610640A1 - Procede de preparation d'enzymes immobilisees et installation pour sa realisation - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE PREPARATION D'ENZYMES IMMOBILISEES. SELON L'INVENTION, ON ENTREPREND UNE RECIRCULATION SUCCESSIVE D'UN REACTIF CHIMIQUE A TRAVERS UN SUPPORT IMMOBILE POUR L'ACTIVATION DE LA SURFACE DU SUPPORT ET LA FIXATION DE L'ENZYME, PUIS DE L'ENZYME, OU DE L'ENZYME PUIS DU REACTIF CHIMIQUE POUR LA FIXATION DE L'ENZYME AU SUPPORT, ON REALISE ALORS LA RECIRCULATION JUSQU'A UNE SATURATION COMPLETE EN REACTIFS INDIQUES DES PORES DU SUPPORT, APRES QUOI ON EFFECTUE L'EPURATION DE L'ENZYME IMMOBILISEE AU SUPPORT. L'INSTALLATION EST MUNIE D'UN TRANSPORTEUR AVEC DES DISPOSITIFS DE FIXATION 2 ATTACHES AU MECANISME DE TRACTION, DESTINES A Y PLACER DES CAPACITES PERFOREES 3 POUR LE SUPPORT, ET DE CHAMBRES 8 INSTALLEES DANS LE SENS DU DEPLACEMENT DES CAPACITES PERFOREES 3 POUR LE TRAITEMENT DU SUPPORT PAR UN REACTIF CHIMIQUE, L'ENZYME OU UNE SOLUTION D'EPURATION DE L'ENZYME IMMOBILISEE, ET DE DISPOSITIFS POUR LE CHARGEMENT DU SUPPORT DANS LES CAPACITES 3, POUR L'AMENEE DES REACTIFS INDIQUES AINSI QUE POUR LE CHARGEMENT DE L'ENZYME IMMOBILISEE AU SUPPORT. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT A L'INDUSTRIE MICROBIOLOGIQUE.
Description
La présente invention concerne l'industrie micro-
biologique, et plus précisément, un procédé d'obtention d'enzymes immobilisés ainsi qu'une installation pour sa
mise en oeuvre, qui trouvent une application dans l'indus-
trie microbiologique lors de la production d'enzymes immobilisés, particulièrement de la4b-galactosidase immobilisée utilisable pour le traitement du lactosérum, de l'invertase de levure immobilisée utilisable pour l'hydrolyse de solutions de saccharose, de wC- et
-0 15-glucoamylases bactériennes utilisables pour la trans-
formation de l'amidon, etc. On connaît divers procédés de préparation
d'enzymes immobilisés comprenant des processus d'acti-
vation de la couche superficielle du support par son contact successif avec différents réactifs chimiquement actifs, et une immobilisation subséquente des préparations enzymatiques sur le support. Les résidus de réactifs n'ayant par réagi et les traces d'enzyme sont éliminées par de l'eau de lavage. Toutes ces opérations sont réalisées dans des réacteurs ou des récipients du divers type, généralement munis de dispositifs d'agitation pour augmenter l'efficacité de l'immobilisation ayant un fond perforé. On peut également réaliser ces dessus
dans une colonne chargée d'un support, en régime périodique.
(Vvedenie v prikladnuju enzimologiju, Moscou Edts. de
l'Université d'Etat à Moscou, 1982, pages 48-56).
Les méthodes connues sont caractérisées par une faible activité des enzymes immobilisés et par une technologie compliquée de l'obtention de ceux-ci due à la nécessité de réaliser l'agitation du support au cours du processus d'immobilisation. L'agitation du support conduit à la destruction et à l'usure du matériau du
support, ce qui exerce une action négative sur le rende-
ment en produit visé. La nécessité de la décharge du support après chaque opération technologique rend
également plus complexe le processus.
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Toutes les caractéristiques indiquées des méthodes connues ne permettent pas de les utiliser dans
la production industrielle.
On connaît également un procédé d'immobilisation des enzymes (certificat d'Auteur de l'URSS n 608804, 1976), consistant à entreprendre l'immobilisation des enzymes dans un appareil d'enrobage à une vitesse de -60 t/min. On applique, au support, un mélange d'enzyme
et de diverses charges assurant une fixation plus résis-
tante de l'enzyme au support. On applique le mélange par une méthode de pulvérisation multiple. En qualité de support, on utilise du gel de silice. On réalise la pulvérisation du mélange par portions, puis on présèche
à l'air chaud, à une température de 30-35 C, les parti-
cules de support avec le mélange appliqué. Après l'appli-
cation de la quantité totale du mélange, on présèche les particules de support et on les immerge dans une solution de filmogène pour laquelle on utilise une
solution à 1 % d'acétylcellulose dans un mélange acétone-
éthanol: On répète deux fois l'opération d'enrobage par le film, après quoi on présèche définitivement le support dans un courant d'air chaud. Le rendement du processus est de 20 kg de préparation par jour avec une activité de 4,9-6,5 U/g pour la -galactosidase et 10 U/g pour
l'invertase.
Le procédé indiqué est caractérisé par une faible activité des enzymes immobilisés et une procédure technologique complexe. Lors de l'agitation du support dans l'appareil d'enrobage, sa surface à gros pores se détruit facilement, et la poussière formée remplit les
pores, ce qui diminue l'activité des enzymes immobilisés.
L'élimination des solvants après chaque opération techno-
logique par préséchage dans le courant d'air, rend plus
complexe le processus.
Le procédé indiqué est caractérisé par un mauvais
rendement, ce qui limite son utilisation.
On connaît une installation pour l'obtention d'enzymes immobilisés (brevet du Japon n0 55-4391, du 28.12.76), qui renferme une capacité perforée pour le support,de forme cylindrique au fond réticulaire, des dispositifs pour le chargement du support dans la capacité, pour l'amenée des réactifs chimiques, des enzymes, des solutions pour l'épuration de l'enzyme immobilisé et pour la décharge de l'enzyme immobilisé au support situés
dans la partie supérieure de l'installation.
L'immobilisation de l'enzyme dans cette installa-
tion est réalisée par chargement, par le haut de la capacité, du support et des réactifs chimiques pour
l'activation de la surface des particules de support.
Après l'évacuation, de la capacité, des réactifs chimiques ayant contacté le support, on admet, dans la capacité, une solution contenant l'enzyme, o l'enzyme est fixé à la surface activée du support. La décharge de l'enzyme immobilisé au support est réalisée par courant d'air
amené sous pression dans la partie inférieure du réacteur.
La décharge du produit visé terminée, on répète les opéra-
tions technologiques.
L'installation décrite est peu efficace pour les raisons suivantes: - elle ne permet de réaliser la production de l'enzyme immobilisé qu'en régime périodique; - elle n'assure pas un bon rendement à cause du volume limité de la capacité pour le support; - elle a un système complexe de dispositifs pour le chargement du support et la décharge du produit fini; - sa construction rend difficile l'évacuation des restes de réactifs de secteurs peu accessibles de l'installation, ce qui provoque la contamination par une
microflore étrangère.
On s'est donc proposé, par modification des opérations technologiques et de la construction de l'installation, de mettre au point un procédé et une installation pour l'obtention d'enzymes immobilisés aptes à la réalisation industrielle en régime continu, permettant de simplifier la procédure technologique, d'accroître l'activité des enzymes immobilisés et la productivité du procédé. La solution consiste en ce que, dans le procédé
proposé de préparation des enzymes immobilisés, compre-
nant le traitement du support par un réactif chimique pour la fixation de l'enzyme et par l'enzyme avec une épuration subséquente de l'enzyme immobilisé au support.conformément à la présente invention, on réalise le traitement du support par une récirculation subséquente, à travers un support immobile, d'un réactif chimique, pour l'activation de la surface du support et la fixation de l'enzyme, puis de l'enzyme, ou de l'enzyme, et ensuite du réactif chimique pour la fixation de l'enzyme au support, la recirculation étant alors réalisée jusqu'à une saturation complète des
pores du support en réactifs indiqués.
Le procédé revendiqué permet d'augmentE de 2 à fois la productivité du processus, d'élever l'activité des enzymes immobilisés, de simplifier la procédure technologique ainsi que de la réaliser à échelle industrielle. Conformément à l'invention, il est avantageux dc réaliser le procédé de préparation d'enzymes immobilisis dans une installation renfermant une capacité perforée pour le support, des dispositifs de chargement du support dans la capacité, d'amenée du réactif chimique, de l'enzyme et d'une solution pour l'épuration de l'enzyme immobilisé ainsi que le dispositif de décharge de l'enzyme
immobilisé au support, installation qui,suivant l'inven-
tion, est munie au moins d'une capacité perforée addition-
nelle pour le support, d'un transporteur avec des dispositifs de fixation reliés au mécanisme de traction et destinés à la mise en place, sur ceuxci, de capacités perforées pour le support et des chambres disposées dans le sens du déplacement des capacités perforées pour le traitement du support se trouvant dans les capacités perforées, par un réactif chimique, par l'enzyme ou par une solution pour l'épuration de l'enzyme immobilisé, dont chacune a une tubulure avec des orifices pour l'admission d'un des réactifs indiqués dans la capacité perforée, placée dans la partie supérieure de la chambre, et un réservoir installé au fond de la chambre pour collecter les réactifs indiqués sortant des capacités perforées, réservoir qui communique avec la tubulure par une conduit3 et une pompe pour la réalisation de la recirculation des réactifs à travers la capacité perforée jusqu'à une saturation complète des pores du support en réactifs indiqués, les parois supérieure et d'about des chambres ayant alors des fentes et des fenêtres pour le déplacement des dispositifs de fixation portant les capacités perforées de la chambre précédente dans la
chambre suivante.
Conformément à l'invention, il est rationnel que les dispositifs de fixation indiqués soient reliés au mécanisme de traction du transporteur à une distance mutuelle correspondant à la distance entre les centres de deux
chambres voisines, ce qui permet d'entreprendre simulta-
nément toutes les opérations technologiques dans les différentes chambres, et grâce à ce fait, la durée de tout le processus se voit diminuée et la technologie simplifiée. L'installation revendiquée,apte à une utilisation industrielle,fonctionne en régime continu et présente une forte productivité, par exemple la production de - galactosidase immobilisée atteint 70 tonnes par an. L'installation permet d'automatiser tout le
processus technologique de l'immobilisation des enzymes.
L'invention est expliquée par une description
détaillée du procédé et de l'installation pour la prépa-
ration des enzymes immobilisés avec référence aux dessins annexés sur lesquels: - la figure 1 représente une vue générale de l'installation pour l'obtention d'enzymes immobilisés,
en isométrie,avec un arrachement partiel,suivant l'inven-
tion;
- la figure 2 est une coupe d'un brin de trans-
porteur suivant la ligne II-II de la figure 1,suivant l'invention. Le procédé revendiqué peut être réalisé aussi
bien en régime périodique qu'en régime continu.
A titre de supports pour l'immobilisation des enzymes, on utilise des supports inorganiques et organiques. A titre de supports inorganiques, on utilise les gels de silice à gros pores (bioxyde de silicium) à des dimensions de particules de 0,1-1,0 mm et des pores de 30-200 nm, une céramique poreuse, divers types d'argile, du charbon activé, etc. A titre de supports organiques on utilise, par exemple, des polysaccharides naturels, la cellulose et ses dérivés, l'agarose et ses dérivés, à des dimensions des pores de 30-100 nm, etc. Le procédé d'immobilisation proposé peut être
utilisé pour n'importe quels enzymes dans les solutions.
On réalise l'immobilisation des enzymes par recirculation à travers un support immobile, en premier lieu, d'un réactif chimique pour l'activation de la surface du support. Puis on effectue la recirculation de l'enzyme à travers le support. Il se produit alors la fixation chimique de l'enzyme à la surface activée du
support.
A titre de réactif chimique pour l'activation de la surface du support, on peut utiliser des dérivés de silane, par exemple le raminopropyltriéthoxysilane ou
leur combinaison avec des réactifs bifonctionnels.
On entreprend la recirculation jusqu'à une saturation complète des pores du support en réactifs indiqués. L'immobilisation des enzymes peut être réalisée par recirculation, premièrement, à travers un support immobile de l'enzyme, jusqu'à une saturation complète, en enzyme, des pores du support, puis on entreprend la recirculation,à travers le support,du réactif chimique pour la fixation de l'enzyme au support. A titre de réactif chimique indiqué, on peut utiliser l'aldéhyde glutarique. L'épuration de l'enzyme immobilisée sur le support est réalisée par recirculation, à travers le support indiqué, d'eau et de diverses solutions, par exemple des solutions tampons, une solution de chlorure
de sodium, etc., selon l'enzyme immobilisé.
Le procédé revendiqué permet de simplifier la procédure technologique grâce au fait que l'agit-ion mécanique, le déchargement multiple du support du passage d'un cycle technologique à un autre, ainsi que l'usure et le broyage du support ont été exclus, aussi a-t-on réduit sa perte, ainsi que la durée du processus
d'immobilisation des enzymes.
Le procédé revendiqué permet d'augmenter le rendement du processus et l'activité des enzymes immobilisés. L'installation d'obtention d'enzymes immobilisés (figure 1) comprend un transporteur muni d'une transmission électrique 1 avec un dispositif de traction par chaîne, par câble, à carrousel, à vis ou d'une dispositif de traction analogue à ceux-ci. Des dispositifs de fixation 2 sont placées à une distance égale les uns des autres sur les dispositifs de traction du transporteur pour le positionnement et le déplacement des capacités perforées 3
pour le support, dans le sens du mouvement du transpor-
teur. Il est préférable de réaliser la perforation sur toute la surface de la capacité 3. Dans le cas de l'utilisation d'un dispositif de traction par chaîne, on le réalise sous la forme d'un monorail 4, sur lequel sont placés des chariots 5 avec des dispositifs de fixation 2 avec possibilité de mouvement et qui sont reliés par une chaîne 6 à une roue
dentée 7 disposée sur l'arbre de sortie de la commande 1.
L'installation renferme une série de chambres 8 pour le traitement du support qui se trouve dans les capacités perforées 3, par des réactifs chimiques, par l'enzyme ou par une solution d'épuration de l'enzyme immobilisé. Les chambres 8 sont placées dans le sens du déplacement des capacités perforées 3. Le long de toute la surface supérieure de la paroi de chaque chambre 8, il y a une fente 9 assurant un déplacement libre des
dispositifs de fixation 2 d'une chambre 8 à l'autre.
Les deux parois d'about de chaque chambre 8 ont également des fenêtres 10 destinées au passage, de part en part, des capacités 3 d'une chambre à l'autre. Les parois extérieures des chambres 8 sont munies de fenêtres 11 pour contrôler la bonne marche du processus dans les
chambres 8. Un réservoir 12 (figure 2), pour l'accumula-
tion des réactifs, est placé sur le fond de chaque chambre 8. Le réservoir 12 communique avec une tubulure 13 par une conduite 14 et une pompe 15 (figure 2). La conduite 14 (figure 2) est munie d'une vanne à solénoïde
16. Chaque tubulure 13 exécute la fonction d'un disposi-
tif d'amenée des réactifs dans les capacités perforées 3 (figure 2) et elles sont placées à la partie supérieure
des chambres 8.
Les réservoirs 12 (figure 2) sont réunis, par des conduites 17 Tfigure 1), à des bacs-collecteurs extérieurs (cela n'est pas montré sur la figure) pour les composants utilisés et par une conduite 18 (figure 2) avec une vanne à solénoide 19 au réseau d'égouts.
L'installation revendiquée contient un transpor-
teur à bande 20 (figure 1) avec un poussoir 21 pour l'amenée des capacités vides 3 vers le dispositif de chargement du support dans les capacités 3. Le dispositif de chargement du support dans la capacité 3 est réalisé
sous la forme d'une trémie 22 avec un alimenteur à vis 23.
L'installation est également dotée d'un dispositif-
poussoir 24 pour le déchargement de l'enzyme immobilisé
au support dans le transporteur à bande 25.
L'installation renferme des chambres 8 en
quantités correspondant au nombre d'opérations technolo-
giques. La distance entre les centres de deux chambres 8 voisines est choisie égale à la distance entre deux dispositifs de fixation voisins 2, ce qui détermine le
pas du transporteur.
Il va sans dire que l'installation proposée, comme toutes les installations existantes, est munie de tous les dispositifs nécessaires et des appareils de construction connue permettant d'effectuer des observations visuelles, de contrôler le processus technologique en régimes prescrits et de réaliser automatiquement tout le processus. Le fonctionnement de l'installation proposée est
mis en oeuvre de la manière suivante.
Dans la trémie 22 du dispositif de chargement, on introduit un support granulé, par exemple du gel de silice, on actionne le transporteur à bande 20 pour l'avance des capacités perforées vides 3 à l'aide des poussoirs 21, sur les dispositifs de fixation 2, vers la trémie 22. On connecte simultanément la transmission électrique 1, en mettant
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en marche le transporteur. Dans le cas d' éxecution du transporteur sous la forme d'un transporteur à chaîne, sa chaîne 6, en coopérant avec la roue dentée 7, déplace, par monorail 4, les chariots 5 avec les dispositifs de fixation 2 transportant les capacités 3 de la trémie 22 du dispositif de chargement vers la première des chambres 8 disposées en tandem. Grâce aux fenêtres 10 et à la fente 9, la capacité 3 sur le dispositif. de fixation 2
arrive facilement dans la chambre 8. Au cours du dépla-
cement de la capacité 3 vers la chambre 8, le système d'admission est mis en action et l'enzyme ou un réactif chimique pour l'activation de la surface du support arrive par la conduite 17, dans le réservoir 12. Après remplissage du réservoir 12 par l'une des solutions nécessaires indiquées, leur amenée cesse. Au moment o la capacité 3 se trouve dans la chambre 8, la transmission
électrique 1 est débranchée et le mouvement du transpor-
teur est arrêté. La vanne à solénoïde 16 s'ouvre, et la solution nécessaire citée plus haut arrive, à l'aide de la pompe 15, par la conduite 14, du réservoir 12 dans la
tubulure à orifices 13.
La solution utilisée dans la chambre 6 mbe par les orifices de la tubulure 13 sur le support contenu dans la capacité 3. La solution,après avoir traversé la couche du support, s'écoule de nouveau dans le réservoir 12, d'o on la remet en circulation, comme il est indiqué plus haut, sur le support,jusqu'à une saturation complète, en solution utilisée, des pores du support. Après cela, on ferme la vanne 16 et on arrête la circulation de la solution utilisée du réservoir 12 vers la tubulure 13. On ouvre la vanne 19 et on évacue la solution épuisée à l'aide de la pompe 15 par la conduite 18, du réservoir 12
vers le réseau d'égouts.
l Pendant le traitement du support dans la première des chambres 8 disposées en succession, on réalise le chargement du support dans la capacité suivante 3, amenée
par le transporteur à bande 20 vers la trémie 22.
Après la fermeture de la vanne 16, on branche la
transmission électrique 1, mettant en marche le trans-
porteur, et la capacité 3 contenant le support traité se déplace jusqu'au centre de la deuxième'des chambres 8
disposées en succession.
La capacité 3 suivante, avec le support admis de la trémie 22, arrive alors dans la première des chambres 8 successives, dans le réservoir 12 de laquelle on amène de nouveau l'enzyme ou le réactif chimique pour l'activation de la surface du support. Le traitement du support dans la première des chambres 8 est réalisé
comme il a été décrit plus haut.
Grâce au fait que les dispositifs de fixation 2 sont fixés sur le transporteur à une distance les uns des autres correspondant à la distance entre les centres de deux chambres voisines 8, il est possible, pendant le traitement du support dans la chambre précédente 8, de réaliser le traitement du support arrivé de la chambre précédente 8 dans la chambre 8 suivante. Dans la chambre suivante 8, on utilise une solution du réactif chimique
pour la fixation de l'enzyme ou une solution de l'enzyme.
L'amenée du réactif nécessaire, son accumulation, la circulation à travers le support traité dans la chambre précédente 8 et l'évacuation du réactif sont
réalisés d'une façon analogue à celle décrite pour le traite-
ment dans la première chambre 8.
Après la saturation complète des pores du support en solutions utilisées dans les première et deuxième chambres 8, on ferme les vannes 16 dans chaque chambre 8 et on arrête la circulation de la solution utilisée, des réservoirs 12 vers les tubulures 13. On ouvre les vannes
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19 et on évacue les solutions épuisées par les conduites 18, des réservoirs 12, à l'aide des pompes 15, dans le
réseau d'égouts.
Ensuite, par le transporteur mis en mouvement au moyen de la transmission électrique 1, la capacité 3 remplie du support arrive dans la première des chambres 8 successivement disposées, la capacité contenant le support traité dans la première chambre 8 arrive dans la deuxième chambre 8, et la capacité 3 avec le support traité dans
la deuxième chambre 8 arrive dans la troisième chambre 8.
Après le positionnement des capacités 3 au centre de chaque chambre 8, la transmission électrique 1 est débranchée, le transporteur s'arrête et le traitement
du support par une solution,indispensable pour la prépa-
ration des enzymes immobilisés,s'effectue dans chaque
chambre 8.
Les capacités 3 contenant le support ayant subi le traitement complet dans les chambres 8 par des réactifs permettant d'obtenir l'enzyme immobilisé sur le support, sont successivement amenées, par transporteur, au poussoir 24 pour le déchargement de l'enzyme immobilisé au support
sur le transporteur à bande 25.
Pour mieux faire comprendre l'invention, on donne ci-après des exemples de la réalisation du procédé de
préparation des enzymes immobilisés suivants.
Exemple 1
Dans chaque capacité perforée, on charge,à partir de la trémie, 0,45 kg de gel de silice sec ayant des dimensions de particules de 0,3-0,5 mm, un diamètre des
pores de 40-60 nm et d'une surface spécifique de 80 m2/g.
La hauteur de la couche du support dans les capacités perforées est de 75 mm. Les capacités perforées chargées de support sont amenées,à l'aide du transporteur,dans la
première des chambres disposées en succession.
Dans la première chambre, on admet la solution tampon à 0,1 mole d'acétate à une vitesse de recirculation de 4,0 1/mn, à pH = 4,6, sur la couche du support,pendant minutes pour l'imprégnation des pores des granules du support. Ensuite, on amène la capacité perforée avec le support imprégné par la solution tampon d'acétate dans la deuxième chambre, o l'on réalise son traitement par 0,9 i d'une solution enzymatique de, -galactosidase à une
vitesse de recirculation de 4,0 1/mn pendant 45 minutes.
L'activité de départ de la solution enzymatique de - -galactosidase est de 175 U/ml. Par unité d'activité de la.}-galactosidase, on prend une quantité d'enzyme qui forme 1.umole de produits d'hydrolyse de lactose dans une solution à 5 % de lactose pendant 1 minute, à un pH de 4,6 et à la température de 30 C. On entreprend la recirculation jusqu'à une saturation complète des pores des granules de support, après quoi la capacité perforée contenant le support indiqué arrive de la deuxième chambre dans la chambre suivante, o l'on traite le support en faisant passer, à travers lui, une solution aqueuse à 1 % d'aldéhyde glutarique dans la solution tampon à 0,1 mole d'acétate à pH = 6,85 à une vitesse de 4 1/mn. Le processus dure 45 minutes à une v: se de recirculation de 4,0 1/mn. Il se produit alors ur_ fixation complète de la -galactosidase à la surface des granules de support. On amène ensuite les capacités perforées avec la t -galactosidase immobilisée au support
dans la chambre suivante, o l'on purifie la 4-galacto-
sidase immobilisée des traces de réactif chimique et de l'enzyme par recirculation,à travers le support avec la -galactosidase immobilisée, d'eau à une vitesse de 3 1/mn pendant 15 minutes, puis d'une solution à 2 moles de NaCl à une vitesse de 3 1/mn, dans la chambre suivante, pendant 15 minutes. On répète ensuite le lavage à l'eau pendant 15 minutes, après quoi on amène la capacité indiquée dans la chambre suivante, o l'on traite la
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-galactosidase immobilisée au support par une solution
tampon à 0,1 mole d'acétate à une vitesse de recircula-
tion de 3 1/mn pendant 15 minutes pour augmenter la durée de conservation de l'enzyme immobilisé. On obtient 2,2 kg de -galactosidase immobilisée à une activité de 253 U/g
(65,5 %) en calculant sur les substances sèches.
Exemple 2
On entreprend le processus d'une façon analogue à celle décrite à l'exemple 1. On charge, dans chaque capacité perforée, 1 kg de gel de silice à une dimension de particules de 0,3-0,5 mm et à un diamètre de pores de -60 nm, d'une surface spécifique de 80 m /g. La hauteur de la couche de granules est de 125 mm. On réalise le processus de recirculation comme à l'exemple 1. On utilise 2,2 1 de solution enzymatique de q5-galactosidase à une activité de départ de 175 U/ml. On obtient 3,6 kg de Q -galactosidase immobilisée à une activité de 255 U/g
(66,0 %), en calculant sur les substances sèches.
Exemple 3
On réalise le processus comme à l'exemple 1. On charge 2,4 kg de gel de silice dans chaque capacité perforée, d'une façon tout à fait analogue à celle décrite à l'exemplè 1. On effectue la recirculation dans les chambres comme à l'exemple 1. On utilise 5,5 l'de solution enzymatique de _-galactosidase à une activité de départ
de 175 U/ml. On obtient 8 kg de.-galactosidase immobi-
lisée à une activité de 245 U/g (65 %) en calculant sur
les substances sèches.
Exemple 4
On charge 0,56 kg de gel de silice à une dimension de particules de 0,6-0, 8 mm, à un diamètre de pores de 40-60 nm et d'une surface spécifique de 80 m /g, dans chaque capacité perforée, à partir de la trémie. La
hauteur de la couche du support dans les capacités perfo-
rées est de 80 mm. On amène les capacités perforées -
chargées du support, à l'aide du transporteur, dans la première des chambres successives. Dans la première chambre, on fait passer une solution aqueuse à 5 % de r-aminopropyltriéthoxysilane à travers la couche de support à une vitesse de recirculation de 4,0 1/mn pendant minutes. Il se produit alors la fixation chimique du - aminopropyltriéthoxysilane au support. On amène ensuite la capacité perforée avec le support fixé au r-aminopropyltriéthoxysilane dans la deuxième chambre, o l'on réalise le traitement du support par une solution
à 1 % d'aldéhyde glutarique à une vitesse de recircula-
tion de 2,0 1/mn pendant 30 minutes, après quoi on traite le support indiqué dans la chambre suivante par 2,0 1 de solution enzymatique de rgalactosidase à une vitesse de recirculation de 4,0 l/mn pendant 60 minutes. L'acti-
vité de départ de la solution enzymatique de -galactosi-
dase est de 56 U/ml. On entreprend la recirculation jusqu'à une saturetion complète des pores des granules de support, il se produit alors la fixation chimique de l'enzyme à la surface du support activé par les réactifs chimiques indiqués plus haut. On amène ensuite la capacité avec la -galactosidase immobilisée au support dans la chambre suivante, o l'on réalise le lavage à l'eau à une vitesse de recirculation de 2,0 1/mn pendant 10 minutes, après quoi on traite la I -galactosidase immobilisée au support par une solution tampon à 0,1 mole d'acétate, pH = 4,5, pendant 10 minutes, dans la chambre suivante. On répète ensuite le lavage à l'eau dans la chambre suivante pendant-10 minutes, puis dans la chambre voisineavec une solution à 1 mole de NaCl dans les mêmes conditions. On obtient 1,8 kg de _-galactosidase immobilisée à une activité de 40 U/g (52,3 %) en calculant
sur les substances sèches.
Exemple 5
On entreprend le processus comme à l'exemple 4.
On charge, dans chaque capacité,2,6 kg de gel de silice à une dimension de particules de 0,3-0,5 mm, à un diamètre de pores de 40-60 nm et d'une surface spécifique de m2/g, la hauteur de la couche de support étant de mm. On réalise le traitement du support par une solution à 1 % de raminopropyltriéthoxysilane pendant minutes à une vitesse de recirculation de 4 1/mn. On utilise 7,8 1 d'une solution enzymatique de t-galactosidase à une activité de départ de 140 U/ml. On entreprend le processus comme à l'exemple 1. On obtient 8,2 kg de P -galactosidase immobilisée à une activité de 40 U/g
(52,3 %) en calculant sur les substances sèches.
Exemple 6
On entreprend le processus comme à l'exemple 4.
On charge,dans chaque capacité perforée, 1,0 kg de gel de silice sec à des dimensions de particules de 0,3-0,5 mm, à un diamètre de pores de 40nm et d'une surface spécifique de 80 m2/g. La hauteur de la couche du support dans la capacité est de 125 mm. On réalise le t: tement du support comme à l'exemple 4. On utilise 4 1 de solution aqueuse à 1 % de J--aminopropyltriéthoxysilane. A titre de préparation enzymatique, on utilise la préparation
d'invertase obtenue à partir de levures de bière.
L'activité de la solution d'invertase utilisée est de 1920,0 U/ml dans une solution tampon à 0,1 mole d'acétate à pH de 4,6. L'activité est en U/ml, c'est-à-dire en oumolesde produits de réaction de l'hydrolyse du saccharose,
qui se forment pendant 1 minute à pH = 4,6 et à la tempé-
rature de 30 C dans une solution à 7 % de saccharose. On utilise 3,0 1 de solution enzymatique de l'invertase. On entreprend le processus d'immobilisation de l'invertase
comme à l'exemple 4. On obtient 3,5 kg d'invertase immobi-
lisée à une activité de 2050 U/g (35,6 %) en calculant
sur les substances sèches.
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Exemple 7
Pour l'obtention de la glucoamylase immobilisée, on réalise le processus comme à l'exemple 4. On charge,dans chaque capacité perforée, 1,0 kg de gel de silice sec à une dimension de particules de 0,3-0,5 mm, à un diamètre de pores de 40-60 nm et d'une surface spécifique de m2/g. On entreprend le traitement du support comme à l'exemple 4. On utilise 4,0 1 d'une solution aqueuse de t-aminopropyltriéthoxysilane. A titre de préparation enzymatique, on utilise une solution de glucoamylase ayant une activité de 2380 U/ml. Par unités (U) d'activité de glucoamylase, on prend une quantité d'enzyme qui, dans une solution à 1 % d'amidon soluble, catalyse son hydrolyse à pH = 4,6 et à une température de 50 C, avec formation de 1 mole de solution enzymatique de glucoamylase. On entreprend le processus d'immobilisation comme à l'exemple 4. On obtient 3,5 kg de glucoamylase immobilisée ayant une activité de 990 Ufl (31,2 %) en calculant sur les
substances sèches.
Exemple 8
Pour obtenir l'Z -amylase immobilisée, on entrepend le processus comme à l'exemple 4, mais en qualité de préparation enzymatique, on utilise 1,5 1 de solution de o -amylase dans une solution tampon à 0,1 mole
de phosphate à pH = 6,2 et à une activité de 2520 U/ml.
Par unité (U) d'activité de l'dc-amylase, on prend une quantité de produits d'hydrolyse (calculée sur le maltose), Aumoles, qui se forme pendant l'hydrolyse d'une solution aqueuse à 1 % d'amidon sous l'action de 1 ml d'enzyme à la température de 50 C, à pH = 6,2 pendant 1 minute. On entreprend l'immobilisation de l'IC-amylase comme il est décrit à l'exemple 4. On obtient 3,5 kg d'oC-amylase immobilisée ayant une activité de 720 U/g (19,0 %) en
calculant sur les substances sèches.
Claims (3)
1. Procédé de préparation d'enzymes immobilisés comprenant le traitement du support par un réactif chimique pour la fixation de l'enzyme et par l'enzyme suivi de l'épuration subséquente de l'enzyme immobilisé au support, caractérisé en ce qu'on réalise le traitement du support par recirculation successives travers un support immobile,du réactif chimique pour l'activation de la surface du support et la fixation de l'enzyme, ensuite de l'enzyme ou de l'enzyme, puis du réactif chimique pour la fixation de l'enzyme au support, la recirculation étant alors réalisée jusqu'à une saturation
complète, en réactifs indiqués, des pores de support.
2. Installation pour la réalisation du procédé selon la revendication 1, renfermant une capacité perforée pour le support, des dispositifs pour le chargement du support dans la capacité, pour l'amenée du réactif chimique, de l'enzyme et de la solution d'épuration de l'enzyme immobilisé et pour le déchargement de l'enzyme immobilisé au support, caractérisée en ce qu'elle est munie d'au moins une capacité perforée additionnelle (3) pour le support, d'un transporteur avec des dispositifs de fixation attachés au mécanisme de traction et destinés à la mise en place, sur ceux-ci, des capacités perforées (3) pour le support et de chambres (8) installées dans le sens du déplacement des capacités perforées (3) pour le traitement du support contenu dans les capacités perforées (3), par le réactif chimique, l'enzyme ou par la solution d'épuration de l'enzyme immobilisé, dont chacune a une tubulure (13) avec des orifices pour l'amenée, dans la capacité perforée (3), de l'un des réactifs indiqués, ladite tubulure étant placée dans la partie supérieure de la chambre (8), et d'un réservoir (12) fixé au fond de la chambre (8) pour recevoir les réactifs indiqués sortant des capacités perforées (3),
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réservoir qui communique avec la tubulure (13) par une conduite (14) et une pompe (15) pour la recirculation des réactifs à travers la capacité perforée (3) jusqu'à une saturation complète des pores de support en réactifs indiqués, les parois supérieures et d'about des chambres (8) ayant des fentes (9) et des fenêtre (10) pour le déplacement des dispositifs de fixation (2), avec les capacités perforées (3),de la chambre précédente dans
la chambre suivante.
3. Installation selon la revendication 2, caractérisée en ce que les dispositifs de fixation (2) indiqués sont attachés au mécanisme de traction du
transporteur à une distance les unes des autres corres-
pondant à celle entre les centres de deux chambres
voisines (8).
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|---|---|---|---|---|
| DE3224024A1 (de) * | 1982-06-28 | 1983-12-29 | UOP Inc., 60016 Des Plaines, Ill. | Verfahren zur immobilisierung von glucoseisomerase und immobilisiertes glucoseisomerase-system |
| FR2573772A1 (fr) * | 1984-11-23 | 1986-05-30 | Sucre Rech & Dev | Enzyme invertase insolubilisee a haute activite specifique, son procede d'obtention et procede utilisant cet enzyme |
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- 1987-02-10 DE DE19873704041 patent/DE3704041A1/de not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
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