SU1317024A1 - Способ получени иммобилизованных гидролаз 0-гликозильных соединений - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к области биотехнологии и может быть использовано дл  получени  иммобилизованных на твердых носител х ферментов. Цель изобретени  - увеличение ферментативной активности иммобилизованных гидролаз и ускорение процесса . Иммобилизацию осуществл ют в перфорированном контейнере, заполненном пористым кремнеземом с толщиной сло  гранул 40-200 мм. Реагенты направл ют рециркул цией душирова- нием через слой. Скорость рециркул ции реагентов 40-220 л/мин на 1. м сечени . При расходе реагентов 1-5 л на 1 кг носител  отдельные процессы активации и иммобилизации осуществл ют в течение 0,1-2,0 ч. Данным способом иммобилизованы грибна  р -га- лактозидаза, дрожжева  инвертаза и другие гидролазы. 5 табл. i СЛ со

Description

1.1

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к способам получени  иммобилизованных на гранулированных твердых пористых материалах фе рмен- тов, в том числе к осуществлению процессов активации носител  и св зывани  ферментов с ним, и может найти применение в микробиологической про- . мышленности при производстве иммобилизованных ферментов, в частности иммобилизованных грибной jb -галакто- зидазы, дрожжевой инвертазы, бактериальных об - и глюкоамилазы и др.

Цель изобретени  - увеличение ферментативной активности целевого продукта и ускорение процесса.

Изобретение заключаетс  в том, что .процесс иммобилизации гидролаз 0-гликозильных соединений провод т в перфорированном контейнере. Перфорированный контейнер  вл етс  конусным сосудом, стенки и дно которого покрыты перфорированным материалом дл  удерживани  гранулированного носител  и не создающего заметного гид I

равлического сопротивлени  при движении растворов через слой гранул, В ходе рециркул ции растворов обра- зуётс  на поверхности сло  гранул слой жидкого реагента, высота которого зависит от скорости притока реагента . За счет действи  капилл рных сил и водопроницаемости упакованного в контейнере пористого материала , .жидкие реагенты контактируют с носителем,более эффективно, По своим техническим показател м контейнер приближаетс  к реактору с фильтрующим дном, однако в перфорированном контейнере активно работают также стенки, которые способствуют эффективному перемещению жидкости в межгранульном пространстве. Эффективность движени  жидкости в перфорированном контейнере можно сравнивать с перемешиванием в реакторе. Таким образом, контейнерный метод иммобилизации на гранулированные материалы ферментов имеет следующие преимущества: увеличиваетс  эффективность и интенсивность контактировани  реагентов ,с носителем, которые отражаютс  в увеличении активности препаратов и сокращении времени проведени  процесса, а также уменьшаютс  потери носител  за счет отсутстви  его механического разрушени , имеющего место в реакторах перемешивани .

42

в том числе в дражирователе, В nejv ({юрированном контейнере упакованный носитель не требует многократной пе-. регрузки в ходе многоэтапной иммобилизации .

Использование душевого устройства позвол ет создавать равномерный слой реагента по всей поверхности носител  и обеспечивает рециркул цию pea-

гентов с нужной скоростью.

Ускорение процесса иммобилизации с сохранением высокой активности целевого продукта может быть достигнуто при заполнении контейнера слоем

пористого кремнезема толщиной 40- 220 мм и пропускании реагентов со скоростью 40-220 л/мин на 1 м в течение 0,1 - 2,0 ч (при расходе реагентов 1,0 - 5,0 г на 1 кг носител ).

По сравнению с известным способом достигаетс  уменьшение времени процесса иммобилизации на 1 ч, а также увеличение активностей иммобилизованных ферментов в 8-200 раз,

Способ иллюстрируетс  следующими примерами.

Примеры 1-3, В перфорированные контейнеры (размеры и другие

данные указаны табл,1) загружают

0,45 кг (пример 1), 1,0 кг (пример 2) или 2,4 кг (пример 3) сухого силика- гел  С-80 с размерами частиц 0,3- 0,5 мм, диаметром пор 40-60 нм и

удельной поверхностью 80 . Высота сло  гранул 75 мм, 125 мм или 180 мм соответственно. Через слой гранул пропускают 0,1 М ацетатного буфера рН 4,6 дл  пропитывани  пор

гранул буфером. Затем пропускают 0,9 л, 2,2 л или 5,5 л ферментного раствора, имеющего исходную активность 175 Е/мл со скоростью рециркул ции 4,0 л/мин. За единицу активности /3- галактозидазы прин то такое количество фермента, которое образует в 5%-ном растворе лактозы 1 мкмоль продуктов за 1 мин при рН 4,6 и 30°С.

Кинетика адсорбции -галактозидазы на силикагель С-80 представле- на в табл.1, откуда видно, что она практически заканчиваетс  за 30 мин. После контактировани  фермента с

носителем полученный комплекс обрабатываетс  1%-ным водньм раствором глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере рН 6,85, При скорости рециркул ции 4,0 л/мин процесс про313

должаетс  45 мин, Объемное соотношение реагента и влажного носител  1,5 л/кг. Иммобилизованна  /3 -галак- тозидаза очищаетс  от следов реагента и фермента, которые не принимают участие в. реакции, проточной промывной водой со скоростью 3 л/мин в течение 15 мин, а затем рециркул ци- ей со скоростью 3 л/мии 2М раствором NaCl в течение 15 мин. Объемное соотношение промьшного реагента и носител  2,1 л/кг сухого материала. Затем повтор ют проточную промывку водой. Дл  увеличени  срока.хранени  препарата его пропитывают 0,1 М ацетатным . буфером рН 4,6. Получают 2,2 кг, 5,6 кг или 8,0 кг влажной иммобилизованной / -галактозидазы с активностью (Е-г сухого) и выходом (%): 253 Е/г (65,5%); 265 Е/г (66,0% или 245 Е/г (65%) соответственно. Обща  продолжительность процесса иммобилизации 3,0 ч. Если проводить адсорбцию в течение 0,5 ч, то процесс продолжаетс  2 ч, т.е. в сутки можно изготовл ть не менее 22-80 кг готовой иммобилизованной и -галактозидазы .

Пример 4.В перфорированный контейнер (пример 1) помещают 560 г сухого силикагел  МСА-750 (размер частиц 0,6 - 0,6 мм) . Высота сло  гранул 80 мм. Через слой пропускают со скоростью 4,0 л/мин или 220 л/мин на 1 м сечени  контейнера 5%-ный водньй раствор аминопропилтриэтокси- силана в течение 30 мин. Объемный расход силана 3,6 л/кг носител . За .ходом процесса след т по исчезновению в реагенте основного вещества - силана. Концентраци  силана определ етс  титрованием проб 0,1 М НС, Изменение концентрации силана в рабочем реагенте в ходе силинизации силикагел  МСА-750 представлено в табл,2.

Расчетное количество св занного С носителем силана найдено из материального баланса по остаточной кон цент рации силана.

После термической обработки гранул при 120°С в течение 2,0 ч провод т активацию носител  с помощью 1%-ного глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере рН.6,85 в течение 30 мин при расходе реагента 2,2 л/к носител . Скорость рециркул ции реагента 105 л/мин I м сечени  или

44

2,0 л/мин. Проточна  промывка водой осуществл етс  в течение 10 мин со скоростью 2,0 л/мин, а обработка 0,1 М ацетатным буфером рН 4,5 в те- чение IО мин при расходе буфера

2,0 л/кг носител . Определ емое количество активного альдегида на но- сителе 0,205 мг-экв/г.

Иммобилизации подвергаетс  гриб- на  jb -галактозидаза с исходной активностью 56 Е/мл, Скорость рециркул ции фермента 220 л/мин 1.м сечени  при расходе реагента 3,6 л/кг.носител  . Данные по иммобилизации /Ь - галактозидазы в слое силикагел  МСА- 750 приведены в табл,3.

Непрореагировавший с носителем фермент удал ют проточной промывкой водой при скорости 110 л/мин на 1 м .сечени  в течение 10 мин, затем 1 М раствором NaCl в тех же услови х,

Активность препарата 40 Е/г, т,е, 52,3% от вз той дл  иммобилизации активности. Получают 1,8 кг готово- го продукта в течение 5,4 ч, т,е, 9,0 кг в сутки.

Пример 5.В перфорированный контейнер (пример 3) помещают слоем толщиной 200 мм 2,6 кг сухого сили- кагел  С-80. Рабоча  поверхность 0,06 м. Силанизаци  проводитс  1%-ным водным раствором аминопропил- триэтоксисиланом в течение 30 мин

при расходе реагента 4,3 л/кг носи- тел  и при скорости рециркул ции 55 л/мин-м. Термическа  обработка при 120 с, обработка 1%-ным раство-.: ром глутарового альдегида, а также

удаление нереагировавших остатков ре- агентов осуществл етс  так, как описано в примере 4, но с удельной скоростью реагентов 60 л/мин-м ,

Дл  иммобилизации примен ют препарат |5 -галактозидазы. с исходной активностью 140 Е/мл, Скорость циркул ции при расходе ферментного раствора 2,8 л/кг носител  3,9 л/мин, .т,е, 65 л/мин,м. Данные, иллюстрирующие ход иммобилизаций -галакто- зидазы в слое силикагел  С-80, приведены в табл.4.

Из данных табл,4 видно, что хот  процесс провод т в течение 6 ч, он практически заканчиваетс  уже после 30-минутной рециркул ции ферментного раствора.

Помывка полученного препарата осуществл етс  по технологии, описанной в примере 4,

513

Получено 8,2 кг иммобилизованной -галактозидазы с активностью Г45Е/Г ( за 3,4 ч), что позвол ет прорзво- ить 57,4 кг препарата в сутки,

Пример 6-9, В перфорированый контейнер (пример 2) помещают 10 кг сухого силохрома (.размеры час-, тиц 0,3 0,5 мм). Высота сло  135мм, рабоча  поверхность гранул 0,05 м, ерез слой гранул пропускают со скоостью 5 л/мин т,е, 100 л/мин на 1 м, 1.%-ный водного раствора аминпропил- триэтоксисилана в течение 0,5-ч. Терическа  обработка проводитс , как описано в примере 4,

Активаци  силанизированного носител  осуществл етс  раствором бензохинона в этаноле в течение 30 мин при скорости рециркул ции 120 л/мин м , Расход реагента 4,0 л/кг носител .

Промывка и подготовка дл  иммобилизации носител  пров однтс  так,, как описано в примере 4,

Дл  получени  иммобилизованной ин- вертазы примен ют препарат, полученный экстрагированием отработанных в пивоварении и измельченных пивных дрожжей. Активность в Е/мл,, т.е. в мкмол х продуктов реакции гидролиза , которые образ- аотс  в течение 1 мин при рН 4,6 и температуре 30 С,

Данные иммобилизации в различных услови х инвертазы, полученной из пивных дрожжей, приведены в табл.Б,

. Получают 3,0 кг готовой инвертазы в течение 3,9 ч, т„е, 31,2 кг в течение суток.

Пример 10, иммобилизацию инвертазы провод т так., как описано в примере 7, но в качестве ферментного препарата примен ют водный раствор инвертазы марки А (НПО Виохимре- актив) в О , 1 М ацетатном буфере рН 4,6 с активностью 7200 Е/мл, Лктид- ность полученного фермента инверта-- зы 2050 Е/г сухого, Выход активности 42,3%.

Пример 11, л  гголучени  иммобилизованного ферментп, обладаю™ щего глюкоамилазной активностью, носитель силохрома СХ-2 активируют так как описано и примере 7, но в качестве фермента примен ют раствор гл1око амилазы L-150 фирмы Ново (Дани ) с активностью 2380 Е-мл, За единицы активности прин то такое количес во

70246

фермента, которое в растворе растворимого крахмала катализирует его гидролиз при рН 4,6 -и 50° с образованием 1 мкмоль глюкозы в 1 мин,

5 Активность иммобилизированной 990 Е/г, с выходом 29,3%,

П р и м е р . 12. Дл  получени  шчмобилизованного фермента, обладающего oi -амилазной активностью,

JO подготовку носител  и процесс иммо- .билизации провод т так, как в примере 11, но в качестве фермента примен ют раствор об -амилазы фирмы Ново под фирменным названием Bacterial

15 Anylase 120L, Перед применением фер- ментньй препарат развод т в 10 раз 0,1 М фосфатным буфером рН 2,6, Активность фермента выражают в микромол х мальтозы (li) , образовавшейс 

0 в течение мин под действием 1 г катализатора в 1%-ком растворе крахмала при 50°,и рН 6,2, Активность ис ходного фермента 2520 Е/мл, а иммобилизованной -амилазы 720 Е/г,

25 (выход 37,2%).

Пример 13, В перфорированный контейнер высотой 100 мм и размером 80 и 290 мм,; зах ружают 1 ,2 кг сухого силикагел  С-80, Высота сло 

.30 40 мм, Технологический процесс иммобилизации р -галактозндазы осуществл ют , как оаисано в примерах 1-3, Ак- тивнсЗсть полученного препарата 240.Е/Г при выходе активности 60,8%., кбличе35 ство получаемого препарата 3,8 кг.

Брем  проведени  технологических one- раций 3 ч, Обща  производительность 30,4 кг в сутки,

Q Объемный расход каждого компонента колеблетс  в пределах 1,0-5,О л/кг носител  и определ етс  минимальным и максимальн 21М необходимым количеств вон основного вещест)ча в реагентах,

(5 которые мот ут обеспечивать или более не увеличивают положительного эффекта . Расход реагента регулируетс  в соответствии с изменением конпент рации реагента и зависит от рода ре/J-Q агента, от его химических свойств, от нос:-ггел  и т.д,

Нилчлим Пределом скорости рециркул ции реаг ентов  вл етс  минимальное контактное врем  и кратность рецир- 55 КУ-1 ИИ, в течение которых намеченный технологичес;кий процесс завершаетс  достижением цели, например ак тивности иммобилизованного фермента, Верхним пределом скорости  вл етс 

максимальное контактное врем  и кратность рециркул ции. Удельные предельные скорости учитывают величину сечени  контейнера, а также общее количество гранул в контейнере.

В качестве носител  наход т применение крупнопористые, с развитной поверхностью гранулированные материалы типа силикагел  (МСА-750, С-80) или силохрома (СХ), а также другие, имеющие размеры частиц 0,1 - 1,0 мм.

Высота сло  гранулированного носител  в контейнере определ етс  его свойствами. Главными параметрами  вл ютс  гранулометрический состав, размеры гранул, пористость и другие показатели, обеспечивающие скорость самотока реагентов в пределах 2 - 5 л/мин, т.е. 40-220 л/мин на 1 м сечени  сло  гранул. Увеличение высоты сло  (выше 220 мм) нецелесообразно из-за уменьшени  скорости самотока, а увеличение ее можно осуществить лишь с помощью внешних сил (давление в закрытой системе, центрифугальна  сила и др.). Уменьшение высоты сло  (менее 40 мм) приводит к уменьшению производительности способа и исчезновению капилл рного эффекта дви

Диаметры контейнера, Mi j

0

5

5

жени  жидкости в пространстве пористого гранулированного сло .

Claims (1)

1. Таким образом, использование предложенного способа позвол ет увеличить активность иммобилизованных ферментов (в 8-25 раз дл  -галактози- дазы и в 150-200 раз дл  инвертазы . в расчете на 2 носител ), а также, ускорить процесс иммобилизации. Формула изобретени 

   Способ получени  .иммобилнзов.анных гидролаз 0-гликозильных соединений, предусматривающий обработку пористого кремнезема химическими реагентами , водным раствором фермента и промывание носител  водными растворами в проточном контейнере, отличающийс  тем, что, с целью увеличени  ферментативной активности целевого продукта и ускорени  процесса , обработку химическими реагентами и раствором фермента, а также промывание провод т в перфорированном контейнере, заполненном пористым кремнеземом с толщиной сло  40 - 220 мм, душированием в течение 0,1- 2,0 ч со скоростью 40-220 л/мин на 1 м при объемном расходе реагентов 1,0 - 5,0 л на 1 кг носител ,

   Т .а б л и ц а 1

   90/150 155/260 180/290

   Активность раствора , Е/мл

   56,0 50,0 49,2 49,0 46,8 45,8

   Врем  иммобилизации , мин

   Активность иммобилизованного фермента после (промывки Е/г: 145

   Выход, % 50

   Расчетное количество св занного - фермента, Е/г

   О

   42,8

   48,6

   50,0

   65,6

   78,8

   Таблица 4

   Остаточна  активность раствора

   Е/г

   I

   %

   Редактор И, Сегл ник

   Составитель В. Муронец Техред М.Ходанич Корректор Л, Патай

   Заказ 2394/23 .Тираж 499Подписное

   ВНИИПИ Государственного, комитета СССР

   по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., -д.Л/З

   Производственно-полиграфическое предпри тие, г, Ужгород, ул, Проектна , 4