DE3704041A1

DE3704041A1 - Verfahren zur herstellung von immobilisierten enzymen und anlage zur durchfuehrung desselben

Info

Publication number: DE3704041A1
Application number: DE19873704041
Authority: DE
Inventors: Michkel Oskarovic Mandel; Evgenij Ivanovic Christoforov; Geb Ermakova Samosina; Levon Arutjunovic Nachapetian
Original assignee: TALLINSKIJ POLITECHNICESKIJ INSTITUT; VSESOJUZNYJ NAUCNO-ISSLEDOVATEL'SKIJ INSTITUT BIOTECHNOLOGII; Tallinsky Politekhnichesky Institut; VNII BIOTECHNOLOGII
Current assignee: TALLINSKIJ POLITECHNICESKIJ INSTITUT; VSESOJUZNYJ NAUCNO-ISSLEDOVATEL'SKIJ INSTITUT BIOTECHNOLOGII; Tallinsky Politekhnichesky Institut; VNII BIOTECHNOLOGII
Priority date: 1985-04-02
Filing date: 1987-02-10
Publication date: 1988-08-18
Also published as: DK8700430A; GB8702512D0; BG47580A1; GB2200637B; SU1317024A1; GB2200637A; FR2610640B1; FR2610640A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die mikro biologische Industrie und insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen und auf eine Anlage zur Durchführung desselben, welches beziehungs weise welche in der mikrobiologischen Industrie bei der Herstellung immobilisierten Enzymen, insbesondere von immobilisierter β-Galaktosidase, verwendet zur Ver arbeitung der Molke, Hefeinvertase, verwendet zur Hydro lyse von Saccharoselösungen, bakterieller α- und Gluko amylase verwendet zur Verarbeitung der Stärke, und ande ren Enzymen eingesetzt werden.

Bekannt sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen, die die Aktivierung der Oberflächenschicht eines Trägers in der Weise vorsehen, daß man den Träger mit unterschiedlichen chemisch ak tivierten Reagenzien in einer bestimmten Reihenfolge in Kon takt bringt, wonach die Immobilisierung von trägergebun denen Enzympräparaten erfolgt. Restliche nicht umgesetzte Reagenzien und Enzymspuren werden mit Waschwasser ent fernt. Alle diese Arbeitsgänge werden in der Regel in Reaktoren oder Gefäßen verschiedenen Typs durchgeführt, welche in der Regel über Rührwerke zur Steigerung der Immobilisierungseffektivität verfügen und einen gelochten Boden haben. Die Aktivierungsprozesse lassen sich auch in einer trägergefüllten Säule periodisch verwirklichen. (Einführung in die angewandte Enzymologie, Moskau, Verlag MGU (Moskauer Staatliche Lomonossow-Universität), 1982, S. 48-56. Vvedenie v prikladnuye enzimologiyu. Mosk va izdatelstvo MGU, 1982, S. 48-56).

Die bekannten Verfahren zeichnen sich durch eine niedrige Aktivität von immobilisierten Enzymen und eine komplizierte Technologie zur Herstellung der letztgenann ten aus, was mit der Notwendigkeit, das Umrühren des Trä gers bei der Immobilisierung durchzuführen, verbunden ist. Das Umrühren des Trägers führt zur Zerstörung und zum Verschleiß des Trägermaterials, was sich auf der End produktausbeute negativ auswirkt. Dadurch, daß der Trä ger nach jedem technologischen Arbeitsgang auszutragen ist, wird die Verfahrenstechnologie ebenfalls erschwert.

Alle genannten Merkmale der bekannten Verfahren er möglichen nicht, sie großtechnisch zu verwenden.

Bekannt ist ferner ein Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen (SU-PS 6 08 804 C 07 G 7/02, 1976), wel ches darin besteht, daß die Immobilisierung von Enzymen in einem Dragierapparat erfolgt, dessen Drehzahl zwischen 50 und 60 U/min liegt. Auf den Träger bringt man das Ge misch aus Enzym mit verschiedenen Füllstoffen auf, welche eine festere Bindung des Enzyms an dem Träger sichern. Das Gemisch wird durch mehrmalige Zerstäubung aufgebracht. Als Träger kommt Silikagel zum Einsatz. Das Gemisch wird portionsweise zerstäubt, danach werden die Trägerteilchen mit den darauf aufgebrachten Gemischen mit Warmluft bei einer Temperatur von 30 bis 35°C angetrocknet. Nach dem Aufbringen der Gesamtmenge des Gemisches werden die Trä gerteilchen angetrocknet und in die Lösung eines Film bildners eingetaucht, wobei als solche eine 1%ige Lösung der Azetylzellulose im Azeton-Äthanol-Gemisch dient. Das Überziehen mit dem Film wird zweimal wiederholt, wonach der Träger mit Warmluftstrom völlig getrocknet wird. Nach diesem Verfahren werden 20 kg Präparat je Tag mit Aktivitäten von 4,9 bis 6,5 E/g bei β-Galaktosidase und 10 E/g bei Invertase hergestellt.

Das genannte Verfahren ist durch eine niedrige Aktivi tät von immobilisierten Enzymen und komplizierte Techno logie gekennzeichnet. Durch Umrühren des Trägers im Dragierapparat wird seine grobporige Oberfläche leicht zerstört, und der entstehende Staub füllt die Poren auf, was die Aktivität der immobilisierten Enzyme herabsetzt. Die Entfernung von Lösungsmitteln nach jedem technologi schen Arbeitsgang durch Antrocknen im Luftstrom macht die Verfahrenstechnologie kompliziert.

Das angegebene Verfahren zeigt eine niedrige Lei stungsfähigkeit, wodurch seine Verwendung beschränkt ist.

Bekannt ist eine Anlage zur Herstellung vom immobi lisierten Enzymen (JP-PS 55-4 391 vom 28. Dezember 1976 IPK C 12 N 1/00), die einen als zylindrischen Behälter mit Siebboden ausgeführten gelochten Behälter für den Träger, Vorrichtungen zum Aufgeben des Trägers in den Behälter, Zuführen von chemischen Reagenzien, Enzymen und Lösungen zur Reinigung von immobilisiertem Enzym und Austragen des trägerfixierten Enzyms enthält, wobei die Vorrichtungen im Oberteil der Anlage befindlich sind.

Die Immobilisierung des Enzyms an dieser Anlage er folgt durch Beschickung des Trägers und der chemischen Reagenzien zur Aktivierung der Oberfläche von Trägerteil chen in den Behälter von oben. Nachdem die mit dem Trä ger umgesetzten chemischen Reagenzien aus dem Behälter herausgeführt worden sind, wird dem Träger eine enzymhalti ge Lösung zugegeben, wodurch das Enzym an der aktivier ten Trägeroberfläche gebunden wird. Das trägergebundene Enzym wird durch den dem Unterteil des Reaktors unter Druck zugeführten Luftstrom ausgetragen. Nach dem Austrag des Fertigprodukts werden die technologishen Arbeits gänge wiederholt.

Die beschriebene Anlage ist von geringem Nutzeffekt aus folgenden Gründen:

- Die Anlage ermöglicht die Herstellung des immobili sierten Enzyms nur im periodischen Betrieb.
- Die Anlage sichert keine hohe Leistung wegen be schränkten Rauminhalts des Behälters für den Träger.
- Die Anlage verfügt über ein kompliziertes System von Vorrichtungen zum Aufgeben des Trägers und Austrag des Fertigprodukts.
- Die Bauform der Anlage erschwert die Entfernung von zurückgebliebenen Reagenzien aus schwer zugänglichen Stellen der Anlage, was die Verunreinigung mit fremder Mikroflo ra zur Folge hat.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zu grunde, durch Änderung der technologischen Arbeitsgän ge und der Bauform der Anlage ein Verfahren und eine An lage zur Herstellung von immobilisierten Enzymen zu entwic keln, welches beziehungsweise welche zur großtechnischen Herstellung im kontinuierlichen Betrieb geeignet sind, die Verfahrenstechnologie zu vereinfachen und die Ak tivität von immobilisierten Enzymen sowie die Leistung des Prozesses zu steigern.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß im vorgeschlage nen Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen, welches die Behandlung eines Trägers mit einem chemischen Reagens zur Bindung des Enzyms und mit einem Enzym und die anschließende Reinigung des trägerfixierten Enzyms vorsieht, gemäß der vorliegenden Erfindung die Behandlung des Trägers durch den aufeinanderfolgenden Rückumlauf des chemischen Reagens zur Aktivierung der Trägeroberfläche und Bindung des Enzyms durch den unbeweglichen Träger, dann des Enzyms oder des Enzyms und danach des chemi schen Reagens zur Bindung des Enzyms am Träger erfolgt, wobei der Rückumlauf so lange dauert, bis die Trägerporen mit den angegebenen Reagenzien völlig gesättigt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Lei stung des Prozesses zu verzwei- bis verfünffachen, die Aktivität von immobilisierten Enzymen zu erhöhen, die Verfahrenstechnologie zu vereinfachen und das Verfahren großtechnisch durchzuführen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen zweckmäßi gerweise an einer Anlage, enthaltend einen gelochten Be hälter für den Träger, Vorrichtungen zum Aufgeben des Trägers in den Behälter, Zuführen von chemischem Reagens, Enzym und Lösung zur Reinigung des immobilisierten En zyms und Austragen des trägerfixierten Enzyms, durchzu führen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung mindestens mit einem zusätzlichen gelochten Behälter für den Trä ger, mit einem Förderer, der an seinem Zugorgan befestigte Halter trägt, die zur Aufnahme von gelochten Behältern für den Träger dienen, und mit nach der Bewegungsrichtung der gelochten Behälter angeordneten Kammern zur Behand lung des in den gelochten Behältern befindlichen Trägers mit chemischen Reagens, Enzym oder Lösung zur Reinigung des immobilisierten Enzyms ausgerüstet ist, wobei jede der Kammern einen im Oberteil der Kammer vorhandenen Stutzen mit Öffnungen zur Zuführung eines der angegebenen Reagenzien in den gelochten Behälter und ein am Boden der Kammer aufgestelltes Sammelbecken zum Speichern der genannten Reagenzien, welche aus den gelochten Behältern kommen, hat, das mit dem Stutzen über eine Rohrleitung und eine Pumpe in Verbindung steht, damit der Rückumlauf von Reagenzien durch den gelochten Behälter verwirklicht wird, bis die Trägerporen mit den angegebenen Reagenzien völlig gesättigt werden, wobei die obere Wand und die Stirnwände der Kammern Schlitze und Türen zur Verschiebung der Hal ter mit den gelochten Behältern aus der vorhergehenden Kammer in die darauffolgende Kammer zur Verfügung haben.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es zweckmäßig, daß die genannten Halter am Zugorgan des Förderers in einem Abstand befestigt sind, der dem Mittenabstand von zwei benachbarten Kammern entspricht, was die gleichzei tige Durchführung aller technologischen Arbeitsgänge in verschiedenen Kammern ermöglicht, so daß die Dauer des gesamten Prozesses verkürzt und die Technologie ver einfacht wird.

Die erfindungsgemäße Anlage eignet sich zum groß technischen Einsatz, arbeitet kontinuierlich und zeigt eine hohe Leistung, zum Beispiel bis etwa 70 t/Jahr bei der Herstellung der immobilisierten β-Galaktosidase. Die Anlage macht es möglich, den ganzen technologischen Prozeß der Immobilisierung vollzuautomatisieren.

Nachstehend wird die Erfindung durch die ausführliche Beschreibung des Verfahrens und der Anlage zur Herstellung von immobilierten Enzymen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine Gesamtansicht der Anlage zur Herstellung von immobilisierten Enzymen in isometrischer Darstellung unter Teilausschnitt gemäß der Erfindung,

Fig. 2 einen Schnitt durch einen Strang des Förderers nach II-II in Fig. 1 gemäß der Erfindung.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich sowohl in periodischem als auch kontinuierlichem Betrieb verwirk lichen.

Als Träger zur Immobilisierung von Enzymen dienen anorganische und organische Träger. Als anorganische Träger werden grobporige Silikagele (Siliziumdioxid) mit Teilchengrößen von 0,1 bis 1,0 mm und Porengrößen von 30 bis 200 nm, Irdengut, verschiedene Tone, aktivierte Kohle und andere Materialien eingesetzt.

Als organische Träger dienen zum Beispiel natürliche Polysaccharide, Zellulose und ihre Derivate, Agarose und ihre Derivate mit einer Porengröße von 30 bis 100 nm u. a.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Immobilisierung kann für beliebige in Lösung befindliche Enzyme verwendet werden.

Die Immobilisierung von Enzymen erfolgt in der Weise, daß man zunächst das chemische Reagens zur Aktivierung der Trägeroberfläche durch den unbeweglichen Träger rück umlaufen läßt. Dann wird der Rückumlauf des Enzyms durch den Träger vorgenommen. Es kommt dabei zur chemischen Bindung des Enzyms an der aktivierten Trägeroberfläche.

Als chemisches Reagens zur Aktivierung der Trägerober fläche lassen sich Silanderivate zum Beispiel γ-Ami nopropyltriäthoxysilan oder ihre Kombination mit bifunk tionellen Gruppen benutzen.

Der Rückumlauf erfolgt bis zur völligen Sättigung der Trägerporen mit den angegebenen Reagenzien.

Die Immobilisierung von Enzymen kann man durchführen, indem man durch den unbeweglichen Träger zunächst ein Enzym bis zur völligen Sättigung von Trägerporen mit dem Enzym und dann ein chemisches Reagens zur Bindung des Enzyms am Träger durch denselben rückumlaufen läßt. Als angegebenes chemisches Reagens kann Glutaraldehyd ein gesetzt werden. Die Reinigung des trägerfixierten Enzyms verwirklicht man, indem man durch den angegebenen Träger Wasser und verschiedene Lösungen beispielsweise Puffer lösungen, Natriumchloridlösung und andere abhängig von dem immobilisierten Enzym rücklaufen läßt.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet, die Tech nologie des Prozesses dadurch zu vereinfachen, daß das mechanische Vermischen, der mehrmalige Austrag des Trä gers aus einem technologischen Zyklus in den anderen wegfallen, der Verschleiß und die Zerkleinerung des Trä gers vermieden werden, sein Verlust abnimmt sowie die Immobilisierungsdauer von Enzymen verkürzt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren gibt die Möglich keit, die Prozeßleitung zu steigern und die Aktivität von immobilisierten Enzymen zu erhöhen.

Die Anlage zur Herstellung von immobilisierten Enzy men (Fig. 1) enthält einen mit elektrischem Antrieb 1 ver sehenen Förderer, dessen Zugorgan als Kette, Seil, Karussell, Schnecke oder dgl. ausgeführt ist. Am Zugorgan des Förde rers sind in gleicher Entfernung voneinander Halter 2 zur Aufnahme und Verschiebung der gelochten Behälter 3 für den Träger nach der Bewegungsrichtung des Förderers befestigt. Das Lochen ist über der ganzen Oberfläche des Behälters 3 bevorzugt auszuführen.

Falls ein Kettenzugorgan zur Verwendung kommt, ist es als Einschienenbahn 4 ausgeführt, an der Schlitten 5 mit den Haltern 2 verschiebbar angeordnet sind, wobei sie über die Kette 6 mit dem Zahnrad 7 an der Welle des Antriebs 1 ver bunden sind.

Die Anlage enthält eine Reihe von Kammern 8 zur Be handlung des in den gelochten Behältern 3 befindlichen Trägers mit chemischen Reagenzien, Enzym oder Lösung zur Reinigung des immobilisierten Enzyms.

Kammern 8 sind in der Bewegungsrichtung der geloch ten Behälter 3 angeordnet. Längs der ganzen Oberwand hat jede Kammer 8 einen Schlitz 9, der für die ungehinder te Verschiebung der Halter 2 aus einer Kammer 8 in die andere sorgt. Beide Stirnwände jeder Kammer 8 verfügen auch über Öffnungen 10, die zum Durchtritt der Behälter 3 aus einer Kammer 8 in die andere dienen. Die Außenwände der Kammer 8 sind mit Schaulöchern 11 zur Überwachung des in den Kammern 8 vor sich gehenden Prozesses versehen. Am Boden jeder Kammer 8 ruht das Becken 12 (Fig. 2) zum Speichern von Reagenzien auf. Das Becken 12 steht über Rohrleitung 14 und Pumpe 15 (Fig. 2) mit Stutzen 13 in Verbindung. Die Rohrleitung 14 (Fig. 2) ist mit dem Magnet ventil 16 ausgestattet.

Die Stutzen 13 dienen als Vorrichtungen zur Zuführung von Reagenzien in die gelochten Behälter 3 (Fig. 1) und befinden sich im Oberteil der Kammern 8.

Die Becken 12 (Fig. 2) sind über Rohrleitungen 17 (Fig. 1) mit Außensammlern (in Fig. nicht gezeigt) für die ver wendeten Bestandteile und über die Rohrleitung 18 (Fig. 2), die ein Magnetventil 19 hat, mit dem Kanalisationsnetz verbun den.

Die erfindungsgemäße Anlage enthält einen Bandförde rer 20 (Fig. 1) mit einem Aufschieber 21 zur Bereitstellung von leeren Behältern 3, damit eine Vorrichtung den Träger in die Behälter 3 aufgibt. Die Vorrichtung zur Aufgabe des Trägers in den Behälter 3 ist in Form eines Bunkers 22 mit einem Schneckenspeiser 23 ausgeführt.

Die Anlage ist auch mit einer Vorrichtung und zwar einem Aufschieber 24 zum Austragen des trägerfixierten Enzyms auf den Bandförderer 25 ausgerüstet.

Die Anlage enthält die Kammern 8 in einer Menge, die der Anzahl von technologischen Arbeitsgängen entspricht. Der Mittenabstand von zwei nebeneinander aufgestellten Kammern 8 wird gleich dem Abstand zwischen zwei benach barten Haltern 2 gewählt, was den Schritt des Förderers bestimmt.

Die erfindungsgemäße Anlage, wie alle bestehenden An lagen, ist mit allen notwendigen Einrichtungen und Geräten der bekannten Konstruktion selbstverständlich ausgestattet, welche es ermöglichen, visuell zu beobachten, den techno logischen Prozeß unter gegebenen Bedingungen zu über wachen und den Gesamtprozeß automatisch durchzuführen.

Die erfindungsgemäße Anlage wird wie folgt betrie ben.

In den Bunker 22 der Vorrichtung zum Aufgeben bringt man einen granulierten Träger, beispielsweise Silikagel ein, schaltet den Bandförderer 20 ein, der leere geloch te Behälter 3 mittels der Aufschieber 21 auf die Halter 2 zum Bunker 22 fördert. Gleichzeitig wird der elektrische Antrieb 1 eingeschaltet, der den Förderer antreibt. Falls es sich beim Förderer um einen Kettenförderer handelt, so verschiebt seine Kette 6, indem sie mit dem Zahnrad 7 in Wechselwirkung steht, durch die Einschienenbahn 4 die Schlitten 5 mit den Haltern 2, welche die Behälter 3 vom Bunker 22 der Aufgabevorrichtung zur ersteren von den aufeinanderfolgenden Kammern 8 transportieren. Durch Öffnungen 10 und Schlitze 9 gelangt der Behälter 3 auf dem Halter 2 ungehindert in die Kammer 8. Beim Verschieben des Behälters 3 zur Kammer 8 wird ein System eingeschaltet, welches das Enzym oder ein chemisches Reagens zur Aktivie rung der Trägeroberfläche über die Rohrleitung 17 in das Becken 12 zuführt. Nach der Auffüllung des Beckens 12 mit der erforderlichen Lösung wird ihre Zufuhr beendet. In der Zeit, wo der Be hälter 3 in der Kammer 8 ist, wird der elektrische An trieb 1 ausgeschaltet und der Förderer bleibt stehen. Das Magnetventil 16 öffnet sich, und die erforderliche, oben genannte Lösung strömt mit Hilfe der Pumpe 15 über die Rohrleitung 14 aus dem Becken 12 in den Stutzen 13, ver sehen mit Öffnungen.

Durch Öffnungen des Stutzens 13 gelangt die in dieser Kammer 8 verwendete Lösung auf den im Behälter 3 befind lichen Träger. Die verwendete Lösung, indem sie durch die Trä gerschicht strömt, gelangt wieder in das Becken 12, aus welchem sie, wie oben hingewiesen, auf den Träger rückum läuft, bis die Trägerporen mit der verwendeten Lösung völlig gesättigt werden. das Magnetventil 16 wird nachher geschlossen, und der Umlauf der verwendeten Lösung aus dem Becken 12 zum Stutzen 13 wird beendet. Das Magnetventil 19 öffnet sich, und mittels der Pumpe 15 wird die erschöpf te Lösung aus dem Becken 12 über Rohrleitung 18 in das Kanalisationsnetz herausgeführt.

Bei der Behandlung des Trägers in der ersteren der aufeinanderfolgenden Kammern 8 wird der Träger in den fol genden Behälter 3 aufgegeben, der am Bandförderer 20 zum Bunker 22 transportiert wird.

Nach dem Schließen des Magnetventils 16 wird der elektrische Antrieb 1 eingeschaltet, der den Förderer in Betrieb setzt, und der Behälter 3 mit dem behandelten Träger bewegt sich zur Mitte der zweiten der aufeinander folgenden Kammern 8.

Der folgende Behälter 3 mit dem aus dem Bunker 22 be schickten Träger tritt dabei in die erstere der aufeinan derfolgenden Kammern 8 ein, in deren Becken 12 das Enzym oder ein chemisches Reagens zur Aktivierung der Träger oberfläche wieder aufgegeben wird. Der Träger wird in der ersten Kammer 8 analog zu dem oben beschriebenen behan delt.

Dadurch, daß die Halter 2 am Förderer in einem Ab stand voneinander befestigt sind, der dem Mittenabstand von zwei benachbarten Kammern 8 entspricht, ist es mög lich, in der Zeit, wo der Träger in der vorhergehenden Kam mer 8 behandelt wird, die Behandlung des aus der vorange gangenen Kammer 8 gekommenen Trägers in der nachfolgenden Kammer 8 durchzuführen. In der nachfolgenden Kammer 8 be nutzt man die Lösung des chemischen Reagens zur Bindung des Enzyms oder die Enzymlösung.

Die Zufuhr des erforderlichen Reagens, sein Speichern, seinen Rückumlauf durch den in der vorangegangenen Kammer 8 schon behandelten Träger und das Abfließen des Reagens führt man analog zu dem bei der Beschreibung der Behand lung in der ersten Kammer 8 oben angegebenen durch.

Nach der völligen Sättigung der Trägerporen mit den verwendeten Lösungen in der ersten und zweiten Kammer 8 werden die in jeder Kammer 8 vorhandenen Magnetventile 16 geschlossen, und der Umlauf der verwendeten Lösung aus den Becken 12 zu Stutzen 13 wird beendet. Die Magnetventile 19 werden geöffnet, und mittels der Pumpen 15 werden die erschöpf ten Lösungen aus den Becken 12 über die Rohrleitungen 18 in das Kanalisationsnetz herausgeführt.

Der Förderer, der durch den elektrischen Antrieb 1 betätigt wird, bringt dann den schon mit dem Träger ge füllten Behälter 3 in die erstere der aufeinanderfolgenden Kammern 8, den Behälter mit dem in der ersten Kammer behan delten Träger in die zweite Kammer 8 und den Behälter 3 mit dem in der zweiten Kammer behandelten Träger in die dritte Kammer 8.

Nachdem die Behälter 3 in der Mitte jeder Kammer 8 angeordnet worden sind, wird der elektrische Antrieb 1 ausgeschaltet, der Förderer bleibt stehen, und in jeder Kammer 8 erfolgt die Behandlung des Trägers mit der gemäß der Technologie zur Herstellung von immobilisierten Enzymen erforderlichen Lösung.

Die Behälter 3 mit dem Träger, der der Gesamtbehandlung in den Kammern 8 mit Reagenzien unterworfen worden ist, welche das trägerfixierte Enzym herzustellen ermöglichen, werden in einer bestimmten Reihenfolge nach mittels des Förde rers zum Aufschieber 24 transportiert, damit das trägerfixier te Enzym auf den Bandförderer 25 ausgetragen wird.

Zum besseren Verstehen der vorliegenden Erfindung wer den folgende Beispiele zur Durchführung des Verfahrens zur Herstellung von immobilisierten Enzymen angeführt.

Beispiel 1

In gelochte Behälter werden je 0,45 kg trockenes Silikagel aus dem Bunker aufgegeben, wobei die Teilchen größe 0,3 bis 0,5 mm, der Porendurchmesser 40 bis 60 nm und die spezifische Oberfläche 80 m²/g betragen. Die Trägerschichthöhe in den gelochten Behältern ist 75 mm gleich. Die mit dem Träger beschickten gelochten Behälter wer den mittels Förderer in die erstere der aufeinanderfolgen den Kammern transportiert. In die erste Kammer leitet man durch die Trägerschicht 0,1 molare Azetatpufferlösung bei einem pH-Wert von 4,6 mit einer Umlaufgeschwindigkeit von 4,0 1/min innerhalb von 15 Minuten um die Poren von Trägergranalien zu tränken. Dann wird der gelochte Behälter mit dem darin befindlichen vom Azetatpuffer getränkten Trä ger in die zweite Kammer gebracht, wo seine Behandlung mit 0,9 1 Enzymlösung der β-Galaktosidase bei einer Rückumlaufgeschwindigkeit von 4,0 1/min innerhalb von 45 Minuten erfolgt. Die Ausgangsaktivität der Enzymlösung der β-Galaktosidase beträgt 175 E/ml. Als Aktivitäts einheit der β-Galaktosidase wird eine solche Enzymmenge angesehen, die in 5%iger Laktoselösung 1 Mol Hydrolyseprodukte der Laktose innerhalb von 1 Minute bei einem pH-Wert von 4,6 und einer Temperatur von 30°C bildet. Der Rückumlauf wird bis zur völligen Sättigung der Poren von Trägergrana lien durchgeführt, wonach der gelochte Behälter mit dem angegebenen Träger aus der zweiten Kammer in die nachfol gende Kammer gelangt, wo der Träger dadurch behandelt wird, daß man durch denselben eine 1%ige wäßrige Lö sung von Glutaraldehyd in 0,1 molaren Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,85 mit einer Geschwindigkeit von 4 1/min rückumlaufen läßt. Bei einer Rückumlaufgeschwin digkeit von 4 1/min dauert der Prozeß 45 Minuten. Es kommt dabei zur vollständigen Bindung der β-Galaktosidase an der Oberfläche von Trägergranalien. Die gelochten Be hälter mit der trägergebundenen β-Galaktosidase kommen nachher in die folgende Kammer, wo die trägergebundene β-Galaktosidase von Spuren der chemischen Reagens und des Enzyms dadurch gereinigt wird, daß man durch den Trä ger mit der trägergebundenen β-Galaktosidase Wasser mit einer Geschwindigkeit von 3 1/min innerhalb von 15 Minuten und dann 2 molarer NaCl-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 3 1/min in der nachfolgenden Kammer innerhalb von 15 Minuten rückumlaufen läßt. Die Wasserwäsche wird dann innerhalb von 15 Minuten wiederholt, wonach der angegebe ne Behälter in die nachfolgende Kammer gefördert wird, wo die trägergebundene β-Galaktosidase mit 0,1 molarem Azetatpuffer bei einer Rückumlaufgeschwindigkeit von 3 1/min innerhalb von 15 Minuten behandelt wird, um die Aufbewahrungszeit des immobilisierten Enzyms zu verlän gern. Man erhält 2,2 kg immobilisierte β-Galaktosidase, deren Aktivität 253 E/g (65,5%), bezogen auf die Trockensubstanzen, beträgt.

Beispiel 2

Der Prozeß erfolgt analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen. In die gelochten Behälter werden je 1 kg (in jeden Behälter) Silikagel mit 0,3 bis 0,5 mm Teilchengröße, 40 bis 60 nm Porendurchmesser und einer spezifischen Ober fläche von 80 m²/g aufgegeben. Die Schichthöhe der Granalien beträgt 125 mm. Der Rückumlauf wird analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen durchgeführt. Man verwendet 2,2 Liter Enzymlösung der β-Galaktosidase mit einer Ausgangsaktivität von 175 E/ml. Man erhält 3,6 kg immo bilisierte β-Galaktosidase, deren Aktivität 255 E/g (66,0%), bezogen auf die Trockensubstanzen, beträgt.

Beispiel 3

Der Prozeß erfolgt analog zu dem in Beispiel 1 beschrie benen. In die gelochten Behälter werden je 2,4 kg (in jeden Behälter) Silikagel analog zu dem in Beispiel 1 beschrie benen aufgegeben. Der Rückumlauf in den Kammern wird analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen durchgeführt. Man ver wendet 5,5 Liter Enzymlösung der β-Galaktosidase mit einer Ausgangsaktivität von 175 E/ml. Man erhält 8 kg immobilisierte β-Galaktosidase, deren Aktivität 245 E/g (65%), bezogen auf die Trockensubstanzen, beträgt.

Beispiel 4

In gelochte Behälter werden je 0,56 kg (in jeden Behäl ter) Silikagel aus dem Bunker aufgegeben, wobei die Teil chengröße 0,6 bis 0,8 mm, der Porendurchmesser 40 bis 60 nm und die spezifische Oberfläche 80 m²/g betragen. Die Trägerschichthöhe in den gelochten Behältern beträgt 80 nm.

Die mit dem Träger beschickten gelochten Behälter werden mittels Förderers in die erstere der aufeinander folgenden Kammern transportiert. In der ersten Kammer leitet man durch die Trägerschicht eine 5%ige wäßrige Lösung von γ-Aminopropyltriäthoxysilan bei einer Rückumlauf geschwindigkeit von 4,0 l/min innerhalb von 30 Minuten. Es kommt dabei zur chemischen Bindung des γ-Aminopro pyltriäthoxysilans am Träger. Dann wird der gelochte Behälter mit dem an γ-Aminopropyltriäthoxysilan ge bundenen angegebenen Träger in die zweite Kammer gebracht, wo die Behandlung des Trägers mit 1%igem Glutaraldehyd bei einer Rückumlaufgeschwindigkeit von 2,0 l/min inner halb von 30 Minuten erfolgt, wonach der angegebene Träger in der nachfolgenden Kammer mit 2,0 Liter Enzymlösung der b-Galaktosidase bei einer Rückumlaufgeschwindigkeit von 4,0 l/min innerhalb von 60 Minuten behandelt wird. Die Ausgangsaktivität der Enzymlösung der β-Galaktosidase entspricht 56 E/ml. Der Rückumlauf wird bis zur völligen Sättigung der Poren von Trägergranalien durch geführt, dabei kommt es zur chemischen Bindung des En zyms an der mit den oben genannten chemischen Reagen zien aktivisierten Trägeroberfläche. Der Behälter mit der trägergebundenen β-Galaktosidase wird nachher in die nachfolgende Kammer gebracht, wo die Wasserwäsche bei einer Rückumlaufgeschwindigkeit von 2,0 l/min innerhalb von 10 Minuten erfolgt, wonach die trägergebundene β-Ga laktosidase in der nachfolgenden Kammer mit 0,1 molarem Azetatpuffer bei einem pH-Wert von 4,5 innerhalb von 10 Minuten behandelt wird. Dann wiederholt man das Wa schen mit Wasser in der nachfolgenden Kammer inner halb von 10 Minuten und anschließend mit 1 molarer NaCl-Lösung in der nachfolgenden Kammer unter den gleichen Bedingungen. Man erhält 1,8 kg immobilisierte β-Galak tosidase, deren Aktivität 40 E/g (52,3%), bezogen auf die Trockensubstanzen, beträgt.

Beispiel 5

Der Prozeß erfolgt analog zu Beispiel 4. In jeden Behälter werden je 2,6 kg Silikagel mit 0,3 bis 0,5 mm Teilchengröße, 40 bis 60 nm Porendurchmesser und einer spezifischen Oberfläche von 80 m²/g aufgegeben, die Trä gerschichthöhe beträgt 180 mm. Die Behandlung des Trägers wird mit 1%iger Lösung von γ-Aminopropyltriäthoxysilan innerhalb von 30 Minuten bei einer Rückumlaufgeschwindig keit von 4 l/min durchgeführt. Man verwendet 7,8 Liter Enzymlösung der β-Galaktosidase mit einer Ausgangs aktivität von 140 E/ml. Der Prozeß erfolgt analog zu Beispiel 1. Man erhält 8,2 kg immobilisierte β-Galak tosidase, deren Aktivität 40 E/g (52,3%), bezogen auf die Trockensubstanzen, beträgt.

Beispiel 6

der Prozeß erfolgt analog zu Beispiel 4. In jeden gelochten Behälter werden je 1,0 kg trockenes Silikagel mit 0,3 bis 0,5 mm Teilchengröße, 40 bis 60 nm Porendurch messer und einer spezifischen Oberfläche von 80 m²/g auf gegeben. Die Trägerschichthöhe im Behälter beträgt 125 mm. Die Behandlung des Trägers wird analog zu Beispiel 4 durch geführt. Man nimmt 4 Liter 1%ige wäßrige Lösung von γ- Aminopropyltriäthoxysilan. Als Enzympräparat dient ein Präparat der Invertase aus Bierhefe. Die Aktivität der verwendeten Invertaselösung beträgt 1920,0 E/ml in 0,1 molarem Azetatpuffer, der pH-Wert beträgt 4,6. Die Aktivi tät ist in E/ml ausgedrückt, d. h., in µMol von Reak tionsprodukten, angefallen bei der Saccharosehydrolyse innerhalb von 1 Minute bei einem pH-Wert von 4,6 und einer Temperatur von 30°C in 7%iger Sacchararoselösung. Man nimmt 3,0 Liter Enzymlösung der Invertase. Die Im mobilisierung der Invertase wird analog zu Beispiel 4 durchgeführt. Man erhält 3,5 kg immobilisierte Invertase, deren Aktivität 2050 E/g (35,6%), bezogen auf die Troc kensubstanzen, beträgt.

Beispiel 7

Zur Herstellung der immobilisierten Glukoamylase wird der Prozeß analog Beispiel 4 durchgeführt. In jeden ge lochten Behälter werden je 1,0 kg trockenes Silikagel mit 0,5 bis 0,5 mm Teilchengröße, 40 bis 60 nm, Porendurch messer, und einer spezifischen Oberfläche von 80 m²/g aufgegeben. Die Behandlung des Trägers erfolgt analog zu Beispiel 4. Man nimmt 4,0 Liter wäßrige Lösung von γ- Aminopropyltriäthoxysilan. Als Enzympräparat dient die Glukoamylaselösung mit einer Aktivität von 2380 E/ml. Als Aktivitätseinheit (E) der Glukoamylase wird eine solche Enzymmenge angenommen, die in 1%iger Lösung von lösli cher Stärke ihre Hydrolyse bei einem pH-Wert von 4,6 und einer Temperatur von 50°C unter Bildung von 1 µMol Gluko se innerhalb von 1 Minute katalysiert. Man nimmt 1,5 Liter Enzymlösung der Glukoamylase. Die Immobilisierung erfolgt analog zu Beispiel 4. Man erhält 3,5 kg immobilisierte Glukoamylase mit einer Aktivität von 990 E/g (31,2%), bezogen auf die Trockensubstanzen.

Beispiel 8

Zur Herstellung der immobilisierten α-Amylase wird der Prozeß analog zu Beispiel 4 durchgeführt, nur daß als Enzymlösung 1,5 Liter α-Amylaselösung in 0,1 molarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,2 und einer Aktivi tät von 2520 E/ml verwendet werden. Als Aktivitätseinheit (E) der α-Amylase ist eine solche Menge von Hydrolyseproduk ten (bezogen auf die Maltose) in µMol ausgedrückt ange nommen, die bei der Hydrolyse 1%iger wäßriger Stärkelösung unter Einwirkung von 1 ml Enzym bei einer Temperatur von 50°C und einem pH-Wert von 6,2 innerhalb von 1 Minute entsteht. Die Immobilisierung der α-Amylase erfolgt analog zu Beispiel 4. Man erhält 3,5 kg immobilisierte α-Amylase, deren Aktivität 720 E/g (19,0%), bezogen auf die Trockensubstanzen, beträgt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen, welches die Behandlung eines Trägers mit einem chemischen Reagens zur Bindung des Enzyms und mit einem Enzym und die anschließende Reinigung des trägerfixier ten Enzyms vorsieht, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung des Trägers durch den aufeinanderfolgenden Rückumlauf des chemischen Reagens zur Aktivierung der Trägeroberfläche und Bindung des Enzyms durch den un beweglichen Träger, dann des Enzyms oder des Enzyms und danach des chemischen Reagens zur Bindung des Enzyms am Träger erfolgt, wobei der Rückumlauf so lange dauert, bis die Trägerporen mit den angegebenen Reagenzien völlig gesättigt werden.

2. Anlage zur Durchführung des Verfahrens nach An spruch 1, welche

- einen gelochten Behälter (3) für den Träger und
- Vorrichtungen zum Aufgeben des Trägers in den Be hälter (3), Zuführen von chemischem Reagens, Enzym und Lösung zur Reinigung des immobilisierten Enzyms in den Behälter (3) mit dem darin befindlichen Träger und Austragen des trägerfixierten Enzyms vorsieht, dadurch gekennzeichnet, daß sie
- wenigstens mit einem zusätzlich gelochten Behälter (3) für den Träger
- mit einem Förderer, der an seinem Zugorgan befe stigte
- Halter (2) trägt, die zur Aufnahme von gelochten Behältern (3) für den Träger dienen, und
- mit nach der Bewegungsrichtung der gelochten Be hälter (3) angeordneten Kammern (8) zur Behandlung des in den gelochten Behältern (3) befindlichen Trägers mit chemischem Reagens, Enzym oder Lösung zur Reinigung des immobilisierten Enzyms ausgerüstet ist, wobei jede der Kammern
- einen im Oberteil der Kammer (8) vorhandenen Stut zen (13) mit Öffnungen zur Zuführung eines der ange gebenen Reagenzien in den gelochten Behälter (3) und ein
- Sammelbecken (12) aufgestellt
- am Boden der Kammer (8) zum Speichern der genannten Reagenzien, welche aus den gelochten Behältern (3) kommen, hat, das mit dem Stutzen (13) über
- eine Rohrleitung (14) und
- eine Pumpe (15) in Verbindung steht, damit der Rück umlauf von Reagenzien durch den gelochten Behälter (3) verwirklicht wird, bis die Trägerporen mit den angegebe nen Reagenzien völlig gesättigt werden, wobei
- die obere Wand und die Stirnwände der Kammern (8)
- die Schlitze (9) und
- Öffnungen (10) zur Verschiebung der Halter (2) mit den gelochten Behältern (3) aus der vorhergehenden Kammer (8) in die darauffolgende Kammer zur Verfügung haben.

3. Anlage nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

- die genannten Halter (2)
- am Zugorgan des Förderers in einem Abstand von einander befestigt sind, der dem Mittenabstand von zwei benachbarten Kammern (8) entspricht.