DE3220961C2

DE3220961C2 -

Info

Publication number: DE3220961C2
Application number: DE3220961A
Authority: DE
Inventors: Yacov Rishon Lezion Il Ashani; Haim Ramat Hasharon Il Leader; Lily Rishon Lezion Il Raveh; Rachel Tel Aviv Il Bruckstein; Miachel Rehovot Il Spiegelstein
Original assignee: STATE OF ISRAEL VERTRETEN DURCH ISRAEL INSTITUTE FOR BIOLOGICAL RESEARCH NESS-ZIONA IL
Current assignee: STATE OF ISRAEL VERTRETEN DURCH ISRAEL INSTITUTE FOR BIOLOGICAL RESEARCH NESS-ZIONA IL
Priority date: 1981-06-04
Filing date: 1982-06-03
Publication date: 1990-05-17
Also published as: IL63037A; DE3220961A1; US4472320A; IL63037A0

Description

Die Erfindung betrifft neue 1,3,2-Dioxaphosphorinan-2-oxide, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende nichttoxische Anticholinesterase-Arzneimittel, die in der Medizin Verwendung finden.

Bei kürzlichen Untersuchungen wurden gezeigt, daß Acetyl cholinesterase (AChE,EC 3.1.1.7), die zuvor mit 1,3,2-Di- oxaphosphorinan-2-oxiden inhibiert worden ist, eine spontane Reaktivierung mit einer t _1/2 von 12 min bei pH 7,0 erleidet, was in großem Widerspruch zu dem Enzym steht, welches mit O,O-Diäthylphosphorylderivaten inhibiert ist [vgl. Ashani et al., Biochemistry 11, 3518 (1972) und Ashani und Leader, Biochem. J. 177, 781 (1979)].

Der Schutz von Säugetieren gegenüber der Vergiftung durch organische Phosphorverbindungen durch Vorbehandlung mit Carbamaten wurde der Inhibierung der Acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) zugeschrieben, wobei labile Carbamoyl- AChE-Konjugate gebildet werden. Diese Inhibierung ver hindert die vollständige und irreversible Phosphorylie rung, und als Folge wird die Enzymaktivität, bedingt durch die spontane Decarbamoylierung, wiederhergestellt. Die Geschwindigkeit der AChE-Regeneration hängt u. a. von der Struktur des Carbamoyl-Molekülteils und von den kine tischen Eigenschaften des Enzyms ab [vgl. Gordon et al., Toxicol and App. Pharmacol. 43, 207 (1978)].

Weiterhin werden Carbamate häufig für die Behandlung von Krankheiten verwendet, die mit cholinergischen Störungen einhergehen, z. B. Pyridostigminbromid bei Myasthenia gravis, Neostigminmethylsulfat bei nervlich bedingten Blasenfunktionsstörungen und Physostigmin bei Gehirn störungen.

Carbamate dieser Art sind ziemlich giftige Arzneimittel, und die maximale Dosis, die bei solchen Verbindungen, wie Physostigminsulfat und Pyridostigminjodid, bei Meer schweinchen keine Nebenwirkungen ergibt, beträgt 0,16 bzw. 0,1 mg/kg.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue 1,3,2-Dioxaphos phorinan-2-oxide der Formel

worin R′ für H, Alkyl oder eine Gruppe der Formel -Alkyl- N(R′)₂ bzw. -Alkylen-N(R′)₂ steht, R′′ für Wasserstoff oder Alkyl in der 4-, 5- oder 6-Stellung steht und X ein physiologisch annehmbares Anion darstellt, das dem quaternären Ammoniumsalz entspricht, wobei die Verbindung der Formel (III) auch als freies Amin vorlie gen kann, ein Verfahren zur Herstellung solcher Verbin dungen und pharmazeutische Zubereitungen, die eine oder mehrere dieser Verbindungen als aktiven Bestandteil ent halten und bei der Behandlung cholinergischer Störungen und der Prophylaxe gegenüber der Organophosphor-Vergiftung verwendet werden.

Die pharmazeutischen Zubereitungen sind von Wert bei der Behandlung von Vergiftungen durch Organophosphor-Verbindungen und ebenfalls bei der Behandlung von Krankheiten, wie Myasthenia gravis (und anderen ähnlichen Autoimmun krankheiten), Glaucoma, Blasenfunktionsstörungen, Gehirn störungen und allgemein Enzleptica.

Im Gegensatz zu den Carbamaten sind die neuen Verbindungen vergleichsweise wenig toxisch und können in ver gleichsweise großen Dosiseinheitsmengen ohne bemerkens werte Nebenwirkungen verabreicht werden.

Die Verbindungen der obigen allgemeinen Formel können leicht - wie aus den folgenden Beispielen folgt - herge sellt werden.

Verbindungen der Wahl sind Verbindungen, worin R′ Nieder alkyl, wie Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Iso butyl und tert.-Butyl; Aryl, wie Phenyl, substituiertes Phenyl, Benzyl, etc., bedeutet; R′′ für Wasserstoff, Methyl, Äthyl, Propyl oder Isopropyl steht und X ein beliebiges, an sich bekanntes, physiologisch annehmbares Anion bedeutet. Bevorzugte Anionen sind Halogene, wie Chlor, Brom, Jod und Methansulfonat.

Die neuen Verbindungen werden tatsächlich aus zwei Mole külteilen (I) und (II) synthetisiert, nämlich dem cyclischen Phosphatester (I) und dem (3-Trimethylammonio)- phenyljodid oder einer ähnlichen Gruppe

worin Y in dieser Art von Estern Cl, F, SCH₂CH₂N(R′)₂, etc. bezeichnet, R′ für H, Alkyl, Aryl, etc. steht, R′′ Wasserstoff oder Alkyl, wie oben definiert, bedeutet und X die oben gegebene Bedeutung besitzt. Die Gruppe (II) ist eine potentiell wirksame Abgangsgruppe.

Eine bevorzugte Verbindung ist O-(3-Trimethylammonio phenyl)-1,3,2-dioxaphosphorinan-2-oxid-jodid (TDPI), welches das Kombinationsprodukt der obigen Verbindung (I) und der Verbindung (II) (R′ = CH₃; X = J) ist.

Die bevorzugte Verbindung ist die, worin X für J steht. Man kann aber auch ein anderes physiologisch annehmbares Anion verwenden.

Durch die Einführung des quaternären Stickstoffatoms wird die Inhibierungsgeschwindigkeit erhöht, während gleichzeitig die Phosphorylierung von AChE in vivo auf die peripheren Stellen beschränkt wird. Es wurde experi mentell gefunden, daß die reversible Phosphorylierung von AChE durch (I) wirksam durch spezifische Reaktivatoren, wie Oxime, im Gegensatz zu dem Carbamoyl-AChE-Konjugat kontrolliert werden kann. Die austretende Gruppe (II) ist ein Strukturanalogon des potenten reversiblen Inhibitors von AChE-Ecrophoniumbromid, worin R′ Äthyl bedeutet. Im allgemeinen sind Phenylester des Typs (I) in neutralen, wäßrigen Lösungen bei mäßigen Temperaturen (25 bis 37°C) sehr stabil.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Ver bindungen der Formel (III) umfaßt die Umsetzung von 2- subst.-1,3,2-Dioxaphosphorinan-2-oxid (I; X = Cl) mit 3- Dimethylaminophenol oder mit substituiertem 3-Dimethyl aminophenol und die anschließende Umsetzung mit einem Alkylhalogenid, wie Methyljodid, zur Herstellung des angestrebten Produkts.

Die neuen Verbindungen sind von Wert als aktive Bestand teile pharmazeutischer Zubereitungen für die Behandlung von cholinergischen Störungen und für die Prophylaxe bei der Vergiftung mit Organophosphorverbindungen, sowie als Fungizide und Pertizide.

Beispielsweise hat eine prophylaktische Anwendung solcher Zubereitungen eine Schutzwirkung gegenüber Dosismengen in der Größenordnung von 5 bis 22 LD₅₀, ausgedrückt als Schutzverhältnis, abhängig von dem verabreichten Gift und dem verwendeten Tier, ergeben. Weiterhin sind die neuen Verbindungen und die diese enthaltenden pharmazeutischen Zubereitungen von Wert bei der Behandlung von Krank heiten, wo man erwarten kann, daß eine kontrollierte Er höhung von Acetylcholin wirksam bei der Behandlung der cholinergischen Störungen ist. Beispielsweise erhöht eine Verbindung der Formel (III) die Kontraktibilität der glatten Muskeln signifikant, was man aus der Blasen wölbung bei Kaninchen und Menschen erkennen kann. Sie schützt weiterhin das vorbehandelte Hemidiaphragma von Ratten vor der somatischen Vergiftung durch partiale oder zeitweise Blockade von AChE.

Die folgenden Synthesen und Verwendungsangaben von spezifischen Verbindungen der obigen Gruppe von Verbindungen, nämlich von Verbindungen, worin R′ Methyl bedeutet und X für Halogen steht, vorzugsweise für Jod, sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel Herstellung von O-(3-Trimethylammoniophenyl)-1,3,2-dioxaphosphorinan-2-oxid-jodid (TDPI)

(a) Eine Lösung von 2-Chlor-1,3,2-dioxaphosphorinan- 2-oxid (48,0 g, 0,3 M) in trockenem Benzol wird tropfenweise zu einer Lösung von 3-N,N-Dimethylaminophenol (42,0 g, 0,3 M) und Triäthylamin in 250 ml trockenem Benzol gegeben. Das Gemisch wird 4 h am Rückfluß er hitzt, auf Zimmertemperatur abgekühlt und dann wird das Triäthylamin-Hcl abfiltriert. Nach dem Waschen mit kaltem Wasser erfolgt ein Waschen mit kalter 10%iger wäßriger NaOH. Das Benzol wird über MgSO₄ getrocknet und bei vermindertem Druck entfernt. Das entstehende, viskose Öl wird an Siliciumdioxid (CHCl₃) chromatographiert; man erhält 31,5 g des reinen und homogenen tertiären Amins.

(b) 11,0 g der obigen Verbindung und 20 g Methyl jodid werden 2 h in Aceton am Rückfluß erhitzt. Der Nieder schlag wird abfiltriert und aus 95%igem Äthanol um kristallisiert; man erhält 8,9 g blaßgelbe, rhombische Kristalle, Fp. 178 bis 181°C (Zers.).

Analyse für C₁₂H₁₉NPO₄J:
berechnet:
C 36,09%, H 4,76%, N 3,50%;
gefunden:
C 35,96%, H 4,73%, N 3,32%.

Die NMR, MS und IR-Spektroskopie bestätigen die Homogenität und die Struktur von TDPI. Aus der UV-Analyse folgt, daß das freie Phenol TMPH, falls überhaupt vorhanden, 0,3% nicht übersteigt.

Unter Verwendung des obigen Verfahrens werden cis- und trans-4-Methylderivate von (III), nämlich O-(3-Trimethyl ammoniophenyl)-4-methyl-1,3,2-dioxaphosphorinan- 2-oxid-jodid, hergestellt. Die beiden Isomeren werden vor der Alkylierung mit Methyljodid durch Säulen chromatographie getrennt.

Die neue Verbindung (III), worin R′ für CH₃ steht und R′′ H in den Stellungen 4, 5 und 6 bedeutet und X = J (TDPI), wird mit AChE entweder von einer elektrischen Zelle oder mit Rattenhirnhomogenat inkubiert und die Abnahme in der Enzymaktivität nähert sich einem stationären Zustand. Man stellt fest, daß die Anfangsgeschwindigkeit der Freigabe von TMPH in guter Übereinstimmung mit der Geschwindigkeitskonstanten ist, die man bei Inhibierungs messungen erhält. Das inhibierte Enzym wird spontan bei der extremen Verdünnung in einer Geschwindigkeit wieder hergestellt, die ähnlich wie die Geschwindigkeitskonstante, die man bei Inhibierungsuntersuchungen von Schema I berechnet.

2-Hydroxyiminomethyl-1-methylpyridinium-jodid (2-PAM) beschleunigt die spontane Reaktivierung signifikant, wo hingegen das 3-Analoge (3-PAM) die Regenerierung der Enzymaktivität nicht verbessert. Aufgrund dieser Ergeb nisse und im Vergleich mit früheren Untersuchungen wurden verschiedene cyclische Ester (I) in dem folgenden Schema für die Inhibierung von AChE durch TDPI nahe gelegt.

Butyrylcholinesterase (BuChE, EC 3.1.1.8), entweder aus Pferde- oder aus Mäuseserum, zeigt andere Profile. Es entwickelt sich kein stationärer Zustand, obgleich die Geschwindigkeitskonstanten bei der Inhibierung mit der Zeit abnehmen. Da die Anwesenheit von mehreren Formen des Serums BuChE nachgewiesen wurde, ist es wahrschein lich, daß die Darstellung der ersten Ordnung mehr als einen Exponenten bedeutet. Das inhibierte Enzym regene riert sich nicht so schnell wie AChE-TDPI-Konjugat. Je doch verstärkt 2-PAM die Reaktivierung von Pferdeserum BuChE nach der Inhibierung mit TDPI. Die verschiedenen Geschwindigkeitskonstanten werden aus den Anfangsneigungen bei der Inhibierung und Reaktivierung von BuChE im Gegensatz zu AChE berechnet, wo die Anfangskonstanten aus den Gleichungen, die auf dem Schema I beruhen, berechnet wurden. Eine Alterung wurde nur im Fall von BuChE beob achtet. In Tabelle 1 sind die verschiedenen kinetischen Parameter, die mit der Inhibierung von AChE und BuChE durch TDPI assoziiert sind, angegeben.

Tabelle 1

Kinetische Parameter für TDPI bei pH 7,0

Die Bildung von instabilem, kovalentem Phosphoryl-AChE- Konjugat ist offensichtlich begleitet von dem nicht kovalenten, reversiblen Komplex (Michaelis-Komplex) zwischen AChE und TDPI (AChE · TDPI) oder TMPH (AChE · TMPH). Obgleich gefunden wurde, daß TMPH (K _I = 0,25 µM) 50fach wirkungsvoller ist als TDPI (K _i = 0,013 mM), ausge drückt als Konzentrationen, die erforderlich sind, um eine ähnliche Menge an Michaelis-Komplex zu ergeben, er gibt TDPI einen besseren Schutz von AChE gegenüber der irreversiblen Phosphorylierung als (II). Bei diesem Satz von Versuchen wurde die Wirksamkeit von TDPI und TMPH aufgrund des gleichen Konzentrations/Affinitäts-Verhält nisses verglichen, wobei I/K _I =10.

Wenn TDPI zu einem isolierten Ratten-Hemidiaphragma gegeben wird, nimmt die AChE-Aktivität in einer Geschwin digkeit ab, die ähnlich ist, wie die bei AChE entweder aus Rattenhirnhomogenat oder vom Zitteraal. Die Entfernung von TDPI durch Waschen ergibt die Aktivität des Enzyms bei dem Ratten-Hemidiaphragma wieder bis zum ursprünglichen Wert innerhalb von 15 bis 30 min. TDPI schützt das Ratten-Hemidiaphragma vor der irreversiblen Blockierung der Tetanus erzeugenden Spannung, die durch einen starken Anticholinesterase-Inhibitor, 1,2,2-Tri methylpropyl-methylphosphonofluoridat (Soman), erzeugt wird. Bei Hemidiaphragmen, die nicht mit TDPI vorbehan delt waren, verschwand die tetanische Aktivität voll ständig und konnte bei der Entfernung der Inhibitoren nicht wiederhergestellt werden. Zusätzlich schützt TDPI Mäuse (zusammen mit Anticholinergika und Oxim) gegen 5 × LD₅₀ Soman und 22 × LD₅₀ Paraoxon.

Die Korrelation zwischen den in vitro-Ergebnissen und den in vivo-Beobachtungen läßt den Schluß zu, daß der ausgezeichnete Schutz von AChE, der durch TDPI erhalten wird, auf die Bildung eines reversiblen, kovalenten Phosphorylkonjugats und auf die Bildung reversibler, kovalenter Michaelis-Komplexe, (AChE · TDPI) und (AChE · TMPH), zurückzuführen ist.

Es wurde weiterhin gezeigt, daß glatte Muskeln, die von der Blasenwölbung entnommen wurden, von Kaninchen und Menschen stark auf TDPI ansprechen. Diese Muskeln kon traktieren, wenn sie 10 min in Anwesenheit von 20 µg/ml TDPI inkubiert sind, fünfmal stärker als nichtbehandelte Muskeln nach der Zugabe der gleichen Menge an Acetyl cholin. Die Muskelaktivität kehrt allmählich auf ihre normale Aktivität beim Auswaschen zurück.

Es wurde festgestellt, daß die Toxizität von TDPI, aus gedrückt als LD₅₀, 444 mg/kg (subkutan) bei Mäusen be trägt. TDPI ist ein relativ nichttoxisches, potentielles Arzneimittel, das bei der Behandlung cholinergischer Störungen verwendet werden kann.

Bei einem anderen Beispiel wurde gezeigt, daß durch die Einführung von einer Methylgruppe in der 4-Stellung der Verbindung (III) (R′ = CH₃; 4-R′′ = CH₃; X = J) cis zu dem Aryloxy- Molekülteil (II) die Affinität von (III) gegenüber AChE (K _I] erhöht wird und eine Abnahme im k _S erfolgt (vergl. Schema I). Im Falle des Isomeren mit einer 4-trans-Methylgruppe nehmen die Affinität, die Phosphory lierung und spontane Reaktivierung signifikant ab, ver glichen mit TDPI. Die akute Toxizität (LD₅₀) der beiden 4-Methyl-Isomeren liegt im Bereich von 250 bis 260 mg/kg (subkutan) bei Mäusen.

Da K _I, k′ und k _S die gesamte Geschwindigkeitskonstante für eine Näherung an den stationären Zustand von AChE und die Aktivität von AChE beim stationären Zustand be stimmen, können die Verbindungen der Formel (III) als nichttoxische Arzneimittel für die Behandlung von Krank heiten verwendet werden, bei denen eine kontrollierte Erhöhung von Acetylcholin wirksam ist.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen weiterhin fungizide und pertizide Eigenschaften. Die Erfindung betrifft weiterhin Zubereitungen mit pertizider und fungizider Wirkung, die die erfindungsgemäßen Verbindungen sowie übliche Zusatzstoffe und/oder Trägermaterialien enthalten.

Claims

1. 1,3,2-Dioxaphosphorinan-2-oxide der allgemeinen Formel worin R′ Wasserstoff, Alkyl oder eine Alkyl-N(R′)₂-Gruppe bedeutet, R′′ für Wasserstoff oder Alkyl in den 4-, 5- oder 6-Stellungen steht und X ein physiologisch annehm bares Anion darstellt.

2. Verfahren zur Herstellung von 1,3,2-Dioxaphos phorinan-2-oxiden nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 2-Chlor-1,3,2-dioxaphosphorinan-2-oxid mit einer Verbindung der Formel umsetzt und anschließend mit einem Alkylhalogenid um setzt.

3. Pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Bestandteil eine Verbindung nach Anspruch 1 enthält.