DE3200822A1 - Verfahren zur kopplung von proteinen und haptenen an teflon(pfeil hoch)r(pfeil hoch) fuer immunologische und enzymatische bestimmungen - Google Patents

Verfahren zur kopplung von proteinen und haptenen an teflon(pfeil hoch)r(pfeil hoch) fuer immunologische und enzymatische bestimmungen

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DE3200822A1 DE19823200822 DE3200822A DE3200822A1 DE 3200822 A1 DE3200822 A1 DE 3200822A1 DE 19823200822 DE19823200822 DE 19823200822 DE 3200822 A DE3200822 A DE 3200822A DE 3200822 A1 DE3200822 A1 DE 3200822A1
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Lebrecht von Dr. 2406 Stockelsdorf Klitzing
Thomas Dr. Schultek
Christian 2400 Lübeck Strasburger
William Graham Dr. 2401 Groß-Grönau Wood
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds

Description

  • VERFAHREN ZUR KOPPLUNG VON PROTEINEN UND HAPTENEN AN TEFLONR
  • FÜR IMMUNOLOGISCHE UND ENZYMATISCHE BESTIMMUNGEN Antikörper spielen bei mikroanalytischen, insbesondere bei immunologischen Meßverfahren eine erhebliche Rolle. Im medizinischen Bereich trifft dies insbesondere für die Hormonanalytik zu. Hierbei kommt es zu einer von der Konzentration abhängigen reversiblen Bindung zwischen einem bekannten An-Antikörper und dem entsprechenden zu messenden Substrat (Antigen).
  • Ober eine Eichkurve mit bekannten Standards wird dann auf die Konzentration der zu bestimmenden Substanz in der Probe geschlossen. Es handelt sich hierbei demzufolge um ein indirektes Meßverfahren. Daraus ergibt sich auch die besondere Problematik einer einwandfreien Trennung zwischen dem freien Antigen und dem Antigen/Anti körper-Komplex. Meistens erfolgt diese durch Zentrifugation, entweder unmittelbar oder nach weiteren Reaktionen, die eine Massenzunahme des Komplexes zum Ziel haben.
  • Um das Meßverfahren effizienter zu machen, geht das Bestreben dahin, Antikörper an cnemisch inerte Kunststoffe -die sich von dem wässrigen Reaktionsansatz sehr gut abtrennen lassenzu binden. Insbesondere eignen sich hierzu Materialien, die die Möglichkeit einer kovalenten Anknüpfung -und damit sehr festen Bindung- von Proteinen, z.B. Antikörper, bieten.
  • Bisher lag das Problem in der häufig sehr hohen unspezifischen Bindungsfähigkeit von Kunststoffen, was zu nicht-reproduzierbaren Meßergebnissen führt. Die Forderung ist also ein chemisch inerter Kunststoff, wofür sich am besten TEFLONR eignet.
  • Dieser Kunststoff hat noch den weiteren Vorteil einer hohen spezifischen Masse, die eine einfache Abtrennung ermöglicht.
  • Die charakteristische Inertheit von TEFLON verhinderte jedoch bis jetzt eine Anwendung für das hier beschriebene Bestimmungsverfahren.
  • Bislang sind Proteine entweder adsorptiv an Polystyrol oder Polypropylen angelagert worden oder an NYLON kovalent gebunden worden; diese Kunststoffe sind jedoch nicht in dem geforderten Maße soweit inert, daß sie für immunologische Analysenverfahren unbedenklich eingesetzt werden können.
  • Dieser Erfindung liegt daher ein Verfahren zugrunde, mit dessen Hilfe Proteine und Haptene an die Oberfläche von TEFLON1Z-Kugeln oder -scheiben gebunden werden können. Hierzu wird zunächst TEFLONR in einer wässrigen NH3-Lösung in Anwesenheit von metallischem Natrium aktiviert: 1 g Natrium (metallisch) ad 80 ml mit 30% NH3-Lösung; 20 min schütteln bei ca. 35 Nach einmaligem Waschen mit destilliertem Wasser erfolgt eine Bindung des gewünschten Antikörpers im Zweistufenverfahren: 1. Aktivierung mit Carbodiimid (0.5.g Carbodiimid in 10 ml KH2PO4, 0.5 mol/l, pH 6.0 über 12 h bei 22 OC) 2. Der TEFLONR-Carbodiimid-Komplex wird mit dem gewünschten Antikörper gekoppelt (Reaktion erfolgt in KH2P04, 0.05 (!) mobil, pH 6.0 in Anwesenheit des Antikörpers).
  • In einem analogen Verfahren ist es auch möglich, Haptene (z..
  • Thyroxin) an TEFLONR zu binden. Hierbei wird nach der Na/NH3-und Carbodiimid-Aktivierung eine 'Brücke' errichtet, wobei TEF-LONR mit 6-aminohexan-säure reagiert. Anschließend erfolgt eine erneute Aktivierung mit Carbodiimid (s.o.). Nach einem Waschschritt mit destilliertem Wasser wird das Hapten gebunden (über die NH2-Gruppen).
  • Weiterhin lassen sich Enzyme an aktiviertes TEFLONR binden.
  • Damit wird erreicht, daß sich diese Proteine in quasi-fester Form darstellen lassen und sich zu jedem gewünschten Zeitpunkt aus dem Reaktionsansatz entfernen lassen.
  • Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht es somit, für alle immunologischen Meßverfahren entsprechende Testkombinationen zu entwickeln.
  • Testverfahren: Meßgröße ist die prozentuale Bindung, im folgenden auf die eingegebene Gesamtradioaktivität bezogen. Zur Ober-TEFLONR prüfung der Bindungsstärke wird der an TEFLONR gebundene Antigen/Antikörper-Komplex in Detergentien gewaschen. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse im Vergleich zu unspezifischen Bindungen und Adsorptionen an anderen Kunststoffen dargestellt:
    Material gesamte Bindung nach Bindung nach
    Radioaktivität Abtrennung der Auswaschen mit
    ungebundenen Detergentien
    Anti gene
    Kovalente Bindung Na-aktiviertes 100 % 75 % 74 % TEFLONR Adsorptionen Polystyrol- 100 % 63 % 56 % Röhrchen Polypropylen-Röhrchen 100 % 54 % 46 % Polystyrol- 100 % 63 - 70 % 58 - 66 % ugeln TEFLONR-Scheiben 100 % 37 % 30 % (bei pH 6.0) SPAC+)-Röhrchen 100 % 60 % 55 % Unspezifische Bindung Na-aktiviertes 100 % 4 % , 0.2 % TEFLONR 1 TEFLON -Scheiben 100 % 3 % 0.1 % Polystyrol-Kugeln 100 % 7 % 4 % Polystyrol- 100 % 6 % 4 % Röhrchen +)SPAC = Wz. BYK-Mallinckrodt

Claims (4)

  1. P a t e n t a n s p r ú c h ê Imm ¼, unologisches Analysenverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß ein chemisch inerter Kunststoff (z.B. TEFLONR) für Proteinbindungen aktiviert wird.
  2. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an aktivierten Kunststoff Proteine (z.B. Antikörper) kovalent gebunden werden.
  3. 3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an aktivierten Kunststoff Haptene (z.B. Antigene) kovalent gebunden werden.
  4. 4. Enzymatisches Analysenverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß Enzyme an aktiviertes TEFLONR gebunden werden.
DE19823200822 1982-01-14 1982-01-14 Verfahren zur kopplung von proteinen und haptenen an teflon(pfeil hoch)r(pfeil hoch) fuer immunologische und enzymatische bestimmungen Withdrawn DE3200822A1 (de)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0205581A1 (de) * 1984-12-17 1986-12-30 Akzo Nv Festphasenimmuntest mit immunoreagenzien, immobilisiert auf inerten kunstharzoberflächen.
EP0353460A2 (de) * 1988-06-28 1990-02-07 Millipore Corporation Membranen zur Protein-Sequenzierung an der Festphase
WO1999007750A1 (en) * 1997-08-05 1999-02-18 The University Court Of The University Of St. Andrews Perfluorinated resins as a support for solid phase reactions

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EP0353460A2 (de) * 1988-06-28 1990-02-07 Millipore Corporation Membranen zur Protein-Sequenzierung an der Festphase
EP0353460A3 (de) * 1988-06-28 1991-09-04 Millipore Corporation Membranen zur Protein-Sequenzierung an der Festphase
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