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BESCHREIBUNG
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Die Erfindung betrifft ein neues hydrolysiertes Glucan, ein Verfahren
zu seiner Herstellung und für pharmazeutische Zwecke geeignete Zubereitungen, die
dieses hydrolysierte Glucan enthalten. Das erfindungsgemaße Glucan ist ein wertvolles
immunmodulierendes Mittel zur Behandlung von Krebserkrankungen und von Gelenkrheumatismus.
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Es ist gut bekannt, daß Fungi der Klasse Basidiomycetes Polysaccharide
erzeugen können, die Aktivität gegen Krebsarten und andere Tumoren besitzen. Diese
Polysaccharide sind Jedoch nur geringfügig in Wasser löslich und selbst wenn es
möglich ist, eine wässrige Lösung aus solchen Polysacchariden herzustellen, gelatiniert
diese Lösung leicht. Infolgedessen ist es sehr schwierig, pharmacologische Versuche
mit diesen Polysacchariden durchzuführen und noch stärkere Schwierigkeiten treten
auf, wenn man versucht, diese Polysaccharide therapeutisch anzuwenden.
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Gelenkrheumatismus ist eine unheilbare Krankheit und obwohl zahlreiche
Arzneimittel untersucht worden sind, um die Krankheit zu heilen, waren die Versuche
nicht erfolgreich. Bekannte Behandlungen, beispielsweise die Behandlung mit Steroiden,
steroidfreien entzündungshemmenden Mitteln, goldhaltigen Arzneimitteln usw., sind
in Jedem Fall symptomatische Behandlungen, jedoch keine kausalen Behandlungen.
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In der Japanischen Patentschrift 828 248 wird ein Verfahren zur Herstellung
eines Polysaccharids mit Anti-Tumor-Aktivität beschrieben, bei dem ein Glucan erzeugender
Mikroorganismus des Genus Corticium oder des Genus Hypnochus gezüchtet wird und
danach aus der Kulturbrühe ein Glucan abgetrennt wird, welches in
der
Hauptkette ß-(1-+ 3)-Bindungen und in den Seitenketten p-(1 -> 6)-Bindungen besitzt.
Wie Jedoch vorstehend erläutert wurde, hat das gebildete Glucan zwar Antitumoraktivität,
es läßt sich Jedoch in der Praxis schwierig anwenden, weil seine wässrige Lösung
zur Gelbildung neigt.
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Erfindungsgemäß wurde nun überraschenderweise gefunden, daß durch
Behandlung von Glucanen dieses Typs mit Ameisensäure und anschließende Hydrolyse
des gebildeten Produkts ein Glucan mit wesentlich verbesserter Löslichkeit in Wasser
hergestellt werden kann und daß darüber hinaus das so erhaltene Glucan in unerwarteter
Weise eine sehr stark verbesserte Antitumoraktivität zeigt.
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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Glucan, das 3-(1 p 3)-Bindungen
in der Hauptkette und p-(1 -+ 6)-Bindungen in den Seitenketten aufweist, wobei das
Verhältnis von Glucoseeinheiten in den Seitenketten zu Glucoseeinheiten in der Hauptkette
etwa 2:7 beträgt, welches durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet ist: (a) In
Form des gefriergetrockneten Produkts ist es ein weißer, amorpher Feststoff; (b)
es ist löslich in Wasser, Dimethylsulfoxid und in Dimethylformamid und ist unlöslich
in Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Benzol und Diäthyläther; (c) seine Elementaranalyse
entspricht im wesentlichen den Werten, die für ein Polysaccharid des Hexose-Typs
mit gebundenem Wasser der folgenden Formel errechnet werden: (C6H1005)n-nH20 s in
der n eine aus Eigenschaft (e) errechnete Zahl von mehr als 800 ist; (d) sein Infrarot-Spektrum
(KBr-Pulver) entspricht dem in der beigefügten Zeichnung dargestellten Spektrum
und
(e) in der analytischen Ultrazentrifugal-Verteilungskurve wird
nur ein einziger Peak beobachtet und sein aus der Sedimentationskonstante errechnetes
Molekulargewicht beträgt 150 000 bis 160 000.
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Dieses Glucan ist erhältlich durch Behandlung eines Polysaccharids,
das durch einen Fungus der Familie Corticiaceae erzeugt wird, mit Ameisensäure und
Hydrolyse des so behandelten Produkts.
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Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung
des erfindungsgemäßen hydrolysierten Glucans durch Behandlung eines Polysaccharids,
das durch einen Fungus der Familie Corticiaceae gebildet wird, mit Ameisensäure
und anschließende Hydrolyse des so behandelten Produkts.
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Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Arzneimittel, welches das
erfindungsgemäße hydrolysierte Glucan im Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten
Träger oder Verdtinnungsmittel enthält.
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Das als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete
Polysaccharid ist ein Stoffwechselprodukt eines Funugs der Familie Corticiaceae
der Basidiomyceten, beispielsweise eines Fungus des Genus Corticium oder Hypnochus.
Dieses Ausgangs-Polysaccharid kann hergestellt werden, indem der gewählte Fungus
gezüchtet wird, wie ausführlicher in der japanischen Patentschrift 828 248 beschrieben
ist.
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Das erfindungsgemäße hydrolysierte Glucan wird vorzugsweise hergestellt,
indem 70 bis 90-gewichtsprozentige wässrige Ameisensäure zu dem Ausgangs-Polysaccharid
gegeben wird und das erhaltene Gemisch'vorzugsweise unter Rühren, erhitzt wird.
Die Temperatur, auf die das Reaktionsgemisch erhitzt wird, ist nicht besonders kritisch,
wenn auch eine Temperatur von 800 bis 1000C bevorzugt wird. Die für diese Reaktion
erforderliche Zeit hängt von den Reaktionsbedingungen, insbesondere der Temperatur,
ab; die Reaktion läuft Jedoch normalerweise innerhalb einer Dauer von 5 Minuten
bis 1 Stunde vollständig ab.
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Vorzugsweise wird danach der Uberschuß an Ameisensäure durch Verdampfen
unter vermindertem Druck entfernt. Dann wird Wasser zugesetzt, um den Rückstand
zu hydrolysieren. Die Hydrolyse erfolgt vorzugsweise durch Erhitzen des Gemisches
unter Rückfluß, bis die Deformylierung vollständig ist. Das gebildete gelatinöse
Material kann dann durch Zentrifugieren entfernt werden und zu der Mutterlauge wird
ein organisches Lösungsmittel zugesetzt, um einen Niederschlag auszufällen, der
dann gewonnen wird. Die Art des in dieser Stufe verwendeten Lösungsmittels unterliegt
keiner speziellen Beschränkung, vorausgesetzt, daß dieses das hydrolysierte Polysaccharid
nicht löst. Vorzugsweise wird ein Alkohol, wie Methanol oder Äthanol, verwendet.
Der erhaltene Niederschlag wird dann in Wasser gelöst oder dispergiert und die Lösung
oder Dispersion wird gefriergetrocknet, wobei das gewünschte hydrolysierte Polysaccharid
in Form eines weißen, amorphen Feststoffes erhalten wird.
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Dieser amorphe Feststoff ist in Wasser, Dimethylsulfoxid und in Dimethylformamid
löslich und ist unlöslich in Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Benzol und Diäthyläther.
Er ist außerdem warmebeständig.
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Die Daten seiner Elementaranalyse entsprechen den Daten, die für ein
Polysaccharid des Hexosid-Typs mit einem Gehalt an gebundenem Wasser der Formel
(CgH1005),.liH20 errechnet werden.
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Das Infrarotspektrum des Produkts (in Kaliumbromid-Pulver) ist in
Fig. 1 dargestellt.
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Die Verbindung hat eine spezifische Drehung 20 7 = -15° + O (c = 0,1,
Dimethylsulfoxid).
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D In der analtytischen Ultrazentrifugal-Verteilung (ultra-centrifugal
spectrum) des Produkts wurde nur ein einziger Peak beobachtet
und
aus der Sedimentationskonstante wurde ein Molekulargewicht im Bereich von 150 000
bis 160 000 erhalten, woraus der Wert n in der vorstehend angegebenen Formel zu
833 bis 889 errechnet werden konnte.
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Die das erfindungsgemäße hydrolysierte Glucan aufbauenden Saccharide
können in folgender Weise identifiziert werden. Das hydrolysierte Glucan wird in
in wässriger Schwefelsäure gelöst und dann während 120 Minuten bei 1000C in einem
geschlossenen Rohr weiter hydrolysiert. Dann wird das Produkt mit Bariumhydroxid
neutralisiert und der Papierchromatographie unterworfen. Durch Entwicklung des Papierchromatogramms
mit einer wässrig-ammoniakalischen Silbernitratlösung wird nur ein einziger Flecken
beobachtet. Das durch diesen einzigen Flecken charakterisierte Produkt kann durch
Vergleich mit der Wiederholung des Versuches unter Verwendung einer Standardprobe
als Glucose identifiziert werden. Die Bindungsarten der Glucoseeinheiten, die das
erfindungsgemäße hydrolysierte Glucan aufbauen, können bestimmt werden, indem das
Glucah mit Hilfe üblicher Methoden vollständig methyliert wird, das methylierte
Glucan unter Bildung von methylierter Glucose hydrolysiert und die methylierte Glucose
reduziert und das Reduktionsprodukt acetyliert wird. Durch Gaschromatographie wird
das so gebildete Gemisch als Acetate von 2,3,-4, 6-Tetra-0-methylglycitol, 2,4,
6-Tri-0-methylglycitol und 2,4-Di-0-methylglycitol im Molverhältnis von etwa 1:2,5:1
identifiziert. Dieses Ergebnis bestätigt, daß das erfindungsgemäße Glucan etwa zwei
Seitenketten (Jeweils aus einer einzigen Glucoseeinheit), gebunden mit (1 > 6)-Bindungen
auf Je 7 Glucoseeinheiten, mit (1 o 3)-Bindungen, in der Glucan-Hauptkette aufweist.
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Durch Untersuchung der Zersetzungsprodukte, die mit Hilfe von Endo-p-1,3-glucanase
und Exo-ß-1,3-giucanase erhalten wurden, wurde außerdem bestätigt, daß alle Glucosebindungen
in der p-Konfiguration vorlagen.
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Das erfindungsgemäße hydrolysierte Glucan ist besser in Wasser löslich
und unterliegt weniger stark der Gelbildung in wässriger
Lösung,
als das Polysaccharid, aus dem es hergestellt wurde.
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Außerdem ist seine Immunmodulierende Aktivität (beispielsweise die
Anti-Krebs-Aktivität und die Hemmwirkung gegen Arthritis) sehr stark und von niederer
Toxizität begleitet. Insbesondere die starke Aktivität zur Hemmung von Arthritis
und die niedere Toxizität waren angesichts der entsprechenden Eigenschaften bzw.
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Aktivitäten von Polysacchariden, die direkt durch Fungi der Klasse
Basidiomycetes erzeugt wurden, nicht zu erwarten. Das erfindungsgemäße hydrolysierte
Glucan ist daher wertvoll zur Behandlung von Krankheiten, die durch Störungen des
Immunsystems verursacht werden, z.B. Gelenkrheumatismus.
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Die biologische Aktivität und Toxizität des erfindungsgemäßen hydrolysierten
Glucans werden durch die nachstehenden Tests aufgezeigt.
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(1) Anti-neoplastische Aktivität Diese Versuche wurden mit 7 Wochen
alten männlichen Mäusen des ICR-Stammes durchgeführt. 2 x 106 Krebszellen von Sarcoma
180 wurden auf die Achselhaut Jeder Maus aufgepfropft.6 bzw. 7 Tage nach dem Aufpfropfen
wurde eine Probe des erfindungsgemäßen hydrolysierten Glucans (hergestellt nach
der in dem nachstehenden Beispiel 1 beschriebenen Weise) in sterilisierter physiologischer
Kochsalzlösung durch InJektion in die Bauchhöhle verabreicht.
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Die Konzentration des hydrolysierten Glucans in der Salzlösung betrug
0,1 % (Gewicht/Volumen). 25 Tage nach dem Aufpfropfen wurde der Durchmesser des
Tumors gemessen. Der Versuch wurde unter Verwendung einer Kontrollgruppe von Mäusen
wiederholt, denen kein hydrolysiertes Glucan verabreicht wurde. Das Tumor-Hemmungsverhältnis
(%) ) wurde mit Hilfe der nachstehenden Formel errechnet: d d x x 100 do worin d
der durchschnittliche Tumordurchmesser (mm) der
Kontrollgruppe
und d der durchschnittliche Tumordurchmesser der behandelten Gruppe ist. Die Ergebnisse
sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt, die die Wirkung von variierenden
Mengen des pro Tag verabreichten erfindungsgemäßen hydrolysierten Glucans auf das
Tumor-Hemmungsverhältnis zeigt.
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45 Tage nach dem Aufpfropfen wurden alle behandelten Mäuse sorgfältig
untersucht, um die Anzahl von Mäusen zu bestimmen, die eine vollständige Regression
des Tumors zeigten. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind ebenfalls in Tabelle
1 gezeigt, in der die Anzahl von Mäusen, die vollständige Regression zeigten, im
Verhältnis zu der Gesamtzahl der untersuchten Mäuse in der jeweiligen Gruppe angegeben
ist.
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Tabelle 1
| Verabreichte Menge Tumor-Hemmungs- Vollständige |
| (mg/kg Körpergewicht/Tag Verhältnis (96) Regression |
| 0,1 47 1/5 |
| 1,0 85 3/4 |
| 10,0 100 5/5 |
(2) Arthritishemmende Aktivität Diese Versuche wurden nach der Verfahrensweise nach
Winder et al (C.V. Winder, L.A. Lembke und MoD. Stephens, Arth. Rheum., 12, 472
(1969)) zur Messung der Fähigkeit von Verbindungen zur Unterdrückung von AdJuvans-induzierter
Arthritis von Ratten durchgeführt. Dieser Versuch wird üblicherweise zur Prufung
von antineoplastischen Mitteln angewendet
Lewis-Ratten erhielten
eine subcutane InJektion des AdJuvans in die Sohlenfläche jeder rechten Hinterpfote,
um die Krankheit hervorzurufen. Eine Lösung des erfindungsgemäßen hydrolysierten
Glucans wurde nach dem Einimpfen des Adjuvans 15 Tage lang täglich in die Bauchhöhle
injiziert. Die Versuche wurden mit einer Kontrollgruppe von Tieren wiederholt, denen
das hydrolysierte Glucan nicht verabreicht wurde. Am 18., 20., 24., 28. und 32.
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Tag nach dem Einimpfen des Adjuvans wurden die Schwellungen der Füße
der behandelten Ratten mit den Schwellungen der Füße der nicht behandelten Ratten
verglichen und unter Anwendung einer ähnlichen Formel wie der zur Errechnung des
Tumor-Hemmungs-Verhältnisses verwendeten Formel wurde das Hemmungsverhältnis für
jede Dosis des hydrolysierten Glucans berechnet. Die Ergebnisse sind in Form der
Mittelwerte in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt.
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Tabelle 2
| Verabreichte Menge Zahl der Hemmungs- ID50 |
| (mg/kg Körpergewicht/Tag Tiere Verhältnis |
| 0,1 5 36,8 + 3,6 |
| 0,33 |
| 1,0 10 59,0+3,9 |
(3) Akute Toxizität Ein Test der akuten Toxizität (Beobachtung während einer Woche)
wurde durchgeführt, indem Proben des hydrolysierten Glucans in die Bauchhöhle von
männlichen ddy-Mäusen inJiziert wurden. Nach der Verabreichung der Proben in Mengen
von 100 bzw. 300 mg/kg wurden keine Todesfälle beobachtet und das Körpergewicht
stieg normal an.
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Aus den vorstehend erläuterten Ergebnissen ist ersichtlich, daß das
erfindungsgemäße hydrolysierte Glucan beträchtlichen Wert als immunmodulierendes
Mittel hat. Die Verabreichung des Mittels erfolgt vorzugsweise parenteral, beispielsweise
durch subcutane InJektion, intravenöse InJektion oder intramuskuläre InJektion.
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bie Tagesdosis schwankt in Abhängigkeit von der zu behandelnden Krankheit,
dem Verabreichungsweg und der Häufigkeit der Verabreichung; im allgemeinen beträgt
Jedoch die Tagesdosis für einen Erwachsenen 0,5 bis 50 mg, beispielsweise etwa 5
mg. Diese Menge kann als Einzeldosis oder in Teildosen verabreicht werden.
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Das erfindungsgemäße hydrolysierte Glucan kann in einer Form zubereitet
werden, die für den gewahlten Verabreichungsweg geeignet ist, wobei jede beliebige
der Zubereitungen angewendet werden kann, die normalerweise für andere immunmodulierend
wirksame Mittel angewendet wird. So kann beispielsweise ein Mittel in einer Ampulle
in der Menge einer Dosiseinheit vorgesehen werden oder es kann in einem Behälter
für mehrere Dosiseinheiten, vorzugsweise zusammen mit einer antiseptisch wirksamen
Substanz, vorgesehen werden.
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Das Mittel kann in Form einer Suspension, einer Lösung oder einer
Emulsion in einem öligen oder wässrigen Trägermedium angewendet werden und kann
gegebenenfalls übliche Zusätze, beispielsweise Suspensionshilfsmittel und/oder Stabilisatoren
und/ oder Dispergiermittel.enthalten.
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Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die aktive Substanz in Form
eines Pulvers vorliegen, welches vor der Verabreichung in einem geeigneten Träger,
beispielsweise in sterilem, pyrogenfreiem Wasser, gelöst wird.
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Wenn das erfindungsgemäße Mittel in Form einer Dosiseinheit vorgesehen
wird, enthält es vorzugsweise 0,5 bis 10 mg- der aktiven Substanz pro Dosiseinheit.
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Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele ausführlicher
erläutert. Darin zeigt Beispiel 1 die Herstellung des erfindungsgemäßen
hydrolysierten
Glucans und Beispiel 2 die Herstellung eines pharmazeutischen Mittels, welches das
hydrolysierte Glucan enthält.
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Beispiel 1 Zu 3 g Corticane (einem Polysaccharid, das gemäß dem nachfolgenden
Herstellungsbeispiel erhalten wurde) wurden 240 ml einer 90-prozentigen (Gewicht/Gewicht)
wässrigen Ameisensäure gegeben und das Gemisch wurde unter Rühren 20 Minuten auf
95°C erhitzt. Nach dem Verdampfen der Ameisensäure unter vermindertem Druck wurden
600 ml Wasser zu dem Rückstand zugefiigt und das gebildete wässrige Gemisch wurde
unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Minuten lang bei 10 000
Upm zentrifugiert. Zu der so abgetrennten überstehenden Flüssigkeit wurden 2,4 1
Äthanol gegeben, wobei ein Niederschlag gebildet wurde, der dann durch Zentrifugieren
gewonnen wurde. Zu dem Niederschlag wurden 500 ml Wasser gegeben und dann wurde
das wässrige Gemisch gefriergetrocknet, wobei 2,0 g des gewünschten hydrolysierten
Glucans in Form eines weißen amorphen Feststoffes erhalten wurden. Das Produkt hatte
folgende Eigenschaften: Elementaranalyse Berechnet für (C6HlnO,) .nH20: C: 40,00
%; H: 6,71 %; Wasser: 10,00 %.
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Gefunden: C: 40,22 %; H: 6,52 %; Wasser: 9,63 %.
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Spezifische Drehung: t 20 - 150 (c = 0,1, Dimethylsulfoxid).
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Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr) vcm-1: 3400, 1640, 1080, 1040.
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Molekulargewicht (analytische Ultraæntrifugalverteilung, Phosphatpuffer,
pH 6,5): 159 000.
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Beispiel 2 5 mg des in Beispiel 1 erhaltenen hydrolysierten Glucans
wurden in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und die Lösung wurde dann in
üblicher Weise durch Erhitzen sterilisiert, wobei eine inJizierbare Lösung erhalten
wurde.
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Herstellung des Ausgangs-Glucans In fünf 500 ml-Sakaguchi-Kolben wurden
Jeweils 100 ml eines Glucose-Kartoffelmediums (mit einem Gehalt an 2 Gew.-% Glucose
in einer gekochten Brühe, die 200 g/l Kartoffeln enthielt) gegeben und der Kolbeninhalt
wurde sterilisiert.
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Eine Kultur von Corticium vagum -31-9 (FERM No. 302) wurde dann eingeimpft
und die Schüttelis:ultur wurde 8 Tage lang bei 260C durchgeführt. Nach der Beendigung
der Züchtung wurden 800 ml destilliertes Wasser zu 400 ml der Kulturbrühe gegeben
und der pH-Wert des Gemisches wurde auf 7,4 eingestellt. Das Gemisch wurde dann
in einer Homogenisiervorrichtung homogenisiert und die feste Substanz wurde durch
Zentrifugalabscheidung entfernt.
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Zu 1 1 der überstehenden Flüssigkeit wurden 3 1 Äthanol gegeben und
der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in destilliertem
Wasser gelöst. Anschließend wurden.162 ml einer 0,1 m wässrigen Lösung von Cetyltrimethylammoniumbromid
und 13 ml einer 0,5 m wässrigen Lösung von Natriumhydroxid zugesetzt, um den pH-Wert
der Lösung auf 12,6 einzustellen, so daß die Polysaccharide ausgefällt wurden. 300
ml einer 10 zeigen (Gewicht/ Volumen) wässrigen Essigsäure wurden zu dem Niederschlag
gegeben, um ihn zu lösen, wonach der Lösung 1,2 1 Äthanol zugesetzt wurden. Der
gebildete Niederschlag wurde in 350 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung
wurde in einen Celluloseschlauch gefüllt und gegen destilliertes Wasser
dialysiert.
Zu 500 ml des Dialysats wurden 2 1 Äthanol gegeben, um erneut die Polysaccharide
auszufällen. Der gebildete Niederschlag wurde in 100 ml destilliertem Wasser gelöst
und dann gefriergetrocknet, wobei 2 g eines rohen Glucans erhalten wurden.
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13,5 mg des so erhaltenen rohen Glucans wurden in 27 ml destilliertem
Wasser gelöst und die Lösung wurde durch eine mit Sephadex G"200 (Warenzeichen)
gefüllte Säule geleitet. Die Säule wurde dann mit destilliertem Wasser eluiert und
das Eluat in 20 ml-Fraktionen gewonnen. Das Glucan zeigte einen Peak in der dritten
Fraktion und in den Fraktionen 2 bis einschließlich 11 wurden 75,3 % des gesamten
Polysaccharids gewonnen. Die Fraktionen 2 bis 11 wurden kombiniert und der erhaltenen
Lösung wurden 800 ml Äthanol zugesetzt, um die Ausfällung durchzuStihren.
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Der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst und
dann gefriergetrocknet, wobei 9,2 mg eines als "Corticane" bezeichneten Glucans
erhalten wurden0 Corticane ist eine weiße neutrale Substanz.
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