DE3011714C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sterilisation oder Entseuchung einer Apparatur nach der Gattung des Hauptanspruchs.

Bei der Sterilisation oder Entseuchung von Apparaturen besteht das Hauptproblem in der Vernichtung von Bakteriensporen. So können bekanntlich zahlreiche Bakterien bei Temperaturen überleben, die sehr vier höher liegen als deren normale Wachstumstemperaturen, wobei es sich um thermoresistente, nicht als Sporen vorliegende Bakterien handeln kann, obgleich diese Eigenschaft vor allem für Bakterien typisch ist, die Endosporen bilden.

Endosporen halten in der Tat Temperaturen aus, die für die entsprechenden vegetativen Zellen tödlich sind. So ist es z. B. möglich, die Sporen bestimmter Bazillen mehrere Stunden lang auf Temperaturen von über 100°C zu erhitzen, ohne daß dadurch eine Sterilisation erfolgt. Selbstverständlich werden die Sporen bei hohen Temperaturen zerstört, doch ist deren Sterbensrate sehr viel niedriger als diejenige der entsprechenden vegetativen Zellen.

Zur Zerstörung von Bakteriensporen lassen sich zwei Verfahrensweisen mit sehr unterschiedlichen Zielen anwenden:

• - eine Sterilisation, die eine Zerstörung aller vorhandenen Bakteriensporen mit einer Wahrscheinlichkeitsrate zum Ziele hat, die mit dem Erfordernis nach der Kommerzialisierung steriler Produkte, die in sterilen Apparaturen verarbeitet sind, im Einklang steht. Dies ist z. B. der Fall bei der Sterilisation verschiedener, bei der Behandlung von Milch eingesetzter Materialien;
• - eine Entseuchung, die den Gehalt an Sporen auf ein Niveau herabsetzt, das für den angestrebten Verwendungszweck als ausreichend angesehen wird. Eine derartige Verfahrensweise ist z. B. auf bestimmten Gebieten der industriellen Behandlung von Gemüsen anwendbar.

Eine Sterilisationsbehandlung sieht die Einwirkung eines Mittels mit sporicider Wirkung während einer vorbestimmten Zeit und Temperatur vor, wobei die Gesamtheit von Zeit und Temperatur, die für ein bestimmtes Verfahren charakteristisch sind und zu einer bestimmten Sterilisationswirkung führen, mit ′′Sterilisationsplan′′ bezeichnet wird.

Die Berechnung eines derartigen Plans basiert auf der genauen Kenntnis der Behandlungsbedingungen (insbesondere in bezug auf pH, Temperatur und Wasseraktivität) und der Zerstörungskinetik von Bakteriensporen unter diesen Bedingungen. Dabei wählt man für diese Berechnung die Parameter von Bakteriensporen aus, die typisch sind für die thermoresistentesten Stämme, die vernichtet werden sollen. Diese Stämme (oder Stämme mit vergleichbaren Eigenschaften) müssen üblicherweise in dem zu behandelnden Produkt oder Material vorliegen und sie müssen außerdem befähigt sein, sich in dem Produkt nach dessen Sterilisation zu entwickeln.

Eine Berechnung des Sterilisationsplans ist nur dann möglich, wenn die Zerstörungskinetik der Bakteriensporen einem konstanten und reproduzierbaren Gesetz folgt bei einer wie bei der anderen Behandlung. Unter diesem Gesichtspunkt stellt daher die Sterilisation durch Hitzeeinwirkung einen beachtlichen Vorteil dar. So ist ganz allgemein die Zerstörungskinetik von Bakteriensporen durch die folgende Gleichung charakterisiert:

E = log (No/N) = t/D _T (1)

wobei E die Sterilisationseffizienz (definiert als der Logarithmus der Verhältnisses zwischen No, der Zahl der ursprünglich vorhandenen Bakteriensporen, und N, deren Zahl nach einer Zerstörungsbehandlung während der Zeit t), das Verhältnis darstellt zwischen der Behandlungsdauer t und einer Konstante D _T , die charakteristisch ist für die Behandlung des betreffenden Stammes und Dezimalreduktionszeit bei der Temperatur T gennant wird. Die Zerstörungskinetik kann somit leicht durch eine Gerade wiedergegeben werden, durch Auftragen von log N als Funktion von t.

Nachteilig an zahlreichen sporiciden Behandlungen ist, daß bei diesen die Zerstörungskinetik nicht einem derart einfachen Gesetz folgt. So gibt es zahlreiche Beispiele für Zerstörungskinetiken, die durch die angegebene Gleichung (1) nicht beschrieben werden können, wie z. B. die Druckschrift O. Cerf., Journal of Applied Bacteriology (1977) 42: 1-19, erkennen läßt.

Zu nennen sind ferner die Behandlungen in alkalischem Milieu oder in Methylenglykol, Glutaraldehyd, Wasserstoffperoxid und Ethylenoxid.

Bei den bekannten Sterilisationsverfahren wird mit feuchter Hitze bei Temperaturen von über 100°C gearbeitet, wobei bekanntlich bei über 100°C jeder zusätzliche Temperaturgrad mit stark erhöhten Verfahrenskosten verbunden ist.

Ferner ist bei der Sterilisation mit Dampf oder der Sterilisation mit heißem Wasser unter Druck Voraussetzung, daß die gesamte zu sterilisierende oder zu entseuchende Apparatur den anzuwendenden Druck aushält, so daß in den meisten Fällen kostspielige Apparaturen verwendet werden müssen.

Es besteht daher ein starkes Bedürfnis an einer Sterilisation oder Entseuchung bei Temperaturen unter 100°C sowie Verfahrensbedingungen, die es ermöglichen, so nahe wie möglich bei Atmosphärendruck zu arbeiten.

Gegenstand des Hauptpatents sind Hydroxyamine der Formel

worin bedeuten:

Reinen geradkettigen, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest mit 5 bis 18 Kohlenstoffatomen und Xein Brückenglied der Formeln -O-, -S- oder -NH-

und deren Salze, sowie die Verwendung dieser Hydroxyamine als Sterilisations- oder Konservierungsmittel.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein besonders leicht und einfach durchzuführendes und dennoch wirksames Verfahren zur Sterilisation oder Entseuchung einer Apparatur anzugeben.

Gelöst wird die gestellte Aufgabe mit einem Verfahren, wie es in Anspruch 1 gekennzeichnet ist.

In vorteilhafter Weise führt man die Behandlung während einer Zeitspanne von 1 bis 60 Minuten durch.

Vorzugsweise arbeitet man bei Temperaturen von 70 bis 90°C, insbesondere während einer Zeitspanne von 10 bis 30 Minuten.

Der Erfindung liegt somit die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß ein Teil der aus dem Hauptpatent bekannten Verbindungen Sterilisationsmittel eines besonderen Typs sind, die sich auch als ′′Hilfsmittel für die Hitzeeinwirkung′′ bezeichnen lassen.

Die Wirkung des Hilfsmittels äußert sich dabei in einer wesentlichen Verminderung des Absolutwerts der Widerstandsfähigkeit von Sporen. Daraus ergibt sich, daß die wohlbekannten Berechnungsmethoden für die Sterilisation durch Hitze insgesamt übernommen werden können für die Sterilisation mit Hilfe derartiger Verbindungen in einem Temperaturintervall von 60 bis 100°C bei Atmosphärendruck.

Aus verschiedenen Versuchen, die diesbezüglich durchgeführt wurden, ergibt sich, daß zur Erzielung einer zufriedenstellenden Sterilisation die zu behandelnde Apparatur mit einer Lösung, die 0,5 bis 2% der Verbindung, vorzugsweise 1% der Verbindung, enthält, während einer Zeitspanne von 10 bis 30 Minuten, vorzugsweise während einer Behandlungszeit in der Größenordnung von 20 Minuten, bei einer Temperatur zwischen 70 und 90°C, vorzugsweise bei einer Temperatur von 80°C, in Kontakt gehalten werden muß.

Eine Verbindung, die sich als besonders wirksam erwiesen hat, ist die Verbindung der Formel:

in Form des Hydrochlorids, die im folgenden als Verbindung A bezeichnet wird.

Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten Verbindungen haben den weiteren Vorteil, daß sie nicht toxisch sind, Haut und Schleimhäute nicht reizen, und nur eine sehr schwache Korrosionswirkung sowohl auf Metallteile als auch auf Kunststoffmaterialien ausüben.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

Die sporicide Aktivität wird in Form von Überlebenskurven wiedergegeben, d. h. durch eine graphische Auswertung, bei der der Logarithmus der Konzentration an überlebenden Sporen als Funktion der Zeit aufgetragen ist. Die auf diese Weise erhaltene Überlebenskurve weist einen geraden Teil auf, der einem gegebenenfalls vorliegenden Schulterabschnitt vorausgeht. Dieser gerade Teil ist charakteristisch für eine Dezimalreduktionszeit, d. h. für eine Zeit, die zur Verminderung der Zahl der lebenden Sporen um 90% erforderlich ist und durch den Buchstaben D symbolisiert wird.

D ist die zum Übergang der Überlebenskurve in eine logarithmische Einheit erforderliche Zeit. Der Wert für D wird in Minuten ausgedrückt.

Die Teile der Überlebenskurve, die geradlinig sind, werden durch das umgekehrte Verhältnis ihrer Neigung wiedergegeben, nämlich:

worin bedeuten:

t = Behandlungszeit der Sporen in Minuten No = Zahl der lebenden Sporen pro ml z. Zt. Null N = Zahl der überlebenden Sporen pro ml z. Zt. t.

Der Wert für D erhöht sich als Funktion der Widerstandsfähigkeit der Sporen. In bestimmten Überlebenskurven wird eine Latenzperiode und ein Nachziehen festgestellt.

Die Latenz ist der Teil der Überlebenskurve, der dem Schulterabschnitt entspricht.

Das Nachziehen ist charakterisiert durch die Verlangsamung der Dezimalreduktionszeit, ausgehend von einer bestimmten Zahl von Reduktionsdezimalen (von 3 bis 4).

a) Allgemeine Charakteristiken der Wirkung der Verbindung A

Die sporicide Wirkung der Verbindung A in Kombination mit Hitzeeinwirkung wurde an Sporen von Bacillus subtilis var. niger untersucht, bei dem es sich um den Bezugsstamm bei der Sterilisation auf chemischem Wege handelt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

• - die Verbindung A in einer Konzentration von 3% hat keine Wirkung bei Raumtemperatur (Temperatur unter 30°C),
• - bei 65°C führt der Zusatz der Verbindung A zu einer beträchtlichen Verminderung des Wertes für D (bei pH 7,0 beträgt D = 2,5 min anstelle von 6.10³ min),
• - die Wirkung der Verbindung A bei 65°C ist optimal bei pH 7 bis 8 und minimal bei pH 4,5,
• - die Wirkung der Verbindung A ist maximal bei Konzentrationen von mindestens 0,9% und sie verschwindet bei Konzentrationen von unter 0,01%.

b) Wahl eines Bakterienstammes für die Untersuchung der Wirkung der Verbindung A

Die Widerstandsfähigkeit gegenüber der Verbindung A von Sporen von B. subtilis var. niger war zu gering, um eine genaue Untersuchung in einem weiten Bereich von Temperatur und Erhitzungsdauer zuzulassen. Es wurde daher unter den anderen, für Laborstudien zur Verfügung stehenden Bezugsstämmen Untersuchungen dahingehend durchgeführt, ob mindestens einer unter ihnen eine Widerstandsfähigkeit besitzt, die für eine derartige Untersuchung ausreicht. Nach der Prüfung von Dutzenden von Stämmen fiel die Wahl auf einen Stamm von B. licheniformis, der im Institut Pasteuer unter der Nr. CNCM I. 079 hinterlegt ist und im Labor aufgrund seiner Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxyd Anwendung findet.

Der Wert für D bei 65°C in Gegenwart der Verbindung A betrug 20 min bei pH 7,0 (gegenüber 2 · 10⁴ min in Abwesenheit der Verbindung A); der Einfluß des pH-Wertes und der Konzentration der Lösung an Verbindung A ist identisch mit den Werten, die für die Sporen von B. subtilis var. niger gefunden wurden.

C) Charakteristiken der Wirkung der Verbindung A auf die Sporen von B. licheniformis Einfluß der Temperatur

In Temperaturintervall von 40 bis 80°C verminderte sich der Logarithmus von D linear mit der Temperatur. Es ergab sich somit die allgemeine Eigenschaft der Hitzeeinwirkung auf die Bakteriensporen. Der Wert für z in Gegenwart der Verbindung A ist jedoch eindeutig höher als in Abwesenheit der Verbindung A (21,5°C anstelle von 8,9°C bei pH 7,0).

z ist die Zahl der Celsiusgrade, die erforderlich sind, daß die T. D. T.-Kurve (Einfluß der Temperatur auf die Dezimalreduktionszeit) in eine logarithmische Einheit übergeht:

worin bedeuten:

T₂-T₁= Behandlungstemperatur in °C, D₁-D₂= Dezimalreduktionszeit in Minuten bei entsprechenden Temperaturen.

Tabelle 1

Thermoresistenz in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 Sporen von Bacillus licheniformis Nr. CNCM I.079 und Bacillus subtilis var. niger

Tabelle 2

Zerstörung von Sporen von Bacillus licheniformis Nr. CNCM I. 079 durch die Verbindung A in einer Konzentration von 0,9% bei pH 7,0 und von Bacillus subtilis var. niger durch die Verbindung A in einer Konzentration von 2,7% bei pH 7,0

Die Ergebnisse zeigen, daß die Wirksamkeit der Verbindung A gegenüber alleinigem Erhitzen abnimmt bei steigender Temperatur.

Linearität der Überlebenskurve

Die Überlebenskurve ist die Kurve, welche den Logarithmus der Zahl der überlebenden Sporen als Funktion der Erhitzungszeit bei einer bestimmten Temperatur wiedergibt.

Unter idealen Bedingungen ist diese Kurve eine Gerade in der eine Messung ermöglichenden Zone (10⁸ bis 10² überlebende Sporen) und unter diesen Bedingungen lassen sich der Wert für D genau berechnen und die zur Erzielung einer korrekten Sterilisation erforderlichen Bedingungen sehr genau festlegen. Als besonders wichtig erweist sich dabei, sicherzustellen, daß für die geringen Zahlen von überlebenden Sporen keine Verlangsamung oder gar Abplattung (als ′′Nachziehen′′ bezeichnetes Phänomen) der Kurve eintritt, was das Vorliegen einer geringen Menge an Sporen, die der Behandlungswirkung entgangen sind, anzeigt. Es verdient hervorgehoben zu werden, daß ein derartiger Befund nicht bereits dann erbracht ist, wenn eine neue chemische Verbindung mit sporicider Wirkung entdeckt wird.

Für diese Untersuchung mit Verbindung A erwies es sich als notwendig, nicht durch direkte Auszählung im Kulturmilieu zu arbeiten, sondern mit Hilfe einer Filtration auf einer Membrane, um jedes Einbringen von Verbindung A in das Kulturmilieu auszuschließen (es erweist sich, daß das Wachstum im Kulturmilieu von erhitzten Sporen in Gegenwart der Verbindung A teilweise gehemmt wird). Unter diesen Bedingungen ist die Wachstumskurve nach dem Erhitzen in Gegenwart der Verbindung A bei pH 7,0 vollkommen linear und sie zeigt kein Nachziehen bei Temperaturen von 80 und 90°C. Die Überlebenskurve bleibt linear bei 50 bis 70°C, zeigt jedoch ein Nachziehen bei einer Zerstörungsrate von 10⁵. Die Überlebenskurve ist dann nicht mehr linear.

Zahl der überlebenden Sporen

Tabelle 3

Beispiel für eine lineare Überlebenskurve (Erhitzen auf 80°C in Gegenwart von 0,9% Verbindung A bei pH 7,0; Sporen von B. licheniformis Nr. CNCM I. 079)

Tabelle 4

Beispiel für eine Überlebenskurve mit Nachziehabschnitt (Erhitzen auf 60°C in Gegenwart von 0,9% Verbindung A bei pH 7,0; Sporen von B. licheniformis Nr. CNCM I. 079)

Beispiel 2

Die Sterilisation des gesamten Sterilisationskreislaufs für Milch in einer Apparatur zur Behandlung von UHT-Milch erfolgt in der Praxis bei 120 bis 130°C während 30 Minuten und feuchter Hitze unter Druck.

Die Sterilisation mit der Verbindung A kann demgegenüber wie folgt durchgeführt werden: der Sterilisationsplan wird festgelegt auf ein Erhitzen bei 80°C während 20 Minuten (oder auf jede andere gleichwertige Behandlung unter dem Gesichtspunkt von deren sporicider Wirkung im Temperaturbereich von 80 bis 100°C).

In einer ersten Phase wird eine 1%ige Lösung der Verbindung A in einem geschlossenen Kreislauf im gesamten Sterilisator- Milchkreislaufbereich umgewälzt. Die Temperatur des Erhitzungsabschnitts des Sterilisators wird in solcher Weise festgelegt, daß an jedem Punkt des Kreislaufs eine Mindesttemperatur von 80°C herrscht.

Nach 20 Minuten Einwirkung bei dieser Temperatur wird der Sterilisator auf normalen Sterilisationsbetrieb eingestellt und mit Wasser gespeist, das unter den gleichen Bedingungen wie später die Milch sterilisiert und gekühlt wird. Dieses Wasser dient zum Evakuieren der Lösung von Verbindung A in einen Vorratsbehälter für eine spätere Behandlung, und anschließend zum Spülen. Dann wird Wasser mit Milch unter den­ selben Bedingungen wie denjenigen, die nach der Sterilisation durch alleinige Hitzeeinwirkung praktiziert werden, durchgeleitet.

Beispiel 3

Eine weitere Anwendung der Verbindung A sieht die Entseuchung von Apparaturabschnitten vor, die mit Bakteriensporen stark verunreinigt sind. Im Blanchierabschnitt einer Sterilisationskette für Gemüse begünstigt z. B. die dort herrschende erhöhte Temperatur das Wachstum und die Sporenbildung von thermophilen Bakterien (die zur Vermehrung bei 65 bis 70°C befähigt sind), deren Sporen eine ungewöhnlich stark erhöhte Widerstandsfähigkeit besitzen. Die Entseuchung dieses Abschnitts, das aus einem Material besteht, welches eine Druckeinwirkung nicht aushält und wo übliche bekannte chemische Sterilisationsmittel (Säuren, Basen, Chlorderivate und dergleichen) wegen des Risikos einer Korrosion nicht angewandt werden können, ist erfindungsgemäß durchführbar unter den gleichen Temperaturbedingungen (80 bis 100°C) und höher und sogar bei einer tiefer liegenden Temperatur zwischen 60 und 80°C, da in diesem Falle eine Verminderung der Verseuchung mit Sporen auf ein akzeptables Niveau angestrebt wird. Die Behandlungsdauer sollte im Hinblick auf die Widerstandsfähigkeit von thermophilen Sporen in der Größenordnung von 20 bis 30 min liegen, kann jedoch variiert werden je nach Risiko der tatsächlichen Verunreinigung und Häufigkeit der Entseuchungsoperationen.

Claims (2)

1. Verfahren zur Sterilisation oder Entseuchung einer Apparatur durch Behandlung mit einer wäßrigen Lösung, die mindestens 0,01 Gewichtsprozent einer Verbindung der Formel worin R einen n-Alkylrest mit 5 bis 14 Kohlenstoffatomen bedeutet, in Form der Base oder von Salzen enthält, nach Patent 26 06 106, dadurch gekennzeichnet, daß man die Apparatur bei einer Temperatur zwischen 60 und 100°C bei Atmosphärendruck mit der Lösung behandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung während einer Zeitspanne von 1 bis 60 Minuten durchführt.