DE2919833A1

DE2919833A1 - Gereinigtes, krebsassoziiertes protein und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2919833A1
Application number: DE19792919833
Authority: DE
Inventors: Kurt Frimann Berg; Kurt Baekgaard Osther
Original assignee: Alfred Benzon AS
Current assignee: Alfred Benzon AS
Priority date: 1978-05-17
Filing date: 1979-05-16
Publication date: 1979-11-29
Also published as: ES480624A1; FR2426055A1; AU4717279A; BE876301A; AU521404B2; NZ190470A; LU81273A1; PT69617A; NL7903854A; JPS5516291A; GB2021593A; FI791551A; SE7904276L; IT7968046A0; NO791643L

Description

Die Erfindung betrifft ein gereinigtes, mit Krebs assoziiertes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung.

Aus der US-PS 4 132 769 (entsprechend der DE-OS 25 48 636) ist ein als C1-IAC bezeichnetes krebsassoziiertes Protein bekannt.

"IO C1-IAC wird als ein krebsassoziiertes Glykoprotein beschrieben, das eine Ci-Inaktivatorwirkung (d-Esterase-Hemmwirkung),ein Molekulargewicht von 110 000 bis 130 000 Dalton (bestimmt durch Gelfiltration) und eine Svedberg-Konstante von 6,2S (bestimmt durch Ultrazentrifugation) aufweist. C1-IAC findet

sich in Pleura- und Ascitesflüssigkeiten von Krebspatienten, Serum und anderen Körperflüssigkeiten von Krebspatienten sowie in bei der Züchtung von menschlichen Krebszellen erhaltenen Kulturmedien.

Erfindungsgemäß wird ein gereinigtes Protein zur Verfügung gestellt, das die gleichen immunologischen Determinanten wie C1-IAC aufweist, d.h. das erfindungsgemäße Protein ist in der

Lage, mit den in der US-PS 4 132 769 beschriebenen Antikörpern, die spezifisch gegen C1-IAC gerichtet sind, zu präzipitieren

und spezifisch immunisierbare Tiere, wie Schweine (dänische Landrasse) und Schafe, unter Bildung von gegen C1-IAC spezifischen Antikörpern, die in der US-PS 4 132 769 beschrieben sind, zu immunisieren. Das erfindungsgemäße Protein läßt sich erhalten, indem man eine C1-IAC enthaltene Lösung über eine Antikörper-Affinitätschromatographiesäule gibt, die matriximmobilisierte Antikörper, die spezifisch gegen C1-IAC gerichtet sind, enthält, und anschließend die Säule mit einem Detergens eluiert. Das auf diese Weise eluierte, gereinigte Protein (im folgenden als CaDet bezeichnet) läßt sich dadurch kennzeichnen, daß es mit Immunoglobulinen präzipitiert, die spezifisch gegen den krebsassoziierten C1-Inaktivator C1-IAC (definiert in der vorerwähnten US-PS 4 132 769) gerichtet

sind, und daß es in einem SDS-PAGE-Gradienten-Gel (SDS-PAGE = L _j

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Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese), im wesentlichen nur eine einzige scharfe Bande bei etwa 25 000 DaI-ton ergibt.

Die Tatsache, daß das Protein im wesentlichen nur eine einzige scharfe Bande in einem SDS-PAGE-Gradienten-Gel ergibt (entsprechen 95 bis 99 % und im allgemeinen mindestens 98 % des gesamten vorhandenen Proteins), ist nach allgemeinen biochemischen Prinzipien als Beweis für das Vorhandensein eines gereinigten Proteins anzusehen. Das beim SDS-PAGE-Verfahren gefundene spezielle "Molekulargewicht" gilt als ein einwandfreies Charakteri-. stikum ("finger print")des in Frage stehenden Proteins.

Das erfindungsgemäße gereinigte Protein (nachstehend mit CaDet abgekürzt), das nur mit Antikörpern gegen C1-IAC reaktive immunologische Determinanten (anders ausgedrückt gegenüber C1-IAC charakteristische immunologische Determinanten) aufweist, erweist sich als besonders wertvolles Antigen zur Immunisierung von spezifisch immunisierbaren Tieren unter Bildung von spezifischen, gegen C1-IAC (und infolgedessen auch gegen CaDet) gerichteten Antikörpern. Bei einer derartigen Bildung von Antikörpern gegen C1-IAC liegen die Vorteile der Verwendung des neuen Proteins CaDet darin, daß aufgrund der Verwendung des gereinigten Antigens ein wesentlich höherer Titer des monospe-

zifischen Antikörpers (spezifisch gegen C1-IAC und infolgedessen gegen CaDet) bei der Immunisierung erhalten wird. Demgemäß bietet das Protein CaDet bei der Herstellung von gegen C1-IAC spezifischen Antikörpern einen beträchtlichen Vorteil. Die bei Verwendung von CaDet zur Immunisierung von spezifisch immuni-

sierbaren Tieren erhältlichen, spezifischeren'und empfindliche-

Vd

pp

Vsrwenduns! / ren Antikörper bieten beträchtliche Vorteile bei der diagnosti^nen/ von anti-Cl-IAC. Die höhere Spezifität und Sensibilität der unter Verwendung von CaDet als immunisierendem Antigen herge-

stellen anti-d-IAC-Immunoglobuline erlauben den Nachweis von 35

geringeren CI-IAC-Konzentrationen im Serum von Krebspatienten.

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Abgesehen von seiner Verwendbarkeit als Antigen bei der Immunisierung von Tieren kann CaDet auch zur Eichung von Tests auf anti-C1-IAC sowie als Reagens bei Hämagglutinationstests und

Radioimmuntests verwendet werden.
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Antikörper, die gegen CaDet gebildet sind, beispielsweise in Schafen oder Schweinen (vgl. die vorerwähnte US-PS 4 132 769)_/ können für diagnostische Zwecke auf die in der vorgenannten US-PS beschriebene Weise herstellt werden. Beispielsweise können die Antikörper einem Agarosegel, das mit gestanzten Löchern zur Aufbringung des Materials mit einem mutmaßlichen Gehalt an C1-IAC versehen ist, einverleibt werden (Manzini-Verfahren). Beispielsweise können auch Radioimmuntests unter Verwendung von isotopenmarkiertem CaDet zur Absorption von Antikörper oder

unter Verwendung von isotopenmarkiertem Antikörper zur Absorption von CaDet entsprechend üblichen Prinzipien zur Durchführung von Radioimmuntests vorgenommen werden. Es können auch Hämagglutinationsverfahren angewendet werden, bei denen CaDet auf rote Blutkörperchen (oder Latexteilchen oder ähnliche Teil-

, aufgebracht und sodann .

chen) / der Antikörper aufgebracht wxrd. Wie bekannt, werden Hämagglutinationstests und analoge Reaktionen vorzugsweise mit reinem Antigen oder monospezifischem Antikörper durchgeführt.

Eine weitere Verwendungsmöglichkeit von Antikörpern, die gegen

das erfindungsgemäße gereinigte Protein CaDet gebildet sind, besteht in der Verabfolgung an Menschen zur Therapie von verschiedenen Krebserkrankungen. Zu diesem Zweck werden die Antikörper in Schweinen gebildet, beispielsweise in Schweinen der dänischen Landrasse. Antiserum, das aus diesen immunisier-

ten Schweinen gewonnen worden ist, wird einer Serumfraktionierung unter Erhalt der im wesentlichen reinen IgG-Immunoglobulinfraktion unterworfen. Es wurde festgestellt (vgl. die US-PS 4 132 769), daß (f.er Mensch IgG-Immunoglobuline des Schweins

verträgt. Diese Immunoglobuline bewirken nämlich beim Menschen 35

bei parenteraler Verabfolgung keine Immunisierung. Ein weiterer Verwendungszweck für die gegen CaDet gebildeten Antikörper besteht im Einsatz als Antikörper bei der Antikörper-Affini-

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tätschromatographie zur Herstellung von CaDet aus Flüssigkeiten mit einem Gehalt an C1-IAC.

Wie vorstehend erwähnt, kann CaDet aus Lösungen mit einem Gehalt an C1-IAC durch Antikörper-Affinitätschromatographie und durch Elution mit einem Detergens hergestellt werden. Das SDS-PAGE-Molekulargewicht von etwa 25 000 Dalton unterscheidet sich beträchtlich von dem bei der Gelfiltration ermittelten Molekulargewicht von 110 000 bis 130 000 Dalton, das in der ÜS-PS ¹Q 4 132 769 angegeben ist. Die Tatsache, daß das gereinigte Protein im SDS-PAGE-Acrylamid-Gradieriten-rGal bei einem bestimmten Molekulargewicht ein Finger—print-Muster hinterläßt, bedeutet nicht notwendigerweise, daß das Protein in seiner nativen Form

das gleiche Molekulargewicht aufweist. 15

Das mit dem SDS-PAGE-Gradienten gefundene Molekulargewicht 25 000 Dalton (im Vergleich zum früher bei der Gelfiltration für das Protein C1-IAC gefundenen Molekulargewicht von 110 000 bis 130 000) bedeutet möglicherweise, daß CaDet ein Zersetzungsprodukt von nativem, krebsassoziiertem C1-Inaktivator (C1-IAC) ist. Ein derartiges Zersetzungsprodukt kann sich beispielsweise aufgrund der Detergensbehandlung in der Elutionsstufe und/ oder aufgrund der Behandlung mit SDS gebildet haben, wobei die immunologischen Determinanten von C1-IAC erhalten geblieben sind. Dieses Ergebnis kann aber auch bedeuten, daß es sich bei dem in der US-PS 4 132 769 beschriebenen C1-IAC nicht um ein reines protein sondern um ein Konglomerat von verschiedenen Proteinen mit einer d-Esterase-Hemmwirkung handelt.

Die Gelfiltration von rohem C1-IAC an Sephacryl S-200 in Iprozentigem Triton X-100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vom pH-Wert 7,2 mit einem Gehalt an 1m NaCl ergibt bei der Elution 3 Peaks, die mit anti-Ci-IAC (vgl. US-PS 4 132 769) präzipitieren. Ein Peak entspricht einem Molekulargewicht von 90 000 bis 100 000 Dalton, ein weiterer Peak einem Molekulargewicht von 50 000 bis 55 000 Dalton und der dritte Peak einem Molekulargewicht von 25 000 bis 30 000 Dalton. Diese Gelfiltration ist nachstehend näher beschrieben.

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Das bei der Gelfiltration ermittelte Molekulargewicht stimmt mit Annahme überein, daß es sich bei C1-IAC um ein Konglomerat von mehreren Einheiten handelt.

Unabhängig von der genauen Natur der protein-chemischen Beziehung zwischen C1-IAC und CaDet wurde festgestellt, daß CaDet, wie vorstehend erläutert, ein äußerst wertvolles Antigen zur Bildung von hohen Titern an monospezifischen Antikörpern gegen C1-IAC ist. Derartige Antikörper können ebenso eingesetzt werden, wie das in der US-PS 4 132 769 beschriebene anti-Ci-IAC. Erfindungsgemäß besteht aber der zusätzliche Vorteil des erhöhten Titers und eines stark monospezifischen Charakters.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des Proteins CaDet, das mit gegen C1-IAC (vgl. US-PS 4 132 769) spezifischen Antikörpern präzipitiert und das vorerwähnte SDS-PAGE-Acrylamid-Gradienten-Gel-Muster aufweist, wobei 95 bis 99 %, im allgemeinen mindestens 98 % des Proteins in einer einzigen Bande bei etwa 25 000 Dalton erscheinen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung, die eine Komponente enthält, die mit spezifisch gegen C1-IAC gerichteten Antikörpern präzipitiert , der Antikörper-Affinitätschromatographie unter Verwendung von matrix-immobilisierten Antikörpern, die spezifisch el -IAC gerichtet sind, unterwirft und das antikörper-25

gebundene CaDet eluiert. Diese Antikörper Affinitätschromatographie wird in an sich bekannter Weise unter Verwendung einer Säule mit matrix-immobilisierten Antikörpern durchgeführt. Die Anwesenheit von CaDet im Eluat kann durch die vorerwähnte SDS-PAGE-Gradienten-Gelelektrophorese (nachstehend näher erläutert)

nachgewiesen werden. Die Elution von CaDet wird zweckmäßiger— weise spektrophotometrisch durch Bestimmung des Proteins im Eluat verfolgt. Die Ci-IAC-Aktivität der Eluatfraktionen wird durch Immunopräzipitationstests bestimmt, wobei beispielsweise der Durchmesser des Präzipitationsrings in einem Manzini-Test

unter Verwendung von anti-C1-IAC gemessen wird (vgl. die US-PS 4 132 769).

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folgen den Die Bedingungen für die Beschickung der Säule / bei der Antikörper-Affinitätschromatographie üblichen Prinzipien;

vgl. hierzu auch die nachstehenden Ausführungen. Die Elutionsbedingungen der Säule werden so eingestellt, daß das vorstehend charakterisierte Protein CaDet eluiert wird. Es wurde festgestellt, daß sich hierfür ein aus PBS mit einem pH-Wert von 7,2 bestehender Elutionspuffer mit einem Gehalt an 0,1 % Triton X-100 und 1m NaCl eignet. Es besteht jedoch kein Grund zu der Annahme, daß Triton X-100 das einzige Detergens ist, das in der Lage ist, C1-IAC von der Säule ohne Zerstörung des Antigens (oder der Antikörpersäule) zu eluieren. Somit können erfindungsgemäß auch andere ionogene Detergentien, wie Natriumdodecylsulphat (SDS) oder nicht-ionische Detergentien zur Elution von CaDet von der Säule verwendet werden. PBS = phosphat-gepufferte Kochsalzlösung.

Die auf die Säule aufgesetzte Lösung, die eine mit Antikörpern gegen C1-IAC präzipitierende Komponente enthält, kann entweder ein rohes, C1-IAC enthaltendes Präparat, wie Pleura- oder Ascitesflüssigkeit von Krebspatienten oder ein bei der Züchtung von menschlichen Krebszellen erhaltenes Kulturmedium sein (vgl.

ein

hierzu die US-PS 4 132 769). Es kann sich auch um entsprechendes, teilweise gereinigtes Präparat handeln, beispielsweise um ein durch Adsorption und Gelfiltration gereinigtes Präparat (vgl. die genannte US-PS). Vorzugsweise handelt es sich um ein gemäß dem "Sephadex A50"-Verfahren (vgl. die genannte US-PS) hergestelltes Produkt, zu dessen Gewinnung das Material mit einem Gehalt an C1-IAC an einem Anionenaustauscherharz (beispielsweise Sephadex A 50) adsorbiert wird und aus dem Eluat vom Anionenaustauscherharz das Material mit einem Gehalt an C1-iac präzipitiert wird und anschließend das Präzipitat dialysiert, in NaCl-Lösung gelöst und diese Lösung lyophilisiert wird. Weitere Ausgangsprodukte mit einem Gehalt an C1-IAC, die zur Herstellung von CaDet verwendet werden können, sind PIacentaflüssigkeit und Placenta-ähnO.che TFlüssigkeiten. Eine hohe Konzentration an C1-IAC wurde in Placenta gefunden. Da Placenta eine Quelle für Humanproteine ist, für deren Erhalt keine gesetzlichen oder ethischen Beschränkungen

bestehen, stellt die Herstellung von Antikörpern gegen C1-IAC L . _I

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ORIGINAL INSPECTED

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unter Verwendung von aus Placenta gewonnenem CI-IAC als Antigen, vorzugsweise von aus Placenta gewonnenem CaDet,eine wichtige Ausführungsform der Erfindung dar. Die Tatsache, daß Placenta C1-IAC enthält, muß bei der Interpretation von Testergebnissen an Proben von schwangeren Frauen mittels anti-Ci-IAC, gebildet gegen C1-IAC oder CaDet, berücksichtigt werden. Dieser Befund steht jedoch nicht im Gegensatz zu den vorstehenden Ausführungen, daß es sich bei C1-IAC um ein mit verschiedenen Krebsarten assoziiertes Protein handelt, wobei C1-IAC die als Parasiten im menschlichen Gewebe wachsenden Krebszellen gegen eine Zerstörung durch das menschliche Immunsystem schützt. In entsprechender Weise kann Cl-IAC das das Immunsystem neutralisierende Protein darstellen, das den Fetus befähigt, sich im Uterus festzusetzen und darin zu wachsen, ohne daß er durch das Immunsystem der Mutter angegriffen wird.

Entsprechend anderen biologischen Gemischen, aus denen ein in kleinen oder relativ kleinen Anteilen vorhandenes Protein zu isolieren ist, werden die zur Herstellung von CaDet verwendeten C1-IAC enthaltenden Lösungen vorzugsweise einer Behandlung zur Entfernung, Neutralisierung oder Zerstörung von darin enthaltener proteolytischer Aktvität unterzogen, beispielsweise durch Zugabe eines enzymzerstörenden Mittels oder eines Enzyminhibitors, wie Sojabohnen-Trypsininhibitor, PoIy-L-lysin oder Trasylol, oder indem man die Lösung über eine Säule, die mit immobilisierten Enzyminhibitoren oder enzymzerstörenden Mitteln beschickt ist, gibt. Die in der Antikörper-Affinitätssäule verwendeten Anti-CI-IAC-Immunoglobuline können auch vor ihrer Immobilisierung oder Verwendung zur Entfernung von jeglicher proteolytischer Aktivität behandelt werden, indem man sie der gleichen Behandlung unterwirft, beispielsweise indem man sie über eine Säule mit matrix-immobilisiertem Enzyrainhibitor oder enzymzerstörendem Mittel gibt.

Bei den in der Antikörper-Affinitätschromatographiesäule verwendeten anti-Ci-IAC-Immunoglobulinen kann es sich um Immunoglobuline handeln, die auf an sich übliche Weise gegen C1-IAC

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(vgl. beispielsweise die US-PS 4 132 769), die vorzugsweise, falls notwendig, zur Erhöhung ihrer Spezifität einer Absorp-

worden
tionsbehandlung unterzogen/sind. Es kann sich auch um gegen CaDet gebildete Immunoglobuline handeln. Die Immobilisierung der Immunoglobuline an einer Matrix wird zweckmäßigerweise durchgeführt, indem man die Immunoglobuline kovalent an eine Matrix, beispielsweise eine vernetzte Agarose (z.B. Sepharose 4B) nach an sich üblichen Verfahren bindet. Vorzugsweise werden die Antikörper in einem solchen Ausmaß gebunden, daß die Gesamtmenge an kovalent an die Matrix gebundenem Antikörper höchstens 85 % der in der kovalenten Bindungsstufe verwendeten Immunoglobuline entspricht. Entsprechend den Ausführungen in

Scand.J. Immunol., Bd. 6 (1977), S. 77 bis 86, ergibt dies die höchsten Ausbeuten von der Säule.

Für die Lagerung (vorzugsweise bei -7O⁰C oder bei +4⁰C) und für die spätere Verwendung wird CaDet enthaltende Eluat zweckmäßigerweise auf ein geringes Volumen mit einer Proteinkonzentration in der Größenordnung von ΙΟγ/ml oder darüber eingeengt. Dieser Konzentrationsvorgang kann beispielsweise unter Verwendung von Dialyseschläuchen und Saccharose oder unter Verwendung einer Konzentrationszelle (beispielsweise Millipore) mit einem Filter mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze

von 10 000 Dalton durchgeführt werden. 25

Die Anwesenheit eines Detergens im Eluat stabilisiert das CaDet, das sonst wie andere reine Proteine in wäßriger Lösung zur Instabilität neigt. Beispiele für weitere einsetzbare Stabilisatoren sind Natriumdodecylsulphat (SDS; beispielsweise eine

^ 0,1- oder 0,2prozentige Lösung), Rinderserumalbumin (BSA; beispielsweise eine Iprozentige Lösung) oder andere geeignete Proteine oder Peptide aus nicht-humanen Quellen, die den beabsichtigten Verwendungszweck des CaDet nicht stören. Eine andere Möglichkeit besteht in der Zugabe von etwa 25 Vol.-% Äthylenglykol.

Für eine Verwendung als Antigen zur Immunisierung von Tieren wird CaDet (vorzugsweise stabilisiert mit Triton X-100 oder

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SDS) anschließend an eine Dialyse, beispielsweise gegen einen 20 millimolaren Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 0,1 % Triton X-100, in entsprechender Weise mit einem Träger vereinigt. Als Träger können beispielsweise Dextranblau 2000 (Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 2 000 000, an das Cibacron F3 GA kovalent gebunden ist) und ähnliche makromolekulare Materialien, verwendet werden, an die ein Ligand gebunden ist, der gemäß dem gleichen Mechanismus wie Cebacron F3 GA Proteine bindet. Auch eine Kombination mit Freund-Adjuvans (komplett oder nichtkomplett) kann sich als wertvoll erweisen. Für Immunisierungszwecke kann CaDet an verschiedene andere, für Immunisierungszwecke an sich bekannte Träger gebunden werden, beispielsweise PBD und Albumin aus der immunisierten Tierspezies.

Die Immunisierung von spezifisch immunisierbaren Tieren^ beispielsweise Schweinen, wird zweckmäßigerweise gemäß dem Verfahren der US-PS 4 132 769 durchgeführt. Beispielsweise kann ein Schwein durch viermalige Injektion in den Nacken in Abständen von etwa 14 Tagen immunisiert werden, wobei für jede Injektion nur 2y CaDet, in wäßriger Lösung stabilisiert, beispielsweise mit 0,1prozentigem Triton X-100, und vereinigt mit der entsprechenden Volumenmenge an Freund-Adjuvans,verwendet werden. Die Entwicklung des Antiserums im Tier kann gemäß dem Verfahren der US-PS 4 132 769, vorzugsweise unter Verwendung von CaDet als Antigen für den Nachweis des Antikörpertiters, durchgeführt werden.

Neben der vorstehend beschriebenen Antikörper-Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Säule können im erfindungsgemäßen Verfahren auch beliebige andere Verfahren zur Antikörper-Affinitätschromatographie unter Verwendung von immobilisierten Antikörpern eingesetzt werden. Beispielsweise kann in an sich üblicher Weise ein chargenweiser Betrieb oder eine Chromatographie in Zentrifugen vorgenommen werden.

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1 Alternativ zur Antikörper-Affinitätschromatographie können auch andere affinitätschromatographische Verfahren in an sich bekannter Weise eingesetzt werden- wobei in sämtlichen Fällen als matrix-immobilisiertes Material ein Material verwendet wird, ⁵ gegenüber dem C1-IAC und CaDet eine Affinität aufweisen. Beispielsweise können Enzyme verwendet werden, die durch C1-IAC gehemmt werden, insbesondere Proteasen, wie Plasmin und aktivierte C1-Esterase, sowie andere Materialien,.gegenüber denen C1-IAC eine Äffini£äj;-aufweisen, wie Lectine, z.B. Con A, W hydrophobe Liganden, Dextranblau und andere Materialien mit einem Gehalt an einem Liganden vom Typ des Cibacron F3 GA und dergleichen.

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Nachstehend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand von experimentellen Beispielen näher erläutert.

Gelfiltration

Zur näheren Charakterisierung von rohem Cl-IAC durph Bestimmung eines Molekulargewichts oder von Molekulargewichten in einem milden Detergens und durch Vergleich dieses Ergebnisses mit dem Molekulargewicht von CaDet, wird eine Gelfiltration an Sephacryl G-200 (hergestellt durch kovalente Vernetzung von Allyldextran mit Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, Ausschlußbereich 5000 - 200 000 Dalton) durchgeführt. Als Puffer wird 20 millimolarer Phosphatpuffer (PB) vom pH-Wert 7,2, mit einem Gehalt von Im NaCl und 1 % Triton X-100 verwendet. Es ist zu postulieren, daß die auf diese Weise bestimmten Molekularge-

• wichte annähernd die Molekulargewichte der nativen Formen von rohem Cl-IAC wiedergeben.

Der Versuch wird folgendermaßen durchgeführt:

Sephacryl G-200 wird in eine Pharmacia-Säule K 2,6/100 (Durch-

gefüllt
messer 2,6 cm, Länge 100 cm)/unter Verwendung von Puffer in einer Menge, die dem 2- bis 6-fachen Bettvolumen entspricht. Nach Zusatz von weiterem Puffer in einer Menge, die dem 3-fachen Bettvolumen entspricht, ist die Säule stabilisiert. An-

schließend wird die Säule mit 5 Eichsubstanzen mit den Molekulargewichten 12 400, 17 800, 25 000, 45 000 bzw. 67 000, jeweils gelöst in 5 ml Puffer, geeicht. Nach dem Auftragen der Eichsubstanzen wird die Säule mit dem Puffer gewaschen. Fraktionen mit einem Volumen von 5,3 ml werden aufgefangen.

Mittels einer Durchflußküvette werden die Absorptionswerte bei 230 nm gemessen. Eine Ampulle von lyophilisiertem, halbgereinigtem Cl-IAC (hergestellt gemäß der US-PS 4 132 769, Spalte 31) wird in 5 ml Puffer gelöst. Nach dem Aufsetzen dieser Probe werden Eluatfraktionen aufgefangen. Die Absorptionsmessungen bei 230 nm werden auf die vorstehend beschriebene Weise durchgeführt. Es ergibt sich die aus Fig. 3 ersichtliche Protein-Elutionskurve. Zur Entfernung des über-

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schußes an Triton X-IOO werden die Fraktionen 16 - 60 unter Verwendung von kleinen mit Sephadex G-IO (Agarose-Gel) ge-

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packten !Säulen (afluilibriert mit 20 millimolarem Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 0,1 % Triton X-100 = "Dialysepuffer") auf folgende Weise "dialysiert": Zunächst werden die einzelnen Fraktionen auf die mit Sephadex G-10 gep*ackten .Säulen aufgesetzt. Anschließend wird je nach dem Aufsetzvolumen mit etwa 2 bis 3,5 ml "Dialysepuffer" gewaschen. Die eluierten ("dialysierten") Proben werden direkt gemäß einem Manzini-

■jO antJL-Cl'-IAC-Test (vergl. die vorgenannte US-PS) getestet, wobei jede dialysierte Probe, die einer Fraktion bei der Gelfiltration entspricht, in ein in die Manzini-Platte gestanztes Loch gebracht wird. Nach 48 Stunden wird der Durchmesser des Präzipitationsrings gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 aufgetragen.

Aus Fig. 3 ist ein kleiner Peak bei 90 000 bis 100 000 Dalton und ein deutlicher Peak (größter Peak) bei 50 000 bis 55 000 Dalton, gefolgt von einer Schulter bei 25 000 bis 30 000 Dalton, ersichtlich. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit dem SDS-PAGE-Muster von CaDet rechtfertigt die Annahme, daß CaDet (identisch oder fast identisch mit reinem Cl-IAC) in einem nicht-ionogenen Detergens ein komplexes Molekulargewicht bzw. komplexe Molekulargewichte aufweist. Die Cl-IAC-Komplexe können aus den Einheiten mit 25 000 Dalton gebildet sein, da bei der vorerwähnten Gelfiltration Species mit 25 000, 50 000 und 100 000 Dalton festgestellt werden. Bei Durchführung der gleichen Gelfiltration ohne Verwendung eines Detergens wird ein breiter Peak im Bereich von 75 000 bis 125 000 Dalton beobachtet.

Herstellung von CaDet

10 ml anti-Cl-IAC (absorbiert), das in einem Schwein gebildet und gemäß dem Verfahren der US-PS 4 132 769 hergestellt und absorbiert worden ist, wird mit 10 ml 0,1 m NaHCO, mit einem Ge- halt an 0»5 m NaCl und einem pH-Wert von 8,3 vermischt. 2 g trockenes mit CNBr aktiviertes Sepharose 4B Gel (vernetzte Agarose) werden in 10"³m HCl (Insgesamt 400 ml) suspendiert und

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mit dieser Lösung gewaschen. Nach Filtration (Büchner-Trichter) wird das Gel bei Raumtemperatur mit der vorerwähnten Antikörperlösung vermischt und 2 Stunden leicht bewegt. Nach der Kupplung mit dem Antikörper wird das Gel mit Beschickungspuffer (0,1 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 7,2) mit einem Gehalt an 1% Äthanolamin gewaschen. Das Gel wird unter verminder tem Druck entgast und in eine Pharmacia-K9/10-Chromatographiesäule gepackt. Anschließend wird mit Beschickungspuffer in einer Menge, die dem 10-fachen Bettvolumen entspricht, gewasehen. Ferner wird mit dem 10-facheri Bettvolumen an Elutionspuffer (PBS vom pH-Wert 7,2 mit einem Gehalt an 1 m NaCl und 0,1 % Triton X-100) gewaschen. Dieser Waschzyklus wird 5x durchgeführt. Nunmehr kann das Material, das mit dem Antikörper gegen Cl-IAC reaktive Proteine enthält, aufgesetzt werden.

In diesem Fall wird das gleiche lyophilisierte Material mit einem Gehalt an Cl-IAC, das vorstehend bei der Gelfiltration verwendet worden ist, eingesetzt. Das lyophilisierte Material wird in 5 ml des vorerwähnten Beschickungspuffers gelöst. Die Säule wird mit dem Beschickungspuffer gewaschen, bis nicht an die Säule gebundenes Protein ausgewaschen ist. Sämtliche, von der Säule ausgewaschenen und spektrophotometrisch mit einer Durchflußküvette registrierten Fraktionen werden als "Waschflüssigkeit" bezeichnet. Anschließend wird die Säule mit dem vorerwähnten Elutionspuffer eluiert, wobei Fraktionen mit einem Volumen von 5 ml aufgefangen werden. Das Eluat wird vereinigt und unter Verwendung von Dialyseschläuchen/Saccharose auf ein Volumen von etwa 2 ml eingeengt. Dieses Produkt wird als "Eluat" bezeichnet. Der gleiche Konzentrationsvorgang von 40 ml auf etwa 2 ml wird mit der vorerwähnten "Waschflüssigkeit" durchgeführt. Das auf die Säule aufgesetzte rohe, Cl-IAC enthaltende Protein wird^als "aufgesetztes Material" bezeichnet. Beschickung, Waschen und Elution werden bei 4°C durchgeführt.

"Aufgesetztes Material", "Waschflüssigkeit" und "Eluat" werden auf die Anwesenheit von Protein, das eine Bindung mit anti-Cl-IAC eingeht, getestet; vgl. die US-PS 4 132 769. Diese Bestimmung wird unter Verwendung von gegossenen Manzini-Agarosegel-

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•j platten mit einem Gehalt an anti-Serum aus Schweinen durchgeführt. Proben von "aufgesetztem Material", "Waschflüssigkeit" und "Eluat" werden auf in die Platte gestanzte 5 jal-Löcher gegeben. In sämtlichen drei Fällen wird eine Präzipitation festgestellt, die den in Fig. 2 gezeigten Präzipitationen entspricht.

In Tab. I sind die Ergebnisse des Manzini-Tests zusammengestellt.

Tabelle 1

	Experiment Volumen Nr. 465	0	Präzipitation mit anti-Cl-IAC	Präzipitationszone
15	aufgesetztes Material 3,	0	positiv	10 mm
	fWaschflüssig- Konzen- <keit 1,	0	positiv	10 mm
	trat von IEluat 1,		positiv	14 mm
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Bei den in der vorstehenden Tabelle angegebenen Präzipitationszonen handelt es sich um die Präzipitationsdurchmesser, gemessen aufgrund der Manzini-Technik (SRID).

Im "aufgesetzten Material", in der "Waschflüssigkeit" und im "Eluat" wird Cl-IAC-Aktivität festgestellt. Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei einem weiteren Experiment (Nr. 471) .

__ "Aufgesetztes Material", "Waschflüssigkeit" und "Eluat" werden der SDS-PAGE-Elektrophorese (Länge 15 cm, 8 »- 20 %iger Gradient, Stärke 0,75 mm; diese Werte haben sich als zweckmäßig erwiesen) unterzogen. Die Ergebnisse von Elektrophoreseläufen mit den 3 genannten Materialien unter den vorgenannten Bedingungen

_g5 sind in Fig. 1 zu sehen. " Demgemäß treten 95 - 99 % der krebsassoziierten Proteinfraktion unter diesen Bedingungen als eine Bande (vgl. Fig. 1, Nr. 5 und 9, vereinigtes Eluat der krebsassoziierten Proteinfraktion) auf. Unter Zugrundelegung der

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Molekulargewichtseichsubstanzen mit Molekulargewichten von 12 400, 17 800/ 25 000 und 45 000 (vgl. Fig. 1, Nr. 1, 6 und 10) ergibt sich in diesem System (unter nicht-reduzierenden Bedingungen, d.h. ohne Mercaptoäthanol) für die krebsassozlierte Proteinfraktion ein Molekulargewicht von etwa 25 000.

Immunisierung von Schweinen

Für die Immunisierung von Schweinen werden 1-5 γCäDet in 1 ml Kochsalzlö^ng mit einem Gehalt an 0,1 % Triton X-100 gelöst. Die Lösung wird mit 1 ml Freund-Adjuvan3 (komplett oder nicht-komplett) vermischt.

Die Verabfolgung an die Schweine und die Gewinnung des Antiserums werden gemäß der US-PS 4 132 769 durchgeführt. Nach 3-5 ,Injektionen im Abstand von 2 Wochen lassen sich im Schwein spezifische Antikörper feststellen. Diese spezifischen Antikörper bilden ein scharfes Präzipitat gegen rohes Cl-IAC und gegen das gemäß der vorgenannten ÜS-PS hergestellte Cl-IAC. Aufgrund der Größe des beim Manzini-Verfahren ermittelten Präzipitationsrings läßt sich feststellen, daß der spezifisch gegen CaDet gebildete Antikörper einen Titer aufweist, der etwa das 10-fache des Titers beträgt, der bei der Immunisierung mit Cl-IAC gemäß der vorerwähnten US-PS erhalten wird. Wie die gegen Cl-IAC gebildeten Antikörper reagieren die gegen CaDet ge-

bildeten Antikörper unter Präzipitation mit dem krebsassoziierten Protein Cl-IAC (hergestellt gemäß der genannten US-PS) und mit CaDet (gereinigt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren) sowie mit Seren und Körperflüssigkeiten von Krebspatienten, wobei beispielsweise das in der genannten US-PS beschriebene Man- * zini-Verfahren angewendet wird. Ein Beispiel für eine geeignete Manzini-Platte ist in etwa dreifacher Vergrößerung in Fig. 2 dargestellt ./Seren von gesunden, nicht schwangeren Frauen, die nicht an einer klinisch nachweisbaren Krebserkrankung leiden, gibt es keine Präzipitation, weder mit dem Antikörper der

genannten US-PS noch mit dem gegen CaDet gebildeten Antikörper.

Nach dem Ouchterlony-Verfahren läßt sich eine Identität zwischen dem anti-Cl-IAC-Antiserum der genannten US-PS und dem

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ORIGINAL INSPECTED

- 19 anti-CaDet feststellen.

Weitere Eigenschaften des krebsassoziierten Proteins

Die lyophilisierte Cl-IAC-Probe, die bei der vorerwähnten GeI-filtration als Ausgangsmaterial verwendet worden ist, wird auf die pH-Empfindlichkeit ihrer antigenen Eigenschaften untersucht. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

Tabelle II

pH-Empfindlichkeit der antigenen Eigenschaften von Cl-IAC

pH Präzipitation mit

anti-Cl-IAC-Antiserum _s

2,5 nein

3,5 nein

4,0 positiv

5,5 positiv

9,5 positiv

10,0 nein

Es ist festzustellen, daß die antigenen Eigenschaften bei einem pH-Wert von 3,5 und darunter bei einem pH-Wert von 10,0 und darüber ze.rstört werden.

Die Empfindlichkeit des gleichen Cl-IAC-Präparats gegenüber verschiedenen Chemikalien wird untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

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- 20 Tabelle III 919833

Chemikalien

Präzipitation mit anti-Cl-IAC-Antiserum

3m KSCN 3m Harnstoff (0,4% Äthanolamin) 1% SDS + 10% Berol 5% SDS 1% SDS + 10% Triton X-100 0,1% Triton X-100 3m KSCN (1% Äthanolamin) nexn

positiv positiv positiv positiv positiv(größerer Ring*) positiv (kleinerer Ring**)

8n Harnstoff

8n Harnstoff, 2 minütiges Erwärmen auf 96⁰C

8n Harnstoff + 0,4% Mercaptoäthanol

8n Harnstoff + 0,4% Mercaptoäthanol, 2 minütiges Erwärmen auf 96⁰C

0,2% SDS

0,2% SDS, 2 minütiges Erwärmen auf 96⁰C

0,2% SDS + 0,4% Mercaptoäthanol 0,2% SDS + 0,4% Mercaptoäthanol,

2 minütiges Erwärmen auf 96⁰C

0,2% Triton X-100

0,2% Triton X-100 + 0,4% Mercaptoäthanol, 2 minütiges Erwärmen auf 96⁰C positiv

negativ positiv

negativ positiv (größerer Ring*)

negativ positiv

negativ

*) Der Grund für den größeren Präzipxtationsring, der eine stärkere Antigenität andeutet, liegt möglicherweise darin, 30 daß diese Chemikalien die Aggregate der krebsassoziierten Proteeine auflösen.

**) Trotz der Anwesenheit von 1% Äthanolamin sind die antigenen Eigenschaften aufgrund der Anwesenheit von 3m KSCN etwas 35 vermindert.

Es ist festzuhalten, daß die antigenen Eigenschaften durch den

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r _ ₂₁ _ -ι

Einfluß von 3m KSCN allein verloren gehen, während sie in den anderen Fällen erhalten bleiben. Durch Erwärmen werden die antigenen Eigenschaften jedoch in allen Fällen zerstört.

Weitere Materialien zur Immunisierung von Tieren

Erfindungsgemäß wurde festgestellt/ daß eine Immunisierung von Tieren (wenngleich mit weniger guten Ergebnissen, als sie mit CaDet erhältlich sind) bei Verwendung eines auf die nachstehend beschriebene Weise hergestellten Überstands vorgenommen werden

¹ als Einschicht

kann: Osteogene Sarcomzellen menschlichen Ursprungs werden/in Eagle-MEM mit Hank-Salz und 5 % fötalem Kälberserum unter Zusatz von Glutamin (vgl. die US-PS 4 132 769) gezüchtet. Anschließend werden die Zellen und die Kulturflüssigkeit auf Ί5 -30⁰C eingefroren. Hierauf wird das erhaltene Gemisch zentrifugiert. Mit dem überstand werden auf die vorbeschriebene Weise Schweine immunisiert. Es ist anzunehmen, daß durch den Gefriervorgang eine Cytolyse oder Zellzerstörung unter Freisetzung von

Proteinen (einschließlich eines Antigens) erfolgt. 20

Bemerkenswert ist, daß dieser überstand nach Vermischen mit Freund-Adjuvans direkt zur Immunisierung von Schweinen verwendet werden kann. Bei dieser Immunisierung bilden die Schweine einen Antikörper, der spezifisch mit CaDet und Cl-IAC sowie mit Seren oder Kröperflüssigkeiten von Krebspatienten reagiert. Nach Züchtung und Einfrieren der menschlichen Krebszellen, wie beschrieben, läßt sich jede beliebige Reinigung unter Anwendung des vorstehend für die Herstellung von CaDet aus rohem Material

mit einem Gehalt an Cl-IAC beschriebenen Verfahren durchführen. 30

Gemäß den Angaben der US-PS 4 132 769 können die gegen Cl-IAC gebildeten Antikörper der Modifikation oder Fragmentierung unterworfen werden, wodurch Fragmente oder modifizierte Produkte für verschiedene Zwecke, die in der genannten US-PS angegeben sind, erhalten werden.

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Leerseite

Claims

VOSSIUS · VOSSIUS · HILTL · TAUCMNER · HEUNEMANN SIEBERTSTRASSE 4. · 8OOO MÖNCHEN 86 ■ PHONE: (O89) 47 4-075 CABLE: BENZOLPATENT MÜNCHEN TELEX 5-29453 VO P AT D 16. Mai 1979 u.Z.: P 181 Case 821370 A/S ALFRED BENZON Kopenhagen, Dänemark 10 Gereinigtes, krebsassoziiertes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung Priorität: 17. Mai 1978, Dänemark, Nr. 2163/78 Patentansprüche

1. Protein (CaDet), das mit spezifisch gegen den in der US-PS 4 132 769 definierten, krebsassoziierten Ci-Inaktivator (C1-IAC) gerichteten Immunoglobulinen präzipitiert, dadurch ge-

kennzeichnet, daß es in einem SDS-PAGE Acrylamid-Gradientengel im wesentlichen nur eine einzige scharfe Bande bei 25 000 Dalton zeigt.

2. Protein (CaDet) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß es mit einem immunogenen Material kombiniert ist.

3. Antikörper gegen CaDet entsprechend der Definition von Anspruch 1.

4. Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um im wesentlichen reine Schweine-IgG-Immunoglobuline handelt.

5. Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Protein (CaDet) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung, die eine Komponente enthält, die mit spezifisch gegen C1-IAC gerichteten Antikörpern präzipitiert, der Äffinitätschroma-

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Γ "1

tographie unterwirft und gebundenes CaDet eluiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Affinitätschromatographie eine Antikörper-Affinitätschromatographie anwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antikörper matrix-immobilisierte Antikörper, die spezifisch

gegen C1-IAC gerichtet sind, verwendet. 10

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antikörper matrix-immobilisierte Antikörper, die gegen CaDet gebildet sind, verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung, die die Komponente enthält, die mit spezifisch gegen C1-IAC gerichteten Antikörpern präzipitiert, über eine Antikörper-Affinitätschromatographiesäule, die einen matriximmobilisierten Antikörper, der spezifisch gegen C1-IAC gerich-

^u tet ist, gibt und anschließend die Säule zur Freisetzung von antikörper-gebundenem CaDet eluiert.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 5, 6 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution von CaDet mittels eines Detergens durchführt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Detergens Triton X-100 verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sich die

/über die Säule gegebene Lösung von Serum oder anderen Körperflüssigkeiten von Krebs-Patienten, von bei der Züchtung von menschlichen Kreaszellen erhaltenen Kulturmedien, von Placen— taflüssigkeit oder Placenta-ähnlichen Flüs-

sigkeiten ableitet.

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13. Verfahren zur Herstellung von Antiseren oder Antikörpern gegen C1-IAC oder CaDet, dadurch gekennzeichnet, daß man ein spezifisch immunisierbares Tier mit CaDet immunisiert und Serum aus dem immunisierten Tier gewinnt.

14. Verfahren zur Herstellung von C1-IAC entsprechend der Definition in der ÜS-PS 4 132 679 oder CaDet, dadurch gekennzeichnet, daß man als Quelle für rohes C1-IAC Placentaflüssigkeit oder Placenta-ähnliche Flüssigkeiten verwendet. . . -.-.■;

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Placentaflüssigkeit oder die placenta-ähnlichen Flüssigkeiten durch Adsorption, Gelfiltration und/ oder Affinitätschromatographie reinigt und konzentriert.

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