NO791643L - Cancer-tilknyttet protein og fremgangsmaate for fremstilling derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av et

renset cancer-assosiert protein.

US-patent 4.132.769 (svarende til tysk off.skrift

P 25 48 636.6) beskriver et cancer-assosiert protein som

betegnes Cl IAC. Cl IAC er beskrevet som et cancer-assosiert glykoprotein som oppviser Cl inaktivator-virkning (Cl esterase-hemmende virkning), og som har en molekylvekt på 110.000-130.000 Dalton, bestemt ved gelfiltrering, og en Swedberg-konstant på 6,2S bestemt ved ultrasentrifugering. Cl IAC ble funnet i pléura- og ascites-væsker fra cancerpasienter, serum fra cancerpasienter og andre kroppsvæsker fra cancerpasienter,

samt i dyrkningsmedier -fra dyrkede humane cancerceller.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse har det vist seg at et renset protein som viser samme immunologiske determinanter som Cl IAC (med andre ord er i stand til å utfelles

med de i US-patent 4.132.769 beskrevne antistoffer som er

rettet spesifikt mot Cl IAC, og i stand til å immunisere spesifikt immuniserbare ikke-humane dyr så som griser av dansk landrase og sauer for dannelse av antistoffer som er spesifikke mot Cl IAC som beskrevet i US-patent 4.132.769), kan erholdes ved å lede en Cl IAC-holdig oppløsning gjennom en antistoff-affinitetskromatografikolonne som inneholder matrix-immobiliserte antistoffer som er rettet spesifikt mot Cl IAC, og eluere kolonnen ved hjelp av en detergent.

Det rensede protein som elueres på denne måte

(i det følgende betegnet CaDet), kan karakteriseres ved at det utfelles med immunoglobuliner som er rettet spesifikt mot den cancer-assosierte Cl inaktivator Cl IAC som er definert i det ovenfor omtalte US-patent 4.132.769, og ved at det i en

SDS PAGE (natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese)

gradientgel viser i det vesentlige bare ett skarpt bånd ved ca. 25.000 Dalton.

Det forhold at proteinet viser i det vesentlige bare ett skarpt bånd i en SDS PAGE gradientgel (svarende til 95-99%, vanligvis minst 98% av det samlede tilstedeværende protein), betraktes i overensstemmelse med normale biokjemiske prinsipper som et bevis for etablering av et renset protein, og den bestemte "molekylvekt" som finnes i SDS PAGA, ansees som et utvetydig, karakteristisk "fingeravtrykk" av det aktuelle protein.

Det rensede protein (i det følgende betegnet CaDet) ifølge oppfinnelsen, med immunologiske determinanter som bare er reaktive med antistoffer mot Cl IAC, hvilket renset protein med andre ord har immunologiske determinanter som er karakteristiske for Cl IAC, er meget nyttig som antigen for immunisefing av spesifikt immuniserbare dyr for å få dannet spesifikke antistoffer rettet mot Cl IAC (og dermed også rettet mot CaDet). Fordelene ved å anvende det nye protein CaDet ved denne produksjon av antistoffer rettet mot Cl IAC er særlig at det på grunn av anvendelse av det rensede antigen ved immuniseringen oppnås en meget høyere titer av det monospesifikke antistoff (spesifikt overfor Cl IAC og dermed også overfor CaDet).

Det hittil ukjente protein CaDet betyr således et betydelig fremskritt ved fremstillingen av antistoffer som er spesifikke overfor Cl IAC. De mer spesifikke og mer følsomme antistoffer som oppnås ved anvendelsen av CaDet til immunisering av spesifikt immuniserbare dyr, medfører betydelige fordeler ved den diagnostiske anvendelse av anti Cl IAC. Den høyere spesifisitet og følsomhet (aviditet) som de under anvendelse av CaDet som immuniseringsmiddel fremstilte anti Cl IAC-immunoglobuliner oppviser, muliggjør påvisning av lavere konsentrasjoner av Cl IAC i serum fra cancerpasienter.

Utover å være nyttig som antigen til immunisering av dyr, kan CaDet også anvendes til standardisering av anti Cl IAC-tester, og som reagens ved hemagglutinasjonstester og ved radioimmunoassay.

Antistoffer som er frembragt mot CaDet, f.eks. i sauer eller griser som beskrevet i det ovennevnte US-patent 4.132.769, kan tilberedes for diagnostisk anvendelse på samme måte som beskrevet i dette US-patent. Således kan antistoffene f.eks.

inkorporeres i en agarosegel hvor det er stanset ut huller for påføring av materiale som mistenkes for å være Cl IAC-holdig (Manzini-teknikken). Det kan også f.eks. utføres RIA-tester under anvendelse enten av isotopmerket CaDet til absorpsjon av antistoff, eller isotopmerket antistoff til absorpsjon av CaDet i overensstemmelse med vanlige RIA-prinsipper. Dessuten kan det anvendes testmetoder som benytter henagglutinasjonsteknikken,

i henhold til hvilken CaDet påføres på røde blodlegemer (eller lateks eller lignende partikler), og antistoffet påføres.

Det er velkjent at det bør foretrekkes å utføre hemagglutinasjonstester og analoge reaksjoner med rent antigen eller mono-spesifikt antistoff.

En annen anvendelsesmulighet for antistoffer mot det rensede CaDet ifølge oppfinnelsen er for administrering til mennesker til terapi av forskjellige cancersykdommer. For dette formål frembringes antistoffene i griser, f.eks. i griser av dansk landrase, og det fra de immuniserte griser erholdte antiserum underkastes en serumfraksjonering for oppnåelse av den i det vesentlige rene IgG-immunoglobulinfraks jon derav,

da det har vist seg (jfr. US-patent 4.132.769) at grise-IgG immunoglobuliner kan tåles av mennesker, idet de ikke immuniserer mennesker ved parenteral administrering.

En ytterligere anvendelse for antistoffer frembragt mot CaDet, er som antistoffer ved antistoff-affinitetskromatografi for fremstilling av CaDet fra Cl IAC-holdige væsker.

Som nevnt ovenfor kan CaDet fremstilles fra en Cl IAC-holdig oppløsning ved antistoff-affinitetskromatografiteknikk og eluering ved hjelp av et rensemiddel. Molekylvekten på

ca. 25.000 Dalton i henhold til SDS PAGE avviker vesentlig fra den molekylvekt på 110.000-130.000 Dalton, bestemt ved gelfiltrering, som er angitt i US-patent 4.132.769. Det forhold at proteinet, når det er renset, avgir et "fingeravtrykk" i en SDS PAGE akrylamidgradiengel ved en bestemt molekylvekt, betyr imidlertid ikke nødvendigvis at proteinet i sin opprinnelige form.har samme molekylvekt.

Den molekylvekt på ca. 25.000 Dalton som er funnet i SDS PAGE gradienten,kan, sammenlignet med molekylvekten på 110.000-130.000 Dalton, som tidligere er funnet ved gelfiltrering for proteinet Cl IAC, tyde på at CaDet er et nedbrytningsprodukt

av den opprinnelige cancer-assosierte Cl inaktivator (Cl IAC),

idet dette nedbrytningsprodukt f.eks. blir dannet ved detergent-1 behandlingene i elueringstrinnet og/eller SDS-behandlingen,

men har bibeholdt Cl IACs immunologiske determinanter,

eller det kan tyde på at det i US-patent 4.132.769 beskrevne Cl IAC ikke er et rent protein, men derimot er et konglomerat av flere proteiner som har Cl esterase-hemmende 'virkning.

En gelfiltrering av rått Cl IAC på Sephacryl S-200

i 1% Triton X-100, fosfatbuffer, saltoppløsning (PBS) (pH = 7,2), IM NaCl resulterte i eluering av tre topper som utfelles med

anti Cl IAC som beskrevet i US-patent 4.132.769, idet den ene topp svarte til en molekylvekt på 90.000-100.000 Dalton,

den annen topp svarte til 50.000-55.000 Dalton og den tredje svarte til 25.000-30.000 Dalton. Denne gelfiltrering er beskrevet mer detaljert i den følgende eksperimentelle del.

Den molekylvekt som ble funnet ved denne gelfiltrering, synes

å stemme overens med den antagelse at Cl IAC er et konglomerat av flere enheter.

Uansett hva som er den nøyaktige karakter av det proteinkjemiske forhold mellom Cl IAC og CaDet, har CaDet imidlertid som ovenfor forklart, vist seg å være et særlig nyttig antigen til fremstilling av monospesifikke, høytitrede antistoffer mot Cl IAC, og disse antistoffer har samme anvendelses-områder som det i US-patent 4.132.769 beskrevne anti Cl IAC,

men oppviser de ytterligere fordeler som skyldes deres forbedrede titer og sterkt monospesifikke karakter.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for fremstilling av et protein (CaDet) som utfelles med antistoffer som er spesifikke overfor Cl IAC (som beskrevet i US-patent 4 . 132.769) ,

og som oppviser det ovenne-vnte mønster i SDS PAGE akrylamid-gradientgel med 95-99%, vanligvis minst 98% av proteinet som ett enkelt bånd ved omkring 25.000 Dalton. Denne fremgangsmåte går ut på at en oppløsning inneholdende en komponent som utfelles med antistoffer rettet spesifikt mot Cl IAC, underkastes antistoff-affinitetskromatografi under anvendelse av matrix-immobiliserte antistoffer rettet direkte mot Cl IAC, og det antistoff-bundne CaDet elueres. Denne antistoff-affinitetskromatografi utføres hensiktsmessig under anvendelse av en kolonne av de matrix-immobiliserte antistoffer på i og for seg kjent måte. Tilstedeværelsen av CaDet i eluatet kan påvises ved hjelp av den oven-

nevnte SDS' PAGE gradientgelelektroforese på eluatet i overensstemmelse med f.eks. den metode som er beskrevet i den etter-følgende eksperimentelle del, og overvåkningen av elueringen av CaDet utføres hensiktsmessig ved spektrofotometri til påvisning

av tilstedeværelsen av protein i eluatet. Cl IAC-aktiviteten i eluatfraksjonene bestemmes hensiktsmessig ved immunopresipitasjons-tester, f.eks. ved å måle diameteren av presipitasjonsringen i en Manzini-test under anvendelse av anti Cl IAC som beskrevet i det ovennevnte US-patent 4.132.769.

Egnede betingelser for lading av kolonnen etableres

i overensstemmelse med velkjente antistoff-affinitetskromatografi-prinsipper, og et eksempel på egnede betingelser fremgår av den efterfølgende eksperimentelle del. Betingelsene for eluering av kolonnen tilpasses.til eluering av det ovenfor karakteriserte protein CaDet, og det har vist seg at en egnet elueringsbuffer er en buffer inneholdende 0,1% Triton X-100,

IM NaCl og PBS pH-verdi 7,2. Det er ingen grunn til å tro

at Triton X-100 er den eneste detergent som er i stand til å eluere Cl IAC fra kolonnen uten å ødelegge antigenet (eller ødelegge antistoffkolonnen), og det ligger innenfor oppfinnelsens ramme å anvende andre detergenter av enten ionisk art så som SDS, eller ikke-ionisk art til eluering av CaDet fra kolonnen.

Den oppløsning som påføres på kolonnen og som inneholder en komponent som utfelles med antistoffer mot Cl IAC, kan være enten et rått Cl IAC-holdig preparat så som pleura- eller ascites-væske fra cancerpasienter eller dyrkningsmedium fra dyrkning

av humane cancerceller, begge som beskrevet i ovennevnte US-patent 4.132.769, eller den kan hensiktsmessig være et delvis renset preparat derav, f.eks. det preparat som er renset ved en hvilken som helst av de adsorpsjons,- og gelfiltreringsmetoder som er beskrevet i det nevnte US-patent 4.132.769, fortrinnsvis et produkt som er fremstilt ved den "Sephadex" A50 metode som er beskrevet i US-patent 4.132.769, hvilken metode går ut på at man adsorberer det'Cl IAC-holdige materiale til en anionebytter

(f.eks. "Sephadex" A50) og utfeller Cl IAC-holdig materiale fra eluatet fra anionebytteren, dialyserer presipi.tate t, oppløser det i en NaCl-oppløsning og lyofiliserer. Andre Cl IAC-holdige utgangsmaterialer som egner seg til anvendelse ved fremstilling av CaDet er placentavæske og placenta-tilknyttede væsker. Det er funnet en høy konsentrasjon av Cl IAC i placenta, og da placenta

er en kilde for humane proteiner som er tilgjengelige uten lovmessige eller etiske restriksjoner, utgjør fremstillingen av antistoffer mot Cl IAC ved anvendelse av Cl IAC avledet fra placenta som antigen, fortrinnsvis CaDet fremstilt fra placenta, et viktig aspekt ved den foreliggende oppfinnelse.

Det forhold at placenta inneholder Cl IAC må tas i betraktning

ved fortolkningen av diagnostisk testing av prøver fra gravide kvinner ved hjelp av anti Cl IAC frembragt mot Cl IAC eller CaDet, men strider ikke mot den tidligere beskrevne karakter

av Cl IAC som et protein som er assosiert til flere typer cancer, hvor Cl IAC beskytter cancercellene som vokser som parasitter i humant vev, mot å bli ødelagt av,det humane immunsystem.

På fullstendig samme måte kan Cl IAC være det immunsystem-nøytraliserende protein som setter fosteret i stand til å feste seg og vokse i livmoren uten å bli angrepet av morens immunsystem.

Som alle andre biologiske blandinger hvorfra et

protein som er til stede i små eller relativt små mengder,

skal isoleres, bør de Cl IAC-holdige utgangsoppløsninger som anvendes for fremstilling av CaDet som her beskrevet, fortrinnsvis behandles for fjernelse, nøytralisering eller ødeleggelse av proteolytisk aktivitet i disse, f.eks. ved tilsetning av en enzymdestruktor eller enzyminhibitor så som soyatrypsin-inhibitor, poly-L-lysin eller "Trasyloi", eller ved at oppløsningen føres gjennom kolonner av immobiliserte enzyminhibitorer eller enzym-destruktorer, og de anti Cl IAC-immunoglobuliner som anvendes i antistoffaktivitetskolonnen, kan også, før de immobiliseres eller anvendes, behandles for fjernelse av en eventuell proteolytisk aktivitet derfra ved behandling på samme måte, fortrinnsvis ved passasje gjennom en kolonne av matrix-immobilisert enzyminhibitor eller enzymdestruktor.

De anti Cl IAC-immunoglobuliner som anvendes i antistoff-affinitetskromatografikolonnen, kan være immunoglobuliner som er frembragt på i og for seg kjent måte, mot Cl IAC som beskrevet i det ovennevnte US-patent 4.132.769, og som fortrinnsvis,

om nødvendig, er absorbert for å øke deres spesifikke spesifisitet, eller de kan være immunoglobuliner som er frembragt mot CaDet. Immobiliseringen av immunoglobulinene på en matrix utføres hensiktsmessig ved å binde immunoglobulinene kovalent til en matrix, f.eks. tverrbundet agarose, så som "Sepharose" 4B,

i overensstemmelse med de velkjente prinsipper. Antistoffene bindes fortrinnsvis i et slikt omfang at den samlede mengde antistoff som bindes kovalent til matrixen., svarer til høyst 85% av de immunoglobuliner som anvendes ved den kovalente binding. Analogt med hva som er beskrevet i Scand. J. Immunol.

(5, 77-86 (1977) , fører dette til den høyeste gjenvinning fra kolonnen.

For oppbevaring (fortrinnsvis ved -70°C eller ved +4°C) og senere anvendelse, konsentreres eluatet inneholdende CaDet hensiktsmessig til et lite volum med en konsentrasjon av protein av størrelsesorden 10 ganger pr. ml eller over. Denne konsentrering kan f.eks. utføres ved hjelp av dialyserør og sakkarose eller ved hjelp av en konsentrasjonscelle (f.eks. Mi II i po re) med et filter med en molekylvektavskjæring på

10.000 Dalton. Tilstedeværelsen av en detergent i eluatet stabiliserer CaDet, som ellers, på samme måte som et hvilket som helst annet rent protein i vandig oppløsning, har tilbøyelighet til å være ustabilt. Andre velegnede og anvendelige stabili-satorer er SDS (f.eks. 0,1 eller 0,2% oppløsning), BSA (storfe-serumalbumin) (f.eks..1% oppløsning) eller andre egnede ikke-humane proteiner eller peptider som ikke interfererer med den tilsiktede anvendelse av CaDet. Alternativt kan det anvendes tilsetning av ca. 25 volumprosent etylenglykol.

For anvendelse som antigen til immunisering av dyr blir CaDet, som fortrinnsvis er stabilisert med f.eks. Triton X-100 eller SDS, hensiktsmessig kombinert med en bærer efter at det er dialysert mot f.eks. 20 mmolar PB, 0,1% Triton X-100. Bæreren kan f.eks. være Blue Dextran 2000 (dekstran med molekylvekt ca. 2.000.000, hvortil det kovalent er bundet Cibacron F3 GA) og.lignende makromolekylære materialer, til hvilke det er knyttet en ligand som binder proteiner i overensstemmelse med samme mekanisme som Cibacron F3 GA. Det er også nyttig å kombinere det med Freund's adjuvans (komplett eller ukomplett). For anvendelse ved immunisering kan CaDet også bindes til forskjellige andre bærere, som i seg seiv er kjent til immuniserings-formål, f.eks. PBD eller albumin fra den dyreart som immuniseres.

Immuniseringen av spesifikt immuniserbare dyr, f.eks. griser, utføres hensiktsmessig på samme måte som beskrevet i det ovennevnte US-patentskrift 4.132.769, og som eksempel kan en gris immuniseres ved 4 injeksjoner i halsen med et interavall på ca. 14 dager, idet det til hver injeksjon anvendes så lite som 2 gamma CaDet i vandig oppløsning stabilisert med f.eks. 0,1% Triton X-100, kombinert med et like stort volum Freund's adjuvans. Overvåkningen av antiserum og oppsamlingen av antiserum fra dyret kan utføres i overensstemmelse med de metoder som er beskrevet i US-patent 4.132.769, idet det fortrinnsvis anvendes CaDet som antigen til overvåkning av antistofftiteren.

Selv om det ovenfor er beskrevet antistoff-affinitetskromatografi under anvendelse av en kolonne, er det klart at det kan anvendes en hvilken som helst annen antistoff-affinitetskromatografimetode som benytter immobilisert antistoff, for den foreliggende oppfinnelses formål.

Behandlingen kan f.eks. foretas porsjonsvis, eller kromatograferingen kan utføres i sentrifuger på i og for seg kjent måte, og disse innlysende ekvivalente muligheter ligger innenfor foreliggende oppfinnelses ramme.

Som alternativ til antistoff-affinitetskromatografi kan det på lignende måte utnyttes andre affinitetskromatografi-mekanismer, idet det i alle tilfelle som matrix-immobilisert materiale anvendes et materiale til hvilket Cl IAC og CaDet har en affinitet, f.eks. enzymer som inhiberes av Cl IAC,

særlig proteaser så som plasmin og aktivert Cl-esterase, og andre materialer til hvilke Cl IAC har en affinitet, f.eks. lectiner så som Con A, hydrofobe ligander, Blue Dextrin og andre materialer inneholdende en ligand.av samme type som Cibacron F3 GA.

Eksperimentell del

Gelfiltrering

For ytterligere karakterisering av rått Cl IAC ved bestemmelse av en molekylvekt eller flere molekylvekter av dette i en mild detergent og sammenligning av denne med molekylvekten av CaDet,foretas en gelfiltrering i "Sephacryl G-200"

(en gel som er fremstilt ved kovalent tverrbinding av allyl-dekstran med N,N'-metylen-bis-akrylamid, utelukkelsesområde 5000-200.000 Dalton). Gelbufferen er IM NaCl, 20 mmolar fosfatbuffer (PB), pH verdi 7,2, inneholdende 1% Triton X-100.

De molekylvekter som bestemmes på denne måte, må antas til-nærmelsesvis å ligne molekylvektene til de opprinnelige former av rått Cl IAC.

Forsøk utføres på følgende måte:

"Sephacryl G-200" pakkes i en kolonne Pharmacia.K 2.6/100 (diameter 2,6 cm, lengde 100 cm) ved hjelp av 2-6 lagvolum gelbuffer. Efter ytterligere 3 lagvolum gelbuffer er kolonnen stabilisert. Derefter kalibreres kolonnen ved hjelp av 5 kjente molekylmarkører, med molekylvekt på henholdsvis 12.400, 17.800, 25.000, 45.000 og 67.000, idet markørene oppløses i 5 ml gelbuffer. Eftér påføringen av molekylmarkørene vaskes kolonnen med gelbuffer. Det oppsamles fraksjoner på 5,3 ml,

og de tilsvarende verdier for optisk tetthet ved 230 nm måles ved hjelp av en gjennomløpskuvette for ekvilibrering av kolonnen. En ampulle lyofilisert, halvrenset Cl IAC (fremstilt som beskrevet i det ovennevnte US-patent 4.132.769, spalte 31) oppløses i 5 ml gelbuffer. Efter påføring av denne prøve oppsamles fraksjoner av eluatet, og det utføres målinger av optisk tetthet ved 230 nm ,som beskrevet ovenfor. Dette fører til en proteinelueringskurve som vist i fig. 3. For å fjerne overskudd av Triton X-100 "dialyseres" fraksjonene 16-60 individuelt ved hjelp av små kolonner G 10 Sephadex (agarosegel), som på forhånd er kalibrert i 0,1% Triton X-100 +

20 mmolar PB ("dialysebuffer") på følgende måte:

Først påføres de individuelle fraksjoner på G-10 kolonnene, derefter foretas vasking med ca. 2-3,5 ml "dialysebuffer", avhengig av volumet av påført materiale. De eluerte ("dialyserte") prøver testes direkte ved en Manzini-anti Cl IAC-test (jfr. US-patent 4.132.769), idet hver dialysert prøve som svarer

til fraksjonen ved gelfiltreringen påføres i et utstanset hull i Manzini-platen. Efter 4 8 timers forløp bestemmes diameteren av presipitasjonsringen. Resultatene er oppført grafisk i fig. 3 ..

Som det fremgår av fig. 3 er det en liten topp ved 90.000-100.000 Dalton, og en distinkt (største) topp ved 50.000-55.000 Dalton, efterfulgt av en skulder ved 25.000-30.000 Dalton. En sammenligning av disse resultater med CaDet's

SDS PAGE-mønster rettferdiggjør den antagelse at CaDet (som

er identisk eller nesten identisk med rent Cl IAC) oppviser en kompleks molekylvekt eller komplekse molekylvekter i ikke-ionisk detergent. Cl IAC-kompleksene kan være dannet fra 25.000 Dalton-prøven, da både prøvene svarende til 25.000, 50.000 og 100.000 Dalton kan iakttas ved den ovennevnte gel-

filtrering. Når den samme gelfiltrering utføres uten detergent, fås en bred topp i området 75.000-125.000 Dalton.

Fremstilling av CaDet.

10 ml anti Cl IAC (absorbert) frembragt i griser

og behandlet og absorbert som beskrevet i US-patent 4.132.769, blandes med 10 ml NaHC03(0,1M). inneholdende 0,5M NaCl,

pH-verdi 8,3. 2 g tørr CNBR-aktivert "Sepharose 4B" gel

-3

(tverrbundet agarose) suspenderes og vaskes i 10 M HC1

(ialt 400 ml). Efter filtrering (Buchner-trakt) blandes gelen med den ovennevnte antistoffoppløsning ved romtemperatur og under langsom omrøring i 2 timer. Efter koblingen med antistoff, vaskes gelen med "ladebuffer" (0,1M natriumacetat, pH 7,2) inneholdende 1% etanolamin. Gelen avgasses i vakuum og pakkes i- en kromatograf ikolonne, Pharmacia K9/10 og vaskes med 10 lagvolum ladebuffer og ,derefter med 10 lagvolum elueringsbuffer (IM NaCl + 0,1% Triton X-100, PBS pH-verdi 7,2). Denne vaskecyklus utføres 5 ganger. Kolonnen er derefter klar til påføring av materiale inneholdende proteiner som kan reagere med antistoff mot Cl IAC. I dette tilfelle anvendes samme lyofiliserte Cl IAC-holdige materiale som ble anvendt til den ovenfor beskrevne gelfiltrering. Det lyofiliserte materiale oppløses i 5 ml av den ovenfor beskrevne ladebuffer. Kolonnen vaskes med ladbuffer, inntil det protein som ikke er bundet til kolonnen er vasket ut. Alle fraksjonene som er vasket fra kolonnen og registrert på spektrofotometer med gjennom-strømningskuvette, betegnes "vaskevæske". Derefter elueres kolonnen ved hjelp av den ovennevnte elueringsbuffer i fraksjoner på 5 ml. Eluatet helles sammen og konsentreres ved hjelp av dialyserør/sakkarose til et volum på ca. 2 ml. Dette betegnes "eluat". Den samme konsentreringsoperasjon fra 40 ml til ca. 2 ml utføres med den ovennevnte "vaskevæske". Det rå Cl IAC-holdige protein som påføres på kolonnen, betegnes "innført materiale". Ladeoperationen, vaskingen og elueringen utføres ved 4°C.

"Innført materiale", "vaskevæske" og "eluat" testes

på nærvær av protein som binder seg til anti Cl IAC beskrevet i US-patent 4.132.769. Denne bestemmelse utføres under anvendelse av støpte Manzini-agarose-gelplater inneholdende grise-antiserum. I 5 mikroliters utstansede huller i platen påføres

prøver på "innført materiale", "vaskevæske" og "eluat".

I alle tre tilfeller konstateres et presipitat som ser ut som presipitatene i fig. 2.

I nedenstående tabell er oppført resultatene av Manzini-testen:

De i ovenstående tabell oppførte presipitatsoner er diameteren av utfellingen målt på basis av Manzini-teknikk

(SRID)

Det fremgår av dette at det finnes. Cl IAC-aktvitet i "innført materiale", "vaskevæske" og "eluat". Det samme finnes i et annet forsøk (nr. 471).

"Innført materiale", "vaskevæske" og "eluat" underkastes SDS PAGE elektroforese (lengde 15 cm, 8-20% gradient, tykkelse 0,75 mm, valgt som en velegnet metode). Resultatet av forsøkene på "innført materiale", "vaskevæske" og "eluat" under de ovennevnte betingelser fremgår av fig. 1. Det.sees at 85-99% av den fraksjon av cancer-assosiert protein som kjøres under disse betingelser, viser seg som ett bånd (jfr. fig. 1, nr. 5 og 9, sammenhellet eluat av cancer-assosiert proteinfraksjon) . På basis av beregningen fra molekylmarkørene ved 12.400, 17.800, 25.000

og 45.000, vist ved fig. 1, nr. 1, nr. 6 og nr. 10, vil det sees at molekylvekten av fraksjonen av cancer-assosiert protein er ca. 25.000 i dette system (under ikke-reduserende betingelser, dvs. uten merkapto-etanol).

Immunisering av griser.

Til immunisering av griser oppløses 1-5 gamma CaDet sammen med 0,1% Triton X-100 i 1 ml saltoppløsning, og opp-løsningen blandes med 1 ml Freund's adjuvans (komplett eller ukomplett).

Injeksjonen på grisen og oppsamlingen av antiserum etc. utføres som beskrevet i det ovennevnte US-patnt 4.132.769. Efter 3-5 injeksjoner med et mellomrom på 2 uker konstateres, det i grisen spesifikt antistoff som danner skarpt presipitat mot det rå Cl IAC og mot Cl IAC som beskrevet i det ovennevnte US-patent. Som det Imidlertid konstateres ved størrelsen av presipitat-ringene i Manzini-teknikken, har det spesifikke antistoff, som er frembragt mot CaDet, en titer som er ca.

10 ganger så høy som den titer som oppnås når man immuniserer med det Cl IAC som er beskrevet i det ovennevnte US-patent 4.132.769. På samme måte 'som de antistoffer som er frembragt mot Cl IAC, reagerer de mot CaDet-frembragte antistoffer ved presipitering mot det cancer-assosierte protein Cl IAC som er fremstilt som beskrevet i det ovennevnte US-patent 4.132.769, og mot CaDet som er renset ved den i foreliggende beskrivelse angitte elueringsteknikk, samt mot sera og legemsvæsker fra cancerpasienter, idet det f.eks. anvendes den Manzini-teknikk som er beskrevet i USA-patent 4.132.769. Et eksempel på en velegnet Manzini-plate (i ca. tre gangers forstørrelse) er vist

i fig. 2. Sera fra friske, ikke-gravide individer (som ikke lider av klinisk påviselig cancer) viser ingen presipitering, hverken mot antistoff fremstilt i henhold til US-patent 4.132.769 eller mot antistoff frembragt mot CaDet. Ved Ouchterlony-teknikk konstateres det identitet mellom anti Cl IAC antiserum som beskrevet i US-patent 4.132.769 og anti CaDet.

Ytterligere egenskaper til det cancer-assosierte protein.

Den lyofiliserte Cl IAC-prøve som anvendes som utgangs-materiale ved den ovennevnte gelfiltreringsbehandling, underkastes karakterisering med hensyn til pH-følsomheten av sine antigene genskaper. Det oppnås.følgende resultater:

pH-følsomhet med hensyn til antigene egenskaper av Cl IAC

Det bemerkes at de antigene egenskaper ødelegges ved pH-verdi 3,5 og under og ved pH-verdi 10,0 og over.

Det samme Cl IAC-preparats følsomhet med hensyn .til

dets antigene egenskapers evne til å tåle forskjellige kjemikalier, undersøkes. Resultatene fremgår av nedenstående tabell:

h X) Grunnen til den større ringformede presipitering, som indikerer større antigen-virkning, kan være at disse kjemikalier oppløser aggregater av cancer-assosierte proteiner av den her beskrevne type.

På tross av tilstedeværelsen av 1% etanolamin er de antigene egenskaper noe nedsatt på grunn av tilstedeværelsen av 3M KSCN.

Det vil sees at de antigene egenskapene tapes ved påvirkning av 3MKSCN alene, og at de antigene egenskaper synes

å bibeholdes i andre tilfeller. Oppvarmning ødelegger imidlertid alltid de antigene egenskaper.

Alternativt materiale for immunisering av dyr.

I henhold til et særlig trekk ved foreliggende oppfinnelse har det vist seg at en immunisering av dyr kan utføres, om enn med mindre fremragende resultater enn de som oppnås med CaDet, ved anvendelse av en overliggende væske, som fremstilles som beskrevet i det følgende: osteogensarkomceller av human opprinnelse dyrkes i monolag i Eagle's MEM med Hank's salt og 5% føtalt kalveserum med tilsatt glutamin som beskrevet i ovennevnte US-patent 4.132.769. Derefter fryses cellene + dyrknings-væsken til -30°C, hvorefter den resulterende blanding sentri-fugeres, og den overliggende væsken anvendes til immunisering av griser på samme måte som beskrevet ovenfor. Det antas at frysingen fører til cytolyse eller celledestruksjon under frigjørelse av proteiner, herunder et antigen.

Det er bemerkelsesverdig at denne overliggende væske efter blanding med Freund's adjuvans direkte kunne anvendes til immunisering av griser. Ved denne immunisering dannet grisene et antistoff som reagerte spesifikt med CaDet og Cl IAC, og med humane cancersera eller kroppsvæsker fra cancerpasienter.

Efter den ovenfor beskrevne dyrkning og frysing av humane cancerceller kan en eventuell ønsket rensing derav f.eks. utføres under anvendelse av den metode som er beskrevet ovenfor for fremstilling av CaDet fra et rått Cl IAC-holdig materiale.

I overensstemmelse med de prinsipper som er beskrevet i US-patent 4.132.769 kan de mot Cl IAC frembragte antistoffer underkastes modfikasjon eller fragmentering"for oppnåelse av fragmenter eller modifikasjoner derav på helt samme måte som beskrevet i US-patentet.

Claims (15)

1. Et protein, kalt CaDet, som presipiterer med immunoglobuliner rettet spesifikt mot den cancer-assosierte Cl-inaktivator (Cl IAC) definert i US-patent 4.132.769,karakterisert vedat det i en SDS PAGE akrylamid-gradientgel viser i det vesentlige kun ett skarpt bånd ved 25.000 Dalton.

2. Protein (CaDet) ifølge krav 1, karakterisert vedat det kombineres med et immunogent materiale.

3. Antistoffer frembragt mot det i krav 1 karakteriserte protein CaDet.

4. Antistoffer ifølge krav 3, som er i det vesentlige rene grise-IgG immunoglobuliner.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et renset protein, betegnet CaDet, som presipiterer med immunoglobuliner rettet spesifikt mot den cancer-assosierte Cl inaktivator (Cl IAC) definert i US-patent 4.132.769, og som i en SDS PAGE akrylamid-gradientgel viser i det vesentlige kun ett bånd ved 25.000 Dalton,karakterisert vedat en oppløsning inneholdende en komponent som presipiterer med antistoffer rettet spesifikt mot Cl IAC, underkastes affinitetskromatografi, og bundet CaDet elueres.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisertved at affinitetskromatografien er en antistoff-affinitets-kromatograf i .

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at antistoffene er matrix-immobiliserte antistoffer rettet spesifikt mot Cl IAC.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at antistoffene er matrix-immobiliserte antistoffer frembragt mot CaDet.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at en oppløsning inneholdende den komponent som f<*> presipiterer med antistoffer, rettet spesifikt mot Cl IAC, føres gjennom en antistoff-affinitetskromatografikolonne inneholdende et matrix-immobilisert antistoff rettet spesifikt mot Cl IAC, hvorefter kolonnen elueres for frigjøring av antistoff-bundet CaDet.

10. Fremgangsmåte ifølge kravene 5, 6 eller 9,karakterisert vedat elueringen av CaDet ut-føres ved hjelp av en detergent.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat detergenten er Triton X-100.

12.. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisertved at den oppløsning som føres gjennom kolonnen, er fremstilt fra en kilde som kan være serum fra cancerpasienter, kroppsvæsker fra cancerpasienter, dyrkn^ingsmedier fra dyrkning av humane cancerceller, og placentavæske eller placenta-tilknyttede væsker.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av antisera eller antistoffer mot Cl IAC eller CaDet,karakterisert vedat man immuniserer et spesifikt, immuniserbart ikke-humant dyr med CaDet og samler opp serum fra de immuniserte dyr.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av Cl IAC som beskrevet I US-patent 4.132.769 eller CaDet,karakterisertved at det som kilde for rått Cl IAC anvendes placentavæske eller placenta-tilknyttede væsker.

15. Fremgangsmåte ifølge krav.K,karakterisertved at placentavæske eller placenta-tilknyttede væsker underkastes rensnings- og konseatreringsmetoder valgt blant adsorpsjon, gelfiltrering' og affinitetskromatografi.