DE2842608A1

DE2842608A1 - Verfahren zur herstellung von injizierbaren liposomen

Info

Publication number: DE2842608A1
Application number: DE19782842608
Authority: DE
Inventors: Luigi Moro; Guido Neri; Alessandro Rigamonti
Original assignee: Farmaceutici Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1977-09-30
Filing date: 1978-09-29
Publication date: 1979-04-12
Also published as: FR2404454B1; DE2842608C2; NL7809709A; DK154048B; CH642540A5; FR2404454A1; AU528260B2; JPS5459314A; JPS6134402B2; DK154048C; SE7810109L; ATA693178A; DK425478A; GB2004745A; AU4017478A; CA1116518A; ZA785510B; AT368879B; BE870882A; SE433038B

Description

PATENTANWÄLTE

DIpL-lng. P. WIRTH · Dr. V. SCHMiED-KOWARZIK Dlpl.-lng. G. DANNENBERG · Dr. P. WEINHOLD · Dr. D. GUDEL

33S024 - 1 " SIEGFRIEDSTRASSE 8

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Case G-395

Societa Farmaceutici Italia 3.p.A. 1/2 Largo Guido Donegani
20121 Mailand / Italien

Verfahren zur Herstellung von injizierbaren Liposomen

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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf"ein neues Verfahren zur Herstellung von injizierbaren Liposoraen..

Liposome sind pharmazeutische Zusammensetzungen, in welchen das Heilmittel in Teilchen enthalten ist, die aus wässerigen und Lipidschichten in konzentrischer Anordnung bestehen. Das Heilmittel kann sowohl in der wässerigen cils auch in der Lipidschicht enthalten sein. Die Lipidschicht besteht im allgemeinen aus einem Phospholipid, wie Lecithin und Sphyngomyelin, einem Steroid, wie Cholesterin, und einer ionischen grenzflächenaktiven Substanz, wie Dicety!phosphat, Stearylamin und Phosphatid säure. Die Durchmesser der Liposome betragen 0,01 bis 5 Mikron. Das zur Herstellung von Liposomen angewendete Verfahren umfaßt gewöhnlich zwei Hauptschritte:
1. Herstellung der Liposomen:

Die Lipidkomponenten werden in Chloroform gelöst, das dann im Vakuum abgedampft wird. Dem Kolben, der den Rückstand als dünne Schicht enthält, wird die lleilmittellösung zugesetzt und das Ganze während 30 Sekunden bis >2 Stunden mit Ultraschall geschüttelt. Die so erhaltene Liposomensuspension enthält eine wichtige Fraktion .von nicht-eingeschlossenem Heil- · mittel, die von den Liposomen abgetrennt werden muß. • 2. Abtrennung der Liposomen vom nicht-eingeschlossenen Heilmittel:

Dieses Verfahren erfolgt durch Säulenchromatographie mit einem Molekularsieb Sepharose 6B.

Die Liposomen eluieren zuerst, während das freie Heilmittel

* durch die Sepharose zurückgehalten wird.

Ein anderes geeignetes Verfahren ist das Ultrazentrifugieren bei 100 000 g und nachfolgendes Waschen, immer mit Ultrazentrifugieren, mit gepufferter Lösung. Es hat sich gezeigt, daß die Liposomen bei Tieren antitumoral wirksame Heilmittel selektiv zu neoplastischen Zellen transportieren können.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich nun auf ein neues Verfahren zum /ibtrennen von Liposomen vom nicht-eingeschlossenen Heilmittel. Dabei werden Ionenaustauscher- und adsorbierende

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Harze verwendet, ohne daß die Anwendung von Chromatographie erforderlich ist.

Als Ionenaustauscherharz werden nach bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung solche verwendet, die ein organisches Grundgerüst aufweisen, das sich insbesondere von Styrol/Divinylbenzol oder Acryl- bzw. Methacrylsäure ableitet. Selbstverständlich können dafür aber auch andere Substanzen verwendet werden, die zu einem unlöslichen Polymer führen.

Die Harze des Kationentyps besitzen vorzugsweise funktionelle SuIfon- oder Carbonsäuregruppen, welche in Säure- oder Salzform oder anderweitig aktivierter Form vorliegen können. Harze des Anionentyps können z.B. Polyaminofunktionen aufweisen und entweder als quaternäres Ammoniumsalz oder als freie Gruppe,in Salzform oder als anderweitig aktivierte Base vorliegen.

Das Ionenaustauscherharz wird der Liposomensuspension des Heilmittels, die gereinigt werden muß, zugesetzt und das Ganze 1 bis 120 Minuten lang geschüttelt.

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Die freie Liposomensuspension wird nach Filtrieren durch eine poröse Schicht, die das Harz, auf welchen das freie Heilmittel absorbiert worden ist/ zurückhält, erhalten. Dieses neue Reinigungsverfahren, bei dem lonenatistauscherharze ver-•wendet werden, zeigt den großen Vorteil, daß sehr konzentrierte Lipcsomensuspensionen (bis zu 4 mg/ml Adriamycinhydrochlorid) 'erhalten werden können, die durch Chromatographie lait einem Molekularsieb (maximal 200 /VmI) nicht erzielt werden können. Die so erhaltene Liposomensuspension ist sehr stabil und neigt im Gegensatz zu den Suspensionen, die durch Zentrifugieren mit hoher Umdrehungsgeschwindigkeit erhalten werden, nicht zur Sedimentation. Die definitive chemische Stabilisierung wird durch Gefriertrocknen der Liposomensuspension erzielt.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung - näher erläutern, ohne daß diese jedoch hierauf beschränkt sein soll. . - ; ' ■

B ei s ρ i e 1 1: In einem Verseifungskolben wurden 1,5 g Eilecithin, 0,4 g Cholesterin und 0,2 g Dicetylphosphft in Chloroform gelöst und das Lösungsmittel' bis zur Trockene abgedampft. Eine Adriamycinhydrochloridlösung (Konzentration 20 mg/inl) in 0,007 N Pufferphosx>hat wurde darauf zugesetzt und die Lösung 1 Minute lang mit Ultraschall geschüttelt. Dann wurde die Suspension bei Raumtemperatur "unter Stickstoffatmo- · Sphäre 30 Minuten lang stehen gelassen, worauf 2 g BDH IR-50--Harz, das vorher in die Natriuraform aktiviert worden war, " zugesetzt wurden (das Gewicht bezieht sich auf das Trockengewicht und entspricht 5 ml aufgeblähtem Harz). Der Inhalt,des Kolbens wurce 30 Minuten lang geschüttelt. Dann wurde die Suspension" durch eine poröse Schicht (G" 1) filtriert·. Liposomcn mit einer variierenden Größe von 0,5 bis 2 Mikron und mit einem Gehalt von 60 % der Ausgangsmenge Adriamycin wurden

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erhalten. Sie wurden durch Gefriertrocknung stabil gemacht.

Beispiel 2: Es v/urde V7ie in Beispiel 1 verfahren und die gleichen Mengen Adriamycin und Lipide verwendet, wobei das Schütteln mit Ultraschall auf 10 Minuten ausgedehnt v/urde, um Liposomen mit einer Größe von weniger als 1 Mikron zu erhalten. Es wurde ein nicht-granulares Harz, das ebenfalls die Funktion eines Siebes aufweist, gewählt, da der Gesamtkörper der Liposome eine Größe aufweist, die nicht ganz homogen ist. Demgemäß wurden 10 ml "Dowex 50W-X 4 (100-200 mesh)-Harz, das vorher in die Natriumform aktiviert worden war, in den Kolben eingebracht. Nach dem Filtrieren wurde eine Suspension erhalten, die Liposomen mit einer Größe von 0,2 bis 0,8 Mikron sowie 75 % des Ausgangsadriamycins enthielt. Dann wurden die. Liposomen durch Gefriertrocknung stabil.gemacht«

Beispiel 3: Eine Lösung von 5-Fluoruracil mit .einer Konzentration von 10 mg/ml in 0,007 N Pufferphosphat und mit einem pH-Wert von 8 wurde in den Verseifungskolben gegossen, der die Lipidphase enthielt, welche, wie oben beschrieben, hergestellt worden war. Die Suspension wurde wie in Beispiel 1 behandelt, wobei als Filtriex"harz 10 ml AmberIite ' IRA-400 (Cl), ' das vorher als Chlorhydrat aktiviert worden war, verwendet wii-väen. Die so erhaltenen Liposomen wurden durch Gefriertrocknung stabil gemacht.

Beispiel 4: Liposomen aus 5-Flubruracil wurden, wie oben beschrieben, unter Verwendung von 1,5 g Eilecithin, 0,4 g Cholesterin und 0,2 g Stearylamin hergestellt. Als Reinigungssystern wurden 10 ml Dowex 1-Harz (50 bis 100 mesh), das vorher aktiviert' worden war, verwendet. Die so erhaltenen Liposomen wurden durch Gefriertrocknung stabilisiert. . -

Beispiel 5: Es wurde unter den gleichen Bedingungen und unter Verwendung der gleichen Mengen, wie in Beispiel 2 beschrieben, eine Adriamycin-Liposomensuspension hergestellt und unter Verwendung von 15 g adsorbierendem Rohm und Haas XAD 7^:- Harz, die direkt in den Ilerstellungskolben eingebracht wurden, gei'einigt.

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ORIGINAL INSPECTED

Nach Schütteln während 40 Minuten und Filtrieren durch Sinterfilterglas G 1 wurde eine Liposomensuspension erhalten, die etwa 50 % der Ausgangsmerige Adriamycin enthielt; diese Suspension wurde durch Gefriertrocknen stabilisiert.

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ORIGINAL

TEQ^

Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zum Reinigen von Liposomensuspensionen von nichteingeschlossenem Heilmittel, dadurch gekennzeichnet, daß Ionenaustauscherharze sowohl in aktivierter als auch in nicht-aktivierter Form in Salzfdrm eingesetzt'werden.

ι 2. Verfahren nach Anspruch 1,.dadurch gekennzeichnet, daß •absorbierende Polyraersubstanzen eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß starke oder schwache Harze des Anionentyps eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß starke, oder schwache Harze des Kationentyps eingesetzt werden.

5. Verf cthren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomensuspensionen zur Stabilisierung gefriergetrocknet werden.

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ORIGINAL INSPECTED