DE2741234C3 - Antimalignes Mittel - Google Patents

Antimalignes Mittel

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DE2741234C3
DE2741234C3 DE2741234A DE2741234A DE2741234C3 DE 2741234 C3 DE2741234 C3 DE 2741234C3 DE 2741234 A DE2741234 A DE 2741234A DE 2741234 A DE2741234 A DE 2741234A DE 2741234 C3 DE2741234 C3 DE 2741234C3
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Mariko Musashino Tokio Fukuma
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Munemoto Itoh
Yoshiko Funabashi Chiba Seto
Shigeshi Toyoshima
Syosuke Nagoya Aichi Yamamura
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

Die Erfindung betrifft den im Anspruch gekennzeichneten Gegenstand.
Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß bei einem Leukämiepatienten die Anzahl der Leukämiezellen stark abnahm, als sich bei dem Patienten ein Abszess bildete, wobei die Leukozytenzahl schließlich auf den Normalwert abnahm. Aus dem Abszeß dieses Patienten wurde ein Mikroorganisinenstamm abgetrennt und gezüchtet. Ein Fillrat dieser Kulturflüssigkeit wurde an Versuchstiere, bei denen Leukämie induziert worden war, verabfolgt. Dabei zeigte sich bei den Versuchstieren eine Verringerung der Menge an Leukämieviren, eine Verringerung der Anzahl an Leukämiezellen, eine Wiederherstellung der von Leukämie befallenen Organe, eine Verlängerung des Lebens und eine Steigerung der Zahl an überlebenden Tieren. Bei weiteren Untersuchungen ließ sich feststellen, daß dieses Filtrat nicht nur bei Leukämie sondern allgemein auch bei anderen malignen Tumoren wirksam ist.
I. Identifizierung des Mikroorganismenstamms
Erfindungsgemäß wird der bei ATCC unter der Hinterlegungsnummer 31310 hinterlegte Stamm verwendet. Die Bedingungen gemäß BGH-Beschluß »Bäckerhefe«, PMZ, 1975, Seiten 171 bis 176 sind erfüllt. Der verwendete Mikroorganismenstamm wurde aufgrund folgender Eigenschaften als Staphylococcus epidermidis identifiziert:
Primäre Unterscheidungskritcrien Beweglichkeit (_)
(1) 37°C (_ )
24° C ( + )
Gram-Färbung ( + )
(2) Katalase-Aktivität kokkenförmig
(i) Gestalt (-)
(4) Säurefestigkeit (-)
(5) Sporenbildung ( + )
(6) Wachstum an der Luft (_)
(7) Oxidase-Aktivität ( + )
(8) Glucose verwertung
(9) Oxidations- Fermenlalions- LL
(10) Test(Hugh-Leifson-Test)
Sekundäre Unterscheidungskriterien
(1) Koagulase (-)
(2) V-P-Reaktion ( + )
(3) Pink-Reaktion (-)
(4) Phosphatase (+)
Nitratdeduktion (+)
Somit läßt sich der Keim als Staphylococcus epidermidis bezeichnen.
II. Herstellung des Wirkstoffs
Der Mikroorganismus vermehrt sich in üblichen Medien, d. h. Nährmedien mit einem Gehalt an Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganischen Salzen. Zur Verwertung der durch den Mikroorganismus gebildeten wirksamen Substanzen ist es wünschenswert, eine aerobe Kultur in einem flüssigen Medium unter stationären Bedingungen oder unter Schütteln durchzuführen. Beispiele für entsprechende Nältrmedien sind nachstehend angegeben:
(1) Pepton 17g
Bouiilonextrakt 3g
NaCI 5g
K2HPO4 2,5 g
Glucose 2,5 g
Destilliertes Wasser 1 Liter
(pH-Wert 7,3)
(2) Maisquellwasser 6g
NH4H2PO4 3g
Hefeextrakt 2.5 g
Dextrose 10g
CaCOi 2.5 g
Destilliertes Wasser 1 Liter
(pH-Wert 4.5)
Der Mikroorganismus wird 24 bis 120 Stunden bei Temperaturen von —20 bis +400C im Medium gezüchtet. Ein bevorzugter Temperaturbereich beträgt + 20 bis +400C. Die optimale Züchtungstemperatur beträgt etwa +370C. Die Kolonienoberflächc ist weiß und kreisförmig.
Die erhaltene Gärflüssigkeit wird zentrifugiert. Die nach dem Abtrennen der festen Bestandteile erhaltene Lösung (nachstehend auch als »Kulturlösung« bezeichnet) wird verschiedenen Untersuchungen unterworfen.
III. Eigenschaften des Wirkstoffs
Die erhaltene Kulturlösung wird an Tiere verabfolgt, bei denen verschiedene Erkrankungen induziert worden sind. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt:
(1) Hemmung von malignen, durch Inokulation
mit Leukämieviren verursachten Tumoren
30 ICR-Mäuse werden in drei Gruppen unterteilt. Zwei Gruppen werden mit dem Friend-Leukämievirus inokuliert. Anschließend wird an eine dieser beiden Gruppen 0,1 ml/10 g/Tag der Kulturlösung 8 Tage lang intraabdominal verabfolgt. Die beobachtete Hemmwirkung auf die Milzhypcrtophic ist nachstehend angegeben:
Gewicht der Milz Hemmgrad (B) (%)
0,124 ± 0,022
0,724 ± 0,239
0,219 ±0,039 84,9
Nicht infizierte Gruppe
(Kontrolle)
Infizierte Gruppe
(Kontrolle)
Infizierte Gruppe,
an 8 aufeinanderfolgenden Tagen mit der
Kulturlösung behandelt
(2) Hemmung von malignen, durch Inokulation
von Leukämiezellen verursachten Tumoren
Durch Inokulation von Mäuse-Leukämiezellen L-1210 wird bei BDFi-Mäusen ein Leukämiezustand induziert. Die Mäuse sterben innerhalb einer begrenzten Zeitdauer. Von zwei Gruppen mit jeweils 6 Mäusen, die mit L-1210-Zellen inokuliert worden sind, wird einer Gruppe an 5 aufeinanderfolgenden Tagen die Kulturlösung yerabfolgt. Die Menge der verabreichten Kulturlösung entspricht den Angaben in (1).
Todcs/.eilpunki (Tage nach der
Inokulation)
Unbehandelle Gruppe
Behandelte Gruppe
7, 7, 7, 7, 7, 7
7, 7, 7, 8, 8, mehr als 10
Das Verhältnis von Testgruppe zu Kontrollgruppe (Lebensverlängerungs-Verhältnis) beträgt mehr als 112 Prozent.
(3) Bekämpfung von Ehrlich-Krebszcllen
Zwei Gruppen von ICR-Mäusen mit jeweils lOTieren werden mit Ehrlich-Aszites-Tumorzellen inokuliert. Die Kulturlösung wird einer der beiden Gruppen an 5 aufeinanderfolgenden Tagen intraabdominal verabfolgt. Die Hemmwirkung, die sich aus der Anzahl der Tumorzellen am 10. Tag feststellen läßt, ist nachstehend angegeben. Die Menge der verabfolgten Kulturlösung entspricht der in (I) angegebenen Menge.
Anzahl der Tumorzcllcn
I lcmmgrad
Unbchandclte Gruppe 7,7 x I()K
Behandelte Gruppe 4,7 x K)7
93,7
(4) Wirkung auf Sarcoma 180-Zellen
Auf die vorstehend beschriebene Weise werden zwei Gruppen von ICR-Mäusen mit jeweils 10 Tieren intraabdominal mit Sarcom 180-Zellen inokuliert. Die Kulturlösung wird einer der beiden Gruppen fortlaufend an 5 Tagen verabfolgt. Die am 10. Tag festgestellten Zellzahlen sind nachstehend angegeben. Die Menge der Kulturlösung entspricht der in (1) angegebenen Menge.
ΛπλιΙιΙ der
Tumor/cllcn
llemmgrad
Unbehandelle Gruppe 2,3 x
Behandelte Gruppe 5,3 x
10"
10"
76,9
Zu Vergleichszwecken wird die Wirkung von Kulturlösungen, die unter Verwendung von bekannten Mikroorganismen unter den gleichen Züchtungsbedingungen erhalten worden sind, untersucht Kulturlösungen der nachstehend aufgeführten, bekannten Mikroorganismen werden an mit Friend-Leukämievirus inokulierte Mäuse verabfolgt. In keinem Fall läßt sich eine Hemmwirkung beobachten.
Pseudomonas
Klebsieila
Staphylococcus aureus
IV. Isolierung und Reinigung des Wirkstoffs
Der in der Kulturlösung von Staphylococcus epidermidis ATCC 31310 enthaltene Wirkstoff kann beispielsweise auf die nachstehend beschriebene Weise isoliert und gereinigt werden:
(1) Die Kulturlösung wird 30 bis 10 Minuten bei 3000 bis 12 000 U/min zentrifugiert und dadurch in eine Lösung und Niederschläge getrennt. Anschließend werden die Niederschläge mit destilliertem Wasser gewaschen und nochmals zentrifugiert. Die Waschflüssigkeiten werden mit der Lösung vereinigt. Dieser Vorgang wird 1 bis 5mal (im allgemeinen 3mal) wiederholt.
(2) Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird bei Temperaturen von 10 bis 300C unter vermindertem Druck von 5 bis 30 Torr 1 bis 6 Stunden eingedampft. Der dabei ausgefallene Feststoff wird mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend gelöst. Die Lösung wird wieder eingedampft. Dieses Verfahren wird 1 bis 5mal (im allgemeinen 3mal) wiederholt. Man erhält weiße, gelbe oder bräunlich-weiße kristalline Pulver, die in Wasser löslich sind.
(3) Die erhaltenen kristallinen Pulver werden mit einem Molekularsieb getrennt. Die Aktivitäten der entsprechenden Fraktionen werden untersucht. Die aktive Fraktion wird wiederholt ausgewählt. Dabei erhält man eine Substanz mit einem einzelnen Aktivitätspeak.
Der Wirkstoff wird wieder in Wasser gelöst und durch ein Reinigungsverfahren, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie oder Dialyse gereinigt.
(4) Der auf diese Weise gereinigte Wirkstoff kann durch Zusatz von verschiedenen organischen Lösungsmitteln zur wäßrigen Lösung, durch Veränderung des pH-Werts vom sauren Bereich in den alkalischen Bereich, durch Aussalzen und anschließende Umfällung und Filtration oder Einengen durch Eindampfen abgetrennt werden.
Die auf diese Weise erhaltene Substanz hat folgende Eigenschaften:
Thermisch«: Stahillät:
die Suhslan/ verliert ihre Aktivität nach einer ISminütigcii Behandlung bei KK) ( nicht
Ninhydrin-Reaktion: (-)
Ehrlich-Rcaktion: (-)
Sakuguchi-Rcüklion: (-)
Die antimaligne Aktivität des auf diese Weise isolierten und gereinigten Wirkstoffs läßt sich bestätigen, indem man eine verdünnte wäßrige Lösung davon zu einer Kulturlösung von L-1210-Zellen gibt, die Zellen 48 Stunden bei 35°C züchtet und den Hemmgrad der Vermehrung der Zellen bestimmt.
CaCO3
Destilliertes Wasser
2,5 g
ad 1 Liter
(pH-Wert 4,5)
Verdünnungsgrad Hemmgrad (%) Ansatz B
Ansatz A 100
50 100 95,3
100 100 83,5
200 83,0 78,6
400 72,7 61,4
800 69,0 56,4
1600 59,1 -
3200 49,9
Die durch Staphylococcus epidermidis ATCC 31310 gebildete Substanz weist also eine Hemmwirkung gegen verschiedene maligne Tumore, wie flüssige und feste Karzinome auf. Die Substanz zeigt keine akute toxische Wirkung.
V. Verabfolgung des Wirkstoffs
Die jeweilige Dosis hängt vom Verabfolgungsweg ab, beträgt aber im allgemeinen 3 bis 300 mg/kg. Es sind verschiedene Verabfolgungsarten möglich, beispielsweise die intravenöse, subkutane, intrakutane oder intramuskuläre Injektion, die perorale Verabfolgung, die Gabe von Suppositorien, Pastillen und Emulsionen. Dementsprechend werden geeignete Präparate ausgewählt, wie Pulver, Tabletten (einschichtige und zweischichtige Tabletten, enterische Tabletten und dergl.). Kapseln. Injektionsflüssigkeiten in Ampullen oder Phiolen, sublinguale Tabletten. Pastillen, Suppositorien oder Fettemulsionen.
Die Fig. 1 bis 4 zeigen UV- und IR-Spektren von Fraktionen, die gemäß Beispiel 2 erhalten worden sind.
Fig. 1 zeigt das UV-Spektrum eines Wirkstoffs mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 10 000 (ursprüngliche Lösung mit Wasser zu einer 1 :10-Lösung verdünnt):
Fig. 2 zeigt das UV-SpeWrum eines Wirkstoffs mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 5000 (ursprüngliche Lösung);
Fig. 3 zeigt das IR-Spektrum eines Wirkstoffs mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 10 000;
Fig.4 zeigt das IR-Spektrum eines Wirkstoffs mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 5000.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Staphylococcus epidermidis ATCC 31310 wird 48 Stunden bei 37° C in einem Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:
Maisquellwasser 6g
NH4H2PO4 3g
Hefeextrakt 2,5 g
Dextrose 10g
Die Kulturlösung wird 30 Minuten bei 10 000 U/mir zentrifugiert und dadurch in eine überstehende Flüssigkeit und Niederschläge aufgetrennt. Die Niederschläge werden in 1 Liter destilliertem Wasser redispergiert Die Dispersion wird 18 Stunden bei 37°C stehengelas-
I" sen und sodann erneut bei 10 000 U/min zentrifugiert und dadurch in eine überstehende Flüssigkeit und Niederschläge aufgetrennt. Dieses Verfahren wird 5mal wiederholt. Die erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten werden vereinigt und bei Raumtemperatur bei 10 Torr
ι■> etwa 2 Stunden eingedampft. Nach dem Erreichen eines Einengungsgrads von etwa '/3o wird die vereinigte Flüssigkeit über eine Schicht des am Anmeldetag unter dem Handelsnamen Sephadex G-25 bekannten Produkts gegeben und der UV-Spektralanalyse unter
2i) Verwendung eines Indikators für die optische Dichte be 265 nm unterworfen. Zur Abtrennung der entsprechen den Fraktion bedient man sich eines Verfahrens zurr Nachweis von Polysacchariden, beispielsweise dei Molisch-Reaktion. Die Hemmwirkung auf die Vermeh-
2Ί rung von L-1210-Zellen wird festgestellt. Dementsprechend werden die aktiven Fraktionen abgetrennt Dieses Verfahren wird 3mal wiederholt, um die Fraktion mit der höchsten Aktivität zu erhalten. Aus dieser in Form einer wäßrigen Lösung vorliegenden Fraktion
«ι wird durch Eindampfen ein weißes Pulver erhalten Dieses Pulver wird mit Wasser gewaschen, wieder gelöst und erneut durch Eindampfen eingeengt. Diese; Verfahren wird 5mal wiederholt. Man erhält eir kristallines weißes Pulver. Die Ausbeute aus 1 Liter dei
j"i Kulturlösung beträgt etwa 0,3 g.
Beispiel 2
25 Liter eines flüssigen Mediums mit der gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 1 werden hergestellt
4(i Die Züchtung wird 2 Tage bei 37°C durchgeführt. Die Kulturlösung wird zur Entfernung der Keime 2f Minuten bei 6000 U/min zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit (etwa 23 Liter) wird bei 40°C unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 3 500 cm3 eingeengt.
Die auf diese Weise erhaltenen Niederschläge werden 3mal mit 100 cm3 destilliertem Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden mit dem Konzentrat vereinigt. Die vereinigte Flüssigkeit wire
-,ο bei 40°C unter vermindertem Druck auf ein Volumer von 500 cm3 eingeengt. Das Konzentrat wird mit derr am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Diaflon Ma. 10 000 bekannten Produkt in zwei Fraktionen aufgetrennt, wobei eine Fraktion ein Molekulargewichi von mehr als 10 000 und die andere ein Molekulargewicht von weniger als 10 000 aufweist Die Lösung des Produkts mit dem Molekulargewicht von weniger als 10 000 wird über eine mit Diäthylaminoäthylcellulose beschickte Säule (OH~-Form) gegeben, wobei eine
bo Auftrennung in saure, neutrale und basische Substanzen erfolgt. Anschließend werden die neutralen basischen Subtanzen weiter in zwei Fraktionen aufgetrennt (eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 10 000 (ursprüngliche Lösung) und eine weitere Fraktion mit einem Molekulargewicht von weniger al: 5000, wobei das am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Diaflon Nr. 5000 bekannte Produkt verwendet wird. Die Fraktion mit dem Molekulargewicht vor
weniger als 5000 wird unter Verwendung des am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Diaflon Nr. 1000 bekannten Produkts weiter in zwei Fraktionen aufgetrennt, wovon eine Fraktion ein Molekulargewicht von 1000 bis 5000 und die andere ein Molekulargewicht von weniger als 1000 aufweist. Das Konzentrat läßt sich somit in entsprechende Fraktionen aufteilen. Die UV-
und 1R-Spektren der einzelnen Fraktionen werden bestimmt; vgl. F i g. 1 bis 4.
Die auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltenen Fraktionen werden an Tiere verabfolgt, bei denen verschiedene Erkrankungen induziert worden sind. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.
(A) Antimaligne Wirkung der Fraktionen 5000 <MW (Molekulargewicht) <10000 und 1000 <Molekulargewicht <5000 gegen in vitro gezüchtete Leukämiezellen L-1210
Fraktion
Konz.
(mg/ml)
Mittelwert der Zellenzahl ± Standardabweichung
104/ml)
Hemmgrad Konzentration, die eine
50prozentige Hemmung der Zellvermehrung bewirk! iCs(>
(%) (mg/ml)
Tumorzellen- 0 14,1 ± 0,49 —
Kontrollgruppe
1000 <MW <5000 0,25 9,9 ± 0,97 29,8
0,50 8,5+0,19 39,7
1,0 4,9 ±0,13 65,2
2,0 3,7 ± 0,33 73,8
5000 < MW < 10 000 0,25 2,6 ± 0,93 81,6
0,50 1,8 ±0,15 87,2
1,0 0,8 ± 0,001 94,3
0,70
<0,25
(B) Antimaligne Wirkung der Fraktionen 5000 <MW < 10 000 und 1000 <MW <5000 gegen in vitro gezüchtete Ehrlich-Tumorzellen
Fraktion
Konz. Mittelwert der Zellenzahl Hemmgrad
± Standardabweichung
(mg/ml) (X loVml) (%)
Konzentration, die eine 50prozentige Hemmung der Zellvermehrung bewirkt IC50
(mg/ml)
Tumorzellen- 0 80,4 ± 3,3 —
Kontrollgruppe
1000<MW<5000 0,25 58,7 ± 3,7 39,9
0,50 56,6 ± 3,1 43,8
1,00 49,7 ± 2,9 56,4
2,00 46,1 ± 2,3 63,1
5000<MW<10000 0,25 63,2 ± 1,5 31,6
0,50 52,4 ± 2,5 51,5
LOO 39.4 ± 2,5 75,4
2,00 37,7 ± 1,8 78,5
0,72
0,48
(C) Antimaligne Wirkung der »styeen«-Fraktionen 5000 <MW < 10 000 und 1000 <MW <5000 gegen in vitro gezüchtete Aszjtes-Hepatomzellen AH 41C
Fraktion
Konz.
(mg/ml)
Mittelwert der Zellenzahl Hemmgrad ± Standardabweichung
(X Konzentration, die eine 50prozentige Hemmung der Zellvermehrung bewirkt IC50
(mg/ml)
Tumorzellen- 0 115,9 ± 1,52 —
Kontrollgruppe
1000<MW<5000 0,1 93,4 ± 1,85 19,8
0,5 93,5 ± 6,60 19,0
ίο
Fortsetzung Konz. Mittelwert der Zellenzahl Hemmgrad Konzentration, die eine
fraktion ± Standardabweichung 50prozentige Hemmung
der Zellvermehrung
bewirkt IC5»
(mg/ml) (X Iu4AnI) (%) (mg/ml)
\ 1,00 90,3 ± 2,74 22,4 >2,00
ι 1000 < MW < 5000 2,00 87,7 ± 7,94 24,1
ί 0,1 118,9 ±2,59 0
5000<MW<10000 0,5 62,9 ± 3,35 45,7
1,00 27,3 ± 2,61 76,7 0,60
i 2,00 23,4 ± 1,95 80,2
1
(D) Antimaligne Wirkung der »styeen«-Fraktion 5000 <MW < 10 000 und 1000 <MW <5000 bei mit Ehrlich-Aszites-Tumorzellen inokulierten Mäusen (Einfluß auf die Anzahl der gesamten Tumorzellen am 11. Tag nach der Inokulation der Zellen)
Fraktion
Menge
(mg/kg)
Mittelwert der gesamten Tumorzellen + Hemmgrad der Standardabweichung Zellvermehrung
(X 107) (%)
Kontrollgruppe 0
1000<MW<5000 200
400
600
5000 <MW<10 000 200
115,4 ± 12,6 28,4 ± 6,4 31,2 ± 12,5 29,0+ 3,3 47,1 ± 20,4
55.1 ± 17,1
42.2 ± 5,1
75,3 72,9 74,5
59,1 52,2 63,2
Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Antimalignes Mittel mit einem Gehalt an Wirkstoffen, die dadurch erhalten worden sind, daß man einen Mikroorganismus in einem flüssigen Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält züchtet die festen Bestandteile aus der Gärbrühe entfernt die verbleibende Lösung einengt den auf diese Weise ι» (5) erhaltenen Niederschlag mit Wasser wäscht den Niederschlag wieder in Lösung bringt diese Lösung durch Gelfiltration an einem adsorptiv wirkenden Gel oder unter Verwendung eines Molekularsibs in eine Anzahl von Fraktionen auftrennt eine Fraktion ι > mit antimaligner Aktivität auswählt und diese Fraktion einengt weiter reinigt und dio aktiven Bestandteile davon abtrennt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Staphylococcus epidermidis ATCC 31310 einsetzt > <>
    Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß der in Frage stehende Keim zur Gattung Staphylococcus oder Aerococcus gehört
DE2741234A 1976-09-13 1977-09-13 Antimalignes Mittel Expired DE2741234C3 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10964876A JPS5334914A (en) 1976-09-13 1976-09-13 Antitumor agent

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Publication Number Publication Date
DE2741234A1 DE2741234A1 (de) 1978-03-16
DE2741234B2 DE2741234B2 (de) 1979-07-05
DE2741234C3 true DE2741234C3 (de) 1980-03-20

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ID=14515604

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Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2741234A Expired DE2741234C3 (de) 1976-09-13 1977-09-13 Antimalignes Mittel

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JP (1) JPS5334914A (de)
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DK (1) DK406977A (de)
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