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Lipase-Präparate mit verbesserter Wirkung
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Lipase-Präparate haben technische Bedeutung und könnten beispielsweise
zur Fettspaltung verwandt werden. Ebenfalls können Lipase-Präparate zum Beizen bei
der Gerbereivorbereitung Verwendung finden, Die Handelsprodukte sind zum Zwecke
der Standardisierung mit indifferenten Substanzen wie beispielsweise Zucker, Stärke,
Kieselgur usw. vermischt. Diese Zusätze müssen als integrierende Bestandteile der
Präparate betrachtet werden. Es hat sich nun gezeigt, daß Lipase häufig durch Zugabe
solcher Zusatzstoffe insbesondere dann, wenn es sich um oberflächenaktive Stoffe
handelt, eine starke Äktivitätsverminderung erfährt.
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Es wurde nun gefunden, daß diese Aktivitätsverminderung nicht bzw.
nur in ganz geringfügigem Maße eintritt, wenn solche lipasehaltigen Präparate zusätzliche
10 - 50 Gewichtsteile, vorzugsweise 20 - 40 Gewichtsteile (bezogen auf 1 Gewichtsteil
Lipase) einer Mischung enthalten, die sich aus folgenden Bestandteilen zusammensetzt:
70 - 90 %, vorzugsweise 82 - 86 % Lactose; 8 - 20 Q vorzugsweise 11 - 13 s Molkenprotein;
0,1 -3 %, vorzugsweise 0,2 - 0,5 ffi Milchfett; 0,1 - 5 %, vorzugsweise 1 - 2 %
Molkenmineralstoffe und 0,1 - 3 d09 vorzugsweise 0,5 - 2 % Wasser (% = Gewichtsprozente).
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Unter Molkenprotein oder Serumprotein versteht man die Proteine,
die sich in der unerhitzten Milch nach Ausfällung des Caseins (durch Elektrolyte,
besonders Wasserstoffionen oder Lab) befinden. Dieses Milchserumprotein, hat beispielsweise
folgende Zusammensetzung: 55 - 65 % ß1 und ß2-Lactoglobulin, 13 - 22 qD -Lactalbumin,-
16 - 25 % Immunglobuline und 3 - 4 % Serumalbumin.
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Milchfett besteht aus den Triglyceriden gesättigter und ungesättigter
Fettsäuren. Die Fettsäurezusammensetzung (in Gewichtsprozent) ist beispielsweise
folgende: Buttersäure 2 - 8, vorzugsweise 3,6 - 5,5; Capronsäure 1 - 3, vorzugsweise
1,5 - 2; Caprylsäure 0,1 - 2, vorzugsweise 0,5 - 1; Caprinsäure 0,1. - 5, vorzugsweise
0,3 - 2,5; Laurinsäure 1 - 52 vorzugsweise 2,0 - 2,6; Myristinsäure 5 - 15, vorzugsweise
9,5 - 12; Palmitinsäure 25 - 40, vorzugsweise 28 - 38; Stearinsäure 1 - 15, vorzugsweise
1,5 - 10; gesättigte Säuren über Ct8 1 - 4, vorzugsweise 2 - 3; Decensäure 0,05
- 0,5; Dodecensäure 0,05 -0,5;Tetradecensäure 0,1 - 3; Hexadecensaure 1 - 7; Octadecensäuren
20 - 40, vorzugsweise 25 - 35; Octadecadiensäure 1 - 5; ungesättigte Säuren über
018 1 - 3.
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Unter Molkenmineralstoffe wird eine Mischung von Phosphaten, Citraten,
Chloriden, Sulfaten und Carbonaten des Natriums, Kaliums, Calciums, Magnesiums und
spurenweise des Eisens verstanden. Der Gehalt der Metalle in der Salzmischung in
Gewichtsprozenten ist beispielsweise folgender: Natrium 2- 8,vorzugsweise 4 - 5
Gewichtsprozent; Kalium 10 - 30, vorzugsweise 15 - 20 Gewichtsprozent; Calcium 2
- 30, vorzugsweise 4 - 15 Gewichtsprozent; Magnesium 0,5 - 3, vorzugsweise 0,8 -
1,5 Gewichtsprozent; Eisen 0,01 - 0,1, vorzugsweise
0,02 - 0,08
Gewichtsprozent. Innerhalb der Mischung kommen, bezogen auf ein Gewichtsteil Magnesium
beispielsweise 3 - 8, vorzugsweise 5 - 7 Gewichtsteile Natrium, 2 - 15, vorzugsweise
4 - 8 Gewichtsteile Calcium und 15 - 30, vorzugsweise 18 - 25 Gewichtsteile Kalium.
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Der Gehalt an Säuren in Gewichtsprozenten in der Salzmischung ist
beispielsweise folgender: Phosphatanion (P043 ) 10 - 50, vorzugsweise 15 - 25 Gewichtsprozent;
Citratanion 10 - 30, vorzugsweise 15 - 25 Gewichtsprozent; Chloridanion 10 - 20,
vorzugsweise 12 - 16 Gewichtsprozent; Sulfatanion 2 - 8, vorzugsweise 3 - 6 Gewichtsprozent;
Carbonatanion 2 - 15, vorzugsweise 5 - 10 Gewichtsprozent;bezogen auf 1 g Sulfatanion
kommen innerhalb der Mischung beispielsweise 2 - 5, vorzugsweise 2,5 - 3 Gewichtsteile
Chloridanion,.3 - 10, vorzugsweise 4 - 6 Gewichtsteile Phosphatanion, 3 - 10, vorzugsweise
4 - 6 Gewichtsteile Citratanion und 0,5 - 2, vorzugsweise 0,8 - 1,5 Carbonatanion.
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Vorzugsweise werden als erfindungsgemäßes Stabilisierungsmittel 10
- 50 Gewichtsteile, insbesondere 20 - 40 Gewichtsteile (bezogen auf 1 Gewichtsteil
Lipase) Sitßmolkenpulver verwendet. Süßmolkenpulver ist ein gängiges Handelsprodukt
und wird beispielsweise durch Sprühtrocknung von Molke (süßmolke) hergestellt (siehe
Ullmanns Encyclopädie der technischen Chemie, 12. Band (1960) Seite 518). Siehe
auch E. Wegelin Netherlands Milk and Dairy Journal 5, 263/73 (1951); S.G. Wiechers,
ebenda 6, 127/36 (1952); S.G. Wiechers, A.H. Willem, Nederlandse Centrale Org. voor
Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek, DBP 819 194, 1949; Food 23, 166/71 (1954.).
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Das verwendete Süßmolkenpulver stellt ein Gemisch aus 70 - 90 lo,
vorzugsweise 82 - 86 % Lactose, 8 - 20 dow vorzugsweise 11 - 13 % Molkenprotein,
0,1 - 3 %, vorzugsweise 0,2 - 0,5 Xdo Milchfett, 0,1 - 5 %vorzugsweise 1 - 2 % Molkenmineralstoffe
und 0,1 -3 %, vorzugsweise 0,5 - 2 % Wasser dar (% bedeutet stets Gewichtsprozente).
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Die zu stabilisierende Lipase kann tierischen oder nichttierischen
Ursprungs sein. Beispielsweise handelt es sich um Lipase aus Pankreas oder um Lipase
aus Pflanzen, beispielsweise aus Ricinusbohnen oder Lipase aus Mikro organismen,
beispielsweise aus Pilzen wie Rhizopus arrhizus, Rhizopus nigricans, Rhizopus oryzae,
Rhizopus delemar, Aspergillusarten wie Aspergillus niger, Aspergillus oryzae oder
Welchia perfringens, Mycotorula lipolytica, Candida cyclindracea, Geotrichum candidum.
Vorzugsweise handelt es sich um Lipase nicht-tierischen Ursprungs.
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Die Gewinnung der in Betracht kommenden Lipasen erfolgt in der hierfür
bekannten Preise und ist beispielsweise angegeben in Ullmanns Encyklopädie der technischen
Chemie, Band 7 (1956), Seite 391 - 397, 406 - 411 oder in Bulletin de la SociQtQ
de Chimie Biologique 1966, 48 Nr. 6, Seite 747 - 770 und 1968, 50 Nr. 11, Seite
2179 - 2182. Beispielsweise wird eine Pilzlipase entsprechend Bulletin de la socibté
de Chimie Biologique 1966, 48 Nr. 6, Seite 747 ff. wie folgt erhalten. Das nach
Ab trennung des Myzels aus Kulturen von Pilzsporen erhaltene Filtrat wird im Valruum
bei 30° C konzentriert, zentrifugiert und aus der oberen Schicht nach Verdünnung
das Enzym mit Aceton bei O C gefällt und im Vakuum getrocknet.
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Zur weiteren Reinigung wird in Wasser suspendiert, zentrifugiert,
S04-Ionen durch Zusatz von Bariumchlorid ausgefällt, das Enzym wiederum mit Aceton
ausgefällt und der so erhaltende Rückstand nach Auflösen in destilliertem Wasser
über eine mit Calcium beladene Austauschsäule XE64 bei pH 4,7 aufgebracht und durch
eine Calziumacetatlösung bei pH 5,7 eluiert. Aus dem Eluat wird nach Einstellen
auf pH 6 mit verdünntem Ammoniak das Enzym mit Aceton gefällt und
das
so erhaltene Produkt durch Suspension in demineralisiertem Wasser nochmals über
eine Sephadexsäule G25 chromatographiert.
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Aus dem so erhaltenen Eluat wird durch Gefriertrocknung (-70° c) die
Lipase als Pulver erhalten.
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Besonders auffällig ist die stabilisierende Wirkung bei einer Lipase
aus Rhizopusarten, insbesondere Rhizopus arrhizus.
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Gemäß dem obenangegebenen Verfahren aus Bull. Soc. Chim.
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Biol. 1966, Seite 747 ffo wird beispielsweise eine Lipase mit einer
Aktivität von 8.800.000 Einheiten/g (Bestimmung mittels einer Olivenölemulsion)
erhalten. Diese Lipase stellt ein reines Produkt dar und ist hauptsächlich dadurch
gekennzeichnet, daß sie zwei Optimum-pH besitzt, das eine um pH 7 das andere um
pH 3,5. Sie verhält sich sowohl in der Papierelektrophorese, in der Polyacrylamidgelelektrophorese
als auch in der Chromatographie an Sephadexsäulen wie ein einziges Protein und nähert
sich in ihrer Wirkungsweise insbesondere auf Triglyceride der Pankreas-Lipase. (Weitere
Eigenschaften siehe Bull. Soc. Chim. Diol. 1966, 48 Nr. 6 Seite 756 - 766.) Eine
Aktivitätssteigerung dieser Lipase kann durch eine weitere Reinigung über eine Sephadexkolonne
G 100 (in destilliertem Wasser) erhalten werden, wonach man ein Produkt erhält,
mit einer Aktivität von 11.000.000 Einheiten/g (siehe Bull. Soc. Chim. Biol. 1968,
50 Nr. 11, Seite 2179 - 2182).
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Das erfindungsgemäße Stabilisierungsmittel bewirkt eine Verbesserung
der Haltbarkeit von Lipase, beim Zusammenbringen und/oder Mischen mit Zusätzen wie
sie für Enzym-Handelspräparate üblich sind, insbesondere solchen mit oberflächenaktiven
Eigenschaften wie aktive Tonerde, Aluminiumhydroxyd,
Aluminiumoxyd,
hochdisperse Kieselsäure (Aerosil), Magnet siumcarbonat, Aluminiumsalzen (Aluminiumtrisilikate,
Aluminiumphosphate), Dialkylpolysiloxane, Silicagel, Kieselgur und ähnliche.
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Unter dem Begriff 'aktive Tonerde" werden pulverförmige Oxyde, Oxydhrdrate,
Hydroxyde und basische Salze des Aluminiums verstanden, die nicht weniger als 40
ffi Al 203 enthalten (siehe Ullmanns Encyclopädie der technischen Chemie, dritte
Auflage, Band 4, Seite 545/546 und Band 13, Seite 356).
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Insbesondere handelt es sich um ein Aluminiumhydroxyd-Gel, welches
durch Fällung von Aluminiumsalz-Lösungen (zum Beispiel Sulfat-Lösungen) mit Ammoniumcarbonat
oder Natriumcarbonat und Trocknen des Filterlxchens erhalten wird. (Gehalt an Al203
nicht weniger als 47 dp, vorzugsweise 50 - 60 %.) Der pH einer 4 ideen (Gewicht/Vakuum)
Suspension in C02-freiem Wasser soll nicht über 10,0 liegen. Solche Aluminiumhydroxyd-Gele
sind zum Beispiel unter der Bezeichnung "Teg" im Handel, Bei der hochdispersen Kieselsäure
handelt es sich um eine Kieselsäure, die durch Hydrolyse von Siliciumtetrachlorid
in der Wasserstoff-Flamme erhalten wird (Aerosil). Beispielsweise hat eine solche
Kieselsäure folgende Kenngrößen: Oberfläche (m²/g) nach BET: 50 - 225, vorzugsweise
120 - 225 bzw. 170 - 225; mittlere Größe der Primärteilchen in Millimikron: 12 -
30, vorzugsweise 12 - 16; Schüttgewicht (normale Ware) in g/Liter: ca. 60; Stampfvolumen
(normale Ware nach DIN 53 194) in ml/100 g: 1500 - 2000, vorzugsweise 1700 - 2000;
pH-Wert (nach DIN 53 200) in 4 siger wässriger Dispersion: 3,5 - 4,3 vorzugsweise
3,6 - 4,3.
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Die Dialkylpolysiloxane sind bekannt und im Handelt erhältlich und
werden nach den iiblichen Verfahren erhal-ten, beispielsweise durch Polymerisation
von Siliconen oder durch Hydrolyse und chemische Kondensation von einer oder mehreren
hydrolysierbaren Siliconverbindungeii der allgemeinen Formel R2 SiX2> wobei R
eine niedere Alkylgruppe mit 1 - 3 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 - 2 C-Atomen
ist und X ein Halogenatom (beispielsweise Chlor) oder eine niedere Alkoxygruppe
darstellt. Beispiele für solche Ausgangsverbindungen sind Dimethyldichlorsilan,
Diäthyldichlorsilan, Dimethyldiäthoxysilan, Methyläthyldichlorsilan, Dibutyldichlorsilan,
Dihexylchlorsilan, Äthylbutyldiäthoxysilan und Shnliche.
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Hierbei wird beispielsweise das hydrolysierbare Silicon unter definierten
Bedingungen mit Wasser umgesetzt und so ein Polysiloxan mit der gewünschten Viskosität
erhalten. Das bevorzugte Polysiloxan ist Dimethylpolysiloxan.
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Beispielsweise handelt es sich um ein Material mit dem Freinamen Simethicon.
Dieses Material besteht im wesentlichen aus Dimethylpolysiloxan und 4 bis 4 1/2
Oewichtsprozent eines Siliciumdioxid-Aerogels. So besitzt beispielsweise das Silicon-Fließmittel
dieser Mischung, welche von der Dow-Corning Chemical Company hergestellt wird, ein
Blolelculargewicht zwischen 14.000 und 21.000, einen Siliciumgehalt von 37a3 bis
38,5 %, eine Viskosität bei 250 C von 300 bis 600 centistokes (cs), eine Dichte
bei 250 C von 0,965 bis 25 0,970 und einen Brechungsindex nD von 1.403 + 0,002.
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Das mittlere Molgewicht der Dialkylpolysiloxane liegt vorzugsweise
zwischen 14.000 und 30.000, beispielsweise bei ca. 24.000. Die Viskosität der Dialkylpolysiloxane
kann beispielsweise zwischen 900 - 1.100 cp (250 C) liegen; vorzugsweise
liegt
sie zwischen 950 - 1050 cp. Der Anteil an Niederpolymeren (bis zu einem Molgewicht
von 700) soll gering sein und unter 0,5 do liegen.
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Silica-Gel ist eine aktive Kieselsäure, die zum Beispiel aus 5 m/u
- 4 mm großen Körnern bestcht. Die innere Gesamtoberfläche von 1 g Silica-Gel kann
zum Beispiel 400 - 800 qm groß scin (siehe Römpp Chemie-Lexikon 1966 Band IV 5915
-5916; Ullmanns Encyclopädie der Technischen Chemie Band 15 (1964) Seite 716 - 732).
Vorzugsweise liegt die Korngröße zwischen 5 - 100 mr, vorzugsweise 10 - 50 m. Das
verwendete Siliciumdioxid hat beispielsweise eine Oberfläche von 100 - 250 m2/g,
vorzugsweise 150 bis 200 m2/g. Der Wassergehalt liegt beispielsweise bei 0,5 - 2
%, vorzugsweise zwischen 0,7 -1,5 . Die Herstellung des Siliciumdioxids kann nach
bekannten Verfahren erfolgen, wie durch Einwirkung von Schwefelsäure auf Wasserglas
oder durch Hydrolyse von SiC14 (Degussa-Verfahren; siehe beispielsweise US-Patent
3 086 851, DAS 1 163 784, DAS 1 210 421, DAS 1 150 955).
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Die lipasehaltigen Präparate können darüberhinaus noch weitere Enzyme
enthalten, zum Beispiel proteolytisch wirksame Enzyme und Amylasen (zum Beispiel
Proteasen und Amylasen, wie sie beispielsweise in Enzymkonzentraten aus Aspergillus-Arten
wie Aspergillus oryzae oder auch Aspergillus parastiticus vorliegen).
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Die Herstellu.ng der Präparate erfolgt durch Vermischen der Lipase
mit dem erfindungsgemäßen Stabilisierungsmittel sowie gegebenenfalls weiteren üblichen
Zusätzen in hierfür üblichen Mischern und Homogenisiergeräten (zum Beispiel Taumelmischer,
Zwangsmischer).
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Beispiel 1 Ein Gewichtsteil Lipase wird mit 20 Gewichtsteilen Aluminiumhydroxyd-Gel
(getrocknet) und 30 Teilen Süßmolkenpulver in einem Mörser fein zerrieben und vermischt
(Temperatur 200 C).
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Wird das Süßmolkenpulver weggelassen und durch 30 Gewichtsteile Glucose.
ersetzt, dann zeigt sich, daß nach dem Vermischen gegenüber der Mischung mit dem
Süßmolkenpulver ein Aktivitätsverlust von rund 40 eingetreten ist.