DE2621311C3

DE2621311C3 - Verfahren zum Herstellen von mittels Technetium 99↑m↑ markierten Proteinen

Info

Publication number: DE2621311C3
Application number: DE19762621311
Authority: DE
Inventors: Andre-Marie Ixelles Ermans
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-05-15
Filing date: 1976-05-13
Publication date: 1981-04-30
Also published as: GB1534956A; DE2621311A1; SE7605350L; JPS51142521A; DE2621311B2; CH613177A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von mittels Technetium 99^m markierten Proteinen, bei dem Pertechnetat reduziert und das reduzierte Pertechnetat mit mindestens einem der Proteine aus der Gruppe Fibrinogen und der Immunoglobuline in Berührung gebracht wird, um eine Markierung dieses Proteins zu erzielen.

In der Literatur sind bereits verschiedene Verfahren zum Markieren von Fibrinogen beschrieben. Diese Angaben beziehen sich insbesondere auf die Markierung von Fibrinogen mit Jod J¹³¹ oder J¹²⁵. Zu diesen bekannten Verfahren gehören das elektrolytische Verfahren, das enzymatische Verfahren, das Chloramin-T-Verfahren und das Jodmonochlorid-Verfahren. Diese Verfahren haben bestimmte Nachteile, die einerseits auf die Verwendung von Radioisotopen mit einer zu langen Halbwertszeit oder von Radioisotopen mit einer für die Markierung von Proteinen nicht geeigneten Halbwertszeit und andererseits auf eine mit den derzeit auf dem Markt vorhandene Einrichtungen zum Sichtbarmachen nicht verträgliche Energie und auf eine zu starke Irradiation oder auf ein zu starkes Untergrundgeräusch, welches den Nachweis von Thrombosen im Beckenbereich verhindert, zurückzuführen sind.

Hauptsächlich aus diesen Gründen wendet man heute lieber Verfahren zum Markieren mit Technetium 99^m an, wobei das Technetium 99^m die folgenden Hauptvorteile bietet: es ist leicht erhältlich, hat eine kurze Halbwertszeit, ist ein reiner y-Strahler, dessen Strahlung eine Energie, welche die Sichtbarmachung mit gängigen Apparaturen erlaubt und einen minimalen Irradiationsgrad aufweist

Die bisher angewendeten Markierungsverfaliren basieren jedoch im wesentlichen auf den Methoden der elektrolytischen Markierung. Obgleich in der Literatur auch die Anwendung von Markierungsverfahren mit Technetium 99™ auf chemischem Wege in Gegenwart von Reduktionsmitteln, wie Zinn(II)-chlorid oder Komplexe von Ascorbinsäure mit Eisen, erwähnt sind, geht daraus hervor, daß die Ergebnisse, die damit erzielt wurden, niemals sehr zufriedenstellend waren, weil diese Agentien im allgemeinen zu einer Verminderung der Löslichkeit des reduzierten Pertechnetats führen, welche die Markierung des Proteins verhindern kann. Was die Markierungsverfahren mit Technetium 99^m anbetrifft, in denen die Reduktion von Pertechnetat auf elektrolytischem Wege angewendet wird, so machen sie, obgleich sie nach den Angaben in der Literatur die obengenannten Nachteile der bisher bekannten chemischen Markierungsverfahren nicht aufweisen und häufig die Erzielung einer ziemlich selektiven Markierung des Proteins erlauben, die Verwendung eine; komplizierten und kostspieligen Materials erforderlich, da die Elektrolyse im allgemeinen mit Zirkoniumelektroden durchgeführt wird.

Aus der DE-OS 22 35 681 ist ein Verfahren zum Markieren von Albumin aus Humanserum mit Technetium 99^m in Gegenwart von Zinn(II)-salz als Reduktionsmittel bekannt Hierbei wird der pH-Wert zwischen 4,5 und 6 gehalten. Wie oben bereits erwähnt wurde, besteht der Nachteil beim Arbeiten in Gegenwart von solchen Reduktionsmitteln und bei einem solchen pH darin, daß die Ausfällung von Albumin zwischen oH 4,5 und 6 hervorgerufen wird; unter diesen Bedingungen erhält man eine verringerte Löslichkeit an Pertechnetat, wodurch die Markierung des Proteins behindert werden kann.

Aulgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein wirtschaftliches Verfahren anzugeben, welches die Herstellung einer injizierbaren Lösung eines Proteins der obengenannten Gruppe erlaubt, das mittels Technetium 99^m markiert ist, welches erlaubt, sowohl die sehr vorteilhaften Eigenschaften des Technetiums als Isotopenindikator (Tracer) vollständig auszunutzen als auch eine Selektivität und Stabilität der Markierung sowie eine Wirksamkeit der Bindung des Technetiums an das Protein zu erzielen, die besser sind als diejenigen, die mit den bisher bekannten Markierungsverfahren erzielbar waren.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Verfahren de.· eingangs genannten Gattung dadurch gelöst, daß man die Reduktion des Pertechnetats in Gegenwart von Zinn(II)-chlorid bei einem pH-Wert zwischen 11 und 12 durchführt und daß man die dabei erhaltene Mischung, die das mit Technetium markierte Protein enthält, einer Reinigung unterwirft, welche die Eliminierung eventueller Abbauprodukte dieses Proteins sowie des nichtfixierten Technetiums erlaubt. Erfindungsgemäß erreicht man eine besonders selektive Markierung sowie gute Ausbeute und Stabilität.

Zweckmäßig besteht die Reinigung darin, daß man aus diesem Protein die Substanzen eliminiert (entfernt), die ein Molekulargewicht von weniger als 100 000 aufweisen. Gemäß einer N-sv-ders vorteilhaften Ausführungsform wird die Reduktion des Pertechnetats bei einem pH-Wert in der Größenordnung von 11,6 durchgeführt Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das in physiologischem Serum enthaltene Pertechnetat durch Zugabe einer Lösung von Essigsäure und Zinn(II)-chlorid als Reduktionsmittel und

anschließende Zugabe einer Babe um den pH-Wert auf den gewünschten Wert einzustellen, reduziert

Weitere Einzelheiten der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung von einigen beispielhaften vorteilhaften Ausführungsfornren des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Bezugnahme auf die Zeichnungen hervor. Dabei zeigt

F i g. 1 ein Diagramm, das durch Chromatographie erhalten wurde, welches auf der Abszisse die verschiedenen Fraktionen einer mit Technetium 99^m markiertes Fibrinogen enthaltenden Lösung und auf der Ordinate die Radioaktivität dieser Fraktionen zeigt,

F i g. 2 ein Diagramm, das durch Chromatographie erhalten wurde, welches auf der Abszisse die erhaltenen verschiedenen Fraktionen einer mit Technetium 99^m markiertes Fibrinogen enthaltenden Lösung und auf der Ordinate die optische Dichte dieser Fraktionen angibt,

F i g. 3 das vergrößerte Bild einer elektrostatischen Darstellung, welche die Radioaktivitätszonen zeigt, die der Fixierung des Technetium 99^m-Pertechnetats in den 19 Tage nach der Injektion des Freund-Adjuvans und von 500 μ Ci von 99^m TcOi" erreichten Zonen der rheumatoiden Arthritis des Schwanzes und der Pfote einer Ratte entsprechen,

F i g. 4 ein vergrößertes Bild einer elektrostatischen Darstellung, welche die Radioaktivitätszonen zeigt, die der Fixierung des Technetium 99^m-Fibrinogens in den 19 Tage nach der Injektion der gleichen Dosis des Freund-Adjuvans wie sie für die Erzeugung des in der F i g. 3 dargestellten Bildes verwendet worden ist, und von 500 μ Ci von 99™ Tc-Fibrinogen erreichten Zonen der rheumatoiden Arthritis des Schwanzes und der Pfote einer Ratte entsprechen.

Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Herstellung einer injizierbaren Lösung von Fibrinogen oder Immunoglobulinen, die mittels Technetium 99^m markiert worden sind, als Isotopenindikator (Tracer). Dieses komplexe Radioisotop eignet sich besonders gut in der spezifischen Radiodiagnostik und zur Früherkennung von inflammatorischen Erkrankungen des Bindegewebes, wie z. B. unter anderem der rheumatoiden Polyarthritis, der Gefäßthrombosen Und von malignen Tumoren, insbesondere solchen der Leber und des Gehirns. Unter »rheumatoider Polyarthritis oder Arthritis« ist auch »Arthritis deformans« zu verstehen.

Zweckmäßig verwendet man lyophilisiertes Fibrinogen menschlichen Ursprungs, das Menschen injiziert werden kann und dessen koagulierbare Fraktion sich auf etwa 90% beläuft. Darüber hinaus ist dieses Fibrinogen steril und frei von dem Australien-Antigen und Fieber erzeugenden Stoffen. Es wird in lyophilisierter Form in Gegenwart von Natriumsalzen (basischen Salzen) aufbewahrt.

Bei dem verwendeten Isotopenindikator (Tracer) handelt es sich vorzugsweise um steriles und apyrogenes 99^m Tc-Pertechnetat (NaTcO₄). Bevor das Pertechnetat mit dem zu markierenden Protein, z. B. Fibrinogen, in Berührung gebracht wird, wird es reduziert Es ist nämlich allgemein bekannt daß das in Form von 99^m TcO₄ - erhaltene 99^m Tc vorher zu dem Oxydationszustand 4 + oder 5 + reduziert werden muß, bevor es sich an irgendein Molekül bindet.

Die Auswahl des pH-Wertes ist diesbezüglich sehr wichtig und erfindungsgemäß arbeitet man bei einem pil-Wert in der Größenordnung von 11 bis 12, vorzugsweise bei 11,6. Es ist absolut unerläßlich, den pH-Wert innerhalb dieses Bereiches zu halten. Wenn man sich nämlich davon entfernt, so wurde festgestellt,

daß überraschenderweise sich die Wirksamkeit der Bindung des reduzierten Technetiums an das Protein deutlich vermindert. Als Reduktionsmittel verwendet man Zinn(II)-chlorid. Das reduzierte Technetium bindet sich dann, wenn es mit dem Fibrinogen in Berührung gebracht wird, an die Tyrosylgruppen des Fibrinogenmoleküls.

Das lyophilisierte Fibrinogen wird in sterilem und pyrogenfreiem Wasser gelöst und anschließend einer Dialyse unterworfen, um die obengenannten Natriumsalze abzutrennen. In einer darauffolgenden Stufe wird das reduzierte Pertechnetat, beispielsweise durch Rühren, mit dem gelösten Fibrinogen in intensiven Kontakt gebracht, um die Markierung des Fibrinogens zu bewirken. Die auf diese Weise erhaltene Mischung, die das gelöste Fibrinogen und das reduzierte Pertechnetat enthält, wird anschließend vorzugsweise durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von Natriumeitrat und Zitronensäure auf einen pH-Wert zwischen 7 und 8 gebracht. Ein pH-Wert in der Größenordnung von 7,4 ist besonders geeignet.

Es ist auch möglich, eine Markierung des lyophilisierten Fibrinogens ohne Durchführung der obengenannten Dialyse zu erzielen. Man geht dabei wie oben angegeben vor, wobei man die das gelöste Fibrinogen und das reduzierte Pertechnetat enthaltende Mischung auf einen pH-Wert zwischen 7 und 8, vorzugsweise auf 7,4, bringt, beispielsweise ebenfalls durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von Natriumeitrat und Zitronensäure. Zu diesem Zweck werden erfindungsgemäß die Reduktion des Pertechnetats, das Inberührungbringen des reduzierten Pertechnetats mit dem gelösten Fibrinogen und die Senkung des pH-Wertes der Mischung auf einen Wert zwischen 7 und 8 vorzugsweise unter einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Der Stickstoff nimmt nämlich die Stelle des atmosphärischen Sauerstoffs ein und verhindert jede Oxydation oder Rückoxydation der Bestandteile in Gegenwart insbesondere des reduzierten Pertechnetats.

Erfindungsgemäß unterwirft man die so erhaltene Mischung, die mit Technetium markiertes Protein enthält, einer Reinigung, um eventuelle Abbauprodukte dieses Proteins sowie das an letzterem nicht-fixierte Technetium zu eliminieren. Diese Reinigung besteht vorzugsweise darin, daß man von dem markierten Protein die Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 100 000 und gegebenenfalls weniger als 300 000 abtrennt, indem man die Mischung durch eine geeignete Membran schickt, welche die Substanzen mit einem Molekulargewicht oberhalb der oben angegebenen Werte zurückhält.

Durch eine erste Reinigung eliminiert man zweckmäßig das freie Technetium und das an Moleküle, deren Molekulargewicht unterhalb 100 000 liegt, gebundene Technetium und durch eine darauffolgende zweite Reinigung eliminiert man alle Moleküle, deren Molekulargewicht unterhalb 300 000 liegt. In bestimmten Fällen, beispielsweise dann, wenn man die Markierung des lyophilisierten Fibrinogens ohne Durchführung der Dialyse durchführt, ist es zweckmäßig, vor der obengenannten Reinigung die kolloidalen Teilchen und/oder Niederschläge, wie z.B. die Teilchen von ausgefallenem Zinn, die während der Senkung des pH-Wertes der das gelöste Fibrinogen und das reduzierte Pertechnetat enthaltenden Mischung auftretea abzutrennen- Zum Zurückhalten dieser Teilchen verwendet man beispielsweise ein Mflliporen-Fflter mit einem Porendurchmesser von 0,22 mu-

Durch verschiedene Kontrollverfahren, wie z. B. die Säulenchromatographie und die Immunoelektrophorese, ist es möglich, festzustellen, daß das Reinigungsverfahren eine Eliminierung der Mehrzahl der Abbauprodukte und des freien Technetiums garantiert. Es wurde festgestellt, daß in der erfindungsgemäßen Endlösung das Technetium 99^m zu etwa 90% an einem Fibrinogen-Molekül fixiert ist und das auf eine sehr reproduzierbare Weise, während die beiden aufeinanderfolgenden Reinigungen in bestimmten Sonderfällen die Herstellung einer Lösung von mit Technetium markiertem Fibrinogen erlauben, in der die Menge des an einem Fibrinogenmolekül fixierten Technetiums mindestens 98% beträgt.

Diesbezüglich sei festgestellt, daß mit den bisher bekannten Markierungsverfahren, wie bereits weiter oben angegeben, eine Markierung mit einer ebenso hohen Ausbeute hicht erzielt werden kann, da die dabei erzielbaren Ausbeuten ii) der Größenordnung von 55 bis 70% liegen.

Die beiden beiliegenden Diagramme zeigen die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens und erlauben die Feststellung, daß es sich bei dem markierten Produkt um das Fibrinogen handelt, und das auf eine sehr selektive Weise.

Die beiden folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1
Reduktion des Pertechnetats

10 mCi Pertechnetat, enthalten in 2 ml physiologischem Serum, werden durch Zugabe von 1 ml einer wäßrigen Lösung, die auf 100 ml 20 μΐ 96%ige Essigsäure und 10 mg SnCb · 2 H2O enthält, einerseits und von 0,3 ml 0,1 η NaOH, um den pH-Wert auf 11,6 zu bringen, andererseits reduziert

Konditionierung des Fibrinogens

Man löst Ig lyophilisiertes Fibrinogen in 100 ml sterilem und pyrogenfreiem Wasser. Man dialysiert das gelöste Fibrinogen 18 Stunden lang bei 4° C in Dialysesäcken vom Typ Viskingl-⁸/32" gegen eine 0,6%ige NaCl-Lösung. Man teilt das gelöste Fibrinogen in aliquote Anteile zu 2 ml auf, die man bei —20° C in Fläschchen aufbewahrt

Markierung nach der Erfindung

2 ml Fibrinogen werden 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur mit der das reduzierte Technetium enihäkeiiden Lösung gerührt Anschließend senkt man den pH-Wert der dabei erhaltenen Mischung durch Zugabe der erforderlichen Menge einer Pufferlösung, die 10 ml 0,1 M Natriumeitrat und 0,5 ml 0,1 M Zitronensäure enthält bis auf 7,4.

Reinigung des Fibrinogens

Das nicht-fixierte Technetium und die eventuellen Abbauprodukte werden durch Hindurchleiten durch eine Amicon-Zelle, Modell 12, mit einer Membran vom Typ XM lOOA eliminiert

Endkontrolle der Lösung des markierten
Fibrinogens

Vor der Injektion wird das erhaltene Endprodukt getestet, um die Sterilität und die Abwesenheit von pyrogenen Materialien zu gewährleisten.

Beispiel 2
Reduktion des Pertechnetats

Man verfährt wie in Beispiel 1, wobei man unter einer Stickstoffatmosphäre arbeitet.

Konditionierung des Fibrinogens

Man löst 1 g lyophilisiertes Fibrinogen in Gegenwart von Natriumsalzen in 100 ml sterilem und pyrogenfreiem Wasser. Man unterteilt das gelöste Fibrinogen in aliquote Anteile zu 2 ml, die man bei -20⁰C in Fläschchen aufbewahrt

Erfindungsgemäße Markierung

2 ml Fibrinogen werden unter Stickstoff und bei Umgebungstemperatur 15 Minuten lang mit der das reduzierte Technetium enthaltenden Lösung gerührt. Man senkt anschließend den pH-Wert der gebildeten Mischung durch Zugabe der erforderlichen Menge einer 10 ml 0,1 M Natriumcitrat und 0,5 ml 0,1 M Zitronensäure enthaltenden Lösung von einem Anfangswert von 9,6 auf 7,4, stets unter einer Stickstoffatmosphäre.

Abtrennung der kolloidalen Teilchen und/oder

Niederschläge, die während der Senkung

des pH-Wertes der Mischung auftreten

Endkontrolle der Lösung des markierten
Fibrinogens

Entwicklung der Untersuchungen ist in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

Tabelle
1. Gruppe von drei Ratten + Freund-Adjuvans

μθί Tc^O₄-

J Tage

3 6 9 12
μΟ Fibrinogen-Tc^99m

17

21

25

Die eventuellen Kolloide und das ausgefallene Zinn werden durch Durchlaufenlassen der Mischung durch ein Milliporen-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,22 Γημ abgetrennt.

Erfindungsgemäße Reinigung des Fibrinogens
Man verfährt wie in Beispiel 1.

35

Vor der Injektion testet man das Endprodukt, um die Sterilität und die Abwesenheit von pyrogenem Material zu gewährleisten.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zum Markieren der Immunoglobuline (IgG, IgA, IgM) mittels Technetium. Wie bereits oben angegeben, wurde die Markierung von Fibrinogen und der Immunoglobuline entwickelt für die spezifische Diagnostik und die Früherkennung einer bestimmten Anzahl von Erkrankungen, wie z. B. der rheumatoiden Polyarthritis, der Gefäßthrombosen und der malignen Tumoren, insbesondere der Tumoren der Leber und des Gehirns. Diese Methode erlaubt den Nachweis von Erkrankungen der Organe durch Sichtbarmachung mittels einer y-Szintillationskamera.

Nachfolgend ist ein Vergleichsversuch beschrieben, welcher die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens (99^m Tc-Fibrinogen) gegenüber dem Verfahren, in dem 99¹¹¹TcO₄- verwendet wird, der Isotopenindikator (Tracer), wie er üblicherweise für die Diagnose von Gelenkentzündungserkrankungen bei rheumatoider Arthritis mit dem Freund-Adjuvans bei der Ratte angewendet wird.

Es ist bekannt, daß das histologische Krankheitsbild der rheumatoiden Arthritis durch eine vorzeitige Ablagerung von Fibrin auf der Synovialmembran charakterisiert ist, um die herum sich Zellelemente anreichern, die zur Bildung des Pannus führen. In verschiedenen Entwicklungsstadien der Arthritis nach fas der Injektion des Adjuvans wird eine gleiche Menge des einen oder des anderen dieser beiden Isotopenindikatoren (Tracer) zwei Gruppen von Ratten injiziert. Die

2. Kontinuierliche Aufzeichnung der Radioaktivität innerhalb von 30 oder 60 Minuten.

3. Auswahl der interessierenden Zonen.

4. Berechnung der Aktivitätsverhältnisse:

a) vollständige Pfote/vollständiger Körper

b) aktive Zone/vollständige Pfote

c) aktive Zone/inaktive Zone

5. Vergleich dieser Verhältnisse nach 5 Minuten und nach 30 Minuten.

6. Statistische Methode: »fin Paaren«.

Die Analyse der Ergebnisse, so wie sie insbesondere aus den F i g. 3 und 4 der Zeichnungen ersichtlich sind, erlaubt die folgenden Schlußfolgerungen:

a) Die Verteilung des 99^m TcO₄ und des 99^m Tc-Fibrinogens in den erkrankten Gelenken ist vollkommen verschieden: homogen für das 99^m TcO₄-, wie aus der F i g. 3 der Zeichnungen ersichtlich, worin eine einzige Hyperfixierungszone des Technetium 99^m in der Pfote und in dem Schwanz der Ratte erkennbar ist und heterogen für 99™ Tc-Fibrinogen, wie aus der F i g. 4 ersichtlich, woraus zwei gut unterscheidbare Hyperfixierungszonen in der Pfote und eine starke Fixierung in dem Schwanz hervorgehen. Dieser Unterschied ist in erster Linie auf das verschiedene Verhalten dieser beiden Isotopenindikatoren (Tracer) zurückzuführen.
Die Anreicherung des 99^m TcO₄ - in einem erkrankten Gelenk ist das Ergebnis, das mit zwei Mechanismen zusammenhängt:
In einer ersten Phase ist die Anreicherung proportional zu dem Grad der Entzündung (intravasculärer Mechanismus), in einer zweiten Phase diffundiert der auf den Blutproteinen fixierte Isotopenindikator (Tracer) in die umgebenden Gewebe (extravasculärer Mechanismus).
Das Tc 99^m-Fibronogen diffundiert nicht in die umgebenden Gewebe. Sein Grad der Fixierung ist proportional zu der auf der erreichten Synovialmembran abgelagerten Fibrinmenge.

b) Der Vergleich des Verhältnisses (erkrankte Zone)/ (nicht-erkrankte Zone) nach 5 Minuten und nach 30 oder 60 Minuten zeigt für das 99"¹TcO₄- eine Abnahme dieses Verhältnisses mit dem Ablauf der Zeit, dagegen eine Zunahme dieses Verhältnisses für das 99^m Tc-Fibrinogen.

Die statistische Methode »iin Paaren« ist äußerst signifikant:

Δ R* bei f=5 Minuten und 30 Minuten

99"¹TcO₄-

99^m Tc-Fibrinogen

ρ < 0,001

0,Kp<0,05

c)' Die Anreicherung des 99"¹TcO₄- ist das Ergebnis eines Gefäßerweiterungsprozesses im Rahmen

einer nicht-spezifischen Entzündung, während das 99™ Tc-Fibrinogen eine Fixierungsspezifilät aufweist, die an die Anwesenheit einer Fibrinablagerung auf der Synovialmembran gebunden ist.
d) Das 99^m Tc-Fibrinogen erlaubt als Isotopenindikator (Tracer) die Frühdiagnose und spezifische

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Diagnose von rheumatoiden Arthritis (Arthritis deformans).

e) Das 99^m Tc-Fibrinogen erlaubt andererseits eine objektive Beurteilung der Entwicklungstendenz der Erkrankung.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

I. Verfahren zum Herstellen von mittels Technetium 99^m markierten Proteinen, bei dem Pertechnetat reduziert und das reduzierte Pertechnetat mit mindestens einem der Proteine aus der Gruppe Fibrinogen und der Immunoglobuline in Berührung gebracht wird, um eine Markierung dieses Proteins zu erzielen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reduktion des Pertechnetats in Gegenwart von Zinn(II)-chlorid bei einem pH-Wert zwischen 11 und 12 durchführt und daß man die dabei erhaltene Mischung, die das mit Technetium markierte Protein enthält, einer Reinigung unterwirft, welche die Eliminierung eventueller Abbauprodukte dieses Proteins sowie des nichtfixierten Technetiums erlaubt

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reduktion des Pertechnetats bei einem pH-Wert in der Größenordnung von 11,6 durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung darin besteht, daß man die Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 100 000 von dem Protein abtrennt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung darin besteht, daß man die Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 300 000 von der Mischung abtrennt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung darin besteht, daß man zuerst das freie Technetium und das an Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 100 000 gebundene Technetium und anschließend die Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 300 000 eliminie.t.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüehe 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung eine geeignete Membran passieren läßt, die den Durchgang der von der Mischung abzutrennenden Substanzen erlaubt.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüehe 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das in physiologischem Serum enthaltende Pertechnetat durch Zugabe einer Lösung von Essigsäure und Zinn(II)-chlorid als Reduktionsmittel und anschließende Zugabe einer Alkalibase, um den pH-Wert auf den gewünschten Wert zu bringen, reduziert.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein injizierbares Fibrinogen menschlichen Ursprungs verwendet.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein mit Alkalisalzen assoziiertes lyophilisiertes Fibrinogen verwendet, dieses Fibrinogen in Wasser löst, diese Fibrinogenlösung dialysiert, um die Alkalisalze zu entfernen, und die das Fibrinogen und das reduzierte Pertechnetat enthaltende Mischung auf einen pH-Wert zwischen 7 und 8 bringt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung auf einen pH-Wert in der Größenordnung von 7,4 bringt.

II. Verfahren nach Anspruch 9 und/oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Mischung durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von Natriumeitrat und Zitronensäure auf den gewünschten Wert bringt

12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man mit Alkalisalzen assoziiertes lyophilisiertes Fibrinogen verwendet, dieses Fibrinogen in Wasser löst und die das Fibrinogen und das reduzierte Pertechnetat enthaltende Mischung auf einen pH-Wert zwischen 7 und 8 bringt

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung auf einen pH-Wert in der Größenordnung von 7,4 bringt

14. Verfahren nach Anspruch 12 und/oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Mischung durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von Natriumeitrat und Zitronensäure auf den gewünschten Wert bringt

15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der angegebenen Reinigung die kolloidalen Substanzen und/oder Niederschläge, die gegebenenfalls während der Absenkung des pH-Wertes der Mischung auftreten, abtrennt

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet daß man die Mischung durch ein geeignetes Filter laufen läßt, welches die von der Mischung abzutrennenden Substanzen zurückhält.

17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Markierung von Fibrinogen unter einer Stickstoffatmosphäre durchführt