" Procédé de marquage de protéines à l'aide du technétium ".
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réduction de pertechnétate et la mise en contact du pertechnétate réduit avec au moins une des protéines choisies dans
le groupe comprenant le fibrinogène et les immunoglobines, pour provoquer le marquage de cette protéine.
Différentes techniques de marquage du fibrinogène ont été publiées dans la littérature. Ces données se réfè-
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soit à l'I <1>25
Parmi ces procédés de marquage, existent la méthode électrolytique, la méthode enzymatique, la méthode à la chloramine-T et la méthode au monochlorure d'iode. Ces techniques présentent un certain nombre d'inconvénients qui, d'une part, sont dus à l'utilisation soit de radioisotopes à demi-vie trop longue, soit de radioisotopes à demi-vie qui ne convient pas pour le marquage des protéines et, d'autre part, soit à une énergie non compatible avec les moyens de visualisation existant actuellement sur le marché et à un degré d'irradiation trop important soit à un bruit de fond trop important qui empêche la mise en évidence de thromboses situées dans la région pelvienne.
C'est principalement pour ces raisons que l'on utilise plus volontiers actuellement des procédés de marquage au
99m technétium, le 99m technétium présentant les avantages majeurs suivants : la facilité d'obtention, une demi-vie courte, un émetteur gamma pur dont le rayonnement a une énergie qui permet la visualisation avec les appareils courants et enfin un degré d'irradiation minimal.
Toutefois les procédés de marquage utilisés jusqu'à présent sont essentiellement basés sur des techniques de marquage électrolytique . Bien que la littérature fasse mention
<EMI ID=4.1> par voie chimique, en présence d'agents réducteurs tels que le chlorure stanneux ou l'acide ironascorbique, il ressort de celle-ci que les résultats qui ont été obtenus n'ont jamais été très satisfaisants étant donné que ces agents provoquent généralement une diminution de la solubilité du pertechnétate réduit, qui peut entraver le marquage de la protéine. En ce
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lisant la réduction du pertechnétate par voie électrolytique, bien que ne présentant pas d'après la littérature les inconvénients précités des procédés de marquage chimique connus jusqu'à présent et permettant souvent d'obtenir un marquage assez sélectif de la protéine, elles imposent l'utilisation d'un matériel compliqué et coûteux, l'électrolyse se faisant généralement au moyen d'électrodes de zirconium.
Or, on a constaté, suivant l'invention, d'une façon totalement surprenante, que sous certaines conditions les pro-
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nétium en présence d'agents réducteuis peuvent se révéler extrêmement intéressants par rapport aux procédés de marquage connus, plus particulièrement par rapport aux procédés de marquage par électrolyse, tant sur le plan de la sélectivité du marquage que du rendement et de la stabilité de celui-ci.
Le but de la présente invention est de présenter un procédé économique qui permet d'obtenir une solution injectable d'une protéine du groupe susdit marquée à l'aide du 99m technétium permettant à la fois de profiter pleinement des propriétés très intéressantes du technétium en tant que traceur isotopique et d'obtenir une sélectivité et une stabilité du marquage ainsi qu'une efficacité de liaison du technétium à la protéine supérieures à celles obtenues avec les procé-
dés de marquage connus jusqu'à présent.
A cet effet, suivant l'invention,-on réalise la réduction du pertechnétate en présence d'un agent réducteur à un pH compris entre 11 et 12 et on soumet le mélange contenant la protéine précitée marquée à l'aide de technétium
obtenu par la mise en contact du technétium réduit et de la protéine en cause, à une purification permettant l'élimination de produits de dégradation éventuels de cette protéine
ainsi que de technétium non fixé.
Avantageusement, la purification consiste à éliminer
de cette protéine les substances ayant un poids moléculaire inférieur à 100.000.
Suivant une forme de réalisation particulièrement avantageuse, on réalise la réduction du pertechnétate à un pH
de l'ordre de 11,6.
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nétate, contenu dans du sérum physiologique, est réduit par l'addition d'une solution d'acide acétique et de chlorure stan- neux comme agent réducteur suivie de l'addition d'une base
pour amener le PH à la valeur voulue.
L'invention concerne également une solution injecta-
ble contenant au moins une protéine choisie dans le groupe formé par le fibrinogène et les immunoglobulines, marquée à l'aide
du 99 technétium, obtenue suivant le procédé décrit ci-dessus.
D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre d'exemple non limitatif, de quelques formes de réalisation avantageuses du procédé suivant l'invention.
La figure 1 représente un graphique obtenu par chromatographie montrant en abscisse les différentes fractions <EMI ID=8.1>
nétium et en ordonnée la radioactivité desdites fractions.
La figure 2 représente un graphique obtenu par chromatographie montrant en abscisse les différentes fractions obtenues d'une solution contenant du fibrinogène marqué au
99m technétium et en ordonnée la densité optique desdites fractions. La figure 3 représente l'image aggrandie sortie d'une imprimante électro-statique montrant les zones de radioactivité correspondant à la fixation du 99m technétiumpertechnétate sur les zones atteintes d'arthrite rhumatoïde de la queue et de la patte d'un rat , 19 jours après l'in- <EMI ID=9.1>
Tc 04 .
La figure 4 représente l'image aggrandie sortie d'une imprimante électro-statique montrant les zones de radioactivité correspondant à la fixation du 99m technétium-fibrinogène,sur les zones atteintes d'arthrite rhumatoïde de la
queue et de la patte d'un rat, 19 jours après l'injection
de la même dose d'adjuvant de Freund que celle utilisée pour l'obtention de l'image représentée à la-figure 3, et de Le procédé, suivant l'invention, vise la préparation d'une solution injectable de fibrinogène ou d'immunoglobulines marquée à l'aide du 99m technétium, comme traceur isotopique.
Ce complexe radioisotopique est particulièrement utile dans le radiodiagnostic spécifique et précoce d'affections inflammatoires du tissu conjonctif telles que la polyarthrite rhumatoïde entre autres, les thromboses vasculaires et les tumeurs malignes, en particulier celle du foie et du cerveau.
On utilise avantageusement du fibrinogène lyophilisé d'origine humaine injectable aux humains et dont la fraction coagulable s'élève à 90 % environ. De plus , ce fibrinogène est stérile et est libre d'antigène australien et de pyrogène. Il est conservé sous une forme lyophilisée en présence de sels sodiques.
Le traceur isotopique utilisé est de préférence le
99m Tc pertechnétate (NaTc04) stérile et apyrogène.
Avant d'être mis en contact avec la protéine à marquer, en l'occurence le fibrinogène, le pertechnétate est réduit. Il est, en effet, généralement établi que le
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ment réduit au stade + 4 ou + 5 avant de se fixer sur une molécule quelconque.
Le choix du pH est très important à cet égard et, suivant l'invention, on travaille à un pH de l'ordre de 11
à 12, de préférence de 11,6.
Il est absolument indispensable de maintenir le
pH dans cette gamme. En effet, si l'on s'en écarte, on a constaté, d'une façon surprenante, que l'efficacité de liaison du technétium réduit à la protéine diminue sensiblement.
On utilise comme agent réducteur de préférence le chlorure stanneux. Le technétium réduit se fixerait alors, lorsqu'il est mis en contact avec le fibrinogène, sur les groupements tyrosyles de la molécule de celui-ci.
Le fibrinogène lyophilisé est dissous dans de l'eau stérile et apyrogène et est ensuite soumis à une dialyse
pour séparer les sels sodiques susdits.
Dans un stade suivant, le pertechnétate réduit est mis en contact intense, par exemple par agitation, avec le fibrinogène en solution, de manière à provoquer le marquage
de celui-ci.
Le mélange comprenant le fibrinogène en solution
et le pertechnétate réduit ainsi obtenu est ensuite amené à
un pH compris entre 7 et 8, de préférence par l'addition
d'une solution aqueuse de citrate de sodium et d'acide citrique. Un pH de l'ordre de 7,4 convient parfaitement.
Il est également possible de procéder au marquage
du fibrinogène lyophilisé sans passer par la dialyse susdite. On procède ensuite comme ci-dessus, en amenant le mélange comprenant le fibrinogène en solution et le pertechnétate ré-duit-à un pH compris entre 7 et 8, de préférence à pH 7,4, par exemple également par l'addition d'une solution aqueuse de citrate de sodium et d'acide citrique. A cet effet, suivant l'invention, on notera que la réduction du pertechnétate, la mise en contact du pertechnétate réduit avec le fibrinogène en solution et l'abaissement du pH du mélange entre 7 et 8 se font de préférence sous une atmosphère d'azote. En effet, l'azote prend la place de l'oxygène atmosphérique et empêche toute oxydation ou réoxydation des constituants en présence, notamment du pertechnétate réduit.
Suivant l'invention, on soumet le mélange ainsi obtenu, contenant la protéine marquée à l'aide de technétium,
à une purification pour éliminer des produits de dégradation éventuels de cette protéine ainsi que du technétium non fixé sur cette dernière..
Cette purification consiste de préférence à séparer de cette protéine marquée les substances ayant un poids moléculaire inférieur à 100.000 et éventuellement inférieur à
300.000 en faisant passer ledit mélange sur une membrane appropriée retenant les substances ayant un poids moléculaire supérieur à ceux donnés ci-dessus.
Par exemple, pour retenir les substances à poids moléculaire supérieur à 100.000 on utilise avantageusement une cellule Amicon modèle 12 avec une membrane du type XM 100 A.
Avantageusement, par une première purification, on élimine le technétium libre et le technétium lié aux molécules dont le poids moléculaire est inférieur à 100.000 et, par une deuxième purification subséquente, on élimine toutes les molécules dont le poids moléculaire est inférieur à 300.000.
Dans certains cas, par exemple lorsqu'on procède au marquage du fibrinogène lyophilisé sans passer par la dialyse,
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par exemple, les particules d'étain précipitées, apparaissant au cours de l'abaissement du pH du mélange contenant le fibrinogène en solution et le pertechnétate réduit. On utilisera, par exemple, pour retenir ces particules, un filtre
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Les différentes techniques de contrôle, comme la chromatographie sur colonne et l'immunoélectrophorèse ont permis d'établir que la méthode de purification garantit une élimination de la majorité des produits de dégradation et du technétium libre. Dans la solution finale, il a été constaté, sui
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sur une molécule de fibrinogène et ceci d'une manière très reproductible, alors que les deux purifications successives permettent, pour certains cas particuliers, d'obtenir une solution de fibrinogène marquée à l'aide de technétium dans laquelle la quantité de technétium fixée sur une molécule de fibrinogène est au moins de 98 %.
On notera, à cet égard, qu'avec les procédés de marquage connus jusqu'à présent, ainsi qu'on l'a déjà mentionné précedemment, on ne peut obtenir de marquage avec un rendement aussi élevé, les rendements obtenus se situant aux alentours de 55 à 70 %.
Les deux graphiques susdits permettent d'apprécier l'efficacité du procédé de purification suivant l'invention
et de constater que le produit marqué est bien le fibrinogène et ceci d'une manière très sélective.
Les deux exemples concrets donnés ci-après permet- <EMI ID=15.1>
Exemple 1.
- réduction du pertechnétate.
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gique sont réduits grâce à l'addition, d'une part, d'un ml d'une solution aqueuse de 100 ml contenant 20 lamdas d'acide
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0,3 ml de NaOH 0,1 N pour amener le pH à 11,6.
- Conditionnement du fibrinogène.
On dissout lg de fibrinogène lyophilisé dans 100 ml d'eau stérile et apyrogène. On dialyse le fibrinogène en solution pendant 18 heures à 4[deg.]C dans des sacs à dialyse du type Visking 1-8/32" contre une solution de NaCl 0,6 %.
On divise le fibrinogène en solution en parties aliquotes de 2 ml qu'on conserve en flacons à -20[deg.]C.
- Marquage proprement dit.
2 ml de fibrinogène sont agités pendant 15 minutes et à température ambiante avec la solution contenant le technétium réduit.
On abaisse ensuite le pH du mélange ainsi obtenu jusqu'à 7,4, par addition de la quantité nécessaire d'une solution tampon
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citrique 0,1 M.
- Purification du fibrinogène.
Le technétium non fixé et les produits éventuels de dégradation sont éliminés par passage sur cellule Amicon modèle 12 avec une membrane du type XM 100 A.
- Contrôle final de la solution de fibrinogène marqué. Avant l'injection, le produit final obtenu est testé pour vérifier la stérilité et l'absence de pyrogène.
EXEMPLE 2.
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- Réduction du pertechnétate.
On procède comme dans l'exemple 1, en travaillant sous une atmosphère d'azote.
- Conditionnement du fibrinogène.
On dissout lg de fibrinogène lyophilisé en présence de sels sodiques dans 100 ml d'eau stérile et apyrogène. On divise le fibrinogène en solution en parties aliquotes de 2 ml qu'on conserve en flacons à -20[deg.]C.
- Marquage proprement dit.
2 ml de fibrinogène sont agités sous azote pendant 15 minutes et à température ambiante avec la solution contenant le technétium réduit.
On abaisse ensuite le pH du mélange ainsi formé d'une valeur initiale de 9,6 jusqu'à 7,4, par addition de la quantité nécessaire d'une solution contenant 10 ml de citrate de sodium 0,1 M et 0,5 ml d'acide citrique 0,1 M, toujours sous une atmosphère d'azote.
- Séparation des particules colloïdales et/ou précipitées, apparaissant au cours de l'abaissement du pH du mélange.
Les colloïdes éventuels et l'étain précipité sont séparés par
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- Purification proprement dite du fibrinogène.
On procède comme dans l'exemple 1.
- Contrôle final de la solution de fibrinogène marquée. Avant l'injection, on teste également le produit final pour vérifier la stérilité et l'absence de pyrogène.
De la même façon, le procédé suivant l'invention est applicable pour marquer les immunoglobulines (IgG, IgA, IgM) à l'aide de technétium. Comme déjà signalé ci-dessus, le marquage du fibrinogène et des immunoglobines a été.conçu dans le but du diagnostic -spécifique et précoce d'un certain nombre d'affections comme la polyarthrite rhumatoïde, les thromboses vasculaires et les tumeurs malignes , en particulier les tumeurs du foies et du cerveau.
Cette technique permet la mise en évidence des lésions au niveau des organes par la visualisation à l'aide de la gamma-caméra à scintillation.
On trouvera, ci-après,une étude comparative mettant en évidence les avantages du procédé de la présente invention
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fections articulaires inflammatoires, dans l'arthrite rhumatoide à l'adjuvant de Freund chez le rat.
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gique de l'arthrite rhumatoide est caractérisé par un dépôt précoce de fibrine sur la membrane synoviale autour duquel s'accumulent des éléments cellulaires conduisant à la formation du Pannus.
A divers stade d'évolution de l'arthrite après injection de.l'adjuvant,une même quantité de l'un ou l'autre de ces deux traceurs a été injectée à 2 groupes de rats.
Le développement des investigations est présenté dans le tableau ci-après :
TABLEAU
1. Lots de 3 rats + adjuvant de Freund
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y
2. Enregistrement en continu de la radioactivité pendant 30 ou 60 minutes.
3. Choix des zones d'intérêt.
4. Calcul des rapports d'activité :
a. patte entière / corps entier
b. zone active / patte entière
c. zone active / zone inactive
5. Comparaison de ces rapports après 5 minutes et 30 minutes.
6. Méthode statistique :"t par paires".
L'analyse des résultats, ainsi qu'on peut le voir plus particulièrement aux figures 3 et 4 des dessins annexés' a permis de tirer les conclusions suivantes : <EMI ID=24.1> figure 3 des dessins annexés, où l'on constate une seule m zone d'hyperfixation du 99 technétium au niveau de la patte et de la queue du rat, et hétérogène pour le 99 Tc-fibrinogène, ainsi qu'on peut le voir à la figure 4, où l'on constate deux zones d'hyperfixation bien distinctes au niveau de la patte, et une intense fixation ai niveau de la queue-
Cette différence est due principalement au comportement différent de ces 2 traceurs.
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tion malade est le résultat conjugué de deux mécanismes :
- Dans une première phase,l'accumulation est proportionnelle au degré d'inflammation (mécanisme intravasculaire)
- Dans une seconde phase, le traceur fixé sur des pro-téines sanguines diffuse dans les tissus environnants (mécanisme extravasculaire).
Le Tc 99 -fibrinogène ne diffuse pas dans les tissus environnants. Son degré de fixation est proportionnel à la quantité de fibrine déposée sur la membrane synoviale atteinte.
b) La comparaison du rapport zone malade après zone non malade
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Tc 0 - une diminution de ce rapport au. cours du
du temps et, par contre, une augmentation de ce rap-
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La méthode statistique "t par paires" est hautement significative :
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d'un processus de vaso-dilatation dans le cadre d'une inflammation non spécifique, tandis que le
99mTc-fibrinogène a une spécificité de fixation liée à la présence d'un dépôt de fibrine sur la membrane synoviale.
d) Le 99mTc-fibrinogène en tant que traceur isotopique permet le diagnostic précoce et spécifique de l'arthrite rhumatoide. e) Le 99mTc-fibrinogène permet d'autre part une ap-' préciation objective de la tendance évolutive de la maladie.
Il est bien entendu que l'invention n'est pas limitée aux formes de réalisation décrites et que bien des variantes pourraient être envisagées sans sortir du cadre du présent brevet.
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REVENDICATIONS
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technétium, comprenant la réduction de pertechnétate et la mise en contact du pertechnétate réduit avec au moins une des protéines choisies dans le groupe comprenant le fibrinogène et les immunoglobulines, pour provoquer le marquage de cette protéine, ce procédé étant caractérisé en ce qu'on réalise
la réduction du pertechnétate en présence d'un agent réducteur à un pH compris entre 11 et 12 et en ce qu'on soumet le mélange ainsi obtenu contenant cette protéine marquée à l'aide de technétium à une purification permettant l'élimination de produits de dégradation éventuels de cette protéine ainsi que le technétium non fixé.