DE2621311A1 - Verfahren zum markieren von proteinen mit technetium 99 hoch m - Google Patents
Verfahren zum markieren von proteinen mit technetium 99 hoch mInfo
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Description
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Jean Abramovici,
127, avenue du Pesage, Ixelles, Belgien
Andre-Marie Ermans,
2, avenue de la Foret, Ixelles, Belgien
2, avenue de la Foret, Ixelles, Belgien
Omer Jeghers,
95A, rue Fechereux, Neufchäteau, Belgien
A. GRÜNECKER H. KlNKELDEY W. STÖCKMAIR
DR-ING. - Α*Ξ ,CALf CCH»
K. SCHUMANN
DR REa Ι·*ΑΤ - DtPL-PHYS
P. H. JAKOB
G. BEZOLD
oa FiER Nat - αρι_-α«ω
MÜNCHEN
8 MÜNCHEN 22
13. Kai 1976 P 10 4-09-60/co
°
Verfahren zua Markieren von Proteinen mit Technetium 99
Verfahren zua Markieren von Proteinen mit Technetium 99
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine injizierbare Lösung zum Markieren'von. Proteinen mittels Technetium 99 ?
dem man Pertechnetat reduziert und das reduzierte Pertechnetat mit mindestens einem der Proteine aus der Gruppe Fibrinogen
und der Immunoglobuline in Berührung bringt, um dieses Protein zu markieren. '
In der Literatur sind bereits verschiedene Verfahr en · zum Markieren
von Fibrinogen beschrieben. Diese Angaben beziehen sich
■121
insbesondere auf die Markierung von Fibrinogen mit Jod J y
125
oder J . Zu diesen bekannten Verfahren gehören das elektrolytische
Verfahren, das enzymatische Verfahren, das Chloramin-T-Verfahren
und das Jodmonochlorid-Verfahren. Diese Verfahren haben bestimmte Nachteile, die einerseits auf die Verwendung
von Radioisotopen mit einer zu langen Halbwertszeit oder von Radioisotopen mit einer für die Markierung von Proteinen
nicht geeigneten Halbwe?tszeit und andererseits auf eine mit den
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derzeit auf dem. Markt vorhandene Einrichtungen zum Sichtbarmachen
nicht verträgliche Energie und auf eine zu starke Irradiation oder auf ein zu starkes Untergrundgeräusch, welcacc
den nachweis von Thrombosen im Beckenbereich verhindert, zurückzuführen sind.
Hauptsächlich aus diesen Gründen wendet nan heute lieber Verfahren
zum Markieren mit Technetium 99Π an, wobei das Technetium
99^ die folgenden Hauptvorteile bietet: es ist leicht
erhältlich, hat weine kurze Halbwertszeit, ist ein reiner ^"-Strahler, dessen Strahlung eine Energie, welche die Sichtbarmachung
mit gängigen Apparaturen erlaubt und einen minimalen Irradiationsgrad aufweist.
Die bisher angewendeten Markierung3verfahren basieren jedoch
im wesentlichen auf den Methoden der elektrolytischen Markierung. Obgleich in der Literatur auch die Anwendung von
Karkierungsverfahren mit Technetium 99m auf chemischem Wege
in Gegenwart von Reduktionsmitteln, wie Zinn(Il)chlorid oder Komplexe von Ascorbinsäure mit Eisen, erxrähnt sind, geht daraus
hervor, daß die Ergebnisse, die damit erzielt wurden, niemals sehr zufriedenstellend waren, weil diese Agentien im allgemeinen
zu einer Verminderung der Löslichkeit des reduzierten Pertechnetats führen, welche die Markierung des Proteins verhindern kann.
γη
Was die Markierungsverfahren mit Technetium 99" anbetrifft,
in denen die Reduktion von Pertechnetat auf elektrolytischem Wege angewendet wird, so machen sie, obgleich sie nach den
Angaben in der Literatur die oben genannten !Nachteile der bisher
bekannten chemischen Markierungsverfahren nicht aufweisen
und häufig die Erzielung einer ziemlich selektiven Markierung des Proteins erlauben, die Verwendung eines komplizierten
und kostspieligen Materials erforderlich, da die Elektrolyse im allgeaeinen mit Zirkoniumelektroden durchgeführt wird.
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Es wurde nun sehr überraschend erfindungsgemäß festgestellt, daß die Verfahren zur Markierung von Proteinen auf chemischem
Wege mit Technetium 99m in Gegenwart von Reduktionsmitteln
unter bestimmten Bedingungen außerordentlich vorteilhaft sein können gegenüber den bekannten Markierungsverfahren, insbesondere
gegenüber den elektrolytischen Markierungsverfahren, sowohl was die Selektivität der Markierung als auch
was die Ausbeute und die Stabilität derselben anlangt.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein wirtschaftliches
Verfahren anzugeben, welches die herstellung einer injizierbaren Lösung eines Proteins der oben genannten Gruppe
erlaubt, das mittels Technetium 99m markiert ist, welches
erlaubt, sowohl die sehr vorteilhaften Eigenschaften des. Technetiumsals Isotopenindikator (Tracer) vollständig auszunutzen
als auch eine Selektivität und Stabilität der Markierung sowie eine Wirksamkeit der Bindung des Technetiums an das
Protein zu erzielen, die besser sind als diejenigen, die mit den bisher bekannten Markierungsverfahren erzielbar waren.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Markieren von
Proteinen mittels Technetium 99m ? "bei dem man Pertechnetat
reduziert und das reduzierte Pertechnetat mit mindestens einem der Proteine aus der Gruppe Fibrinogen und der Immunoglobuline
in Berührung bringt, um eine Markierung des Proteins zu erzielen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die !Reduktion
des Pertechnetats in Gegenwart eines Reduktionsmittels bei einem pH-Wert zwischen 11 und 12 durchführt und daß man die
dabei erhaltene Mischung, die das mit Technetium markierte Protein enthält, einer Reinigung unterwirft, welche die Eliminierung
eventueller Abbauprodukte dieses Proteins sowie des nicht-fixierten Technetiums erlaubt.
Erfindungsgemäß wird die Reduktion des Pertechnetats in Gegenwart
eines Reduktionsmittels bei einem pH-Wert zwischen 11 und
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12 durchgeführt und die dabei erhaltene Mischung, die das
mit Technetium markierte oben genannte Protein enthält, das durch Inberührungbringen des reduzierten Technetiums mit dem
Protein hergestellt worden ist, wird einer Reinigung unterworfen, welche die Eliminierung der gegebenenfalls vorhandenen Abbauprodukte
dieses Proteins sowie des nicht-fixierten Technetiums erlaubt.
Zweckmäßig besteht die Reinigung darin, daß man aus diesen
Protein die Substanzen eliminiert (entfernt), die ein Molekulargewicht von weniger als 100 000 aufweisen. Gemäß einer
besonders vorteilhaften Ausführungsform wird die Reduktion des Pertechnetats bei einem pH-Wert in der Größenordnung von
11,6 durchgeführt. Gemäß einer bevorzugten Ausf ührungsform
wird das in physiologischem Serum enthaltene Pertechnetat durch Zugabe einer Lösung von Essigsäure und Zinn(II)chlorid
als Reduktionsmittel und anschließende Zugabe einer Base, um den pH-Y/ert auf den gewünschten Wert einzustellen, reduziert.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine ingiz.ierbare Lösung,
die mindestens ein Protein aus der Gruppe Fibrinogen und der Immunoglobuline enthält, das mittels Technetium 99m markiert
ist und nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
Weitere Vorteile, Merkmale und Einzelheiten der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung von einigen beispielhaften
vorteilhaften Ausführungsformen des erfindungs gemäß en Verfahrens
unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen hervor. Dabei zeigen:
Fig. 1 ein Diagramm, das durch Chromatographie erhalten wurde, welches auf der Abszisse die verschiedenen Fraktionen
einer mit Technetium 99m markiertes Fibrinogen enthaltenden
Lösung und auf der Ordinate die Radiokaktivität dieser Fraktionen zeigt;
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Fig. 2 ein Diagramm, das durch Chromatographie erhalten wurde, welches auf der Abszisse die erhaltenen verschiedenen
Fraktionen einer mit Technetium 99m markiertes
Fibrinogen enthaltenden Lösung und auf der Ordinate die optische Dichte dieser Fraktionen angibt;
Fig. 3 das vergrößerte Bild einer elektrostatischen Darstellung, welche die Radioaktivitäts-zonen zeigt, die der Fixierung
des Technetium 99m-Pertechnetats in den 19 Tage
nach der Injektion des Freund-Adjuvans und von 500 η
Oi von 99m TcO^" erreichten Zonen der rheumatoiden
Arthritis des Schwanzes und der Pfote einer Ratte entsprechen;
Fig. 4- ein vergrößertes Bild einer elektrostatischen Darstellung,
welche die Radioaktivitätszonen zeigt, die der Fixierung des Technetium 99m-Fibrinogens in den 19
Tage nach der Injektion der gleichen Dosis des Freund-Adjuvans
wie sie für die Erzeugung des in der Fig. 3 dargestellten Bildes verwendet worden ist, und von
η Ci von 99m Tc-Fibrinogen erreichten Zonen der rheumatoiden
. Arthritis des Schwanzes und der Pfote einer Ratte entsprechen.
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Herstellung einer
injizierbaren Lösung von Fibrinogen oder Immunoglobulinen, die mittels Technetium 99m markiert worden sind, als Isotopenindikator
(Tracer). Dieses komplexe Radioisotop eignet sich besonders gut in der spezifischen Radiodiagnostik und zur FrüherkennunTvon
inflammatorischen Erkrankungen des Bindegewebes, wie z.B. unter anderem der rheumatoiden_ Polyarthritis, der
Gefäßfchrombosen und von malignen Tumoren, insbesondere solchen
der Leber und des Gehirns. Unter "rheumatoider-; Polyarthritis
oder Arthritis" ist auch "Arthritis deformans" zu verstehen,
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Zweckmäßig verwendet man lyophilisiertes Fibrinogen menschlichen
Ursprungs, das Menschen injiziert werden kann und dessen koagulierbare Fraktion sich auf etwa 90 % beläuft.
Darüber hinaus ist dieses Fibrinogen steril und frei von dem Australien-Antigen und Fieber erzeugenden Stoffen. Es
wird in lyophilisierter Form in Gegenwart von Natriumsalzen (basischen Salzen) aufbewahrt.
Bei dem verwendeten Isotopenindikator (Tracer) handelt es sich vorzugsweise um steriles und apyrogenes 99 Tc-Pertechnetat
(HaTcO^). Bevor das Pertechnetat mit dem zu markierenden Protein, z.B. Fibrinogen, in Berührung gebracht wird, wird es
reduziert. Es ist nämlich allgemein bekannt, daß das in Form von 99 TcO^,"" erhaltene 99m Tc vorher zu dem Oxydationszustand
4-+ oder 5+ reduziert werden muß, bevor es sich an irgendein Molekül bindet.
Die Auswahl des pH-Wertes ist diesbezüglich sehr wichtig und erf indungsgemäß arbeitet man bei einem pH-Wert in der Größenordnung
von 11 bis 12, vorzugsweise bei 11,6. Es ist absolut unerläßlich, den pH-Wert innerhalb dieses Bereiches zu halten.
Wenn man sich nämlich davon entfernt, so wurde festgestellt, daß überraschenderweise sich die Wirksamkeit der Bindung des
reduzierten Technetiums an das Protein deutlich vermindert. Als Reduktionsmittel verwendet man vorzugsweise Zinndichlorid.
Das reduzierte Technetium bindet sich dann, wenn es mit dem Fibrinogen in Berührung gebracht wird, an die Tyrosylgruppen
des Fibrinogenmoleküls.
Das lyophilisierte Fibrinogen wird in sterilem und pyrogenfreiem
V/asser gelöst und anschließend einer Dialyse unterworfen, um die oben genannten Uatriumsalze abzutrennen. In einer darauffolgenden
Stufe wird das reduzierte Pertechnetat, beispielsweise durch Rühren, mit dem gelösten Fibrinogen in intensiven
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Kontakt gebracht, um die Markierung des Fibrinogens zu bewirken.
Die auf diese Weise erhaltene Mischung, die das gelöste Fibrinogen, und das reduzierte Pertechnetat enthält,
wird anschließend vorzugsweise durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von Natriumeitrat und Zitronensäure auf einen pH-Wert
zwischen 7 und 8 gebracht. Ein pH-Wert in der Größenordnung von 7»4- ist besonders geeignet.
Es ist auch möglich, eine Markierung des lyophilisierten Fibrinogens
ohne Durchführung der oben genannten Dialyse zu erzielen. Man geht dabei wie oben angegeben vor, wobei man die
das gelöste Fibrinogen und das reduzierte Pertechnetat enthaltende Mischung auf einen pH-Wert zwischen 7 und 8, vorzugsweise
auf 7»4->
bringt, beispielsweise ebenfalls durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von Natriumcitrat und Zitronensäure.
Zu diesem Zweck werden erf indungsgemäß die Reduktion des Pertechnetats,
das inberiihrungbringen des reduzierten Pertechnetats
mit dem gelösten Fibrinogen und die Senkung des pH-Wertes der Mischung auf einen Wert zwischen 7 und 8 vorzugsweise
unter einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Der Stickstoff
nimmt nämlich die Stelle des atmosphärischen Sauerstoffs ein und verhindert jede Oxydation oder Rückoxydation der Bestandteile
in Gegenwart insbesondere des reduzierten Pertechnetat s.
Erfindungsgemäß, unterwirft man die so erhaltene Mischung,
die mit Technetium markiertes Protein enthält, einer Reinigung, um eventuelle Abbauprodukte dieses Proteins sowie das an
letzterem nicht-fixierte Technetium zu eliminieren· Diese Reinigung besteht vorzugsweise darin, daß man von dem markierten
Protein die Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 100 000 und gegebenenfalls weniger als 300 000
abtrennt, indem man die Mischung durch eine geeignete Membran
schickt, welche die Substanzen mit einem Molekulargewicht ober-
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halb der oben angegebenen Y/erte zurückhält. So verwendet man beispielsweise zum Zurückhalten der Substanzen mit einem Molekulargewicht
von mehr als 100 000 zweckmäßig eine Amicon-Zelle, Modell 12, mit einer Membran vom Typ ZM 100A.
Durch eine erste Reinigung eliminiert man zweckmäßig das freie Technetium und das an Moleküle, deren Molekulargewicht unterhalb
100 000 liegt, gebundene Technetium und durch eine darauffolgende zweite Reinigung eliminiert man alle Moleküle, deren
Molekulargewicht unterhalb 300 000 liegt. In bestimmten Fällen, beispielsweise dann, wenn man die Markierung des lyophilisierten
Fibrinogens ohne Durchführung der Dialyse durchführt, ist es zweckmäßig, vor der oben genannten Reinigung die kolloidalen
Teilchen und/oder Niederschläge, wie z.B. die Teilchen von ausgefallenem Zinn, die \vährend der Senkung des pH-17ertes
der das gelöste Fibrinogen und das reduzierte Pertechnetat enthaltenden Mischung auftreten, abzutrennen. Zum Zurückhalten
dieser Teilchen verwendet man beispielsweise ein Milliporen-Filter
mit einem Porendurchmesser von 0,22 m.
Durch verschiedene Eontrollverfahren, wie z.B. die Säulenchromatographie
und die Immuno elektrophorese, ist es möglich,
festzustellen, daß das Reinigungsverfahren eine Eliminierung der Mehrzahl der Abbauprodukte und des freien Technetiums
garantiert. Es wurde festgestellt, daß in der erfindungsgemäßen
Endlösung das Technetium 99111 zn. etwa 9° % an einem Fibrinogen-Molekül
fixiert ist und das auf eine sehr reproduzierbare V/eise, während die beiden aufeinanderfolgenden Reinigungen in
bestimmten Sonderfällen die Herstellung einer Lösung von mit Technetium markiertem Fibrinogen erlauben, in der die Menge
des an einem Fibrinogenmolekül fixierten Technetiums mindestens 98 % beträgt.
Diesbezüglich sei festgestellt, daß mit den bisher bekannten Markierungsverfahren, wie bereits weiter oben angegeben, eine
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Markierung mit einer ebenso hohen Ausbeute nicht erzielt werden kann, da die dabei erzielbaren Ausbeuten in der
Größenordnung von 55 bis 70 % liegen.
Die beiden beiliegenden Diagramme zeigen die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Seinigungsverfahrens und erlauben die
Peststellung, daß es sich bei dem markierten Produkt um das fibrinogen handelt ,,und das auf eine sehr selektive Weise.
Die beiden folgenden Beispiele, in denen bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung beschrieben sind, dienen der weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens, es sei
jedoch darauf hingewiesen, daß die Erfindung keineswegs darauf beschränkt ist.
Reduktion de^s Pertechnetats
10 ίαOi Pertechnetat, enthalten in 2 ml physiologischem Serum,
werden durch Zugabe von 1 ml einer wäßrigen Lösung, die auf 100 ml 20 jiL 96 %ige Essigsäure und 10 mg SnGl2.2HgO enthält,
einerseits und von 0,5 ml 0,1 n UaOH, um den pH-Wert auf 11,6 zu bringen, andererseits reduziert.
Konditionierung des Fibrinogens
•HW *— —m »_>
·«» «μ. m~^ M .m M η* _» __ „ β«, r
Man löst 1 g lyophilisiertes Fibrinogen in 100 ml sterilem
und pyrogenfreiem Wasser. Man dialysiert das gelöste"Fibrinogen 18 Stunden lang bei 4°C in Dialysesäcken vom Typ
Visking 1-8/52" gegen eine 0,6 %ige ITaC1-Lösung. Han teilt
das gelöste Fibrinogen in aliquote Anteile zu 2 ml auf, die man bei -20°C in Fläschchen aufbewahrt.
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Marki_erun3_naeh der Erfindung
2 ml Fibrinogen werden 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur
mit der das reduzierte Rechnet ium enthaltenden Lösung gerührt. Anschließend senkt man den pH-Wert der dabei erhaltenen
Mischung durch Zugabe der erforderlichen Menge einer Pufferlösung, die 10 ml 0,1 M Natriumcitrat und 0,5 ml 0,1 M
Zitronensäure enthält, bis auf 7Λ·
Reinigung dej3 ^i
Das nicht-fixierte Technetium und die eventuellen Abbauprodukte
werden durch Hindurchleiten durch eine Amicon-Zelle, Modell 12, mit einer Membran vom 5yp XM 100A eliminiert.
Endkontr£ll_e__d_er__Lösung des; marki.ert£n__51ibrinog_ens_
Vor der Injektion wird das erhaltene Endprodukt getestet, um die Sterilität und die Abwesenheit von pyrogenen Materialien
zu gewährleisten.
Reduktion dejs Pertjichne_tats
Man verfährt wie in Beispiel 1, wobei man unter einer Stickst
off atmosphäre arbeitet.
Kondit_ionie_rung des; Pi
Man löst 1 g lyophilisiertes Fibrinogen in Gegenwart von
Natriumsalzen in 100 ml sterilem und pyrogenfreiem Wasser.
Man unterteilt das gelöste Fibrinogen in aliquote Anteile zu 2 ml, die man bei -200C in Fläschchen aufbewahrt.
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Erfindungsgemäße_Marki£rung
2 ml Fibrinogen werden unter Stickstoff und bei Umgebungstemperatur
15 Minuten lang mit der das reduzierte Technetium enthaltenden Lösung gerührt. Man senkt anschließend den pH-Wert
der gebildeten Mischung durch Zugabe der erforderlichen Menge einer 10 ml 0,1 M Natriumcitrat und 0,5 ml 0,1 M Zitronensäure
enthaltenden Lösung von einem Anfangswert von 9*6 auf 7»4·»
stets unter einer Stickstoffatmosphäre.
Abtrennung der kolloidalen Teilchen und/oder Niederschläge, die während der Senkung des £H-Wertejs der Mi_schung__auftreten
Die eventuellen Kolloide und das ausgefallene Zinn werden durch
Durchlaufenlassen der Mischung durch ein Milliporen-Filter mit
einem Porendurchmesser von 0,22 mn abgetrennt.
Man verfährt wie in Beispiel 1.
Endkontr£lle_der__L£Sung des! markiertjen_51i.brinog_ens_
Endkontr£lle_der__L£Sung des! markiertjen_51i.brinog_ens_
Vor der Injektion testet man das Endprodukt, um die Sterilität und die Abwesenheit von pyrogenem Material zu gewährleisten.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zum Markieren
der Immunoglobuline (IgG, IgA, IgM) mittels Technetium. Wie bereits
oben angegeben, wurde die Markierung von Fibrinogen und der !Immunoglobuline entwickelt für die spezifische Diagnostik und
die Früherkennung einer bestimmten Anzahl von Erkrankungen, wie z.B. der rheumat oiden Polyarthritis, der Gefäßthrombosen
und der maglignen Tumoren, insbesondere der Tumoren der Leber
und des Gehirns. Diese Methode erlaubt den Nachweis von Erkran-
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kungen der Organe durch Sichtbarmachung mittels einer f-Szintillationskamera.
Nachfolgend ist ein Vergleichsversuch beschrieben, welcher die
Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens (99 Tc-Fibrinogen)
gegenüber dem Verfahren, in den 99m TcO^" verwendet wird, der
Isotopenindikator (Tracer), wie er üblicherweise für die Diagnose von Gelenkentzündungserkrankungen bei rheumatoiäer Arthritis
mit dem Freund-Adjuvans bei der Ratte angewendet «vird.
Es ist bekannt, daß das histologische Krankheitsbild der rheumatoiden
- Arthritis durch eine vorzeitige Ablagerung von Fibrin auf der Svnovialmembran charakterisiert ist, um die herum
sich Zellelemente anreichern, die zur Bildung des Pannus führen. In verschiedenen Entwicklungsstadnen der Arthritis
nach der Injektion des Adjuvans wird eine gleiche Menge des einen oder des anderen dieser beiden Isotopenindikatoren
(Tracer) zwei Gruppen von Ratten injiziert. Die Entwicklung der Untersuchungen ist in der nachfolgenden Tabelle angegeben:
1. Gruppe von drei Ratten + ITreund-Adjuvans
500 μΟΙ Tc"mO, -
J 1 1 \ s \ >
f ι Tage
0 3 6 9 12 15 17 21
Fibrinogen-Tc"m
2. Kontinuierliche Aufzeichnung der Radioaktivität innerhalb
von 30 oder 60 Minuten.
3. Auswahl der interessierenden Zonen.
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— \ j —
4-. Berechn';r:g der Akfcivitätsverhältnisse:
a) vollständige Pfote/vollständiger Körper
b) aktive Zone/vollständige Pfote
c) aktive Zone/inaktive Zone
5. Vergleich dieser Verhältnisse nach 5 Minuten und nach
30 Minuten.
6. Statistische Methode: "t in Paaren"»
Die Analyse der Ergebnisse, so wie sie insbesondere aus den Fig. 3 und 4- der beiliegenden Zeichnungen ersichtlich sind,
erlaubt die folgenden Schlußfolgerungen:
a) Die Verteilung des 99m TcO^" und des 99mTc-Fibrinogens in
den erkrankten Gelenken ist vollkommen verschieden: homogen für das99mTc0^~, wie aus der Fig. 3 der beiliegenden Zeichnungen
ersichtlich, worin eine einsige Hyperfixierungszone des Technetium
99m in der Pfote und in dem Schwanz -der Ratte erkennbar ist,
und heterogen für 99m Tc-Fibrinogen, wie aus der Fig. 4· ersichtlich
, woraus zwei gut unterscheidbare Hyperfixierungszonen
in der Pfote und eine starke Fixierung in dem Schwanz hervorgehen. Dieser Unterschied ist in erster Linie auf das
verschiedene Verhalten dieser beiden Isotopenindikatoren (Tracer) zurückzuführen.
TTl m*m
Die Anreicherung des 99 TcCL in einem erkrankten Gelenk ist
das Ergebnis,,das mit zwei Mechanismen zusammenhängt:
in einer ersten Phase ist die Anreicherung proportional zu dem Grad der Entzündung (intravasculärer Mechanismus),
in einer zweiten Phase diffundiert der auf den Blutproteinen fixierte Isotopenindikator (Tracer) in die umgebenden Gewebe
(extravasculärer Mechanismus).
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Das Tc 991^-Fi or ono gen diffundiert nicht in die umgebenden
Gewebe. Sein Grad der Fixierung ist proprotional zu der auf der erreichten Synovialmembran abgelagerten Fibrinmenge.
b)Der Vergleich des Verhältnisses (erkrankte Zone)/(nieht-erkrankte
Zone) nach 5 Minuten und nach 30 oder 60 Minuten zeigt für das 99 TcO^ eine Abnahme dieses Verhältnisses mit
dem Ablauf der Zeit, dagegen eine Zunahme dieses Verhältnisses für das 99mTc-Fibrinogen.
Die statistische Methode "t in Paaren" ist äußerst signifikant:
04~ 99mTc-Fibrinogen
0,001 0,1< ρ < 0,05
c) Die Anreicherung des 99mTc0^ ist das Ergebnis eines GefäßerweiterungspxOsesses
im Rahmen einer nicht-spezifischen Entzündung, während das 99mTc-Fibrinogen eine Fixierungsspezifität
aufweist, die an die Anwesenheit einer Fibrinablagerung auf der Synovialmembran gebunden ist.
d) Das 99m!c-Fibrinogen erlaubt als Isotopenindikator (Tracer)
die Frühdiagnose und spezifische Diagnose von rheuaatoiden
Arthritis (Arthritis deformans).
e) Das 99 Tc-Fibrinogen erlaubt andererseits eine objektive
Beurteilung der Entwicklungstendenz der Erkrankung.
Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte
Ausführungsforiaen näher erläutert, es ist Jedoch für den
Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sonlern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert
und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.
Patentansprüche;
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Claims (18)
1. Verfahren zum Markieren von Proteinen mittels Technetium
99m, bei dem Pertechnetat reduziert und das reduzierte Pertechnetat
mit mindestens einem der Proteine aus der Gruppe Fibrinogen und der Immunoglobuline in Berührung gebracht
wird, um eine Markierung dieses Proteins zu erzielen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reduktion des Pertechnetats in
Gegenwart eines Reduktionsmittels bei einem pH-Wert zwischen 11 und 12 durchführt und daß man die dabei erhaltene Mischung,
die das mit Technetium markierte Protein enthält, einer Reinigung unterwirft, welche die Eliminierung eventueller Abbau-
produkte dieses Proteins sowie des nicht-flxierten Technetiums
erlaubt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet-, daß man die Reduktion des Pertechnetats bei einem pH-Wert in der
Größenordnung von 11,6 durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung darin besteht, daß man die Substanzen
mit einem Molekulargewicht von weniger als 100 000 von dem Protein abtrennt.
4-. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Reinigung darin besteht, daß man die Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 300 000 von der
Mischung abtrennt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Reinigung darin besteht, daß man zuerst das freie Technetium und das an Moleküle mit einem Molekulargewicht
von weniger als 100 000 gebundene Technetium und an-
■6 09847/1013
schließend die Moleküle mit' einem. Molekulargewicht von weniger
als 300000 eliminiert.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 3 "bis 55
dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung eine geeignete Membran passieren läßt, die den Durchgang der von der Mischung
abzutrennenden Substanzen erlaubt.
7· Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das in physiologischem Serum
enthaltende Pertechnetat durch Zugabe einer Lösung von Essigsäure und Zinn(II)chlorid als Reduktionsmittel und anschließende
Zugabe einer Alkalibase, um den pH—Wert auf den gewünschten
Wert zu bringen, reduziert.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7?
dadurch gekennzeichnet, daß man ein injizierbares Fibrinogen menschlichen Ursprungs verwendet.
9· Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein mit Alkalisalzen assoziiertes lyophilisiertes Fibrinogen verwendet, dieses Fibrinogen
in Wasser löst, diese Fibrinogenlosung dialysiert, um die Alkalisalze
zu entfernen, und die das Fibrinogen und das reduzierte Pertechnetat enthaltende Mischung auf einen pH-Wert zwischen
7 und 8 bringt.
10. Verfahren nach Anspruch 95 dadurch gekennzeichnet, daß
man die Mischung auf einen pH-V/ert in der Größenordnung von 7,4- bringt.
11. Verfahren nach Anspruch 9 und/oder 10, dadurch gekennzeichnet,
daß man den pH-Wert der Mischung durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von ITatriumcitrat und Zitronensäure auf den
ge-vvünschten Wert bringt.
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12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 "bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß man mit Alkalisalzen assoziiertes lyophilisiertes Fibrinogen verwendet, dieses "Fibrinogen in
Wasser löst und die das !Fibrinogen und das reduzierte Pertechnetat
enthaltende Mischung auf einen pH-Wert zwischen 7 und 8 bringt.
13. Verfahren nach Anspruch 12; dadurch gekennzeichnet, daß
man die Mischung auf einen pH-Wert in der Größenordnung von 7,4- bringt.
14-. Verfahren nach Anspruch 12 und/oder 13, dadurch gekennzeichnet,
daß man den pH-Wert der Mischung durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von ITatriumcitrat und Zitronensäure auf den
gewünschten Wert bringt.
15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 14-,
dadurch gekennzeichnet, daß man vor der angegebenen Reinigung die kolloidalen Substanzen und/oder Niederschläge, die gegebenenfalls
während der Absenkung des pH-Wertes der Mischung auftreten, abtrennt.
16. Verfahren nach Anspruch 155 dadurch gekennzeichnet, daß
man die Mischung durch ein geeignetes Filter laufen läßt, welches die von der Mischung abzutrennenden Substanzen zurückhält.
17. Verfahren nach mindestens einera der Ansprüche 12 bis
16, dadurch ge?£ennzelehnet, daß man die Markierung von
Fibrinogen unter einer Stickstoffatmosphäre durchführt.
18. Injizierbare Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß sie
mindestens ein Protein aus der Gruppe Fibrinogen und der
Immunoglobuline enthält, das mittels Technetium 99*'1 markiert
und nach dem Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 hergestellt worden ist.
609847/1013
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