DD297064A5

DD297064A5 - Reagens zum nachweis der fibrinolytischen aktivitaet

Info

Publication number: DD297064A5
Application number: DD90343498A
Authority: DD
Inventors: Johan Selmer; Niels Tromholt
Original assignee: ��@��@�a�k��
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1990-08-16
Publication date: 1992-01-02
Also published as: ATE92770T1; IL95407A0; JPH04507254A; FI920669A0; DE69002769D1; IL95407A; IE902977A1; DK0487594T3; EP0487594A1; NO920624D0; CA2065147A1; ES2058931T3; IE65525B1; NO920624L; EP0487594B1; DK408289D0; KR920703120A; NZ234937A; AU6285990A; CZ404790A3

Abstract

Ein diagnostisches Reagens zum in-vivo-Nachweis eines erhoehten Ausstoszes eines fibrinolytischen Enzyms bzw. einer erhoehten fibrinolytischen Aktivitaet im menschlichen oder tierischen Koerper, das einen mit einem fibrinolytischen Enzym reagierenden Antikoerper bzw. ein Fragment dieses Antikoerpers enthaelt, der (das) mit einer Substanz markiert ist, die einen in-vivo-Nachweis der Bindung des Antikoerpers an das fibrinolytische Enzym ermoeglicht. In einer Ausfuehrungsform erfolgt ein erhoehter Abbau des Antikoerpers durch eine anschlieszende Verabreichung des fibrinolytischen Enzyms, mit dem der Antikoerper reagiert. Das fibrinolytische Enzym ist vorzugsweise t-PA.

Description

Hierzu 20 Seiten Zeichnungen

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft sowohl ein diagnostisches Reagens zum Nachweis eines verstärkten Ausstoßes eines fibrinolytischen Enzyms bzw. einer verstärkten fibrinolytischen Aktivität als auch die Verwendung dieses Reagens in einem Verfahren zum In-vivo-Nachweis eines derartigen Enzyms einer derartigen Aktivität.

Ausgangssituation der Erfindung

Die Entwicklung eines Thrombus ist ein sehr komplexer Prozeß. In Kurzfassung, die Anlagerung von Blutplättchen an die vaskuläre Oberfläche löst die ganze Koagulationskaskade aus und führt schließlich zur Ansammlung von mit Fibrin überzogenen Blutplättchen. Wahrscheinlich läßt die fortlaufende Fibrinablagerung innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach dem Beginn des Prozesses nach, nachdem sich entweder der Thrombus schon gebildet hat, d. h. schließlich durch fibröses Gewebe ersetzt wurde, das aus glatten Muskelzellen oder Fibroblasten besteht, oder die Fibrinolyse stattfindet. Im letzteren Falle wird vom Endothelium ein Gewebeplasminogenaktivator abgesondert, um das Fibrin am Thrombus zu binden, wo er als Katalysator für die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin wirkt. Der Thrombus kann sich dann im Ergebnis der Fibrinolyse zersetzen. Durch die Entwicklung neuer thromoblytischer Mittel (wie beispielsweise Gewebeplasminogenaktivator oder Streptokinase) wurden schnelle und zuverlässige Methoden zur Diagnose der Thrombose erforderlich, da diese Mittel innerhalb von 4 bis β Stunden der Thrombusbildung am wirksamsten sind (TIMI-Studiengiuppe, N.Engl. J.Med.312,1985, S.932 bis 936). Bisher traten noch keine biochemischen Parameter in Erscheinung, die bei der Lösung dieses Problems hilfreich sein könnten (G.E.Austin, Arch.Path.Lab.Med.111,1987,S.1158 bis 1162).

Es wurden szintigraphische Verfahren für die Diagnose der Thrombose vorgeschlagen. Anfänglich beruhten die für die Diagnose entwickelten Reagenzien auf radioaktiv markierten Blutbestandteilen (z.B. Fibrinogen oder Blutplättchen), damit diese Bestandteile in die sich bildenden Thromben mit aufgenommen werden (Übersicht dieser Methoden, siehe K. A. Krohn und L. C. Knight, „Radiopharmaceuticals for Thrombosis Detection: Selection, Preparation and Critical Evaluation" Seminars in Nuclear Medicine, Band VII, HeH 3, JuIi 1977, S. 219 bis 228). Es wird auch von einigen Nachteilen des Einsatzes von markiertem Fibrinogen bzw. markierten Blutplättchen berichtet (für radioaktiv markierte Blutplättchen weisen A. M. Peters et al., British Medical Journal 293,13.Dezember 1986, S. 1525, kurz darauf hin, daß die Herstellung von markierten Blutplättchen zeitaufwendig ist und eine beachtliche technische Erfahrung erfordert, weswegen der Einsatz noch nicht so weitverbreitet ist); wobei einer der schwerwiegendsten Nachteile der ist, daß die Ansammlung der Reagenzien in Thromben, die älter als 24 Stunden sind, anscheinend unzureichend ist, um einen szintigraphischen Nachweis zu ermöglichen (z. B. es wurde kurz darauf eingegangen durch J. H. Paulsma-De Waal et al., NucCompact 18,1987, S. 284 bis 286).

In jüngster Zeit wurden Versuche unternommen, radioaktiv markierte Antikörper gegen eine Vielzahl von Blutbestandteilen als Reagenzien für die Diagnose von ι nrombose einzusetzen. Eine beachtliche Anzahl von Veröffentlichungen geht auf den Einsatz von monoklonalen oder polyklonalen Antifibrin-Antikörpern ein, die mit verschiedenen radioaktiven Isotopen markiert waren, von denen ln-111,1-131 bzw. Tc-99 m die für die Diagnose speziell der tiefen, venösen Thrombose die am häufigsten verwendeten Isotopewaren.

So beschreiben beispielsweise S. F. Rosebrough et al., Radiology 156,1985, S. 515 bis 517, den Einsatz von mit 1-131 markierten Antifibrin-Antikörpern für die bildliche Darstellung venöser Thromben, die in Hunden erzeugt wurden. S. F. Rosebrough et al., Radiology 162,1987, S. 575 bis 577, beschreiben den Einsatz von mit 1-131 markierten monoklonalen Antikörpern, die für das Fibrin von Mensch und Hund spezifisch sind, für die bildliche Darstellung von reifen Thromben, und sie berichten von der erfolgreichen bildlichen Darstellung von tiefen, venösen Hundethi umben, die 1,3 und 5 Tage alt waren. In ähnlicher Weise beschreiben L.C. Knight et al., J. Nucl. Med.29,1988, S. 494 bis 502, den Einsatz von mit ln-111 markierten monoklonalen Antifibrin-Antikörpern für die bildliche Darstellung vaskulärer Thromben in einem Tierversuch (Kaninchen und Hund) und berichten von der Darstellung von bis zu 4 Tagen alten Thromben bei fünf von acht Kaninchen und von 0,5 bis 24 Stunden alten Thromben bei sechs von acht Hunden. Aus all diesen Untersuchungen wurde geschlußfolgert, daß, auf der Grundlage dieser Feststellungen, markierte monoklonale Antifibrin-Antikörper für die bildliche Darstellung von Thromben bei menschlichen Patienten auch sinnvoll sein könnten.

Diagnostische Untersuchungen einer tiefen venösen Thrombose in Menschen mittels radioaktiv markierter monoklonaler Antifibrin-Antikörper wurden beispielsweise von M. Jung et al., Eur. J. Nucl. Med. 14 (5-6), 1988, S. 280 bis 283; H. J. Aronen et al., Eur. J. Nucl. Med. 14 (5-6), 1983, S. 288 bis 290, und F. De Geeter et al., Eur. J. Nucl. Med. 14 (5-6), 1988, S. 284 bis 287, beschrieben. Jung et al. schlufolgern, daß die szintigraphische Analyse bei der Diagnose einer ausgebildeten, tiefen venösen Thrombose in der Wade, Kniekehlenvene und des Oberschenkels sinnvoll ist, wenn die Thromben nicht älter als 10 Tage sind. Aronen et al. berichten von falschen positiven Ergebnissen der szintigraphischen Analyse und schlußfolgern, daß eine Bestätigung eines positiven Ergebnisses mit Hilfe der Venographie notwendig ist. De Geeter et al. sehen die Antif ibrin-Szintigraphie als eine vielversprechende Alternative zur Kontrastvenographie an. Antifibrin-Antikörper haben den Vorteil, daß sich ihre Antigenstelle

im thrombotischen Bereich befindet. Antlfibrin-Antikörper haben aber auch eine hohe Halbwertszeit im Kreislauf und folglich gibt es eine hohe Hintergrundaktivität. Das grenzt den Einsatz von Antifibrin-Antikörpern auf Situationen ein, bei denen kein Notstand vorliegt (vgl. Z. Oster und P.Som, American Journal of Radiology 152, Februar 1989, S. 253 bis 260, die auch bemerken, daß markiert? Antifibrin-Antikörper für den Nachweis reifer, tiefer venöser Thromben besonders gut geeignet sein können). Andere Veröffentlichungen offenbaren den Einsatz von radioaktiv markierten monoklonalen Antiplättchen-Antikörpern für die Diagnose der Thrombose aus. So beschreiben Peters et al., British Medical Journal 293,1986, S. 1525 bis 1527, den Einsatz eines mit In-111 markierten monoklonalen Antiplättchen-Antikorpers bei der bildlichen Darstellung tiefer venöser Thromben in Patienten und folgern daraus, daß Antikörper eher für die bildliche Darstellung frischer als reifer Thromben geeignet sind, da eine Blutpjättchenhaftung an der Thrombusoberfläche stattfinden muß, um bei der bildlichen Darstellung ein positives Ergebnis zu erhalten. Sie schlagen auch den Einsatz von Antikörpern für die bildliche Darstellung der renalen Allograftabstoßung, der Blutplättchenaufnahme an prothetischen Arterienflächen und von arteriellen und intrakardialen Thromben vor. A. W. J. Stuttle et al., Eur.J.Nucl.Med. 14 (5-6), 1988, S. 122 bis 125, berichten über den Einsatzeines monoklonalen Antiplättchen-Antikörperfragments zur bildlichen Darstellung tiefer venöser Thromben. In gleicher Weise beschreiben P. Som et al., J.Nucl. Med.27,1986, S. 1315 bis 1320, den Einsatz von monoklonalen, mit Tc-99m markierten Antiplättchen-Antikörperfragmenten zur bildlichen Darstellung experimentell induzierter Thromben in Hunden. Sie folgern, daß die Antikörperfragmente zum In-vivo-Nachweis von Thromben im Thorax ohne Blutpoolsubstraktion eingesetzt und für den Nachweis intrakoronärer Thromben verwendet werden können. Sie weisen ferner darauf hin, daß die Markierung der Antikörperfragmente einfacher als die der Blutplättchen ist.

Z. H. Oster und P. Som, American Journal of Radiology 152, Februar 1989, S. 253 bis 260, diskutieren die Eigenschaften von markierten Antiplättchen-Antikörperfragmenten im Vergleich zu den markierten Antifibrin-Antikörpern zum Zwecke der Thrombusdarstellung. Im Vergleich zu den Antifibrin-Antikörpern, die, wie bereits oben erwähnt, eine lange Halbwertszeit haben, besitzen Antiplättchen-Antikörper den Vorteil einer schnellen Blutreinigung. Ihre antigene Stelle befindet sich auf den zirkulierenden Blutplättchen, und gibt diesen somit die Möglichkeit, in den sich entwickelnden Thrombus in einer frühen Stufe mit aufgenommen zu werden, wobei das Zielwert/Blut-Verhältnis erhöht wird (d.h. das Verhältnis zwischen der Aktivität an der thrombotischen Stelle und der Hintergrundaktivität Im Blut). Andererseits erschwert die Verbindung der Antiplättchen-Antikörper mit den zirkulierenden Blutkörperchen die Sichtbarmachung der Thromben, die älter als 24 Stunden sind. Auch die Verwendung radioaktiv markierter fibrinolytischer Enzyme (z. B. Gewebeplasminogenaktivator U-PA), Urokinase, Streptokinase bzw. Vorstufen davon (beispielsweise Plasminogen) sowohl zum Nachweis von Thromben als auch für die Lokalisierung bösartiger Tumore (bei t-PA) wurde zum Zwecke ihrer Affinität zu Fibrin odei anderen Thrombenbestandteilen hin untersucht. So beschreiben J-H. Paulsma-De Waal et al., op.cit, die Untersuchung von Tc-markiertem t-PA als Reagens für den Nachweis von Thrombosen. Sie schlußfolgern, daß systematisch injiziertes, radioaktiv markiertes t-PA keine sinnvollen Ergebnisse ergibt (d.h. Aktivitätsaufnahme im Thrombus), was wahrscheinlich durch den schnellen Abbau in der Leber erfolgt, wohingegen lokal injiziertes, markiertes t-PA eine deutliche Aktivitätsaufnahme im Thrombus zeigt. Andererseits fanden D. J.Hnatowich et al., Eur.J.Nucl.Med. 13,1987, S.467 bis 472, eine positive bildliche Darstellung von experimentell induzierten Hundethromben mit intravenös injiziertem Rekombinations-t-PA, das an mit ln-111 markierte Diethylentriaminpentaessigsäure gekoppelt war, wobei sie immer noch in der Leber einen schnellen Abbau ihres Reagens feststellten. S.-L. Karonen et al., J. Nucl. Med.29,1988, S. 1194 bis 1199, berichten über die Lokalisierung bösartiger Tumore mit radioaktiv markierten Rekombinations-t-PA und folgerten, daß die Ansammlung des markierten t-PA in bösartigem Gewebe auf den potentiellen Einsatz von markiertem t-PA für den Nachweis von Tumoren hinweist. Eine spätere Untersuchung (S.-L. Karonen et al., Eur. J. Nucl.Med. 14 [5-6], 1988, S.610 bis 611) bestätigten jedoch, daß ein Hauptteil des radioaktiv markierten t-PAs schnell vom Plasma eliminiert wurde. Ein weiterer Nachteil des Einsatzes von radioaktiv markiertem t-PA besteht, wegen dessen Ansammlung in der Leber, darin, daß das Risiko des Auftretens einer zu hohen radioaktiven Dosis es erfordert, die Menge des eingesetzten diagnostischen Reagens zu reduzieren. Abgesehen hiervon muß das markierte t-PA mit dem vom Körper als Reaktion auf die Fibrinablagerung gebildeten t-PA um die Anlagerungsstellen am Thrombus konkurrieren. Markierte Streptokinase und Urokinase wurden auch für die bildliche Thromusdarstellung eingesetzt, wie von K. A.Krohn und L.C. Knight, op.cit., berichtet wurde, die auch einige der Schwierigkeiten aufzählen, die der Anwendung dieser beiden Enzyme innewohnen (siehe S.226), und sie schlußfolgern, daß sie klinisch zur Lokalisierung von Thromben noch nicht nützlich sind. Über den Einsatz von radioaktiv markiertem Plasminogen wurde auch von K. A.Krohn und L.C. Knight, op.cit., berichtet, und sie kommen zu dem Schluß, daß es für die bildliche Darstellung älterer Thromben von potentiellem Wert ist.

Offenbarung der Erfindung

Ungeachtet des Vorhandenseins einer großen Vielfalt von radioaktiv markierten Reagenzien, die für den Nachweis von Thromben vorgeschlagen wurde, wird jedoch angenommen, daß es neu ist, einen Antikörper gegen ein f ibrinolytisches Enyzm zu markieren und den Antikörper für den In-vivo-Nachweis einer verstärkten fibrinolytischen Aktivität zu verwenden. Die bisher mit diesen Reagenzien erhaltenen Forschungsdaten zeigen, daß ihr Einsatz mindestens einige der für bekannte Reagenzien nachgewiesenen Mängel beseitigt.

Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein diagnostisches Reagens für den In-vivo-Nachweis verstärkter Ausscheidung fibrinolytischer Enzyme bzw. einer verstärkten fibrinolytischen Aktivität im menschlichen oder tierischen Körper, wobei das Reagens einen Antikörper bzw. ein Fragment dieses Antikörpers enthält, der (das) mit einem fibrinolytischen Enzym reagiert und mit einer Substanz markiert ist, die den In-vlvo-Nachweis der Bindung des Antikörpers an das fibrinolytische Enzym ermöglicht.

In diesem Zusammenhang ist der Begriff „fibrinolytisches Enzym" als ein Enzym zu verctehen, das entweder als direkter Katalysator des Fibrinabbaus wirkt (z. B. Plasmin) bzw. eine Vorstufe hiervon ist (z. B. Plasminogen) oder als der Katalysator für die Teilung einer Enzymvorstufe in eine fibrinolytisch aktive Form (z. B. t-PA oder Urokinase) fungiert. Bevorzugte fibrinolytische Enzyme sind solche, die eine Affinität zu Fibrin aufweisen, d. h., die sich an das Fibrin selbst oder an einen am Fibrin vorhandenen Bestandteil, beispielsweise t-PA, Plasmin, Plasminogen oder hierzu analoge Stoffe, anheften oder die modifiziert wurden, um

eine Affinität für Fibrin aufzuweisen (beispielsweise modifizierte Urokinase). Der Begriff „analog" kann als Derivat des betreffenden Enzyms definiert werden, das man durch Modifikation der DNA-Sequenz erhält, wobei die Dekodierung in einer Weise erfolgt, die zu einer Addition, Subtraktion, Einfügung oder Auslöschung einer oder mehrerer Aminosäuren der Ausgangskette führt, oder auch als ein homologes Enzym bzw. eines, das mit einem Antikörper reagiert, der gegen das native Emy η angeht oder gerichtet ist. Es ist zu beachten, daß mindestens t-PA verschiedene solcher analogen Stoffe schon beschrieben worden sind.

Die Modifikationen, dio zum Erhalt eine fibrinolytischen Enzyms mit einer Affinität zu Fibrin aus einem Enzym mit geringer FibrinaffinitMt (beispielsweisw native Urokinase) erforderlich sind, können durch DNA-Rekombinationstechniken in der als per se bekannten Weise hergestellt werden. Selbstverständlich findet man in der Natur solche analogen bzw. modifzierten Enzyme nicht im menschlichen oder tierischen Körper, doch sie können einen Teil einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden diagnostischen Methode sein, wobei ein analoges bzw. modifiziertes Fnzym dem Patienten vor oder nach der Verabreichung des markierten Antikörpers gegeben werden kann. Ein Vorteil einer derartigen Methode würde sein, daß der fibrinolytische Enzympegel an d6r Stelle beispielsweise eines Thrombus bzw. an einer anderen Fibrinihlagerungsstelle nahezu nach Belieben erhöht werden könnte, bis es zu einer Erhöhung der Antikörperanlagerung kommt, um die Genauigkeit der Diagnose zu steigern.

Der Ausdruck „erhöhte fibrinolytische Aktivität" soll einen über dem normalen Wert liegenden Fibrinabbauwert anzeigen, wogegen sich der Ausdruck „erhöhte Absonderung eines fibrinolyiiuchen Enzyms" auf die erhöhte Sekretion eines oder mehrerer Enzyme bezieht, die Teil des fibrinolytischen Systems sind, wie z. B. in Verbindung mit einem schwachen ischämischen Zustand, in dem keine Fibrinablagerung und folglich auch keine Fibrinolyse stattfindet.

Der Begriff „Antikörper" bezieht sich auf eine Substanz, die als Reaktion eines Menschen bzw. Tieres oder einer menschlichen bzw. tierischen Zelle auf das Vorhandensein des fibrinolytischen Enzyms (oder eines analogen Stoffs) gebildet wird. Gemäß der konventionellen Praxis kann ein „Fragment des besagten Antikörpers" sowohl ein Fab'-, F(ab'2)₂- oder Fv-Fragment des Antikörpers als auch ein Einzel-Antikörper sein.

Unter physiologischen Bedingungen ist der Zirkulationswert fibrinolytischer Enzyme gering, doch die lokale Konzentration dieser Enzyme ist bei Thrombose wesentlich erhöht, was bedeutet, daß die Antigenstellen für Antikörper gegen eines der in Frage kommenden fibrinolytischen Enzyme fast ausschließlich im thrombotischen Bereich gefunden werden, was zu einem günstigen Zielwert/Blut-Verhältnis führt. Dieses Verhältnis kann durch Verabreichung des fibrinolytischen Enzyms, mit dem der Antikörper vor oder nach der Verabreichung des Antikörpers reagiert, noch verbessert werden. Auf diese Weise ist es möglich, den Pegel des in Frage kommenden fibrinolytischen Enzyms bei älteren thrombotischen Schäden zu erhöhen und nicht gebundene Antikörper gegen fibrinolytische Systeme zu beseitigen, um bei kritischen Untersuchungen die Hintergrundaktivität zu verringern. In einer besonders begünstigten Ausführungsform ist das fibrinolytische Enzym t-PA, das bei Verabreichung schnell über den Kreislauf durch Bindung an einen hepatischen Rezeptor entfernt wird. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß bei Verabreichung von t-PA bzw. eines oben aufgeführten analogen Stoffes an geeigneter Stelle nach der Verabreichung eines Anti-t-PA-Antikörpers der sich ergebende t-PA/Anti-PA-Komplex infolge der Bindung des Komplexes an denselben Rezeptor wie das freie t-PAeine wesentlich kürzere Halbwertszeit in Plasma besitzt als der nicht komplexe Antikörper. Gemäß dieser Ausführungsform bezieht sich die Erfindung folglich auch auf eine diagnostische Zusammensetzung, die aus den folgenden Stoffen in separaten Behältern bestei t:

a) ein mit einem fibrinolytischen Enzym, speziell t-PA, reagierender Antikörper bzw. ein Fragment dieses Antikörpers, der/das mittels einer Substanz markiert wurde, die den In-vlvo-Nachweis der Bindung des Antikörpers an das fibrinolytische Enzym ermöglicht, und

b) ein fibrinolytisches Enzym mit dem der Antikörper, speziell t-PA bzw. ein hierzu analoger Stoff, reagiert.

Ferner bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Methode des In-vivo-Nachweises einer erhöhten Absonderung eines fibrinolytischen Enzyms bzw. einer erhöhten fibrinolytischen Aktivität im menschlichen oder tierischen Körper, die:

a) die Verabreichung einer diagnostisch wirksamen Menge eines mit einem fibrinolytischen Enzym reagierenden Antikörpers bzw. eines Fragments dieses Antikörpers, der (das) mit einer Substanz markiert ist, die den In-vlvo-Nachweis der Bindung des Antikörpers bzw. seines Fragments an das fibrinolytische Enzym ermöglicht, an einen menschlichen bzw. tierischen Patienten und

b) die Lokalisierung eines erhöhten Ausstoßes eines fibrinolytischen Enzyms bzw. einer erhöhten fibrinolytischen Aktivität dem Patienten über die Ermittlung des Vorhandenseins gebundener, markierter Antikörper.

In einer Ausführungsform dieser Methode kann ein, einem fibrinolytischen Enzym analoger Stoff bzw. ein Enzym, das zum Aufzeigen einer Fibrinaffinität modifiziert wurde, dem Patienten vor der Verabreichung des markierten Antikörpers gegeben werden. Wie bereits oben gesagt, kann dies eine höhere Konzentrati η des Enzyms an der Stelle der Fibrinablagerung und somit ein stärkeres szintigraphisches Signal (in Beziehung zur Hintergrunoaktivität) gewährleisten, was eine genauere Zustandsdiagnose ermöglicht. Als Alternative kann das fibrinolytische Enzym bzw. ein hierzu analoger Stoff an geeigneter Stelle nach der Verabreichung des Antikörpers, wie oben aufgeführt, gegeben werden. Somit kann die Verabreichung des fibrinolytischen Enzyms nach einer Zeitspanne stattfinden, die für eine Bindung einer adäquaten Menge des markierten Antikörpers am Ort der erhöhten fibrinolytischen Aktivität und die anschließende Verabreichung des fibrinolytischen Enzyms, das eine schnelle Eliminierung des im Kreislauf verbleibenden Antikörpers und folglich eine geringere Hintergrundaktivität garantiert, ausreicht. Diese Zeitspanne kann entsprechend zwischen 30 Minuten und 24 Stunden betragen. Die Dosis des fibrinolytischen Enzyms liegt normalerweise unter einer therapeutischen Dosis.

Ein weiterer Aspect der Erfindung bezieht sich auf den Einsatz eines Antikörpers, der mit einem fibrinolytischen Enzym bzw. mit einem Fragment dieses Antikörpers reagiert, das mit einer Substanz markiert ist, die den In-vlvo-Nachweis der Bindung des Antikörpers bzw. seines Fragments an das fibrinolytische Enzym ermöglicht, für die Herstellung eines diagnostischen Reagens für den In-vivo-Nachweis einer erhöhten Absonderung eines fibrinolytischen Enzyms bzw. einer erhöhten fibrinolytischen Aktivität im menschlichen oder tierischen Körper. Wie oben bereits dargelegt, wird das fibrinolytische Enzym vorzugsweise aus einer Gruppe ausgewählt, die aus t-PA, Plasmin, Plasminogen bzw. analogen Stoffen hierzu besteht, oder es wird ein modifiziertes fibrinolytisches Enzym mit Fibrinaffinität verwendet.

Ein zur Anhebung der Antikörperwerte für diesen Zweck besonders bevorzugtes fibrinolytisches Enzym ist t-PA bzw. ein hierzu analoger Stoff, insbesondere natives t-PA, da dieses Enzym eine hohe Fibrinaffinität aufweist. Auch ist der t-PA-Gehalt im Blut normalerweise sehr klein, dahingegen aber die t-PA-Konzentration in Verbindung mit pathologischen Prozessen hoch. Die im erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren verwendeten Antikörper sind vorzugsweise monospezifische Antikörper, die nur gegen einen speziellen Bestandteil, in diesem Falle das gewünschte fibrinolytische Enzym, gerichtet sind. Monospezifische Antikörper können sowohl polyklonal als auch monoklonal sein.

Polygonale Antikörper können durch Injektion eines geeigneten Tieres mit einer substantiell reinen Aufbereitung des betreffenden fibrinolytischon Enzyms hergestellt werden (um ihre Monospezif ität zu gewährleisten), gefolgt von einer oder mehreren Boosterinjektionen in geeigneten Intervallen (z.B. von zwei Wochen bis zu einem Monat) bis sechs Monate vor der ersten Blutentnahme. Dann, während der Fortführung dieses Immunisierungsprozesses, wird dem Tier ungefähr eine Woche nach jeder Boosterinjektion Blut entnommen, und die Antikörper werden in der in per se angegebenen Weise aus dem Serum isoliert, wie sie von Harboe und Ingild, Scand. J.lmmun.2 (Ausg. 1), 1973, S. 161-164, beschrieben wurde. Es wird jedoch vorgezogen, in der erfindungsgemäßen Methode monoklonal Antikörper (bzw. deren Fragmente, wie Fab'-, F[ab'|₂- oder Fv-Fragmente) zu verwenden, da dieses eine höhere Spezifität und Genauigkeit der Diagnose gewährleistet. Monoklonal Antikörper kann man mittels gut bekannter Methoden erhalten, wie sie z. B. von L. C. Petersen et al., Thrombosis and Haemostasls 57 (2), 1987, S. 205 bis 211, beschrieben wurden. Es ist darauf hinzuweisen, daß die monoklonalen Antikörper von jeder geeigneten Quelle stammen können, und sie so auch beispielsweise von monoklonalen, von Mäusen oder Menschen stammenden, Antikörpern ausgesucht worden sein können.

Der Antikörper kann auch durch Klonierung einer DNA-Sequenz, die für den Antikörper bzw. eines Fragments von ihm kodiert, in einer geeigneten Zelle erzeugt werden, beispielsweise einer mikrowellen, pflanzlichen, tierischen oder menschlichen Zelle, wobei die Zelle dann Kulturbedingungen ausgesetzt wird, die zur Erzeugung des betreffenden Antikörpers bzw. Fragments führen, und der Antikörper bzw. dessen Fragment dann aus der Kultur rückgewonnen wird. Mögliche Verfahrensweisen für die Herstellung Monierter Antikörper bzw. Antikörperfragmente werden beispielsweise beschrieben von L. Riechmann et al., Nature 332,24. März 1988, S.323ff, die die Herstellung chimärer Antikörper variabler Rattenbereiche und konstanter menschlicher Bereiche erläutern; M. Better et al., Science 240,20. Mai 1988, S. 1041 ff, die die Herstellung chimärer Maus-Mensch-Fab-Fragmente beschreiben; A.Sharra und A. Plückthun, Science 7.40,20.Mai 1988, S. 1038 bis 1040, die die Klonierung eines Immunoglobulin-Fv-Fragments erklären, das antigenbindende, variable Domänen besitzt, und E.S.Ward et al., Nature 341, 12.Oktober 1989, S.544 bis 546, die die Klonierung isolierter, antigenbindender, variabler Domänen (Einzeldomänen-Antikörper") beschreiben.

Ein für den Einsatz als diagnostisches Reagens für den vorliegenden Zweck bevorzugt eingesetzter Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper bzw. ein Fragment davon, der mit natürlichem t-PA oder einem hierzu analogen Stoff (wie oben bereits erläutert) reagiert. Monoklonal Antikörper gegen t-PA wurden schon früher für andere Zwecke beschrieben, siehe zum Beispiel L.C.Peterson et al.,op.cit„ EP 298783, K.Kaltoft et al., Proc.Natl.Acad.Scl.USA79,1982, LS.3720 bis 3723, L.S.Nielsen et al., The EMBO Journal 2,1983, S. 115 bis 119, L.S.Nielsen et al., Biochemistry 21,1962, S.6410 bis 6415, K.Dano et al., J. Hlstochem. Cytochem. 30,1982, S. 1165 bis 1170.

Die im erfindungsgemäßen Reagens verwendeten Antikörper sollten vorzugsweise in substantiell reiner Form eingesetzt werden, um die Diagnosegenauigkeit zu erhöhen.

Die zur Markierung des Antikörpers verwendete Substanz kann geeigneterweise ein radioaktives Isotop sein. Das Isotop hat vorzugsweise eine sinnvoll kurze Halbwertszeit aufzuweisen, damit der Patient, dem das erfindungsgemäße Reagens verabreicht wird, keine zu hohe radioaktive Dosis empfängt. Die radioaktive Gesamtdosis kann auch durch die Wahl eines Antikörpers, der in relativ kurzer Zeit aus dem Körper eliminiert wird, auf ein Minimum verringert werden. Das Isotop kann aus den bereits oben für diesen Zweck vorgeschlagenen, z. B. ln-111, Tc-99 m, 1-131,1-123 oder 1-125, ausgewählt werden. Die Markierung des Antikörpers mit dem Radionuklid kann in der Form ausgeführt werden, wie sie für die radioaktive Markierung von Antikörpern im allgemeinen schon beschrieben wurde, vgl. beispielsweise D. J. Hnatovich et al., Science 220,1983, S. 613 bis 615 (wobei der Antikörper vor der Markierung an Diethylentriaminpentaessigsäure gebunden wird, um eine stabile Bindung des Radionuklids zu erleichtern) oder B.A.Rhodes et al., inTumor Imaging (S. W. Burchiel und B. A. Rhodes publ.), New York, Mason Publishing, S. 111 bis 123 (wobei der Antikörper direkt mit dem Radionuklid inkubiert wurde). Speziell die Markierung mit Tc-99 m kann grundsätzlich wie in EP 169232, EP 271806 oder EP 304780 ausgeführt werden. Dioe von diesen radioaktiven Isotopen ausgestrahlte Radioaktivität kann mit einem Gammazähler oder einer Szintillationskamera in einer per se bekannten Weise gemessen werden.

In alternativer Weise kann die zur Markierung des Antikörpers verwendete Substanz eine für die Bildaufnahme mittels Magnetresonanz verwendbare Substanz sein. Beispiele für geeignete Substanzen sind Magnetitteilchen, die mit dem Antikörper überzogen und für die Bildaufnahme grundsätzlich verwendet werden können, wie von S. Cerdan et al., Magnetic Resonance In Medicine 12,1989, S. 151 bis 163, beschrieben, oder paramagnetische Atome, z. B. C'³ oder Gadolinium (vgl. beispielsweise J.C. Saccavini et al., Invest. Radlol., Ergänzung 1,1988, S. S 292 bis S 293.

Das erfindungsgomäße diagnostische Reagens kann in einer Weisu dargeboten werden, die es für eine parenteral, nasale, enterische oder rektale Verabreichung geeignet macht. So kann das Reagens in beispielsweise einer Injektionsform, Aerosolform, Suspensionsform, Lösungsform, Klistierform usw. vorliegen. Das Reagens kann mit pharmazeutisch akzeptierbaren Trägern bzw. Vehikeln, zum Beispiel physiologischer Salzlösung, gemäß der konventionellen pharmazeutischen Praxis dargbboten werden. Der Dosiswert des Reagens liegt normalerweise im Bereich von 0,1 mg bis 10 mg, vorzugsweise 0,5mg bis 5mg, z.B. ungefähr 1 mg, des markierten Antikörpers.

Es ist zu beachten, daß das erfindungsgemäße diagnostische Reagens auch für die Diagnose eines Zustands geeignet sein kann, der eine lokale Fibrinansammlung beinhaltet, die zu einer örtlich erhöhten fibrinolytischen Aktivität führt. So kann das Reagens bei der Diagnose solcher Zustände hilfreich sein, wie Thrombose (einschließlich tiefer venöser Thrombose, koronärer Thrombose, zerebraler Thrombose, Herzthrombose, muralerThrombose,gastrointestinalerThrombose,arteriellerThrombose), Embolie (einschließlich Lungenembolie), Blutung (einschließlich zerebraler Blutung, postoperativer Blutung, gastrointestinaler Blutung, Hämaturie, Hämoptoe), Magen- oder Zwölffingerdarmgeschwür, Ischämie, Geschwulstbildungen (einschließlich Brustkrebs, Ovarialkrebs, bösartiges Melanom, bzw. Gehirn- oder Knochentumoren), Gefäßentzündung, lokale Infekte, lokale Entzündungen (einschließlich Arthritis) oder Brüche.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen Die Erfindung wird mit folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen weiter boschrieben, wobei

Fig. 1: ein Szintlgramm ist, das die erhöhte Aufnahme des monoklonalen, mit ln-111 markierten Anti-t-PA-Antikörpers (t-PA

moAb) an der Stelle der Blutprobenentnahme in der Unterarmvene zeigt, Fig. 2: und Fig.3 Szintigramme sind, die die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markierten t-PA MoAb an der Stulle einer Arteriotomie in der Oberschenkelvene unmittelbar nach der Injektion des Reagens (Fig. 2) und nach 24 Stunden (Fig. 3)

zeigen, Fig. 4: ein Szintigramm ist, das die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markierten t-PA MoAb an der Stelle einer

gastrointestinalen Blutung im unteren, zentralen Teil des Bauches und Zäkums darstellt, Fig. 5: ein Szintigramm ist, das die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markierten t-PA MoAb in Bereichen der tiefen, venösen

Thrombose am rechten Knie veranschaulicht, Fig. 6: ein Szintigramm ist, das die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markierten t-PA MoAb im muralen Thrombus einer

Aneurysma der Bauchaorta zeigt, Fig. 7: ein Szintigramm ist, das die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markierten t-PA MoAb in einem Bereich der

Lungenembolie darstellt, Fig. 8: ein Szintigramm ist, das die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markierten t-PA MoAb im Bereich der arteriellen Trifurcation des linken Unterschenkels vor bzw. eine Stunde und 40 Stunden nach einer Operation zur Entfernung eines

Embolus in diesem Bereich zeigt, Fig. 9: ein Szintigramm ist, das die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markierten t-PA MoAb im Bereich einer lateralen

Knöchelfraktur veranschaulicht, Fig. 10: ein Szintigramm des abdominalen Bereichs ist, das die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markieerten t-PA MoAb in

einem Thrombus der linken Vene des lleums zeigt, Fig. 11: ein Szintigramm des abdominalen Bereichs ist, das die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markierten t-PA MoAb im

beiderseitigen Ovarienbereich, der Blase und einer Tumormetastase zum transversalen Colon hin veranschaulicht, Fig. 12: ein Szintigramm des hinteren, abdominalen Bereichs ist, das die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markierten t-PA

MoAb in einem periappendiculären Abszeß darstellt, Fig. 13: drei Szintigramme sind, die die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markierten t-PA MoAb entsprechend der

rheumatischen Arthritis des Hand-, rechten Knöchel- und Kniegelenkes zeigen, Fig. 14: ein Szintigramm ist, das die erhöhte Aufnahme des mit ln-111 markierten t-PA MoAb im nasalen Bereich darstellt (die

Nasenschleimhaut zeigt im allgemeinen wie die Prostata und Gonaden eine erhöhte fibrinolytische Aktivität), Fig. 15: ein Diagramm ist, das die Gesamtradioaktivität im Plasma des mit ln-111 markierten t-PA MoAb mit und ohne

anschließender t-PA-lnjektion darstellt, Fig. 16: ein Diagramm ist, das den immunoreaktiven Teil des mit ln-111 markierten t-PA MoAb mit und ohne anschließender

t-PA-lnjektion zeigt, Fig. 17: ein Szintigramm ist, das die organische Verteilung des mit ln-111 markierten t-PA MoAb aliein und im Komplex mit t-PA

in Kaninchen veranschaulicht, Fig. 18: ein Diagramm ist, das die Gesamtradioaktivität im menschlichen Plasma des mit ln-111 markierten t-PA MoAb vor und

nach der t-PA-lnjektion darstellt, Fig. 19: ein Diagramm ist, das die Veränderung der Verteilung des mit ln-111 markierten t-PA MoAb nach der t-PA-lnjektion in

menschlichen Organen darstellt, Fig. 20: zwei Szintigramme des kruralen Bereichs sind, die einerseits die erhöhte Ansammlung des mit ln-111 markierten t-PA MoAb im vaskulären Bett des rechten Beins zeigen (A) und andererseits den fokalen Thrombusbereich nach der t-PA-lnjektion angeben (oberer Teil des rechten Beins) (B).

Die folgenden Beispiele sind nur zur Illustration der vorliegenden Erfindung gedacht und sollen keinesfalls ihren Anwendungsbereich einschränken.

Beispiel¹

Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen t-PA.

Reinigung von t-PA-Antlgenen:

Das zur Immunisierung von Mäusen verwendete t-PA wurde gereinigt, wie von Rijken, D. C. und Collen, D. in J. BIoI. Chem. 256, 1981, S.7035 bis 7041, beschrieben. Das gereinigte Material enthielt mehr als 95% reines t-PA, wie mit Hilfe der Silberfärbungs-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese ermittelt wurde.

Immunisierung von AKR-Mäusen mit t-PA:

Gereinigtes t-PA, das, wie oben beschrieben, hergestellt worden war, wurde gegen 0,15M NaCI, das 0,01 % (V/V) Tween 80 enthielt, dialysiert und die Konzentration mit lOpg/ml bestimmt.

Die AKR-Mäuse wurden dreimal in zweiwöchigen Intervallen immunisiert. Bei den ersten beiden Immunisierungen wurden den Mäusen subkutan 50μΙ t-PA injiziert, das mit 50μΙ von Freunds unvollständigem Zusatzstoff emulgiert war (was 5Mg t-PA/Maus entspricht). Die letztere Immunisierung war identisch mit den ersten beiden, doch sie wurde statt subkutan intraperitoneal gegeben. Zwei Monate später enthielt eine Maus eine intravenöse Boosterinjektion von 90μΙ t-PA, jedoch ohne Freunds Zusatzstoff.

Zellfusion und Zellkultur:

Drei Tage nach der intravenösen t-PA-Boosterinjektion wurde die Milz entfernt, und durch sorgfältiges Herausschneiden und Zerteilen der Milz wurde eine Milzsuspension hergestellt. Die sich ergebenden Milzzellen wurden für Zellfusionen verwendet, wie sie von Petersen, L. C. et al., Thrombosis and Haemostasis 57 (2), 1987, S. 205 bis 211, beschrieben wurden. Kurz gesagt, die

Milzzellen wurden mit X63-Ag8-6.5.3-Myelomzellen In Anwesenheit von Polyethylenglykollösung verschmolzen. Nach der Verschmelzung wurden die Zellen In zohn 96er Mikrotlter-Zellplatten angesetzt. Hybridomüberstände wurden nach einem zweiwöchigen Wachstum durch eine enzymverbundene Immunosorbtionsmittelanalyse gescreent. Mehrere Male wurde ein positiver Klon erneut unter Verwendung einer begrenzten Verdünnung Moniert, um die Monoklonalita't zu gewährleisten. Danach wurde die Zellinie in großem Maßstab in „Zellfabriken" von NUNC in einem Medium vermehrt, das aus RPM11640 (Gibco, Großbritannien) mit 2% BMS (Gibco, Großbritannien) bestand.

Reinigung c er monoklonalen Antikörper:

Die Hybridomüberstände wurden konzentriert. Der pH-Wert wurde auf 8,3 eingestellt, und daraufhin wurden die monoklonalen Antikörper bei 4°C durch Adsorption auf einem Protein-A-Gel gereinigt. Die Eluierung erfolgte mit einem Citratpuffer bei einem pH-Wert von 4,5.

Herstellung von F(ab)j-Fragmenten:

Die gereinigten monoklonalen Antikörper (Unterklasse IgG₁) wurden mit Pepsin bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:100 und einem pH-Wert von 4,30 16 Stunden lang bei 37⁰C herausgezogen. Die Reaktion wurde beendet, indem der pH-Wert des Reaktionsgemisches mittels festem Tris auf 0,5 eingestellt wurde. Das F(ab)₂ wurde vom nicht ausgelösten IgG und Produkten mit niedrigem Molekulargewicht in einer Ultragel-AcA-44-Säule getrennt. Die Reinigung der Antikörper, die Pepsinauslösung und die Reinigung des F(ab)₂ wurden auf Silberfärbungs-SDS-Gel überwacht.

F(ab)₂-Marklerung mittels Indium:

Das gereinigte F(ab)₂ wurde mit Indium im wesentlichen nach der Methode von Hnatowich (J. Immun. Methods. 65, S. 147 bis 157 (19831), markiert. Die Immunreaktivität der Konjugat& wurde mittels ELISA und der Immunoabsorbensmethode bestätigt, wobei das t-PA als Antigen benutzt wurde. Die strahlenchemische Reinheit wurde mit Hilfe der Hochdrucksflüssigkeitschromatographie (HPLC) nachgewiesen.

Beispiel 2 Krankenberichte. Alle Patienten wurden mit 1 mg des mit ln-111 markierten Anti-t-PA MoAb injiziert, das entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1 bei einer radioaktiven Dosis von 100MBq hergestellt wurde, allerdings bildet der Bericht B eine Ausnahme, hier betrug

die radioaktive Dosis 50MBq. Die szintigraphische Untersuchung wurde mit Hilfe einer szintigraphischen Kamera GE StarCamdurchgeführt, die an einen Star-System-2-Computer angeschlossen war, wobei unmittelbar nach der Injektion des Antikörpersbegonnen wurde. Während der ganzen Zeitspanne der Untersuchungen wurden keine Komplikationen festgestellt.

A. Von einem 50jährigen Mann wurde 3 Stunden vor der Injektion des markierten Antikörpers eine Blutprobe aus der rechten Unterarmvene entnommen. Während der ersten acht Stunden der szintigraphischen Untersuchung wurde ein kleiner Venenkatheter mehr distal in der rechten Unterarmvene zum Zwecke der Blutentnahme eingesetzt. 24 Stunden nach der Injektion des Antikörpers wurde eine erhöhte Aufnahme des markierten Antikörpers an den Entnahmestellen auf dem Szintigramm beobachtet (Fig. 1), was darauf hinwnist, das der markierte Antikörper zur Feststellung vaskulärer Verletzungsflächen verwendet wurde.

B. In der linken Arteria femoralis communis eines 50jährigen Mannes mit schwerer Arteriosklerose wurde durch eine 5cm lange Arteriotomie eine Thrombendartectomie durchgeführt. 20 Stunden danach wurden die markierten Antikörper injiziert. Bei der szintigraphischen Untersuchung wurde eine sofort ansteigende Aufnahme des Antikörpers entlang der Arteriotomie festgestellt (Fig. 2). 24 Stunden nach der Injektion wurde eine erhöhte Aufnahme des Antikörpers im ganzen Bereich der Operation festgestellt, was einer Mikrothrombose der bei der Operation verletzten Blutgefäße entspricht (Fig. 3).

C. Wegen schwerer gastrointestinaler Blutungen wurde ein 61jähriger Mann in den letzten zwei Jahren mehrere Male ins Krankenhaus eingewiesen. Trotz sorgfältiger Suche nach der Stelle der Hämorrhagie wurde diese nicht gefunden. Wieder wurde der Patient nach einer Btägigen Blutung eingewiesen, und diese Blutung setzte sich auch nach der Einlieferung ins Krankenhaus noch fort. Es wurde markiertes Anti-t-PA MoAb injiziert, und nach 2,5 Stunden eine Stelle erhöhter fibrinolytischer Aktivität im unteren Mittelteil des Abdomens festgestellt (Fig.4). Die f ibrinolytische Aktivität erhöhte sich auch noch weiterhin in diesem Bereich, und nach einer 6stündigen szintigraphischen Untersuchung wurde diese Aktivität auch im Zäkum festgestellt. Zu dieser Zeit wurde immer noch eine fokal erhöhte Aktivität in dem anfangs beobachteten Bereich festgestellt. Bei der Operation des Patienten wurde, 50cm vom ileozäkalen Bereich entfernt, d. h. dort, wo die erhöhte fokale Aktivität festgestellt worden war, ein Karzinoid polypus festgestellt und reseziert. Danach wurden keine gastrointestinalen Blutungen mehr beobachtet.

D. Der Patient war ein 78 Jahre alter Mann, der zwei Woch in vor der szintigraphischen Untersuchung in einen Verkehrsunfall verwickelt war. Wegen Schmerzen im Rücken war er die g nre Zeit fixiert worden. Am Tag vor der szintigraphischen Untersuchung wurde er einer Kontrast-Venographie unterzogen. Die Untersuchung 20 Stunden nach der Injektion der markierten Antikörper zeigte eine stark erhöhte fibrinolytische Aktivität im rechten Bein (Fig. 5), und zwar genau an den in der Venographie festgestellten proximalen Teilen der verstopften thrombotischen Stellen, d. h. an den seitlichen Venen unterhalb des Knies und des distalen Teils der Vena femoralis, unmittelbar oberhalb des Knies.

E. Einem 81jährigen Mann mit einer Aneurysma der abdominalen Aorta, die mit einem muralen Thrombus überzogen war, wurden die markierten Antikörper injiziert, und die szintigraphische Untersuchung begann 20 Stunden, bevor der Patient wegen dieses Zustandes operiert wurde. An der Stelle des muralen Thrombus wurde eine erhöhte fibrinolytische Aktivität festgestellt (Fig.6). Probenstücke der Blutgefäße, die während der Operation an dieser Stelle entnommen wurden, zeigten eine um 60% höhere Aufnahme des markierten Antikörpers im Bereich des muralen Thrombus gegenüber dem aortischen Bereich mit einem hohen Grad an Arteriosklerose, doch keine Thrombusbildung.

F. Wegen Atmungsprobleme wurde ein 69jähriger Mann Ins Krankenhaus eingeliefert. Ein kombiniertes Perfuslons- und Ventilatlons-Szlntigramm erbrachte, daß kleine pulmonalo Emboli in Verbindung mit einer chronischen, obturlerenden Lungenkrankheit vorlagen. Die szintigraphische Untersuchung 24 Stunden nach der Injektion markierter Antikörper zeigte olno erhöhte Antikörperaufnahme im embolischen Bereich des rechten Lungenflügels (Flg. 7).

Q. Eine 81 Jahre alte Frau hatte fünf Tage lang schon leichte Schmerzen im unteren linken Bein und wurde, als die Schmerzen größer wurden und an der Vorderseite des Fußes eine beginnende Hypästosle festgestellt wurde, Ins Krankenhaus eingeliefert. Im kruralen Bereich wurde ein Embolus festgestellt und operativ entfernt. Eine präoper&tive szintigraphische Untersuchung nach der Injektion von markierten Antikörpern zeigte eine ungewöhnlich erhöhte Aufnahme des Antikörpers im Bereich der arteriellen Trifurcation proximal im linken Unterschenkel (Flg. 8). Im vorderen Teil des Fußes wurde auch eine diffuso, erhöhte Aktivität beobachtet, die auf eine erhöhte lokale Ausscheidung von t-PA hinwies. Die szintigraphische Untersuchung wurde postoperativ weitergeführt und innerhalb von 48 Stunden nach der Operation wurde eine Normalisierung Im Szintigramm festgestellt. Die Patientin erholte sich ohne Folgeerscheinungen.

H. Ein 81 jähriger Mann wurde mit einem Bruch dos äußeren Knöchels im rechten Bein einen Tag vor der Injektion des markierten Antikörpers ins Krankenhaus eingeliefert. Eine szintigraphische Untersuchung erbrachte eine erhöhte Antikörperaufnahme im Bereich des Bruches (Fig. 9).

I. Eine 32jährige Frau wurde wegen eines deutlichen Ödems am linken Bein ins Krankenhaus eingeliefert. Eine Starkkontrast-Venographie ergab Anzeichen einer Thrombose in der linken lliumvene. Die Szintlgraphie 24 Stunden nach der Injektion markierter Antikörper zeigte eine hohe fokale Aktivität im gesamten Bereich der linken lliumvene (Fig. 10).

J. Eine 72 Jahre alte Frau wurde mit dem Verdacht euf einen bösartigen Ovarientumor ins Krankenhaus eingeliefert. Eine präoperative Ultraschalluntersuchung zeigte suspekte Veränderungen der rechten Ovarie und eine Tumormasse von 2cm χ 2cm x 2cm im Bereich des oberen Bauches. Eine 24 Stunden nach der Injektion markierter Antikörper durchgeführte Szintigraphie zeigte eine fokale Aktivitätsanhäufung in der Blase, dem beiderseitigen Ovarienbereich und fokal im Bereich des oberen Bauches (Fig. 11). Bei der Operation konnte die Ovarienkrebsdiagnose bestätigt werden, wobei der bilaterale Ovarienkrebs die Blase einschloß und eine distante Metastase im transversen Kolon vorlag.

K. Ein 38jähriger Mann wurde wegen Fieber und leichten Schmerzen unten rechts im Bauch ins Krankenhaus eingeliefert. Die Ultraschalluntersuchung ergab eine fokale homogene Masse im Bereich des unteren rechten Bauches, was einem periappendikulären Abszeß entspricht. Ein 27 Stunden nach der Injektion eines markierten Antikörpers aufgenommenes Szintigramm zeigte eine fokale Aktivitätsanhäufung im selben Bereich, was auf eine fokale Injektion hinweist und so das Ultraschallergebnis bestätigt (Fig. 12).

L. Ein 60 Jahre alter Mann, der mehrere Jahre lang sine starke rheumatische Arthritis ,esaß, wurde wegen eines Rückschlags dieser Krankheit ins Krankenhaus eingeliefert. Die 24 Stunden nach der Injektion eines markierten Antikörpers durchgeführte Szintigraphie zeigte eine erhöhte Aktivität in den Gelenken, die in den akuten Zustand dieser Krankheit einbezogen waren (Fig. 13).

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß dos radioaktiv markierte Anti-t-PA MoAb zur Diagnostizierung einer großen Anzahl von Zuständen eingesetzt werden kann, die mit einer erhöhten f ibrinolytischen Aktivität in vielen verschiedenen Körperteilen verbunden sind, wobei Gewebe mit einer hohen fibrinolytischen Eigenaktivität, wie Prostata, Gonaden und Nasenschleimhaut, mögölicherweise ausgenommen sind (vgl. Fig. 14). MoAb zoigte eine hohe Immunospezifität und Empfindlichkeit. Die Aufnahme des Antikörpers in der Leber war in den ersten vier Stunden gering, was bedeutet, daß im Gegensatz zum Einsatz des radioaktiv markierten t-PA selbst die hepatische Extraktion und folglich eine hohe lokale Konzentration der Radioaktivität in der Leber kein Problem zu sein scheint. In den ersten Minuten nach der Injektion des Antikörpers erfolgte eine verstärkte Aufnahme im thrombotischen Boreich, und danach erhöhte sich die Hintergrundaktivität mehrere Stunden lang. Das Zielwert/Bliit-Ver) ältnis erhöhte sich dann und ergab ein klares szintigraphisches Bild des Bereichs der erhöhten fibrinolytischen Aktivität.

Beispiel 3

Biologische Hintergrundsubtraktion -Tierstudie

Monoklonal Antikörper:

Es wurde ein monoklonaler Antikörper hergestellt, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde. Das F(ab)₂-Fragment wurde mit ln-111 radioaktiv markiert, ebenfalls wie Im Beispiel 1 beschrieben.

Die strahlenchemische Reinheit des markierten Antikörpers betrug 93% und wurde mittels HPLC bestimmt.

Die immunochemische Reinheit des markierten Antikörpers wurde als der Prozentwert der Antikörperradioaktivität ermittelt, der sich an eine t-PA-gekoppelte Sepharose©-Säule (Pharmacia AB, Schweden) binden kann. Die immunochemische Reinheit des Konjugates lag unter der radiochemischen Reinheit, da einige der markierten Antikörper immunologisch nicht reaktiv waren. Die immunologische Reinheit des Antikörpers betrug 91 %.

Das in den Experimenten verwendete t-PA war Actilyse von der Fa. Boehringer, Ingelheim.

Experimentelle Anordnung:

Zwei Kaninchen wurden intravenös Antikörper in Dosis/kg und spezifischer Radioaktivität, die mit der im Beispiel 2 bei den Untersuchungen an Menschen vergleichbar war, injiziert.

Das Kaninchen 1 erhielt die Antikörper zum Zeitpunkt t = 0min Anschließend wurde kein t-PA verabreicht. Kaninchen 2 erhielt die Antikörper zum Zeitpunkt t = 0min. 120min. später wurde Kaninchen 2 eine intravenöse Injektion von t-PA über einen Zeitraum von 1 min verabreicht. Die injizierte t-PA-Menge besaß die dreifache molare Konzentration der verabreichten Antikörper.

Plasmaaktlvltlt: Blutproben wurden zu den Zeitpunkten t » 0 und 10,20,40 und 6OmIn und 2,4, 6, 12 und 24 Stundon nach der Antikörperlnjoktlon

entnommen. Beim Kaninchen 2 wurden zusätzliche Proben 5,10,20,40 und 6OmIn noch der t-PA-lnjoktlon entnommen.

Bei jeder Probe wurde die gesamte Plasmaaktivität ermittelt und mittels einer Regressionsanalyso (Freelance Plus, Vorsion

3.01 ) zu einer expontiollen Kurve zusammengestellt, und es wurde die biologische Gosamthalbwertszeit borochnet. AIIodargestellten Kurven wurden hinsichtlich der physikalischen Verzögerung korriglort. Die Ergebnisse sind In Flg. 15 rtargostollt.

Die T1/2 der Antikörper betrug 10,3 Stunden. Als das t-PA zur Zeit t = 2 Stunden gegeben wurde, wurde oine dramatische Verringerung dor Plasmaaktivität festgestellt. Innerhalb von 10min wurde eine 92%ige Verringerung beobachtet Die biologische Halbwertszeit der radioaktiv markierten immunoroaktivon Antikörper im Plasma wurde als dio Halbwertszeit dor

t-PA-Bindeaktivität bestimmt. Die Ergebnisse) sind in Fig. 16 dargestellt.

Innerhalb von 10min nach der t-PA-lnjoktlon zum Zeitpunkt t = 2 Stünden waren mehr als 99% der Immunoroaktiven Antikörperaktivitäten aus dem Plasma eliminiert worden. Die Halbwertszeit dieser Eliminierung betrug 1 Minute. In den Stunden

nach der anfänglichen Eliminierung konnte ein geringfügiger Aktivitätsanstieg - bis zu 1,6%- festgestellt werden. Diosos wurdezweifelsfrei durch die Rückverteilung des extravaskulären Antikörporpools verursacht.

Aktivität des gesamten Körpers:

Nach 24 Stunden wurden die Kaninchen getötet. Es wurden Szintigramme des ganzen Kaninchenkörpors aufgenommen. Die Ergebnisse sind in Fig. 17 dargestellt. Die nicht in Verbindung mit t-PA verabreichten Antikörper befanden sich hauptsächlich in den Nieren, dagegen wurden die in Verbindung mit t-PA verabreichten Antikörper fast ausschließlich in der Leber gefunden. Aus diesen Experimenten ergibt sich, daß die t-PA/Anti-t-PA-MoAb-Komplexe eine grundsätzlich kürzere Lebensdauer im Organismus aufweisen als Anti-t-PA allein. Weiterhin zeigen die Experimente, daß es möglich ist, die schnolle t-PA/Anti-t-PA-MoAb-Beseitigung in vivo zu nutzen. Die Ergebnisse der Untersuchung lassen vermuten, daß für diese Erhöhung der Antikörperbeseitigung der hepatische t-PA-Rezeptor verantwortlich ist.

Die Verringerung der Gesamtradioaktivität ist ein wesentlicher Parameter für dio Bildaufnahme, weil die Gosamtplasmaaktivität das Zielwert/Blut-Verhältnis bestimmt. Die Reduzierung der t-PA-Bindungsradioaktivität ist ein Maß für die In-vivo-Wirksamkoit des Rezeptoreliminierungspfades. Die Abnahme der Gesamtradioaktivität ist geringer als die Reduzierung der t-PA-Bindungsrac.^;oaktivität, wenn das Konjugat nicht 100%ig immunochemisch aktiv ist.

Beispiel 4 Biologische Hintergrundsubtraktion - Untersuchung am Menschen: Eine 77jährige Frau wurde wegen eines deutlichen Ödems am rechten Bein ins Krankenhaus eingewiesen. Eine Starkkontrast· Venographie ergab Anzeichen einor Thrombose in einer der lateralon Schenkelvenen des rechten Beins. Mit Hilfe von radioaktiv

markierten, monoklonalen Antikörpern, die hergestellt wurden, wie im Beispiel 1 beschrieben ist, wurde eine Szintigraphie

durchgeführt. Die radiochemische Reinheit betrug nur 67%. - /

Eine Stunde nach der Injektion der radioaktiv markierten Antikörper wurden 6mg t-PA (Actilyse©, Fa. Boehringer, Ingelheim)

injiziert.

Plasmaaktivitat:

In regelmäßigen Zeitintervallen nach der t-PA-lnjektion wurden Blutproben genommen. Die Radioaktivität des gesamten Plasmas wurde für jede Blutprobe mit einem Gamma-Quellzähler ermittelt und über der Zeit aufgetragen (Fig. 18). Mit dem Freelance Plus, Version 3.01(j)wurde eine exponentiell Regressionsanalyse durchgeführt. Die T1/2 der Ausgangsphase betrug 4,8 Stunden. Nach der t-PA-lnjektion wurde ein wesentliches Absinken der Plasmaaktivität beobachtet. Innerhalb von 17 Minuten wurde eine 50%ige Reduzierung festgestellt.

Szintigraphie Bioverteilung:

Während der t-PA-lnjektion wurde eine dynamische Überwa<-,iung des Leber- und Herzbereichs mittels einer Gamma-Kamera mit 60 je 15 Sekunden dauernden Aufnahmen durchgeführ:. Die Aktivität des Blutes (Herzbereich) und der Leber wurden errechnet und über der Zeit aufgetragen. Die Verteilungsverschiebung von der Aktivität des zirkulierenden Bluts zur gebundenen Leberaktivität nach der Injektion ist in Fig. 19 eindeutig dargestellt.

Thrombusfeststellung: Anfänglich konnten Anzeichen einer Stauung im unteren Teil des Beins festgestellt werden. Die genaue Lage des Thrombus

konnte jedoch nicht ermittelt werden. Nach der t-PA-lnjektion verringerte sich die Aktivität im erweiterten vaskulären Bett, undder Thrombusbereich wurde gefunden (Fig. 20).

Die biologische Hintorgrundsubtraktion scheint das Bildaufnahmeverfahren zu verbessern und ermöglicht die Feststellung dor Thrombose innerhalb von einigen Stundon.

Claims

1. Diagnostisches Reagens für den In-vlvo-Nachweis eines erhöhten Ausstoßes eines fibrinolytischen Enzyms bzw. einer erhöhten fibrinolytischen Aktivität im menschlichen bzw. tieiischen Körper, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens einen mit dem fibrinolytischen Enzym reagierenden Antikörper oder ein Fragment dieses Antikörpers enthält, der (das) mit einer Substanz markiert ist, die einen In-vivo-Nachweis der Bindung des Antikörpers an das fibrinolytische Enzym ermöglicht.

2. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das fibrinolytische Enzym aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Gewebeplasminogen-Aktivator, Plasmin, Plasminogen bzw. einem hierzu analogen Stoff oder einem modifizierten fibrinolytischen Enzym mit Fibrinaffinität, z. B. modifizierter Urokinase, besteht.

3. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das fibrinolytische Enzym t-PA bzw. ein hierzu analoger Stoff ist.

4. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das fibrinolytische Enzym nativert-PA ist.

5. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monospezifischer Antikörper bzw. ein Fragment davon ist.

6. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper bzw. ein Fragment davon ist.

7. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonal Antikörper mit t-PA bzw. einem analogen Stoff reagiert.

8. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Markierung des Antikörpers verwendete Substanz ein radioaktives Isotop ist.

9. Diagnostisches Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das radioaktive Isotop aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus ln-111,Tc-99m, 1-131,1-123 und 1-125 besteht.

10. Diagnostisches Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer Form vorliegt, die für eine parenteral, nasale, enterale oder rektale Verabreichung geeignet ist, so zum Beispiel als injizierbare Form, als Aerosol, Suspension, als Klistierform usw.

11. Diagnostische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß die aus folgendem in separaten Behältern besteht:

a) einem mit einem fibrinolytischen Enzym reagierenden Antikörper bzw. einem Fragment hiervon, der (das) mit einer Substanz markiert ist, die eine In-vlvo-Ermittlung der Bindung des Antikörpers an das fibrinolytische Enzym gestattet, und

b) einem fibrinolytischen Enzym mit dem der Antikörper reagiert.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das fibrinolytische Enzym t-PA bzw. ein hierzu analoger Stoff ist.

13. Verwendung eines mit einem fibrinolytischen Enzym reagierenden Antikörpers oder eines Fragments des Antikörpers, der (das) mit einer Substanz markiert ist, die einen In-vivo-Nachweis der Bindung des Antikörpers bzw. dessen Fragments an das fibrinolytische Enzym ermöglicht, zur Herstellung eines diagnostischen Reagens für die In-vivo-Ermittlung eines erhöhten Ausstoßes eines fibrinolytischen Enzyms bzw. einer erhöhten fibrinolytischen Aktivität im menschlichen oder tierischen Körper.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das fibrinolytische Enzym aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Gewebeplasminogenaktivator, Plasmin, Plasminogen bzw. einem hierzu analogen Stoff oder einem modifizierten fibrinolytischen Enzym mit Fibrinaffinität besteht.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das fibrinolytische Enzym t-PA bzw. ein hierzu analoger Stoff ist.

16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das fibrinolytische Enzym nativer t-PA ist.

17. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monospezifischer Antikörper bzw. ein Fragment hiervon ist.

18. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper bzw. ein Fragment hiervon ist.

19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper mit t-PA bzw. einem hierzu analogen Stoff reagiert.

20. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Markierung des Antikörpers

verwendete Substanz ein radioaktives Isotop ist.
2!. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das radioaktive Isotop aus einer

Gruppe ausgewählt wurde, die aus In-111, lc-99 m, 1-131,1-123 und 1-125 besteht. 22. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper in einer parenteralen, nasalen, enteralen oder rectalen Formulierung, so zum Beispiel als injizierbare Formulierung, als Aerosol, Suspension, Klistier usw. vorliegt.